Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль Р2Х7-рецепторов и над+-гликогидролазы в модуляции функциональной активности перитонеальных макрофагов при остром перитоните

На правах рукописи

□ОЗ 177-729

Малиновская Наталия Александровна

РОЛЬ Р2Х7-РЕЦЕПТОРОВ И НАД+-ГЛИКОГИДРОЛАЗЫ В МОДУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ ПРИ ОСТРОМ

ПЕРИТОНИТЕ

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 ЯН В да

Томск - 2008

003177729

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель-

доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант

кандидат медицинских наук, доцент

Салмина Алла Борисовна Карачева Альбина Александровна

Официальные оппоненты.

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Чурин Алексей Александрович Маслов Леонид Николаевич

Ведущая организация.

ГОУ ВПО ^Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Зашита состоится " Ц " ^^ЮуС&АА- 2008 г в у О часов

на заседании диссертационного совета Д 001 031 01 при ГУ НИИ фармакологии

Томского научного центра СО РАМН (634029, Томск, пр Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Автореферат

разослан " " 2007 )

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Амосова Е Н

Актуальность проблемы

Проблема лечения гнойного перитонита, несмотря на более чем вековую историю, еще далека от своего окончательного решения и до настоящего времени не перестает привлекать внимание хирургов и исследователей Летальность при перитоните различной этиологии, даже при использовании всего арсенала современных методов лечения, колеблется от 6,7 до 76 % К сожалению, на сегодняшний день не выяснены некоторые аспекты патогенеза перитонита, что существенно снижает эффективность его лечения

Наиболее значимые изменения при воспалении связаны с усиленной активацией и последующей гибелью макрофагов, несмотря на многочисленные исследования в области их морфологии и патофизиологии, остаются непонятными некоторые механизмы активации, функционирования и гибели макрофагов, ограничены сведения о возможности патогенетической коррекции их функций при состояниях, связанных с нарушением активности фагоцитов

Сравнительно недавно были высказаны предположения о новых механизмах, играющих критическую роль в активации и функционировании макрофагов в ответ на праймирующие стимулы, с участием сигнальных молекул Значительный интерес имеет изучение механизмов, ответственных за дизрегуляцию механизмов фагоцитоза, в том числе ассоциированных с нарушением активности клеточных сигнальных систем Существуют немногочисленные сведения об особенностях экспрессии указанных сигнальных молекул на клетках моноцитарно-макрофагальной природы, роли Р2Х7 рецепторов и НЛД"-гликогидролазы/С038 в регуляции внутриклеточного гомеостаза калышя при воспалении Однако до спх пор отсутствует информация о взаимосвязи между пуринергической сигнализацией и активностью НАД+-гидролаз в клетках макрофагальнои природы в норме и при патологических состояниях, кроме того, нет сведений о возможностях фармакологической коррекции функций макрофагов за счет направленной модуляции указанных сигнальных систем Исходя из этого, настоящее исследование представляется актуальным

Цель исследования Изучение рецепторных и пострецепторных механизмов пуринергической регуляции активности перитонеальных макрофагов при остром экспериментальном воспалении (перитонит) для патогенетического обоснования новых стратегий фармакологической коррекции острого воспаления

Задачи

1 Оценить экспрессию Р2Х7 рецепторов и АДФ-рибозилциклазы/С038 на перитонеальных макрофагах при остром перитоните

2 Изучить характер изменения пуринергической рецепции и АДФ-рибозилциклазной активности и функциональной активности макрофагов при остром перитоните

3 Исследовать Р2Х7-опосредованную регуляцию активности АДФ-рибозилциклазы/СШ8 перитонеальных макрофагов в норме и при остром перитоните

4 Оценить особенности развития агтоптоза и некроза, влияние индукторов апоптоза на Р2Х7-опосредованную регуляцию активности АДФ-рибоз11лцпклазы/С038 перитонеальных макрофагов в норме и при остром перитоните

5 Патогенетически обосновать новую технологию коррекции функциональной активности перитонеальных макрофагов за счет направленной модуляции экспрессии и активности пуринергических рецепторов и АДФ-рибознлциклазы/С038

Научная новизна

1 Впервые описаны новые механизмы регуляции функциональной активности и выживаемости перитонеальных макрофагов в норме и при остром экспериментальном воспалении, ассоциированные с пуринергической сигнализацией, АДФ-рибозилциклазной активностью и внутриклеточными рианодпновыми рецепторами

2 Впервые установлены особенности функционирования рецепторных н пострецепторных механизмов внутриклеточной сигнальной транедукции, ассоциированных с активностью пуринергических Р2Х7 рецепторов перитонеальных макрофагов, в норме и при развитии острого экспериментального воспаления, а также взаимосвязь АДФ-рибозилциклазной активности перитонеальных макрофагов с их чувствительностью к апоптогенным стимулам

3 Впервые разработан и использован метод регистрации функциональной активности перитонеальных макрофагов по кинетике аутофлуоресценции клеток

4 Впервые описаны физиологические эффекты лиганда Раэ-рецептора в перитонеальных макрофагах, заключающиеся в регуляции активности АДФ-рибозилциклазы и НАД(Ф)Н-оксидазы

5 Впервые идентифицированы новые патогенетически обоснованные подходы к модуляции активности макрофагов при остром воспалении антагонисты и лиганды пуринергических рецепторов, лиганд и субстрат С038/НАД+-гликогидролазы, модуляторы рианодиновых каналов, ингибиторы внутриклеточных флавопротеинов и индукторы апоптоза

Личный вклад соискателя

Научные результаты, обобщенные в диссертационной работе Малиновской Н А получены самостоятельно Диссертантом выполнено лично определение цели, разработка конкретных задач работы и плана их выполнения, составление протоколов исследований, набор экспериментального материала, моделирование перитонита и осмотр животных, проведение гистологического исследования препаратов париетальной брюшины мышей,

клеточно-биологических исследований, флуориметрпческих исследований АДФ-рибозилциклазной активности С038 и функциональной активности макрофагов, проведение иммуноцитохимических исследований, статистическая обработка материала исследований и интерпретация результатов, написание автореферата и текста диссертации

Практическая значимость работы

1 Установлено, что Р2Х7-рецепторы и С038 являются маркерами активации клеток мононуклеарно-макрофагального ряда

2 Доказано участие Р2Х7 рецепторов и С038/АДФ-рибозилциклазы в регуляции функциональной активности макрофагов и индукции клеточной смерти, что позволяет рассматривать эти молекулы в качестве мишеней для фармакологической коррекции нарушенных функций фагоцитов

3 Разработан и внедрен новый оригинальный метод регистрации функциональной активности клеток макрофагальной природы

4 Дано патогенетическое обоснование новых технологий модуляции функциональной активности макрофаюв в норме и при воспалении за счет регуляции экспрессии Р2Х7 рецепторов, экспрессии и АДФ-рибозилциклазной активности СЭ38, активности рианодиновых каналов

Основные положения, выносимые на защиту

1 Регуляция функциональной активности пернтонеальных макрофагов осуществляется с участием сигнального пути, утилизирующего пуринергические рецепторы Р2Х7 подтипа, АДФ-рибозплциклазу/С038 и внутриклеточные кальцивые депо, регулируемые рианодиновымн рецепторами

2 Экспрессия и активность пуринергических рецепторов Р2Х7 подтипа и СЭ38 пернтонеальных макрофагов увеличиваются при развитии острого экспериментального перитонита

3 Реализация механизмов запрограммированной и патологической гибели макрофагов при воспалении утилизирует АДФ-рибознлциклазную активность СБ38 и пуринергическую сигнализацию

4 Изменения внутриклеточной сигнализации пернтонеальных макрофагов при развитии острого экспериментального перитонита затрагивают как рецепторный (пуринергическая регуляция), так и пострецепторный (НАД1-гликогидролаза, активность рианодиновых рецепторов) уровни, молекулы, участвующие в реализации этой сигнализации, являются патогенетически обоснованными мишенями для фармакологической коррекции

Внедрение результатов исследования Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в работе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, при проведении практических занятии и семинаров у студен гов КрасГМА Результаты внедрены в учебный процесс кафедры хирургических болезней № 2 Подготовлены методические рекомендации «Внутриклеточная сигнализация в макрофагах методы исследования и фармакологической модуляции».

