Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте: влияние тромбоцитов и моделированных эффектов микрогравитации

На правах рукописи

Комиссарова Светлана Владимировна

Регенерация нейронов коры головного мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте: влияние тромбоцитов и моделированных эффектов микрогравитации

14.03.03 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени Кандидата биологических наук

1 АПР 2015

005566565

005566565

Москва - 2015

Работа выполнена:

На кафедре общей патологии и патофизиологии медико-биологического факультета ГБОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования Министерства здравоохранения Российской Федерации и в лаборатории регуляции репаративных процессов ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии».

Научные руководители:

Кубатиев Аслан Амирханович

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, заведующий кафедрой общей патологии и патофизиологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России, директор ФГБНУ «НИИ ОПП».

Пальцын Александр Александрович

Доктор биологических наук, профессор, лауреат Государственной премии СССР, профессор кафедры общей патологии и патофизиологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России, заведующий лабораторией регуляции репаративных процессов ФГБНУ «НИИ ОПП».

Официальные оппоненты:

Конорова Ирина Львовна

Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной нейроцитологии, ФГБНУ «Научный центр неврологии».

Онуфриев Михаил Валерьевич

Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории функциональной биохимии нервной системы, ФГБНУ Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН.

Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов.

Защита диссертации состоится «-?3»Г^>угтЛ^С) 2015 г. в /Н часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» по адресу: 125315, Москва, Балтийская ул., 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «НИИ ОПП» Диссертация размещена на сайте Института www.niiopp.ru

Автореферат разослан « 13 »^¿р1 Тс} 2015 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

Кандидат медицинских наук Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. О социальном и медицинском значении цереброваскулярных заболеваний можно судить по следующим фактам. Смертность от цереброваскулярных заболеваний уступает лишь смертности от заболеваний сердца и смертности от опухолей всех локализаций. Она достигает в экономически развитых странах 11-12%. Многие миллионы людей становятся инвалидами [Гусев и др. 2003; Green, 2008; Donnan et al. 2008].

Распространенность инсультов в мире возрастает. В 2004 г. ВО1? объявила инсульт глобальной эпидемией. Статистика 2005 года определила число первичных случаев инсульта -16 миллионов; число перенесших инсульт — 62 миллиона, число смертей - 5,5 миллиона. Прогноз на 2030 год: первичных инсультов - 23 миллиона, смертей -7,8 миллиона [Mukheijee and Patil, 2011].

Социальный масштаб проблемы выражается в том, что цереброваскулярные заболевания наносят огромный ущерб экономике расходами на лечение, медицинскую реабилитацию, потерями в сфере производства. В нашей стране расчетная сумма прямых и непрямых затрат только на проблему инсульта колеблется от 16,5 до 22 миллиардов долларов в год [Гусев и др. 2003]. Медицинская и социальная значимость цереброваскулярных заболеваний определяют актуальность изучения их патогенеза в эксперименте. В патогенетическом аспекте цереброваскулярные и нейродегенеративные заболевания тесно связаны. Те и другие являются нейровоспалительными болезнями, имеют важную общую особенность развития - деятельность микроглиальных клеток, их структурно-функциональные изменения, обусловленные патогенными факторами, и обусловливающее, в свою очередь, состояние специфических клеток мозга (нервных, макроглиальных) и исход патологического процесса [Prinz et al. 2011; Hesske et al. 2010].

Патогенетически близко к указанным выше болезням стоит черепно-мозговая травма, не уступающая по распространенности инсульту. По данным института им. Н.В.Склифосовского в России частота черепно-мозговой травмы составляет 4,5 на 1000 населения в год [Официальный сайт НИИСП им. Скл. 2009-2010 отделение неотложной нейрохирургии НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Черепно-мозговая травма].

Столь важное место локальных воспалений мозга в медицине и экономике подвигло ученых на значительное число исследований таких состояний. В самой общей форме результат этих исследований выразился в современном убеждении, что главными взаимосвязанными факторами, определяющими патогенез и исход локальных нейровоспалений, являются: степень повреждения и регенерации нервной ткани, а также влияющие на состояние нервной ткани васкуляризация и активность микроглиоцитов-макрофагов. Опыт мировой медицины свидетельствует, что высокий уровень инвалидизации и смертности при инсультах и травмах мозга, в первую очередь (конечно после таких факторов как локализация и объем поражения),

обусловлен недостаточной эффективностью нейропротективной терапии [Ginsberg, 2009; Green, 2008; Jain, 2008; Arai et al. 2009; Xiong et al. 2010]. Для прогресса в этом направлении нужны знания механизмов физиологической и репаративной регенерации мозга.

Будучи уверенными, что успешность терапии определяется степенью её соответствия природному ходу заживления, мы в выборе темы данного исследования руководствовались одним мотивом: изучать естественные механизмы заживления воспалительного очага. Рассматривая патогенез инсульта, следует, на наш взгляд, попытаться определить роль в этом процессе тромбоцитов. В литературе сообщений на эту тему мы не нашли. А, между тем, скопление и, конечно, активация тромбоцитов постоянный элемент патогенеза как ишемического, так и геморрагического инсульта. На все процессы тканевых повреждений, воспалений, регенерации тромбоциты оказывают существенное влияние, будучи естественным источником множества ростовых факторов. Отсутствие сообщений о влиянии тромбоцитов на развитие инсульта при заведомо понятной значительности этого влияния побудило нас провести данную работу.

При инсультах и при травмах мозга нарушается циркуляция в поврежденном участке и динамика циркуляторных изменений в большой степени определяет развитие последующих событий. В качестве рычагов влияния на циркуляцию мы избрали действие микрогравитации. Гравитационная нагрузка - первичный фундаментальный фактор любого события в природе. Мы обратились к микрогравитации как к способу более простому, более однозначному, чем все другие повлиять на гидростатическое давление в сосудистой системе и таким образом исследовать изменения циркуляции при нарушенном оттоке.

Главная характеристика исхода нейровоспаления - уровень восстановления функции. В данном исследовании состояние функции сопоставляли с объективными количественными морфологическими показателями развития регенераторного процесса в поврежденном участке мозга. Это позволило судить о клеточном механизме восстановления функции. Показателем регенерации нейронов был феномен слияния олигодендроцитов с нейронами и пронейрональное репрограммирование ядер олигодендроцитов в цитоплазме нейронов. Результатом этого процесса становится появление в нейроне второго нейронального ядра, второго генома. Появляются структуры, обеспечивающие поддержание и восстановление нарушенной функции мозга, т.е. физиологическую и репаративную регенерацию.

Цель исследования. Изучить морфологические и функциональные проявления репаративной регенерации нейронов при экспериментальном кровоизлиянии в мозг. Определить влияние тромбоцитов и микрогравитации на ангиогенез и особенности микроглиально-макрофагальной реакции в этом патологическом процессе.

Задачи исследования.

1.Создать модель кровоизлияния в кору мозга (геморрагического инсульта), предусматривающую введение в очаг повреждения испытуемого материала и обеспечивающую постоянное по воспроизводимости и стандартное по выраженности нарушение двигательной функции животного.

2,Определить морфологические критерии развития ангиогенеза и активации микроглиоцитов-макрофагов (воспалительной клеточной реакции) в очаге локального повреждения мозга.

3.Установить, как влияет на ангиогенез, воспалительную клеточную реакцию и скорость восстановления двигательной функции изменение содержания тромбоцитов в очаге.

4.Изучить влияние различных режимов микрогравитации на ангиогенез, воспалительную клеточную реакцию и восстановление функциональной активности при локальном воспалении мозга.

5.Провести морфологический и цитохимический анализ изменений нейронов в нейровоспалительном очаге.

6.Исследовать зависимость скорости образования двухъядерных нейронов от содержания в очаге тромбоцитов и режима микрогравитации.

Научная новизна исследования. При локальном воспалении мозга проведен морфологический и цитохимический анализ клеток с двумя различными ядрами - гетерокарионов, образовавшихся после слияния нейронов и олигодендроцитов. Доказано, что ядро олигодендроцита подвергается в гетерокарионе нейрон-специфическому

репрограммированию, в результате которого гетерокарион превращается в нейрон с двумя одинаковыми ядрами. В одном из самых актуальных направлений современной биологии - репрограммировании соматических клеток наша работа занимает особое положение. Репрограммирование воспринимается научным сообществом как процесс, индуцируемый человеком путем трансплантации ядер или действия транскрипционных факторов в культуре. А наша работа открывает пример естественного репрограммирования, совершающегося в природе уже на протяжении миллионов лет. Появление в популяции нейронов некоторого числа двухъядерных увеличивает суммарный геномный фонд этой популяции, что позволяет компенсировать функцию при утрате части нейронов в нормальном онтогенезе или при болезни. Установлено, что повреждение увеличивает число двухъядерных клеток в окружающей очаг повреждения коре. Иными словами, получено свидетельство осуществления путем слияния региональных клеток репаративной регенерации мозга. Получены данные о положительном влиянии тромбоцитов на ангиогенез и активацию тромбоцитами микроглиоцитов-макрофагов в очаге воспаления мозга. Изучено влияние микрогравитации на течение экспериментального геморрагического инсульта. Впервые обнаружено благотворное

тренировочное воздействие микрогравитации при локальном воспалении мозга.

Теоретическая и практическая значимость. Получено знание того, как регенерируют нейроны ЦНС. Это отнюдь не «стабильная клеточная популяция», как думали в XX веке. Пирамидные нейроны коры оказались лабильной клеточной популяцией, которая может отзываться на патогенное воздействие не только гибелью, но и регенерацией. Показана несостоятельность идеологически вредной формулы: «нервные клетки не восстанавливаются». Оказалось, что нейроны коры реагируют на повреждение не пролиферацией, тщетно искавшейся в течение полутора веков, и искомой до сих пор, а ускорением постоянно протекающего процесса физиологической регенерации путем слияния нейронов с олигодендроцитами. В результате такого слияния и последующего нейрон-специфического репрограммирования ядра олигодендроцита нейрон становится двухъядерным, что повышает его функциональный потенциал и документируется в настоящей работе восстановлением полноты движения конечности. Обозначилась пока не очень отчетливая, но правдоподобная положительная связь ускорения слияний с ускорением ангиогенеза. То и другое усиливается тромбоцитами. Дальнейшая экспериментальная разработка этих данных представляется перспективной в теоретическом и практическом плане. Такие исследования определят факторы, регулирующие слияния нервных клеток. Терапевтическое применение комплекса тромбоцитарных факторов сегодня кажется задачей выполнимой. Подтверждение нашим исследованием регенераторной роли слияния нервных клеток увеличивает практическую значимость подсчета числа слияний в анализируемом образце как объективного количественного метода определения интенсивности регенерации мозга. Метод позволяет надежно, количественно оценивать действие патогенных и терапевтических факторов. Данные о том, что микрогравитация, предшествующая повреждению, благотворно действует на развитие очага воспаления могут быть использованы для разработки приемов терапевтической и профилактической физкультуры.

Положения, выносимые на защиту.

1. Физиологическая и репаративная регенерация нейронов коры выражается увеличением числа нейрональных геномов в популяции этих клеток. Увеличение достигается путем слияния нейронов с олигодендроцитами, пронейронального репрограммирования ядра олигодендроцита в цитоплазме нейрона и превращения этого ядра во второе ядро нейрона.

2. Увеличение содержания тромбоцитов в очаге локального воспаления коры мозга уменьшает объем разрушенных тканей, увеличивает скорость ангиогенеза, ускоряет восстановление нарушенной двигательной функции и частоту слияний нервных клеток.

3. Помещение животного с очагом нейровоспаления в условия микрогравитации ухудшает отток крови, увеличивает распространенность и степень деструкции в очаге, замедляет рост кровеносных сосудов и восстановление нарушенной травмой двигательной активности. Применение микрогравитации перед нанесением травмы создает эффект тренировки; улучшает отток крови, уменьшает распространенность и степень деструкции в очаге, ускоряет рост кровеносных сосудов и восстановление нарушенной травмой двигательной активности.

Апробация работы.

Результаты работы были доложены на:

• III конференции молодых ученых, посвященной 80-летию со дня рождения профессора В.В. Гаврюшина в виде устного доклада. Конференция была организована РМАПО (2012г., Москва).

• Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (2011г., Москва).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 6 - в изданиях, рецензируемых ВАК РФ, и 3 - в иностранных журналах.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения и списка литературы.

Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Модель геморрагического инсульта.

Для создания модели геморрагического инсульта животным под эфирным наркозом рассекали кожу по средней линии головы, в операционном поле удаляли надкостницу. Для того чтобы исследовать в развитии инсульта состояние функции, повреждающий объект - трансплантат, вводили в моторную зону коры левого полушария мозга, а именно в участок, ответственный за движение правой передней лапы [Paxinos and Watson, 2007] (от брегмы в ростральном направлении 2мм, от средней линии черепа латерально 4мм, глубина введения 2,5мм. Череп сверлили ручным буром с ограничителем глубины проникновения, трансплантат вводили катетерной иглой с ограничителем глубины погружения. Диаметр иглы - 1,7мм, совпадал с диаметром бура).