учебное пособие «Биохимия регуляций пуринергические сигнальные каскады»

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами и рисунками и состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 167 источников (35 отечественных и 132 иностранных) Работа иллюстрирована 17 таблицами и 40 рисунками

Благодарности

Автор благодарит А Г Соколовича и А В Степаненко за помощь в постановке модели экспериментального перитонита, О В Перьянову за

предоставление_микробиологического материала для моделирования

перитонита, | О Ф Мусаеву 3 Г Сафину за приготовление и окраску гистологических препаратов брюшины мышей, ЛД Зыкову за помощь в описании препаратов брюшины, В В Салмина, сотрудников кафедры вантовоп электроники ФГОУ ВПО СибФУ и О Л Лопатину за помощь в разработке и постановке спектрофлуориметрического метода Автор выражает свою признательность Ю А Успенской и С В Михуткиной за помощь в разработке протоколов методов TUNEL, Annexm V, подсчета клеточности, жизнеспособности н детекции блеббинга

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект и методы исследования

Работа выполнена на кафедре биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии (заведующая кафедрой - д м н , профессор А Б Салмина) и НИИ молекулярной медицины и патобиохимии (руководитель д м н , профессор А Б Салмина) ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ректор - д м н , профессор И П Артюхов) Биоптаты брюшины готовили на кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (заведующая кафедрой - д м н , профессор Л Д Зыкова) Инактивированный St аигеш, штамм 209Р был взят на кафедре микробиологии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (заведующая кафедрой - к б н , доцент О В Перьянова)

Объектом исследования являлись беспородные белые мыши-самцы средней массой 18-20 г В контрольную группу животных входило 70

интактных самцов белых мышей - OK (п=50), ДК 1( п—10), ДК 2 (п=10), ЭГ состояла из 60 животных, у которых моделировался перитонит

Моделирование перитонита осуществлялось согласно М Thdkkei и др с модификациями наркотизированным мышам вводилось по 1 мл взвеси суточной культуры инактивированного нагреванием St aw ens (штамм 209Р, бактериальная концентрация 5х10|о/мл) вместе с питательной средой (МПБ с добавлением 30% глюкозы) Дополнительный контроль воспалительной модели перитонита осуществлялся введением интактным мышам I мл стерильной взвеси, состоящей из МПБ (rpyrtna ДК 1) или смеси МПБ+30% глюкоза (ДК 2)

Ослютр животных включал оценку общего состояния животных (активность, отказ от пищи и воды), принятие ими вынужденного положения тела, увеличение объема живота Сроки наступления смерти мышей и смертность (в процентах ог общего числа мышей в группе) оценивались в ЭГ (п=10), OK (п=10), ДК 1 ( п=7) и ДК 2 (н=7) При вскрытии животных учитывали параметры, оцениваемые по номинальным шкалам наличие и характер выпота в брюшной полости, наличие пареза кишечника, макроскопические особенности париетальной брюшины (цвет, отсутствие б ческа, наличие фибриновых наложений)

Морфочогическая ог/енка биоптатов брюшины включала оценку толщины брюшины, наличия лейкоцитарного инфильтрата и наложений фибрина после окраски парафиновых срезов гематоксилин-эозином и по Ван Гизону при световой микроскопии (хЗОО, хбОО, х1350) Толщина брюшины рассчитывалась с помощью окулярной тинейки в программе Adobe Photoshop CS2 как среднее значение из 3 измерений в различных участках брюшины

Выделение перитонеапъных макрофагов осуществляюсь через 48 часов после моделирования перитонита Через прокол передней брюшной стенки в брюшную полость умерщвленных животных вводили 5 мл стерильного охлажденного раствора Хенкса, производили энергичный массаж брюшной стенки и откачивали перитонеальный экссудат (клетки хранили на льду не более 10 мин) Макрофаги отделяли от других клеток путем их адгезии к поверхности пластиковых чашек Петри в присутствии инактивнрованной человеческой сыворотки Неприкрепившиеся клетки удаляли, а адгезированные клетки отделяли инкубацией с ЭДТА Полученный осадок ресуспендировапи в 4 мл раствора Хенкса

Идентификация и жизнеспособноеть макрофагов оценивались методами витальной окраски (0,1% нейтральный красный) и по Романовскому-Гимза Подсчет клеток, окрашенных витальным красителем, проводили в камере Горяева, цитодифференцировка проводилась по критериям форма, относительные размеры клеток, наличие и форма ядра, цвет циюплазмы

Регистрация блеббинга спазматической мембраны проводилась на нативном препарате при фазово-контрасгноп микроскопии,

дифференцировались интактные макрофаги, в состоянии начальною и

терминального блеббинга, рассчитывался индекс блеббинга (клетки в терминальном блеббинге/обшее количество блеббингующих клеток) как параметр выраженности воспалительного ответа макрофагов

Детекция клеток жспрессирующих Ррецепторы, осуществлялась согласно стандартному протоколу двойного непрямого метода иммуноцитохимии на свежевысушенных препаратах, приготовленных методом толстой капли с использованием первичных (Sigma-Aldrich, США) и вторичных (Имтек, Россия) антител Оценивали количество Р2Х7+ макрофагов на 100 клеток и внутриклеточную локализацию Р2Х7 рецепторов у Р2Х7+ макрофагов

Регистрация экспрессии CD38 проводилась на макрофагах согласно стандартному протоколу прямого метода иммуноцитохимии с использованием антител к CD38 (Caltag Laboratories, США), оценивалось количество CD38+ макрофагов и внутриклеточная локализация антигена у CD38+ макрофагов

Определение АДФ-рибозилциклазной активности CD38 проводилось согласно R М Graeff и др 2 мл полученной клеточной суспензии разделяли на 2 аликвота в первом определяли содержание белка микрометодом Лоури (, согласно протоколу фирмы-производителя (Total Protein Kit, Micro Lowry, Peterson's Modification, Sigma-AIdrich, США), второй аликвот использовался для определения АДФ-рибозилциклазной активности путем инкубации определенного количества клеточной суспензии с реакционной смесью, содержащей НГД+, KCl и СаС12 в трис-HCl Регистрация флуоресценции (СМ 2203) осуществлялась на 0 и 20 минутах инкубации, активность рассчитывалась по разнице флуоресценции и выражалась в ед/мин/мг белка Модуляция активности осуществлялась перед флуориметрическим анализом АТФ, сурамином, оАТФ, НАД+, FasL, комбинациями АТФ и сурамина с FasL

НСТ-тест проводили согласно Е Д Гольдбергу и др 0,1 мл суспензии макрофагов смешивали с 0,1 мл PBS и оставляли на 5 мин при комнатной температуре (спонтанный тест) или с 0,1 мл стимуляторов (0,2% зимозан, золотистый стафилококк 5х106/мл, стимулированные тесты), затем во все пробирки добавляли HCT Из осадка делали мазки, докрашивали метиловым зеленым и оценивали количество формазан+ макрофагов, фагоцитарный резерв (разность между количеством формазан+ клеток в стимулированном и спонтанном варианте) и среднюю интенсивность окрашивания цитоплазмы формазан* клеток с помощью Adobe Photoshop

Спектрофлуорииетрическая оценка функциональной активности макрофагов проводилась путем обработки кривых кинетики их аутофлуоресценции по оригинальной методике (оформлена заявка на изобретение) Для количественной оценки макрофагальной активности использовались максимальная амплитуда интегральной кривой (отн ед) и время достижения полувысоты (т/2) интегральной кривой (сек), для оценки спонтанной и стимулированной активности макрофагов и фагоцитарного резерва (по аналогии с НСТ-тестом) - исходная величина флуоресценции