Приготовление трансплантата.

Состав трансплантата: измельченная гемостатическая коллагеновая губка (ОАО Лужский завод «Белкозин», Россия) и богатая тромбоцитами плазма (PRP) крови кролика (группы 2-5), либо не содержащая клеток плазма крови кролика (группа 1). Объем трансплантата: ЗООмкл, количество тромбоцитов: 6 х 107. Вводимый трансплантат представлял в группе 1 смесь равного объема диспергированной в фосфатном буфере (PBS) коллагеновой губки и не содержащей клеток плазмы. В остальных группах содержание губки и PRP было не строго 50%, а незначительно менялось для создания постоянного числа тромбоцитов в трансплантате. PRP получали из цельной крови кролика, взятой из ушной вены в 9% цитрат натрия (9:1) и открученной на центрифуге (Term BR4i с ротором S40) при 900 об/мин в течение 10 минут, (23° С). Надосадочную часть, которая и являлась PRP, забирали, а оставшуюся часть центрифугировали при 2700 об/мин еще 10 минут (23° С). После второго центрифугирования в надосадке оставалась бесклеточная плазма.

Коллагеновую губку (40-50 мг) сначала нарезали ножницами на более мелкие части, которые на несколько часов замачивали в фосфатном буфере. Затем измельчали с помощью ультразвукового гомогенизатора Bandelin Sonopuls (Bandelin Electronic, Германия) в центрифужной пробирке при объеме фосфатного буфера 3 мл. Гомогенизирование происходило при 100% мощности импульса и частоте 8 импульсов за 10 секунд. Для полного диспергирования применяли 9-10 десятисекундных циклов.

Оценка локомоторной активности животных.

Двигательную активность исследовали перед операцией и на 7 день после операции на установке «Beam Walking» для крыс (ООО «НПК Открытая Наука», Россия). Двигательная активность оценивалась полуколичественным методом - увеличением количества начисляемых баллов, соответственно углублению расстройства движений.

Моделирование микрогравитации.

Условия микрогравитации моделировали снятием нагрузки с задних и частично с передних конечностей путем создания режима антиортостатической гипокинезии (АНОГ). С этой целью крыс одевали в специальные костюмы и подвешивали в индивидуальных клетках головой вниз под углом 30°. Костюмы были сшиты из плотной синтетической ткани с отверстиями для передних и задних лап; в области спины в ткань костюма вшивали металлические пластины, которые обеспечивали прямое положение позвоночного столба и исключали прогибание спины животного во время эксперимента. Стенки клетки были выполнены из органического стекла, пол — сетчатый. Подвеска на блоке, который свободно катался по балке в потолке, позволяла животному беспрепятственно перемещаться по клетке, иметь круглосуточный доступ к корму и воде.

Световая микроскопия.

На вибратоме (Leica VT lOOOS) получали фронтальные срезы толщиной 20 мкм, проходящие через место введения трансплантата. У контрольных животных исследовали фронтальные срезы поля S1FL левого полушария.

Срезы помещали на стекло с поли-Ь-лизиновым покрытием, высушивали и окрашивали по разработанной нами методике [Дубровин и др. 2012]. Съемку препаратов проводили на микроскопе ВХ51 Olympus с помощью программы Cell-F. При гистологической обработке материала большая часть трансплантата обычно не сохранялась, она была представлена только узкой границей с тканью мозга. Далее к периферии различали: 1) область инфильтрата и 2) область пенумбры, занятую клетками инфильтрата и нейронами (судя по морфологии, среди них встречались живые и мертвые), 3) пограничную с зоной инсульта область коры, не содержащую клеток инфильтрата.

Анализ полутонких срезов

Для увеличения точности морфологического анализа и определения содержания двухъядерных нейронов в зонах инфильтрата, пенумбре и пограничной вырезали кусочки размером 1мм3 для заливки в эпоксидную смолу, приготовления полутонких (1мкм) и электронно-микроскопических (50 нм) срезов. Заливку в смолу проводили по стандартной методике. Полутонкие и электронно-микроскопические срезы изготовляли на ультрамикротоме фирмы Leica EM UC6 (Австрия). Полутонкие срезы просматривали в световом микроскопе ВХ51 фирмы Olympus (Япония), снабженным фотокамерой Color View II и программой компьютерного анализа изображений Cell F. Срезы для электронной микроскопии контрастировали в приборе Leica EM АС20 (Австрия), растворами уранилацетата и лимоннокислого свинца. Просматривали и фотографировали в электронном микроскопе Leo 912 AB Omega (Германия).

Иммуноцитохимическое исследование.

Использовали вибратомные срезы (Юмкм) мозга, фиксированного в течение 2 суток в 4% растворе параформапьдегида на PBS. Срезы обрабатывали 0,1% раствором TRITON Х-100 в PBS в течение 10-15 мин. при комнатной температур«. Блокировали раствором ChemiBLOCKER (MiUipore) в течение ЗОмин. Первую инкубацию с антителами — к NeuN (МАВ377, Millipore) -mouse anti-neuronal nuclei в концентрации 1:500 проводили в течение часа при комнатной температуре. После инкубации с первичными антителами в течение ЗОмин инкубировали с Image-iT FX signal enchancer (Invitrogen). Вторичными антителами - Alexa Fluor 488 goat anti-mouse (Invitrogen) в концентрации 1:1000 обрабатывали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Отмывали PBS и инкубировали с флуорохромом DAPI (Sigma) в концентрации 1:105 в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Заключали срезы в среду Fluoromount (Sigma). Для контроля окраски использовали такой же протокол, но без первичных антител. Готовые препараты просматривали под микроскопом Olympus ВХ51(Япония). Методика определения МАР2 повторяла методику

определения NeuN во всем, за исключением концентрации антител. Первичное антитело - Chk pAb to МАР2 (Abeam), концентрация - 1:1000. Вторичное антитело - Goat pAb to Chk Ig (DyLight 488) (Abeam), концентрация — 1:1000.

Радиоавтография.

Радиоактивный предшественник РНК - уридин-Н3 вводили в левый боковой желудочек мозга в дозе 100 мкКи, в объеме 20мкл. Время присутствия предшественника в организме - 2 часа. Полученные с помощью вибратома срезы покрывали эмульсией Amersham ЕМ-1 и, после экспозиции в темноте в течении 10 дней, проявляли проявителем D-19. Срезы окрашивали флуорохромом DAPI. Это позволяло по структуре ядра в эпифлуоресценции различать нейроны и олигодендроциты. Чтобы стали видны зерна серебра, препарат освещали одновременно с эпифлуоресценцией проходящим через конденсор светом. Предшественник неравномерно распределялся в коре. Поэтому из многих срезов выбирали для фотографии те, в которых зернами серебра были мечены только нейроны, а олигодендроциты оставались немечеными. Сделать это нетрудно, поскольку в нейронах РНК синтезируется с гораздо большей скоростью, чем в олигодендроцитах.

Статистический анализ.

У каждого животного из участков коры вырезали по 3 кусочка ткани. Каждый кусочек резали так, чтобы получить не менее 3-х полутонких несерийных срезов.

В полутонких срезах, в области III — V слоев коры считали количество двухъядерных нейронов (ди- и гетерокарионов). Затем с помощью программы Cell F измеряли площадь такого участка среза. Разделив число двухъядерных клеток на площадь, в которой они были обнаружены, устанавливали плотность расположения двухъядерных нейронов на мм2 среза. Результаты сравнивали по критерию Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Таблица 1. Результаты экспериментов. Итоговая таблица.

Экспериментальные группы Количество проанализир о ванных животных, п Состав трансплантата Воздействие микрограви тации Оперт ность, % Средняя площадь среза, занимаемая одним двухъядерным нейроном, тт~ Локомоторная активность, баллы

Контроль 1 нет нет 0 0,317 ±0,033 1

1 6 Коллгеновая губка + бесклеточная плазма крови кролика нет 33 а 0,283 ± 0,0070 2.83 ±0.75

Ь 0,254 ±0,0152

2 8 Коллагеновая губка + РЯР крови кролика нет 33 а 0,250 ±0,0003 1.87 ±0.64

Ь 0,234 ± 0,0006

3 6 Коллагеновая губка + РЯР крови кролика 7 дней АНОГ после инсульта 75 а 0,187 ±0,0002 5.33 ±0.52

Ь 0,187 ±0,0013

4 7 Коллагеновая губка + РЯР крови кролика 7 дней АНОГ перед инсультом 42 а 0,294 ± 0,0960 1.29 ±0.49

Ь 0,303 ± 0,0475

5 7. Коллагеновая губка + Р11Р крови кролика 2 дня АНОГ перед инсультом 12 а 0,195 ±0,0023 1.29 ±0.49

Ь 0,181 ±0,0079

контралатерально е полушарие 0,315 ±0,0338

К

Определение значимости различий показало, что наиболее полное восстановление двигательной активности происходило в четвертой и пятой группах они достоверно отличалась в сравнении по критерию Вилкоксона (р<0,01) от первой и третьей групп. Достоверно (р<0,01) различаются от контроля по плотности расположения двухъядерных нейронов группы 3 и 5. В группе 5 плотность расположения слияний в зоне инсульта достоверно превышает плотность расположения слияний в таком же участке неповрежденного полушария.

Морфологические особенности очагов инсульта.

Морфологическое исследование мозга животных первой экспериментальной группы позволило обнаружить признаки расстройства кровообращения, сохраняющиеся на 7 день после операции. На рис. 2а показан массивный экстравазат, привлекший множество макрофагов.

В этой группе наблюдали не только разрушение сосудистой сети, но и восстановление её - новообразование сосудов. Однако, рост кровеносных сосудов происходил медленно, в инфильтрате и пенумбре сосуды встречались редко и имели малый диаметр — преимущественно капилляры (рис 26). В пограничной зоне изменений сосудистой сети не отмечено. В группе 2 кровеносные сосуды встречались в пенумбре в количестве значительно большем, чем в первой группе. Стенки их зачастую выглядели утолщенными. Сосуды были большего калибра (более зрелыми, рис 2в), представлеными не только капиллярной сетью, но преимущественно венулами и артериолами. Вторая подопытная группа отличалась от первой реакцией макрофагов. Их было значительно больше, Многие из них имели окрашенные в зеленый цвет (метахромазия) гранулы (на полутонких срезах эти гранулы окрашивались в темно-синий цвет). Наблюдалась необычная и очень интересная особенность «поведения» макрофагов. Они участвовали в образовании сосудистой стенки (рис 2в).

Стимуляция ангиогенеза тромбоцитами ярко выразилась в случайной находке, изображенной на рис.. В момент микротомии трансплантат выпал, но вросший даже в него (где, казалось бы, и кровоснабжать нечего) сосуд сохранился и, оказавшись хотя и стихийно, но очень искусно «отпрепарированным», предстает глазу в структурных деталях (Рис. 2г).

Рис. 1. Схема расположения зоны повреждения и прилегающих зон при геморрагическом инсульте (зона коры 51ГЬ)

1 - трансплантат (частично выкрошился), 2 - инфильтрат, 3 ~ пенумбра, 4 - пограничная зона, а, Ь - участки коры, в которых производили подсчет плотности расположения двухъядерных нейронов. Длина масштабной линии 300 мкм. Окраска по описанной методике.

Рис. 2. Первая и вторая группы.

(а) Первая группа. Зона инфильтрата. Рыхло лежащие макрофаги с заполненной светлыми гранулами цитоплазмой, между ними много излившихся из сосудов эритроцитов, х 1000

(б) Первая группа. Пенумбра. Видны клетки инфильтрата, нейрон и кровеносный сосуд с тонкой стенкой, х 1000

(в) Вторая группа. Зона инфильтрата. Видны плотно прилежащие друг к другу макрофаги, заполненные темно-зелеными гранулами. Поперечный срез крупного кровеносного сосуда, окруженного муфтой из макрофагов, х 1000

(г) Вторая группа. Зона трансплантата. Сохранился только вновь образованный в этой зоне сосуд и даже с эритроцитами, сохранившими свою прижизненную форму (стрелки) х 1000

Рис. 3. Четвертая и пятая группы.

(а) Четвертая группа. Инфильтрат. Большое количество клеток инфильтрата и новообразованные сосуды. Стрелками отмечены артериолы, х200.

(б) Четвертая группа. Пенумбра. Представленный свободно лежаи/ими эритроцитами (красные) экстравазат на границе пенумбры и инфильтрата. х200

(в) Пятая группа. Инфильтрат. Новообразованные сосуды (стрелки) и макрофаги, хЮОО

(г) Пятая группа. Зона повреждения. Видны сосуды (стрелки) большого диаметра в инфильтрате и пенумбре, х40.