кинетической кривой (уел ед) и амплитуда флуоресценции интегральной кривой (отн ед) в 2 временных точках 5 мин (спонтанная активность), 30 мин (стимулированная активность) Модуляция активности осуществлялась перед регистрацией кинетики зимозаном, золотистым стафилококком, АТФ, сурамином, оАТФ, НАД+, рианодином, DPI, FasL и их комбинациями Специфичность, точность и чувствительность методов (НСТ-тест, спектрофлуориметрия) оценивались по формулам чувствительность0 [истинно "+"/(истинно "+" + ложно "-")]* 100 специфичность= [истинно "-"/(истинно"-" + ложно "+")]* 100

точность» (истинно"+" + истинно "-"/(истинно "+" + истинно "-' + ложно "+" + ложно "- )1* 100

Оценка апоптоза макрофагов методом TUNEL выполнялась на препаратах клеточной суспензии макрофагов согласно протоколу фирмы-производителя (Apoptag Direct Detection kit, Immunotech, Франция), регистрировались клетки с участками специфической межнуклеосомной фрагментации ДНК Индукция апоптоза осуществлялась FasL

Детекция апоптоза макрофагов методом Annexin Г проводилась на препаратах клеточной суспензии макрофагов согласно протоколу фирмы-производителя (Annexin V Apoptosis Detection Kit, Caltag, США) Кроме выявленных 4 популяций клеток (живые, собственно некротические, апоптотические и клетки во вторичном некрозе), в качестве дополнительных параметров использовались расчетные показатели «общий некроз» (суммирование вторичного и собственно некроза) и «общая клеточная смерть» (сложение апоптоза и общего некроза)

Статистическая обработка результатов включала методы описательной статистики и проверки статистических гипотез с использованием программ Statplus 2006, Statistics 6 0 и MS Excel 2002 Определяли нормальность распределения, дисперсию, среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего Использовались Т-тест (гетеро- и гомоскедатический), критерий Манна-Уитни, корреляционный анализ {Пирсона или Спирмена), однофакторный дисперсионный анализ, таблицы частот и сопряженности 2x2, критерии ф2 и X с поправкой Йетса Все результаты представлены в виде М±т, где М - среднее значение, т- ошибка среднего, р -уровень значимости

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Осмотр животных

Смерть экспериментальных животных (п=5) наступала через 60 (60%) и 72 часа (40%) после моделирования перитонита, в группах ОК(п=5), ДК1(п=5) и ДК2 (п=5) в течение 72 часов все животные сохраняли жизнеспособность Осмотр животных выявил наличие следующих признаков развития перитонита у экспериментальных мышей (Табл 1) гиподинамия, отказ от пищи и воды, принятие вынужденной позы, увеличение объема живота При вскрытии экспериментальных животных наблюдались парез кишечника, мутный

зловонным выпот в брюшной полости, гиперемия, отсутствие блеска брюшины и наличие фибриновых наложений на ней (р^),001) В группах ДК1 и ДК2 либо совсем не наблюдалось указанных признаков, либо они были слабо выражены и достоверно не различались с группой ОК

Таблица 1

Особенности клинической картины перитонита у животных

Признак ЭГ, п=50 ОК, п=50 ДК 1 (МП Б), п-5 ДК 2 (МПБ+30% глюкоза), п=5

Гиподшпмпя мьпиен 2,58±0,086 **** 0 04±0,028 0 2±0 2 0,2±0,2

Отказ от пищи 1! воды 0,88, *"■"* 0,06 0,06

Принятие вынужденной позы 0 69, * + 0 0

Увеличение объема жниша 0 65 1 ** 0 0

Наличие н чдрамер выпота 1 54±0 119 к»* 0 04±0,028 0,2±0,2 0±0

Парез кишечника 0 40 " 0 0

Гиперемия брюшины 2 28-1=0 1 11, 0,06^0,034 0,2±0,2 0x0

Отеук1Впс бльек! бриншшы 0 69 *■** 0 09 0 12

1 Кишження фпбртм на брюшине 0 54, •и-« 0 0

Примечании В таблице представлены значения Мхш или ф2 Здесь и далее р - уровень значимск/ш по сравнению с контролем (*р0,05, **р^Э,01,***р4)>005, ****р^),001)

Данные осмотра мышей свидетельствуют о развитии острого перитонита у экспериментальной группы животных и, следовательно, адекватности используемой модели

Морфологическая оценка брюшины Гистологические изменения брюшины ЭГ соответствовали характерной картине, наблюдаемой при фибринозно-гнойном перитоните наличие лейкоцитарного инфильтрата и нитей фибрина, утолщение брюшины за счет инфильтрации и расслоения ее соединительно-тканной основы, в группах ОК, ДК1 и ДК2 подобных изменений не наблюдалось Толщина брюшины вместе с ее соединительно-тканной основой составила 12,6±4,00 мкм в группе ОК (п=5), 1 1,1 ±2,2 мкм в ДК1 (п=3), 8,8±2,1 мкм в ДК2 (п=3) и 72,8±11,76 мкм в ЭГ (р<0,001 по сравнению с ОК, п=9) Различи^ в толщине брюшины между группами ДК1, ДК2 и ОК не достоверны

Полученные нами результаты подтвердили адекватность используемой нами модели перитонита, основанной на совместном воздействии убитого теплом золотистого стафилококка и, верояно, смеси стафилококковых энтеротоксинов, поскольку создавались оптимальные условия для токсинообразования и предотвращалась их потеря

Идентификация и жизнеспособность макрофагов Чистота выделенных макрофагов, их жизнеспособность и клеточное\ь представлены в Табл 2 Распределение клеток в обеих группах (п = 48) выглядело следующим образом макрофаги (94,0±0,62%), моноциты (3,2±0,31%), лимфоциты (1,7±0,25%) и небольшой процент нейтрофилов (1,0±0,23%) и эритроцитов (0,08±0,05%)

Таблица 2

Характеристики полученных макрофагов

Жизнеспособность % Клеточностъ кл/мп Чис готт выделения м<1кроф1гов %

Контроль 94 8*0 52 п=25 3 1-10423006 п=эО 94 0±0 78 % п-24

Перитонит 95 0*0,41, п=25 9 6"10ь±292669**** п=50 94 ! ±0 98 % (1-24

Полученные нами результаты свидетельствуют об увеличении абсолютного количества макрофагов при развитии перитонита

Блеббинг макрофагальной мембраны

Одним из важных проявлений действия токсических факторов в очаге воспаления на клетки-мишени и клетки-эффекторы является блеббинг плазматической мембраны Полученные нами данные свидетельствуют о возрастании (р<0,001) числа клеток в состоянии начального (в контрольной группе 15,8±1,12%, в экспериментальной - 30,8±2,21%) и терминального блеббинга (контроль - 4,8±0,72%, перитонит - 25,3* 1,12%) у экспериментальных животных (п=9) по сравнению с контрольными (п=9) Кроме того, наблюдалось значительное увеличение индекса блеббинга макрофагов (от 0,23±0,036 в контроле до 0,46±0,019 при перитоните р<0,001), что свидетельствует о развитии выраженного воспалительного ответа у экспериментальных животных

Небольшая доля блеббингующих макрофагов в контрольной группе животных связана с обратимым, не резко выраженным повреждением макрофагов, в экспериментальной группе увеличение доли клеток в состоянии блеббинга за счет резкого увеличения количества макрофагов в состоянии терминального блеббинга свидетельствует о появлении необратимых изменений, связанных с их гибелью путем апоптоза или некроза

Экспрессия Р2Х7 рецепторов и С038 на макрофагах мышей В контрольной группе иммуноцитохимическая детекция Р2Х7 рецепторов выявила примембранную (оба антигена) и цитоплазматическую (только СР38) локализацию (Рис 1, 2) Развитие острого перитонита характеризовалось увеличением количества С038- и Р2Х7-экспрессирующих макрофагов (от 3,3±0,73% и 3,6±0,41% в контрольной до 12,9±1,23% и 8,6±1,25% в экспериментальной группе, р^),001, п=15) без изменения субклеточной локализации пуринергических рецепторов и с изменением локализации СЭ38 в контрольной группе животных чаше (в 77,7% случаев) наблюдапась

примембранная локализация, при перитоните в 100% случаев - диффузная цитоплазматическая локализация.