Рис. 4. Электронно-микроскопические картины гетерокариона и дикариона. А - гетерокарион, справа - нейрон, слева - олигодендроцит. Мембрана разделяет клетки только в верхней части снимка. Внизу мембраны нет и сглажено различие в структуре цитоплазмы. Б - дикарион, ядра не разделены мембраной.

Рис. 5. Изменение структуры хроматина и величины ядра олигодендроцита после слияния с нейроном.

А Указанное стрелкой ядро олигодендроцита расположено в цитоплазме нейрона, т.е. слияние произошло, но ядро пока не изменилось, Оно маленькое,

структура хроматина не выявляется, не отличается от ядра олигодендроцита, расположенного рядом с нейроном.

Б Начало репрограммирования. Размер ядра олигодендроцита в нейроне (стрелка) не увеличился, но хроматин разделился на темный гетерохроматин (вдоль ядерной мембраны и 3 глыбки в центре) и светлый эухроматин в центре ядра.

В Размер ядра олигодендроцита (стрелка) значительно увеличился, но ещё не сравнялся с ядром нейрона. Пояс гетерохроматина по ядерной мембране шире, чем в ядре нейрона.

Г Завершение репрограммирования. Гетерокарион превратился в клетку с двумя одинаковыми ядрами - дикарион.

Рис. 6. Радиоавтографический анализ скорости синтеза РНК в репрограммируемом ядре олигодендроцита.

А В кадре находятся 5 ядер нейронов и 6 ядер олигодендроцитов.

Б При подсветке снизу через конденсор становится видимой метка -черные зерна серебра. Все 5 ядер нейронов интенсивно мечены, а все 6 ядер олигодендроцитов метки не содержат. Иными словами, транскрипция в ядрах олигодендроцитов идет на низкой скорости недостаточной для преодоления порога чувствительности нашего эксперимента. А более мощная транскрипция в ядрах нейронов хорошо выявляется.

В Другой участок препарата. В кадре 4 ядра олигодендроцитов. В одном из ядер (стрелка) пронейрональные изменения структуры — оно самое большое и самое неравномерно окрашенное - разделение хроматина.

Г Подсветка показывает, что пронейрональное изменение структуры имеет функциональное выражение - появление метки над этим ядром олигодендроцита (стрелка), свидетельствующее об увеличении скорости синтеза РНК подобно нейрону. А и В окраска ОАР1. Б и Г Проявление метки путем подсвечивания препарата через конденсор х 1000

Морфологические изменения в группе животных, подвергнутых действию АНОГ после повреждения, выразились снижением стимулирующего действия тромбоцитов на заживление очага. Грубое нарушение циркуляции -экстравазаты, не встречавшиеся во второй группе, в третьей обнаруживались часто. На нарушение оттока и застой крови указывал тот факт, что многие продольно срезанные капилляры, незаметные при нормальном кровообращении, становились четко видимыми. Это наблюдалось как в пограничной зоне, так и в окружающей очаг неповрежденной коре.

Анализ материала третьей группы убедил, что появление в очаге особой популяции макрофагов с зелеными гранулами обусловлено присутствием тромбоцитов. В контрольной группе таких макрофагов не было, в подопытных группах с тромбоцитами в очаге эти макрофаги постоянно встречались.

Одно из основных отличий макрофагов во второй и третьей группах - это количество клеток с темными гранулами. Если в первой группе макрофаги встречаются только окрашиваемые в темный цвет, то во второй свободнолежащие могут быть зачастую со светлым содержимым. В то же время макрофаги, образующие муфту вокруг кровеносных сосудов всегда имеют темную цитоплазму и зеленые гранулы.

Четвертая экспериментальная группа (животные, подвергшиеся перед нанесением травмы воздействию АНОГ в течение 7 дней) характеризовалась большим, чем в первой и третьей группах, количеством новообразованных сосудов (рис. За). Сосуды представлены как капиллярами, так и более зрелыми венулами и артериолами. На границе инфильтрата и пенумбры у всех животных данной группы встречались экстравазаты, значительные по площади (рис. 36). Состояли они преимущественно из рыхло лежащих эритроцитов, крайне редко образующих плотные скопления. Несмотря на пограничное положение, основной массив этих экстравазатов всегда расположен в пенумбре. В самом инфильтрате и в пограничной области коры подобных патологических явлений замечено не было. Кроме описанных экстравазатов других нарушений кровообращения, таких, как стаз крови в капиллярах и сосудов большего диаметра, не наблюдалось. Количество макрофагов в инфильтрате значительно, как и в остальных проанализированных группах. Свободнолежащие макрофаги представлены двумя типами: со светлой цитоплазмой и бесцветными гранулами и с темной цитоплазмой и зелеными гранулами (рис. За). Количество зеленых макрофагов меньше, чем во второй экспериментальной группе и может быть сравнено с количеством макрофагов в третьей группе, где животные подвергались посттравматическому воздействию АНОГ. Макрофаги, входящие в состав клеточной стенки новообразованных сосудов в большинстве своем с темной цитоплазмой, что объединяет эту группу со второй и третьей.

Пятая экспериментальная группа (двухдневный предварительный АНОГ) отличалась наибольшим количеством новообразованных сосудов (рис. Зв), причем это было заметно как в инфильтрате, так и в пенумбре (рис. Зг). В

инфильтрате это преимущественно новообразованные капилляры и синусоподоные венулы с очень тонкими стенками, артериолы встречаются редко. В пенумбре гораздо больше зрелых сосудов, как среди капилляров, так и сосудов большего диаметра. Характерной особенностью сосудов пятой группы является еще и то, что окружающие их макрофаги преимущественно со светлой цитоплазмой. Такого ранее ни в одной из групп не наблюдалось. В то же время в инфильтрате макрофаги с зелеными гранулами встречаются, но их количество незначительно. Грубых нарушений кровообращения в тканях, таких как экстравазаты и застой крови, в этой группе обнаружено не было.

Во всех четырех экспериментальных группах, где в состав трансплантата входили тромбоциты, количество клеток инфильтрата можно оценить, как примерно равное, как и распространение клеток инфильтрата в неповрежденную кору.

Отличается только первая группа, в которой животным вводили бесклеточную плазму крови кролика. Там клетки инфильтрата распространены очень мало, зона пенумбры крайне узкая. Еще одна отличительная особенность первой группы - отсутствие макрофагов в клеточной стенке новообразованных сосудов.