Рис. 1, 2. Экспрессия Р2Х7 рецепторов (1,' а - Р2Х7-позитивная, б - Р2Х7-негативная клетка) и СЭ38 (2, С038-позитивные клетки с примембранной - а и диффузной цитоплазматической - б локализацией антигена, а - контроль, б -перитонит) на макрофагах (,\450).

Очевидно, что увеличение количества Р2Х7- и С038-позитивных клеток в очаге воспаления свидетельствует о миграции большого числа моноцитов и их скорой дифференцировки в метаболически активные макрофаги. Интересным аспектом регуляции чувствительности клеток к действию алоптогенных факторов является внутриклеточный уровень НАД+. С учетом доминирующей роли НАД -гликогидролазы/С038 в регуляции гомеостаза НАД4, мы оценили особенности изменения активности этого фермента и степень вовлеченности его в реализацию сигнальной информации от активированных пуринергических рецепторов на макрофагах в норме и при развитии воспаления.

Активность АДФ-рибозилциклазы пернтонеальных макрофагов мышей

Развитие перитонита характеризовалось значительным увеличением АДФ-рибозилциклазной активности С038 в сравнении с контролем (р < 0,001): 0,004±0,0006 ед/мин/мг белка в контрольной (п=8) и 0,020±0,0018 ед/мин/мг белка - в экспериментапьной (п=8) группе. Между АДФ-рибозилциклазной активностью и количеством С038-экспрессирующих макрофагов была обнаружена сильная (г = -0,84) отрицательная корреляция в контрольной группе.

Усиление АДФ-рибозилциклазной активности в экспериментальной группе животных свидетельствует об увеличении выработки цАДФР. мощного кальций-мобилизующего посредника. Можно предположить, что усиление АДФ-рибозилциклазной активности приведет к конкурентнному ингмбированию НАД+-гликогидролазной активности согласно «разделяющему» механизму функционирования С038. В контрольной группе небольшое количество С038-экспрессирующих клеток, вероятно, сопровождается невысокой Н АД'-гликогидролазной активностью и практически полным отсутствием АДФ-рибозилциклазной активности, этим можно объяснить наличие сильной отрицательной корреляции между количеством С038-экслрессируюших клеток и их АДФ-рибозилциклазной активностью.

Известно, что часть клеток, экспрессирующих СЭ38 на поверхности цитоплазматической мембраны, обладает способностью метаболизировать

НАД^ и транспортировать цАДФР внутрь клетки, возможно перемещение CD38 внутрь клетки (A De Flora, 1997) При развитии воспаления изменение субклеточной локализации гликопротеида CD38, вероятно, поставпяет цАДФР ближе к мишеням, минуя этап транспортировки цАДФР внутрь клетки

Насколько велик вклад АДФ-рибозилциклазной активности в регуляцию жизнедеятельности макрофагальных клеток9 Согласно литературным данным, методы оценки функциональной активности фагоцитов разнообразны Наиболее известными и широко применяемыми являются НСТ-тест, люминол-зависимая хемилюминесценция и определение переваривающей способности фагоцитов (В П Мельников, 1991, Р М Хаитов, 1999)

Спонтанная н пндуцнрованная активность макрофагов Для оценки функциональной активности макрофагов мы испочьзовали классический НСТ-тест и оригинальный спектрофлуориметрический метод, основанный на регистрации кинетики аутофлуоресценции макрофагов

Спонтанный и стимулированный зимозаном НСТ-тест (Табт 3) выявил значительное увеличение количества метаболически активных макрофагов при перитоните, при стимуляции стафилококком достоверных различий не наблюдалось, что, вероятно, свидетельствует о сниженной чувствительности к стафилококку пула активированных макрофагов или о резко выраженных свойствах зимозана как их активатора

Габпица3

Спонтанная и стимулированная активность макрофагов оцениваемая спектрофлуориметрическим и НСТ способами______

НСТ-тест %'ед инт Сшмроф ¡уоримьтрпческнГ! UKK0O \ 1 OI И U4

Контроль Перитонит Кон(роль Перитонит

Спонтанная реакция 12,3±| 95 п=9 21 3±3 01* п-9 0 000-t 0 0000 n-7 0 009±0 002 8* n-ft

Стимулированаая зимозаном реакция 30,1*0 98 п=9 43,4±0,84*** * п=9 0 1 I2i 0 0267 n--7 0 1 17-. 0 021 0 n-7

Стимучированаая стафилококком реакция 27 6±0 47, п=9 28 8±0 46 п~9 0 010±0 ooso n-7 0 034+0 009 3 11 = 7

Фагоцитарный резерв при индукции зимозаном 17,8±1,96, п=9 22,1±3,16 п=9 0,112±0 0207 n-7 0 120±0 022 2 n=6

Фагоцитарный резерв при индукции стафилококком 15 2±2 30 п=9 7 4±2 90* п=9 0 052±0 0124 n-7 0 052=t0 019 6 n=6

Активация отдельных клеток при индукции зимозаном 37 1-13,39 п-5 53 0±2 28** п-5 0 983*0 1842 n=7 1 342±0 OSS 1 n=7

Активация отдельных клеток при индукции стафилококком 18 3±1 89 п=5 23 0±2,26* п=5 0 325±0 0486 1 0 372±0 060 n^7 5 n=7

Фагоцитарный резерв макрофагов при воздействии обоих стимуляторов в контрольной группе был приблизительно одинаков, а в экспериментальной группе отмечалась тенденция к нарастанию (зимозан) фагоцитарного резерва или его достоверное снижение (стафилококк) Эти тенденции согласуются с предположением о сниженной чувствительности макрофагов к стафилококку,

вероятно, вследствие истощения сигнальных механизмов, активирующихся при взаимодействии стафилококка с макрофагом При этом, на фоне общего снижения активности макрофагов, через 30 минут после их стимуляции наблюдается активация отдельных клеток, о чем свидетельствует достоверное повышение интенсивности окрашивания формазан-позитивных клеток в экспериментальной группе при их стимуляции зимозаном и стафилококком В условиях воспаления возможна более ранняя стимуляция бактерицидных систем, поэтому на 30-й минуте контакта макрофага со стафилококками могут наблюдаться пишь остаточные явления активации макрофагов, что поставило нас перед необходимостью динамической оценки функциональной активности макрофагов с определением временных параметров их активации

Спектрофлуориметрический метод оценки функциональной активности макрофагов выявил тенденции, сходные с НСТ-тестом в отношении спонтанной, стимулированной зимозаном и стафилококком активности (Табл 3) и фагоцитарного резерва макрофагов Кроме того, отмечено сходство между этими методами и в отношении активации отдельных макрофагов, что наблюдалось при изучении амплитуды флуоресценции интегральных кривых

Чувствительность и точность НСТ-теста составили по 98,2%, чувствительность спектрофлуориметрического метода - 98,6%, точность -98,7%, специфичность обоих методов - 100% Корреляционный анализ выявил сильные и средней силы отрицательные корреляции между спектрофлуориметрическим методом и НСТ-тестом в контрольной группе и появление положительных корреляций - в экспериментальной Обнаружены следующие преимущества использования спектрофлуориметрического метода в сравнении с часто используемым микроскопическим вариантом НСТ-теста отсутствие субъективизма, регистрация максимальной активности в течение заданного временного промежутка, использование временных параметров оценки макрофагальной активности, высокая точность, чувствительность и специфичность, не уступающая ИСТ-тесту