Исследование двухъядерных нейронов

У контрольных животных и у животных всех подопытных групп в пограничной зоне и окружающей коре постоянно находили двухъядерные нейроны. Двухъядерные нейроны пенумбры не исследовали. Такие находки в толстых (Юмкм) срезах могли быть обусловлены эффектом наложения -superimposing. Однако и при переходе на полутонкие (1мкм) срезы, исключающие наложение, находили клетки с двумя одинаковыми (дикарионы) и с разными (гетерокарионы) ядрами. Такие находки встречались и при электронной микроскопии (Рис. 4). Поэтому присутствие в мозге двухъядерных клеток сочли результатом слияния нейронов с олигодендроцитами. В общей цитоплазме гетерокарионов находили ядро нейрона и ядро олигодендроцита. Строение ядер олигодендроцитов различалось в разных гетерокарионах. По причинам, изложенным в заключении, мы различие ядер олигодендроцитов в гетерокарионах объясняем разным уровнем пронейронального репрограммирования этих ядер. По изменению ядер олигодендроцитов можно было проследить отдельные этапы увеличения сходства их с ядрами нейронов (Рис. 5). Ядра олигодендроцитов увеличивались в размере, меняли удлиненную форму на круглую. Изменялась степень дисперсности хроматина. Ядро не слившегося с нейроном олигодендроцита содержит грубо конденсированный гетерохроматин. Мелкодисперсного эухроматина почти нет. Первым заметным изменением ядра после слияния с нейроном становится разделение хроматина, т.е. образование кроме гетерохроматина отчетливо оформленной зоны эухроматина. В дальнейшем эта зона увеличивается, а зона гетерохроматина сокращается.

Ядра олигодендроцитов приобретают не только внешнее сходство с ядрами нейронов, но в них начинают экспрессироваться специфические маркеры нейронов, такие, как белок КеиЫ, присущий только зрелым нейронам, и МАР2, белок микротрубочек.

Нейрон отличается максимальной скоростью транскрипции сравнительно с другими клетками организма. Следовательно, приобретение особенностей нейрона ядром олигодендроцита должно выразиться дерепрессией многих генов и суммарно реализоваться повышением скорости синтеза РНК. Мы проверили эту гипотезу в радиоавтографическом эксперименте. Результаты эксперимента, представленные на рисунке 6, показали, что ядро олигодендроцита с двумя морфологическими признаками пронейронального репрограммирования (увеличение размера и разделение хроматина) изменило в пронейрональном направлении и функцию — оказалось меченным, как ядра нейронов. В нем подобно нейрону ускорена транскрипция.

Результатом пронейронального репрограммирования ядра олигодендроцита является образование в нейроне второго нейронального ядра. Появление новых структур это регенерация. Мы наблюдали это явление в контрольной группе, что расценили как физиологическую регенерацию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Главным объектом изучения в нашей работе были нейроны. Понимая, что такая позиция в работах по инсульту не отличается оригинальностью, что параллельно с нами работает много исследовательских групп, мы решили анализировать те особенности биологии этих клеток, которые пока неизвестны другим нейроморфологам. Наблюдения, сделанные ранее в нашей лаборатории [Пальцын и др. 2008, 2009; Константинова, канд. диссертация. 2010] давали основания полагать, что феномен слияния нейронов с олигодендроцитами может иметь регенераторное значение и, следовательно, иметь первостепенный интерес в проблеме инсульта. Поэтому мы посвятили работу, изложенную в выше представленном тексте, дальнейшему анализу этого феномена, заслуживающего, на наш взгляд изучения.

Результаты экспериментов показали, что в нормальном постнаталыюм онтогенезе региональные клетки мозга: нейроны и олигодендроциты сливаются и образуют клетки с двумя различными ядрами — гетерокарионы. Привлекает интерес особенности ядер в гетерокарионах. Во всех гетерокарионах одно из ядер всегда бывает ядром нейрона. По структуре второго ядра, как показано в результатах нашей работы гетерокарионы могут быть распределены в последовательность, представляющую собой возрастающую степень сходства второго ядра с ядром нейрона. Этому явлению можно предложить два объяснения. Первое объяснение - нейроны сливаются с разными клетками: микроглиоцитами, предшественниками олигодендроцитов (N02+), самими олигодендроцитами, астроцитами. Однако такое объяснение разнообразия вторых ядер гетерокарионов

отвергается цитохимическим и радиоавтографическим исследованиями. Второе ядро не только морфологически бывает сходно с ядром нейрона, но в нем обнаруживаются маркеры нейронов и сходное с нейроном увеличение скорости транскрипции. Ни микроглиоцит, ни предшественник олигодендроцита, ни астроцит такими способностями не обладают. Поэтому мы объяснили разнообразие вторых ядер в гетерокарионах тем, что гетерокарион образование развивающееся. Дифференцировка клеток не является раз и навсегда заданным состоянием. Такое состояние постоянно поддерживается в определенном динамичном положении равновесием регулирующих дифференцировку факторов или, иными словами, определенную схему транскрипции [Blau and Baltimore, 1991]. После слияния, т.е. образования гетерокариона, маленький олигодендроцит попадает в большой нейрон. Давними опытами по слиянию клеток разной величины в культуре установлено, что среди прочих причин, влияние партнера по слиянию тем сильнее, чем больше объем его цитоплазмы [Ringertz and Savage, 1976]. Концентрация транскрипционных факторов олигодендроцита резко снижается и теперь схему транскрипции ядра олигодендроцита определяют неиральные факторы. В этих условиях бывшее ядро олигодендроцита неизбежно становится вторым ядром нейрона. Действие одинаковых причин не может дать различных результатов.

Таким образом, нами получены доказательства того, что ядро олигодендроцита попадает путем слияния клеток в цитоплазму нейрона и в ней подвергается пронейрональному репрограммированию.

Обнаруженное нами естественное ^программирование включается, как и у Gurdon et al. [1958] перемещением ядра в чужую цитоплазму. Если ради образности встать на антропоморфическую точку зрения, приписать природе цель, то получается, что «цель природы» и современного искусственного репрограммирования соматических клеток одна и та же — регенерация. Мы считаем, что регенеративная роль естественного репрограммирования, конечно, не как цель, а как результат отчетливо проявилась в наших экспериментах. Постоянно протекающие у нормальных животных слияния с последующим репрограммированием слившихся ядер обеспечивают «на выходе» появление новых нейрональных геномов. Структура не может быть без функции. Следовательно, появление дополнительных нейрональных геномов обеспечивает дополнительную нейрональную функцию или восстановление её до прежнего уровня в случае произошедшего снижения. На этом основании мы расцениваем постоянно совершающиеся слияния у нормальных животных как проявления процесса физиологической регенерации. Такая точка зрения подтверждается данными, ' полученными на модели геморрагического инсульта. Таким образом, увеличение числа слияний после инсульта не только доказывает, что таким путем происходит восстановление разрушенной инсультом ткани мозга, но и подтверждает, что менее частые слияния у нормальных животных есть проявление постоянно протекающего воспроизведения утрачиваемых с возрастом структур в нормальных физиологических условиях.

Достоверное увеличение содержания двухъядерных нейронов при инсульте, сравнительно с интактными животными, обнаружено в группах 3 и 5. В группе 5 большая частота слияний сочеталась с минимальной летальностью и максимальной скоростью восстановления движений поврежденной инсультом конечности. Морфологическое исследование дает основания связать благоприятные результаты в 5-й группе с положительными циркуляторными находками, а именно отсутствием стаза крови и церебральных кровоизлияний. АНОГ в течение двух дней перед инсультом не мог не способствовать раскрытию, а, возможно, и новообразованию дополнительных коллатералей. Содержание тромбоцитов в трансплантате повысило концентрацию ангиогенных факторов (УЕвР и других) в зоне инсульта. С действием этих факторов мы связываем выявление густой сети новообразованных сосудов на периферии зоны повреждения у животных этой группы. Уровень васкуляризации может влиять на все процессы гомеостаза, в том числе на содержание двухъядерных нейронов. По крайней мере, усиленный ангиогенез и значительное повышение частоты слияний в той же зоне сравнительно с контролем и аналогичным участком коры противоположного полушария хорошо согласуются. Локомоторная активность у животных этой группы восстанавливалась быстро и через неделю почти достигла исходного уровня, т.е. состояния перед операцией. Увеличение частоты слияний и максимальная эффективность восстановления нарушенных инсультом движений в этой группе (т.е. структурные и функциональные признаки регенерации) доказывают, на наш взгляд, регенераторную роль слияний.

Существенное увеличение плотности расположения двухъядерных нейронов обнаружено также в группе 3. Однако, это благоприятное морфологическое изменение не сопровождалось, как в группе 5, быстрым восстановлением функции. Такой результат мы объясняем следующим образом. Регенерация, конечно, запускается повреждением, без повреждения нечего восстанавливать. Но повреждение не только запускает регенерацию, но одновременно и блокирует её, нарушая гомеостаз рядом патогенетических изменений в очаге: механический стресс, гипоксия, эксцитотоксичность, присутствие реактивных форм кислорода, провоспалительных цитокиков, перегрузка Са2+ [вио е! а1. 2011]. Разнонаправленность морфологических и функциональных проявлений регенерации в группе 3, мы связываем с тяжестью повреждающих воздействий в этой группе. Введение животных этой группы после операции в условия АНОГ увеличило приток крови к очагу и затруднило отток от него [Могеу-Ноиоп е! а1. 2005]. Таким образом усилился главный патогенетический фактор инсульта - расстройство циркуляции. Возросла летальность в этой группе. То, что увеличение плотности расположения двухъядерных нейронов не выразилось улучшением функции, мы предположительно, объясняем следующим образом. Само по себе второе ядро это ещё не удвоенная функция. Для усиления функции должно возрасти число связей двухъядерного нейрона. Вероятно связи в мозге с нарушенным (в этой группе очень резко) тканевым

гомеостазом устанавливаются медленнее и не успевают в заданный нами срок воплотиться в функциональном восстановлении.

Животные групп 4 и 5 помещались в состояние АНОГ перед созданием инсульта. Различие между группами заключалось в продолжительности АНОГ. В ранее проведенном эксперименте мы не обнаружили изменения плотности расположения двухъядерных нейронов после 7-дневной АНОГ без последующего инсульта [Свиридкина и др. 2012]. Созданный в настоящем исследовании инсульт после 7 дней АНОГ не увеличил частоты слияний в поврежденной зоне (группа4). Положительный во всех отношениях результат в группе 5 с 2-х дневной АНОГ перед инсультом (увеличение частоты слияний, максимальное сравнительно с другими группами число сосудов в зоне инфильтрата и пенумбры, отсутствие кровоизлияний, скорейшее функциональное восстановление, минимальная летальность) можно предположительно объяснить увеличением внутривенозного давления при микрогравитации, что способствует открытию и расширению коллатералей и анастомозов. Эти изменения появляются практически сразу после начала действия АНОГ и улучшают циркуляцию. Более длительная АНОГ (группа 4) вызывает противоположные последствия увеличенного венозного напряжения: уменьшение эластичности сосудов и отёк. Кроме того более длительная АНОГ усиливает негативные последствия гипокинезии. Возможно, с этим связано непонятное для нас отсутствие стимулирующего влияния травмы на частоту слияний.

В нашей работе четко определилась связь между появлением в очаге инсульта макрофагов с зелеными гранулами и присутствием тромбоцитов в трансплантате. Макрофаги с зелеными гранулами оказались особой популяцией, отличающейся, во-первых, яркой структурной индивидуальностью - лизосомами зеленого цвета. Во-вторых, эти клетки проявляли необычное «поведение», вернее расположение. Их постоянно находили встроенными в стенки сосудов. Объяснение этим картинам мы можем дать только гипотетическое. Возможно, зеленые макрофаги имеют адаптивно-компенсаторное значение и каким-то образом поддерживают циркуляцию. Поэтому их явно больше привлеклось в очаг во второй группе, где были тромбоциты и серьёзные нарушения циркуляции и меньше в пятой группе, с благоприятными условиями циркуляции.

Регенерация слиянием с олигодендроцитом сохраняет клеточное тело нейрона и все его связи с соседними нейронами. Получается, что стратегия природы в регенерации коры направлена не на смену поколений нейронов, а на поддержание функциональной достаточности единственного поколения.

ВЫВОДЫ

1. У нормальных животных нейроны коры сливаются с олигодендроцитами и образуют клетки с двумя различными ядрами — гетерокарионы.

2. В гетерокарноне нейрон-олигодендроцит ядро олигодендроцита подвергается нейрон- специфическому репрограммированию. Оно становится похожим на ядро нейрона по структуре (величине, форме, строению хроматина), в таком ядре и на его поверхности начинают экспрессироваться специфические маркеры нейрона: NeuN и МАР2, возрастает, подобно ядру нейрона, скорость транскрипции. С завершением репрограммнровання в нейроне появляется второе нейрональное ядро.

3. Превращение ядра олигодендроцита в ядро нейрона показывает, что изобретенный человеком прием репрограммирования -трансплантация ядер соматических клеток имеет естественный природный прототип.

4. Постоянное образование у интактных животных двухъядерных нейронов свидетельствует о том, что этот процесс выражает физиологическую регенерацию мозга.