Функциональная активность макрофагов Анализ активности перитонеальных макрофагов выявил достоверное (р < 0,001) повышение максимальной амплитуды интегральной кривой аутофауоресценции в экспериментальной группе (0,142±0,0073, п=7) в сравнении с контрольной (0,014±0,0008 отн ед , п=7), в отношении т/2 наблюдалась обратная зависимость в контрольной (п=7) группе - 539,4±50,19 сек , в экспериментальной (п=7) - 258,1 ± 10,79 сек (р < 0,001) Зарегистрированные изменения характера течения НАД(Ф)Н-ассоциированных процессов в перитонеальных макрофагах, предположительно, не только отражают активацию НАД(Ф)Н-оксидазы, но и могут явиться следствием модуляции экспрессии и активности Р2Х7 рецепторов, АДФ-рибозилциклазы и сопряженных с ними механизмов высвобождения кальция в цитоплазму из внутриклеточных кальциевых депо через активированные рианодиновые рецепторы

Мы обнаружили наличие положительных связей умеренной силы между количеством Р2Х7-экспрессирующих клеток и функциональной активностью макрофагов в контрольной (г = 0, 31) и экспериментальной (г = 0, 63) группах, между АДФ-рибозилциклазной активностью и функциональной активностью макрофагов в экспериментальной группе (г = 0, 58). Отрицательная корреляционная связь между АДФ-рибозилциклазной активностью и функциональной активностью макрофагов в контрольной группе (г = -0, 35), вероятно, свидетельствует о наличии умеренной функциональной активности макрофагов при практически полном отсутствии АДФ-рибозилциклазной активности CD38. Это наблюдение, а также появление отрицательной корреляции между количеством Р2Х7- (г = -0,55), С038-экспрессирующих макрофагов ( г = -0,86) и их АДФ-рибозилциклазной активностью в контроле, не столь выраженное возрастание АДФ-рибозилциклазной активности (в 5 раз в сравнении с контролем) в сравнении с функциональной активностью (в 10 раз в сравнении с контролем), скорее всего, свидетельствуют об участии и других механизмов, кроме активации CD38, в гиперактивации бактерицидных макрофагальных пиримидин-ассоциированных систем. Возможно, участие Р2Х7 рецепторов в регуляции функциональной активности макрофагов может быть как прямым, так и опосредованным (через C.D38).

По нашему мнению, обнаруженные нами закономерности изменения сигнала аутофлуоресценции перитонеальных макрофагов свидетельствуют о развитии важного клеточно-биологического феномена: вовлеченности пуринергической регуляции и сопряженных с нею внутриклеточных механизмов сигнальной трансдукции в формирование ответа макрофагов на действие сигнала, провоцирующего сборку и активацию НАД(Ф)Н-оксидазы.

Апоптоз макрофагов

Известно, что наиболее достоверным из существующих методов детекции апоптоза является TUNEL. Мы зарегистрировали наличие разрывов ДНК (Рис. 3) в 11,0±2,10% (п=8) у интактных животных. Развитие перитонита сопровождалось достоверным (р < 0,05) снижением количества клеток, гибнущих путем апоптоза до 4,9±1,00% (n=l 1).

а 6 а 6 в г

Рис. 3, 4. Детекция апоптоза перитонеальных макрофагов мышей методами TUNEL (3, а - жизнеспособная клетка, б - TUNEL' макрофаг в состоянии апоптоза) и Annexin V (4, а - жизнеспособная клетка, б - клетка в состоянии апоптоза, в - макрофаг в состоянии вторичного некроза, г -собственно некротический макрофаг) (х450).

Метод Аппехш V (Рис 4), кроме детекции клеток в состоянии раннего апоптоза, позволяет выявить клетки, погибшие путем некроза При перитоните количество аннексин+ клеток снизилось в 2 раза (р = 0,001) в сравнении с контролем при резком повышении числа клеток, гибнущих путем некроза число клеток во вторичном некрозе значительно увеличилось в сравнении с контролем (р < 0,05), число собственно некротических клеток увеличилось в 4 раза (р < 0,001) Общее количество клеток в состоянии некроза (контроль -11,2±2,64%, перитонит - 38,7± 2,82%, п = 12, р < 0,001) и общее количество погибших макрофагов (контроль - 19,8± 3,38%, перитонит - 42,5± 2,90%, п = 12, р < 0,001) при перитоните также имели тенденцию к нарастанию

Согласно литературным данным, активные формы кислорода, продуцируемые внутриклеточными ферментами (главным образом макрофагальной НАД(Ф)Н-оксидазой), в зависимости от уровня их продукции, могут самостоятельно индуцировать апоптоз или некроз фагоцита, не исключено непосредственное влияние золотистого стафилококка на развитие макрофагальной смерти

В контрольной группе между функциональной активностью макрофагов и различными видами клеточной смерти обнаружены положительные корреляции, между АДФ-рибозилциклазной активностью макрофагов и различными видами клеточной смерти - отрицательные корреляции, в экспериментальной группе наблюдались положительные корреляции между функциональной активностью макрофагов и различными видами клеточной смерти, практически полное отсутствие корреляций между смертью макрофагов и их АДФ-рибозилциклазной активностью Возникшие связи, в основном, характеризовались умеренной силой сопряжения, а между функциональной активностью макрофагов и клеточной смертью в экспериментальной группе наблюдалась сильная положительная связь (г = 0,70) Корреляция между функциональной макрофагальной активностью и интенсивностью апоптоза свидетельствует о вкладе НАД(Ф)Н-оксидазы в апоптотическую гибель макрофагов На основании корреляционных взаимосвязей можно выявить прямой вклад пиримидин-зависимых ферментов и Р2Х7 рецепторов (путем образования цитолитических пор) в развитии некроза макрофагов при их гиперактивации АДФ-рибозилциклаза, вероятнее всего, воздействует на активность НАД(Ф)Н-оксидазы, не оказывая прямого влияния на апоптоз

На основании полученных результатов можно выстроить следующие схемы путей сигнальной трансдукции В контрольной группе небольшое число Р2Х7- и С038-экспрессирующих макрофагов в популяции индуцируют умеренную активацию макрофагов, что приводит к запуску апоптоза у небольшого количества клеток В экспериментальной группе увеличение количества Р2Х7- и С038-экспрессирующих макрофагов приводит к выраженной активации АДФ-рибозилциклазы, гиперактивации НАД(Ф)Н-

оксидазы макрофагов, резкому повышению количества некротических макрофагов и снижению количества апоптотических макрофагов за счет ингибирования апоптоза, индукции некроза и/или перехода апоптотических магистралей в некротические (вторичный некроз)

Влияние РавЬ на функциональную активность и аноптоз макрофагов Известно, что важным путем, индуцирующим гибель макрофагов при перитоните, альтернативным активационной гибели, является система РавЬ/ РаБЯ РавЬ вызвал однонаправленное усиление АДФ-рибозилциклазной, функциональной активности макрофагов и индукцию апоптоза в обеих группах (Табл 4), что свидетельствует об участии системы РазЬ/ТаБЯ в сигнальных каскадах, приводящих к активации АДФ-рибозилциклазы и бактерицидных систем макрофагов

Таблица 4

Воздействие индуктора апоптоза (PasL, 100 нг/мл) на функциональную активность и численность апоптотических макрофагов in vitro_

АДЧ>- Максимальная 7/2 (сек ) Ariomoi (TUNEL),

piifionijMMiK'iiiia амплитуда %

(ед/шш/мг белка) флуоресценции

Mill стра н.поп

кривом (от i ед)

Исходная f Исходная + Исходный + FasL Исходны + FasL

активность FasL активность FasL уровень и\ровень

Контроль 0 004i=0 00 0,028 0 014±0 000 0 122 539 4±50 1 336 |±3 11 0±2 10 22 5±3

06, п=8 3=0,00 8 ±001 9 з"оз п--8 61

72" п~7 25«" п-7 п-7 п-8

n=8 п=7

Перитонит 0 020±0 00 0 034 0 142=Ю 007 0 649 258 1 =t 10,7 397 5±1 4 9± 1,00*, 19 2±2,

18»***, ±0,00 ** * ±0 04 9**** п=7 45 85 п=11 00'44

п=8 j I u^s n=8 п-7 **** п=7 ' п=7 п-12 ..