5. При экспериментальном геморрагическом инсульте в коре мозга, окружающей очаг повреждения, увеличивается содержание двухъядерных нейронов (гетерокарионов и дикариоиов).

6. У животных с максимальным увеличением содержания двухъядерных нейронов в коре, наблюдается максимальная скорость восстановления нарушенной инсультом двигательной активности. Эта факты указывают на то, что образование двухъядерных нейронов есть механизм репаративной регенерации нейронов коры.

7. Присутствие тромбоцитов в очаге ускоряет восстановление функции, усиливает ангиогенез.

8. Антиортостатическая гипокинезия в течение двух суток перед инсультом снижает летальность, увеличивает скорость восстаноачения нарушенной инсультом функции, увеличивает ангиогенез, стимулирует регенерацию путем слияния клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Фатхудинов Т.Х., Большакова Г.Б., Комиссарова C.B., Арутюнян И.В., Ржанинова A.A., Гольдштейн Д.В. Ангиогенез при трансплантации ауто- и аллогенных клеток. // БЭБиМ. - 2010. - № 4 (149). - С.442-448.

2. Пальцын A.A., Свиридкина Н.Б., Турыгина С.А., Комиссарова C.B., Дубровин И.П. Регенерация мозга путем слияния региональных клеток коры. /Сборник научных трудов Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина». - М. 2011. - С.126-127.

3. Комиссарова C.B., Турыгина С.А., Александрии В.В. Модель очага воспаления в коре мозга у крыс. // Патогенез. - 2011. - №1 (9). — С.38-42.

4. Комиссарова C.B. Ускорение тромбоцитами регенерации коры мозга при экспериментальном геморрагическом инсульте. /Тезисы для III

конференции молодых ученых, посвященной 80-летию со дня рождения профессора В.В. Гаврюшина. РМАПО. - 2012. - С. 135-136.

5. Свиридкина Н.Б., Шакова Ф.М., Комиссарова С.В., Дубровин И.П., Турыгина С.А., Романова Г.А., Баранов В.М. Морфофункциональное исследование действия антиортостатической гипокинезии при очаговом ишемическом повреждении коры головного мозга. //Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012г. - №2. - С.22-26.

6. Комиссарова С.В., Дубровин И.П., Турыгина С.А., Папьцын А.А., Баранов В.М., Кубатиев А.А. Регенераторный потенциал тромбоцитов при локальном воспалении головного мозга в условиях микрогравитации. // Архив патологии. - 2012. - № 6 (74). - С.13-18.

7. Дубровин И.П., Комиссарова С.В., Турыгина С.А. Универсальный способ окрашивания воспалительных очагов и неповрежденных участков ткани мозга в вибратомных и полутонких срезах. // Вестник РГМУ. — 2012. - №5. - С.62-65.

8. Paltsyn A., Komissarova S., Dubrovin I., Kubatiev A. Increased Cell Fusion in Cerebral Cortex May Contribute to Poststroke Regeneration. // Stroke Research and Treatment. - Volume 2013. - Article ID 869327, 16 pages http://dx.doi.org/10.1155/2013/869327

9. Paltsyn A., Komissarova S., Dubrovin I., Kubatiev A. Increased cell fusion in cerebral cortex may contribute to poststroke regeneration. // Global Medical Discovery Copyright. - 2013. - P. 1 http://globalmedicaldiscovery.com/key-scientific-articles/increased-cell-fusion-in-cerebral-cortex-may-contribute-to-poststroke-regeneration/

10. Paltsyn A.A., Manukhina E.B., Goryacheva A.V., Downey H.F., Dubrovin I.P., Komissarova S.V., Kubatiev A.A. Intermittent hypoxia stimulates formation of binuclear neurons in brain cortex - A role of cell fusion in neuroprotection? // Experimental Biology and Medicine. - 2014. - V. 239. -P.595-600.

11. Комиссарова C.B., Дубровин И.П., Пальцын А.А. Регенерация нейронов. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -2014.-№3.-С.76-87.

Komissarova Svetlana Vladimirovna Regeneration of neurons of a cerebral cortex at an experimental hemorrhagic stroke: influence of platelets and simulated of effects of a microgravity

Abstract

An increase in the number of old people on the planet and the high incidence of neurological diseases drive the relevance of studies that examine the brain mechanisms of regeneration. Only based on our knowledge of these mechanisms can we extend the active, able-bodied and independent from the care of other people living, reduce the humanitarian, medical and social costs of neurological diseases. The conceptual basis for studying the regeneration of brain tissue in adult mammals has been and remains the idea that in the brain, the only expression of regeneration is a change in neuronal generation—neurogenesis. This view was particularly strengthened and began to capture the minds of researchers after the discovery in 1992 of neural stem cells. Enthusiasm fueled a hope for the speedy success of replacement therapy. Today, however, numerous experiments have only reliably proven the new formation of granule neurons of the dentate gyrus of the hippocampus and olfactory bulb. Potential regeneration mechanisms of the other neurons in other brain regions remain unclear.

In this study, we used a model of a hemorrhagic stroke in a motor zone of the cortex in rats at the age of 3 months The experiment shows that cortical neurons can fuse with oligodendrocytes. In formed binuclear cells, the nucleus of an oligodendrocyte undergoes neuron specific reprogramming. It can be confirmed by changes in chromatin structure and in size of the second nucleus, by expression of specific neuronal markers and increasing total transcription rate. The nucleus of an oligodendrocyte likely transforms into a second neuronal nucleus. The number of binuclear neurons was validated with quantitative analysis. Fusion of neurons with oligodendrocytes might be a regenerative process in general and specifically following a stroke. The appearance of additional neuronal nuclei increases the functional outcome of the population of neurons. Participation of a certain number of binuclear cells in neuronal function might compensate for a functional deficit that arises from the death of a subset of neurons. After a stroke, the number of binuclear neurons increased in cortex around the lesion zone. In this case, the rate of recovery of stroke-damaged locomotor behavior also increased, which indicates the regenerative role of fusion.

At animals with the maximum increase in the maintenance of binuclear neurons in cortex, the maximum speed of restoration of the physical activity broken by a stroke is observed. These facts specify that formation of binuclear neurons is the mechanism of reparative regeneration in the brain. Presence of platelets at the center accelerates function restoration, strengthens angiogenesis. The antiorthostatic hypokinesia within two days before a stroke reduces a lethality, increases the speed of restoration of the function broken by a stroke, increases angiogenesis, stimulates regeneration by cell fusion.

Подписано в печать 17.03.2015 г.

Заказ № 20 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел.(499)152-00-16 Тираж 100 шт.