____ " '_i_,____i_

Примечание Здесь и lanee *pfi),05, **p;0,0l,***p:£),005, ****pi£>,001, по сравнению с контролем, ^^1,05, ^pO.Ol, it!i!p^>,005, ^""psO.OOl, по сравнению с исходной активностью

Индукция апоптоза при активации макрофагов осуществляется либо путем, альтернативным запуску макрофагальной гибели при выработке ими активных форм кислорода, либо содействуя активационному апоптозу При повышении уровня РаэЬ в межклеточном пространстве наблюдается десенсибилизация активной формы АДФ-рибозилциклазы к РэбЬ, что может быть обусловлено запуском внутриклеточных механизмов сигнальной трансдукции при активации РазИ, вовлекающими АДФ-рибозилциклазу в клетках макрофагальной природы (Рис 5) Мы не нашли в доступной нам литературе упоминаний о подобного рода феномене, который требует дальнейшего изучения Вероятно как прямое, так и косвенное воздействие на НАД(Ф)Н-оксидазную активность макрофагов Возможно участие РавЛ в этом

феномене, не исключена роль механизмов, запускаемых комплексом РавЬ/РаБЯ (сериновые протеиназы, каспазы).

Рис. 5. Схема возможного воздействия системы РазЬ/ТаБЯ (красные стрелки) на АДФ-рибозилциклазную и функциональную активность макрофагов в норме и при перитоните.

На основании полученных нами данных весьма логичным представляется предположение о том. что разные механизмы реализации сигнальной информации в резидентных и активированных макрофагах при воспалении находят свое отражение в генезе гибели этих клеток. Система РавЬ/РавК участвует в сигнальных каскадах, которые вызывают как активацию, так и утилизацию АДФ-рибозилциклазы и бактерицидной системы макрофагов путем апоптоза макрофагов, проявивших свои функции.

Модуляция функциональной активности макрофагов

Известна роль гомеостаза НАД+ и АТФ в функционировании пуринергических рецепторов и пурин-изменяемого гликопротеида СВ38. При повышении содержания НАД+ и АТФ в межклеточном пространстве происходит активация этих механизмов. В то же время, при активации пуринергических механизмов и последующем разрушении макрофагов в межклеточное пространство высвобождется большое количество медиаторов и клеточных метаболитов (НАД4, АТФ, АМФ. цАДФР, АДФР и др.), играющих роль в появлении и усугублении признаков системной воспалительной реакции.

Для экспериментальной проверки гипотез о сопряжении между Р2Х7-рецепторами, С038/АДФ-рибозилциклазы, активности внутриклеточных пиримидин-чувствительных систем и возможном участии в этих механизмах сигнальной трансдукции рианодиновых каналов, исследовалось влияние модуляторов этих механизмов.

Выявлено, что практически все тестированные концентрации лиганда Р2Х7 рецепторов, АТФ (10 мкМ, 100 мкМ, 1 мМ, 10 мМ); лиганда и субстрата С038, НАД+ (10 мкМ, 100 мкМ, 1 мМ концентрации при изучении

функциональной активносш макрофагов и 1 мМ при исследовании СЭ38) оказали однонаправленное усиление активности АДФ-рибозилциклазы (Табл 5, Рис 7, 9) в контроле и при перитоните, но при воздействии АТФ на макрофагальную активность в обеих группах и НАД1" при перитоните наблюдался эффект насыщения (Табл 5, Рис 8,10), вероятно, связанный с десенсибилизацией активных Р2Х7 рецепторов к действию АТФ Это приводит к частичной инактивации НАД(Ф)Н-оксидазы за счет прямого влияния Р2Х7 рецепторов на функциональную активность макрофагов, при этом часть ферментов остается в активном состоянии (вероятно, за счет продолжающегося влияния на них активированных АДФ-рибозилциклаз) Факт большей стимулирующей активности НАД+ в отношении перитонеальных макрофагов интактных животных и активация НАД(Ф)Н-оксидазы экспериментальных животных низкими концентрациями НАД+ достаточно логично объясняются наличием в эффекторных клетках при воспалении пре-активированного фермента, а также, вероятно, возможными долговременными конформационными изменениями молекулы СЭ38 и/или НАД(Ф)Н-оксидазы Не исключена возможность присутствия в составе микроокружения макрофагов при развитии экспериментального воспаления высокого уровня НАД+, высвобождающегося из разрушенных клеток, и развития «десенсибилизации» фермента к действию НАД+ как субстрата и модулятора его активности, что объясняет эффект насыщения в экспериментальной группе Под действием АТФ в экспериментальной группе обнаружена тенденция к укорочению т/2, в контрольной - к удлинению, при воздействии НАД+ наблюдалось обратное в контроле - укорочение т/2, при перитоните -тенденция к удлинению Однофакторный дисперсионный анализ показал, что средние арифметические значения активности ферментов под влиянием различных концентраций АТФ и НАД отличаются в контрольной группе, причем с достоверностью р < 0,001 и р < 0,01 эти различия не счучайны, а связаны с влиянием концентрации АТФ и НАД+ Наиболее выражен эффект у 1 мМ концентрации АТФ в кошрольной и экспериментальной группах, у 1 мМ НАД+ в контрольной и 10 мкМ - в экспериментальной группе

Обнаружение стимутирующего влияния АТФ в отношении обоих ферментов подтверждает наличие функционально активных Р2Х7 рецепторов в клетках моноцитарно-макрофагагтьной природы и их участие в активации АДФ-рибозилциклазы Мы полагаем, что альтернативным механизмом регуляции активности пуринергических рецепторов может являться опосредованное С038 АДФ-рибозилнрование молекулы рецептора, однако это предположение требует дальнейшей экспериментальной проверки

Таблица 5

Влияние модуляторов на параметры АДФ-рибозилциклазной и функциональной активности макрофагов in vitro__

\к~тивность АДФ- |>1|бО}11ЛЦ11КЛЛЗЫ (ед/мин/мг белка) Максимальная амплитуда флуоресценции интегральном кривой (отн ед.) т/2 (сек)

Контроль Перитонит Контроль Перитонит Контроль Перитонит

Исходное значение 0,004+0,0006 , п= 8 0,020+0,0018 *•** п = 8 0,014±0,0008 , п = 7 0,142±0,0073 ****, п = 7 539,4+50,19, п = 7 258,1+10,79* ***, n = 7

+5 мкМ АТФ 0 007±0 0021 ■1 = 8 0,021 ±0,0016 .... п = 9 0,014+0 0035 , п = 8 0,151+0,0095 .... „ = 7 378,6+74,73, п = 8 316,7+29,79, n = 7

+ 10 мкМ АТФ 0 027+0 0032 п = 8 0,030+0,0036 4 п = 8 0,116±00117 '"», п = 8 325,5+27,38" 5, п = 8

+ 100 мкМ АТФ 0 03 1±0 0056 п = 8 0,036±0 0065 « п = 9 0,170+0,0158 п = 8 0,202+0 0296 п = 7 293 3+22 22" • п = 8 269 1+46,67 n = 7

+ 1 мМ АТФ 0 037+0 0059 ч,> 11 = 8 0 049+00121 п = 9 0 260+0 0494 »" п = 7 0 191+00190 » п = 7 242 1+33 55" " п = 7 342 0+29 10* » n = 7

+ 10 нМ АТФ 0,172+0 0361 Kt,n-7 0,073+0,0046 н» п = 7 292,9+37,90" 5,п = 7

+ 100 мкМ сурам ин 0 008+0,0020 п = 8 0 004+0,0009 »» n = 7 0,077+0,0136 "s п = 8 373,8+46,22', п = 8 268,9+24,53, n = 7

+ 100 мкМ оАТФ 0 008±0 0020 п = 8 0 001+0 0003 „Щ( n = g 0,114+0 0083 7 0,035+0 0054 п = 7 363,9+22,22" ,п = 7 355,00+27,76 ! n = 7

+ 10 мкМ НАД 0 137+00157 «» п = 7 0,356+0,0686 п = 7 353,6+39,05" , п = 7 270,1+39 14, n = 7

+ 100 мкМ НАД" 0 170+0,0139 »»,п-7 292,4+3 l,16sf s,n = 7

+ 1 мМ НАД" 0 016+0 0006 "" п = 8 0 058+0 0045 ..«•»»< n = 9 0,237±0,0287 п = 7 0,277+0,0336 «, п - 7 325,6+45,66" п = 7 236,3+23,82, n = 7

+50 мкМ ритмодин 0 138+0,0148 »». „ = 7 0 057+0 0071 .«..ees* n = 7 269,9+24,13" « n = 7 244 9+38 36 n = 7

+ 10 мкМ DPI 0,006+0,0012 "" п = 7 0 062+0 0070 n = 7 446 3+67 74, n- 7 173,9+13 33* .»6S& n = 7

+5 мкМ АТФ 100 нг/мл FasL 0 037+0 0082 0 033+0 0072 , п = 8 0 105+0 0114 «»", п = 7 0,194+0 0154 п = 7 336,4+40,45" , n = 8 330,6+45 18, n = 7

+ 100 мкМ сурамин 100 нг/мл FasL 0,039+0,0118 » п = 8 0 007^0 0018 п _ з 0,055±0,0063 «»« п = 7 0 068+0 0070 »'«, п = 7 410,0+35,14, n = 7 382,1+23,63" « n = 7

+50 мкМ рианодин I00 кг/мл FasL 0 159+0 0076 "« ,1 = 7 0,177+0 0105 ( п = 7 237,4+27,69" »0 = 7 263,3+41,67, n = 7

+ 10 MkM DPI 100 нг/мл FasL 0 144+0,0082 «",п = 7 0,158+00156 , п = 7 345,7+34,20" n = 7 325,9+27 61" n = 7

0.03 0.01

/1

I !

Щ

«МЙМВЗД --1

Контроль

Лная актиимость ы АТс|» 5 глкГч

к ЛТФ 100 мкМ

. ЛТФ 10 мМ1

Рис. 7, 8. Воздействие внеклеточного АТФ на АДФ-рибозилциклазную активность (ед/мин/мг белка) и функциональную активность (отн. ед.) перитонеальных макрофагов мышей.

§5« . .

м исходна* НАД 1 мМ

«ИАД10м> -НАД 100» VI НАД 1 ИМ

Рис. 9, 10. Воздействие внеклеточного НАД" на АДФ-рибозилциклазную активность (ед/мин/мг белка) и функциональную активность (отн.ед.) перитонеальных макрофагов мышей.

Неселективный (сурамин, 100 мкМ) и селективный (оАТФ, 100 мкМ) антагонисты пуринергических рецепторов Р2Х7 подтипа вызвали разнонаправленные изменения АДФ-рибозилциклазной и макрофагальной активности: в контроле наблюдалось усиление активности, при перитоните -выраженное ослабление. В отношении т/2 обнаружена обратная зависимость: в контрольной группе укорочение, в экспериментальной - его удлинение при воздействии обоих блокаторов. Эти результаты свидетельствуют о разнообразном характере воздействия пуринергических антагонистов на неактивные и активные ферменты. Вероятно, для оказания ими ингибирующего эффекта по отношению к Р2Х7 рецепторам, требуется их предварительная активация вследствие конформационных изменений. Так как этот эффект наблюдается не только под влиянием неселективного, но и селективного блокатора Р2Х7 рецепторов, вероятнее всего, активация происходит путем конформационных изменений Р2Х7 рецепторов, а затем под влиянием Р2Х7 каналов последовательно активируются СЭ38 и/или НАД(Ф)Н-оксидаза.

Модулятор рианодиновых каналов, рианодин (50 мкМ) вызвал разнонаправленные изменения макрофагальной активности (ее повышение в контрольной и снижение в экспериментальной группе) при однонаправленном

укорочении 7/2 в обеих группах Это, скорее всего, свидетельствует о неактивном состоянии (закрытый канал) рианодиновых каналов в макрофагах интактных животных Известно, что для связывания лиганда рианодиновыми рецепторами/каналами для оказания им ингибирующего эффекта, каналы должны находиться в открытом состоянии Поэтому логично предположить, что вместо блокирования рианодиновых каналов, рианодин вызывает конформационные изменения неактивных рианодиновых каналов, приводящих к высвобождению кальция из внутриклеточных депо и повышению уровня цитозольного кальция, что приводит к конформационным изменениям НАД(Ф)Н-оксидазы и быстрой генерации активных форм кислорода Преактивация рианодиновых каналов при воспалении, в условиях высокого содержания цАДФР, приводит к быстрому связыванию этих каналов с рианодином, под влиянием которого происходит быстрая инактивация рианодиновых рецепторов/каналов и НАД(Ф)Н-оксидазы

Ингибитор внутриклеточных флавопротеинов, DPI (10 мкМ) вызвал однонаправленные изменения обоих параметров макрофагальной активности снижение максимальной амплитуды и укорочение 7/2 в обеих группах (Табл 5) DPI значительно ингибирует функциональную активность макрофагов, связанную с активностью НАД(Ф)Н-оксидазы, при этом полного ингибирования макрофагальной активности при перитоните не наступило Вероятно, для полной инактивации НАД(Ф)Н-оксидазы требуются более высокие концентрации DPI или более длительный контакт с ним Возможно, что часть активированных молекул НАД(Ф)Н-оксидазы не чувствительна к действию этого ингибитора благодаря определенным конформационным особенностям или внутриклеточной (внутри фагосомы) локализации, что может наблюдаться при фагоцитозе микроорганизмов

При сочетанном воздействии модуляторов с FasL (Табл 5) обнаружено однонаправленное повышение активности ферментов в обеих группах (АТФ, рианодин и DPI + FasL), усиление их в контроле, ослабление при перитоните (сурамин+FasL), все сочетания вызвали укорочение 7/2 в контрольной и удлинение в экспериментальной группе При сочетанном применении АТФ и FasL наблюдаемое повышение активности АДФ-рибозилциклазы, максимальной амплитуды флуоресценции интегральной кривой и 7/2 в большей степени связано с эффектами FasL, чем АТФ В случае сочетанного использования сурамина и FasL, рианодина и FasL, DPI и FasL возникают сложные взаимодействия между этими модуляторами взаимное усиление эффектов в контроле и взаимное ослабление при перитоните при воздействии на АДФ-рибозилциклазу, взаимоослабление в случае параметров макрофагальной активности (сурамин+FasL), при воздействии на макрофагальную активность взаимоусиление эффектов в контроле и частичное ослабление при перитоните (рианодин+FasL), в контрольной группе небольшое усиление эффекта FasL на максимальную амплитуду под действием

DPI с небольшим снижением эффекта FasL на т/2, при перитоните частичное нивелирование эффектов друг друга (DPI+FasL)

Таким образом, регуляция функциональной активности периюнеапьных макрофагов осуществляется с участием сигнального пути, утилизирующего пуринергические рецепторы Р2Х7 подтипа, АДФ-рибозилциклазу/С038 и внутриклеточные кальцивые депо, регулируемые рианодиновыми рецепторами Дальнейшее изучение взаимосвязи пуринергических и кальций-мобилизующих механизмов и фармакологическая коррекция функциональной активности макрофагов с учетом этой взаимосвязи - одно из перспективных направлений современной патофизиологии, клеточной биологии, иммунологии и клинической медицины

ВЫВОДЫ

1 В регуляции функциональной активности и выживаемости резидентных перитонеальных макрофагов существенную роль играют пурииергическая регуляция за счет Р2Х7 подтипа рецепторов, CD38 за счет АДФ-рибозилциклазной активности и внутриклеточные кальциевые депо, регулируемые рианодиновыми рецепторами

2 При развитии острого экспериментального перитонита возрастает количество Р2Х7- и СБ38-экспрессирующих клеток (в 2,4 и 3,9 раза, соответственно) и изменяется субклеточная локализация CD38 в популяции клеток макрофагальной природы в перитонеальной полости

3 При остром экспериментальном перитоните усиление функциональной активности макрофагов (в 10,1 раз по сравнению с контрольной группой) связано с активацией Р2Х7 рецепторов (усиление функциональной активности макрофагов на 29,8% при воздействии 100 мкМ АТФ), увеличением активности С038/АДФ-рибозилциклазы (в 5 раз в сравнении с контролем, усиление макрофагальной активности макрофагов на 60,1% при воздействии 10 мкМ НАД+), рианодиновых рецепторов (снижение функциональной активности макрофагов на 59,7% при воздействии 50 мкМ рианодина)

4 При остром воспалении регистрируется однонаправленное усиление АДФ-рибозилциклазной активности CD38 (5 раз) и максимальной амплитуды флуоресценции интегральной кривой (в 10,1 раз) при укорочении времени достижения полувысоты интегральной кривой кинетики аутофлуоресценции (в 2,1 раза) фагоцитирующих клеток Максимальная амплитуда флуоресценции интегральной кривой при перитоните коррелирует с количеством Р2Х7- (г = 0, 63) и С038-экспрессирующих (г = -0, 46) макрофагов и с АДФ-рибозилциклазной активностью CD38 (г = 0, 58)

5 При перитоните наблюдается усиление макрофагальной смерги за счет увеличения количества собственно некротических макрофагов (в 4,1 раза) и клеток в состоянии вторичного некроза (в 2,2 раза) при снижении числа макрофагов, находящихся в состоянии апоптоза (в 2,3 раза) Индукция некроза перитонеальных макрофагов при воспалении обеспечивается преимущественно

за счет активации Р2Х7 рецепторов (i = 0,62) и активности НАД(Ф)Н-оксидазы (г = 0,66)

6 FasL обладает регуляторной активностью в отношении сигнальных каскадных реакций, сопряженных с активностью С038/АДФ-рибозилциклазы (повышение на 84,3% у резидентных, на 42,6% у активированных макрофагов), НАД(Ф)Н-оксидазы (повышение на 88,8% и 78,1%, соответственно) в перитонеальных макрофагах, в норме и при остром экспериментальном перитоните

7 Функциональная активность резидентных и активированных перитонеальных макрофагов эффективно модулируется агонистами и антагонистами пуринергических рецепторов, АДФ-рибозилциклазы, рианодиновых каналов и НАД(Ф)Н-оксидазы, что может быть основой для разработки метода фармакологической коррекции острого воспаления

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Спектрофлуориметрический метод детекции аутофлуоресценции макрофагов является информативным, чувствительным и специфичным скрининг-тестом для определения модулирующих эффектов фармакологических препаратов in vitro

2 Регистрация количества Р2Х7- и С038-экспрессирующих макрофагов может быть использована в качестве маркера дифференцировки и активации клеток мононуклеарно-макрофагального ряда

3 Флуориметрическое определение АДФ-рибозилциклазной активности может применяться для оценки функциональной активности макрофагов

4 Необходимо учитывать выявленные механизмы сигнальной трансдукции при фармакологической коррекции активности макрофагов при остром воспалении

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Апоптоз и аутофлуоресценция перитонеальных макрофагов при остром перитоните / О Л Лопатина, И А Малиновская, А А Карачева и др // The XII Symposium of the Russia-Japan Medical Exchange, Piogram and Abstracts, September 20-21 - 2005 - P 549-550

2 Аутофлуоресценция и апоптоз перитонеальных макрофагов при остром воспалении /НА Малиновская, О Л Лопатина, А В Степаненко и др // Бюл сиб медицины Приложение 1 Тезисы докладов V Сиб физиологического съезда -2005 -Т4 — С 115-116

3 Малиновская, НА Оценка активности перитонеальных макрофагов методом флуоресцентного анализа / Н А Малиновская, Н В Зайцев, Д И Лалетин // Магер 68-й всероссийской итоговой научно-практической конференции, посвященной 105-летию профессора Гливенко В Ф - 2004 - Т 2 - С 22-23

4 Метаболические осцилляции НАД(Ф)Н и запрограммированная клеточная гибель макрофагов при остром воспалении / О Л Лопатина, Н А Малиновская, Н В Зайцев, Д И Лалетин // Актуальные проблемы патофизиологии, матер XI межвузовской конференции молодых ученых 21-22 апреля 2005 года -2005 - Ч 2 -С 45-46

5 Особенности экспрессии и функциональной активности Р2Х7 рецепторов в клетках костного мозга при действии доксорубицина / Ю А Успенская, А Б Салмина, Н А Малиновская и др // Экспериментальная и

клиническая фармакология - 2007 - Т 70 - №1 - С 52-56 +

6 Роль НАД -гликогидролазы в модуляции функциональной активности перитонеальных макрофагов мышеи при перитоните /НА Малиновская, А Б Салмина, А А Карачева и др // Сиб мед журн - 2007 - №5 - С 3032

7 Роль СД38-ассоциированных сигнальных внутриклеточных механизмов в модуляции функциональной активности перитонеальных макрофагов при перитоните / Н А Малиновская, А Б Салмина, А А Карачева и др //Сиб мед обозрение -2007 - №2 - С 39-43

Список основных сокращений

АДФР - аденозиндифосфатрибоза, АТФ - аденозинтрифосфат, АФК - активные формы кислорода,

ГОУ ВПО - государственное образовательное учреждение высшего

профессионального образования,

ДК 1,2- группы дополнительного контроля 1 и 2,

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

ед инт - единицы интенсивности,

МПБ - мясопептонный бульон,

НАД(Ф)Н - никотинамидадениндинуклеотид (фосфат), восстановленная форма,

НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид,

НГД+ - никотинамидгуаниндинуклеотид,

НСТ - нитросиний тетразолий,

оАТФ - аденозинтрифосфат, окисленная форма,

ОК — группа основного контроля,

отн /уел ед - относительные/условные единицы,

ПИ - пропидия йодид,

ПОЛ - перекисное окисление липидов,

цАДФР - циклическая аденозиндифосфатрибоза,

ЭГ - экспериментальная группа,

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота,

CD - cluster of differentiation,

DPI - дифениленйодониум,

FasL - Fas-лиганд,

FasR - Fas рецептор,

FITC (ФИТЦ) - fluorescein isothiocyanate (флюоресцеинизотиоционат),

PBS - phosphate buffered saline,

St aureus - Staphylococcus aureus,

TdT - Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,

TUNEL - TdT-mediated dUPT nick end labeling,

WGS - Whole Goat Serum

Лицензия ПЛД № 40-12 от 17 12 1999 г Сдано в печать 20 12 07 г Формат 60\84 1/16 Бумага офсетная №1 Печать о<!>сетнзя Объем 1.5 (Ьиз печ л Заказ № 1271 Тираж 100 экз 660049 г Красноярск, ул Вейнбаума, 26 ККМИАЦ ОИиПД