Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Формирование воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни: роль сурфактантного белка D и репрограммирования макрофагов

На правах рукописи ^^

Лямина Светлана Владимировна

ФОРМИРОВАНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО КОМПОНЕНТА В БРОНХО-ЛЕГОЧНОИ СИСТЕМЕ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЛЕГКИХ И ГАСТРОЭЗОФАГЕАЛЬНОП РЕФЛЮКСНОЙ БОЛЕЗНИ: РОЛЬ СУРФАКТАНТНОГО БЕЛКА О И РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ МАКРОФАГОВ

14.03.03 - Патологическая физиология 14.01.04 - Внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

21 МАР 2013

Москва - 2013

005050934

005050934

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

Малышев Игорь Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Маев Игорь Вениаминович

Официальные оппоненты: Решетняк Виталий Кузьмич

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН;

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт

общей патологии и патофизиологии» Российской Академии Медицинских Наук,

отдел клинической патофизиологии, заведующий отделом

Балякин Юрий Викторович

доктор медицинских наук, профессор;

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра общей патологии медико-биологического факультета, заведующий кафедрой Трухманов Александр Сергеевич доктор медицинских наук;

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета, профессор кафедры

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится « Л-^У^^^ОЙ 13 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.003.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской Академии Медицинских Наук, по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИОПП» РАМН

Автореферат разослан «_

¿7/» ^¿¿г^и^г— 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Скуратовская Лариса Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Продолжающийся рост заболеваемости населения болезнями органов дыхания, увеличение инвалидизации и преждевременной смертности у данной категории больных (Министерство здравоохранения и социального развития России, 2009), по-прежнему, определяет важность проблем патогенеза заболеваний легких и поиска новых подходов в их лечении. Наиболее распространенными среди заболеваний легких в настоящее время являются хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), бронхиальная астма (БА), а также отмечается неуклонный рост заболеваемости саркоидозом органов дыхания (СОД) (Министерство здравоохранения и социального развития России, 2009).

Нередкой клинической ситуацией в последние годы является сочетание бронхиальной астмы (БА) и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) (Корабельников Д.И., Чучалин А.Г., 2002; Маев И.В. и др., 2006), что определяет высокую распространенность симптомов ГЭРБ среди больных БА, взаимное влияние этих патологических состояний друг на друга (Корабельников Д.И., Чучалин А.Г., 2002) и рост числа их тяжелых форм. Известно, что ГЭРБ может проявляться не только симптомами поражения пищевода, но также служить причиной различных внепищеводных проявлений (Маев И.В. и др., 2006). БА и ГЭРБ имеют разную этиологию, однако формирование воспаления в бронхо-легочной системе при данных состояниях (Чучалин А.Г., 2005; Хаитов Р.М„ 2006) обусловлено общим патогенетическим компонентом - нарушением иммунного ответа в форме дисбаланса между клеточным Thl и гуморальным Th2 звеньями иммунитета (P. Kidd, 2003). Поэтому дальнейшее изучение клеточных патогенетических механизмов развития данных заболеваний имеет высокую научную и практическую значимость.

Исключительно важную роль в патогенезе заболеваний с воспалительным компонентом в бронхо-легочной системе играют альвеолярные макрофаги Ml и М2 фенотипов, а одним из ключевых регуляторов функций альвеолярных макрофагов является сурфактантный белок D (SP-D) (Gardai S.J., 2003; Gow A.J., 2011). Макрофаги Ml и M2 фенотипов в зависимости от факторов микроокружения способны изменять свой фенотип (Martinez F.O., 2008), т.е. обладают фенотипической пластичностью. Мультифункциональная структура белка позволяет SP-D выступать в качестве бивалентного фактора контроля фенотипа макрофагов и определять двойственность иммунного ответа, обеспечивая возможность активации иммунного ответа провоспалительной или противовоспалительной направленности. Уровень SPD и его олигомерный состав изменяются при различных заболеваниях легких, в связи с чем белок может быть использован не только как маркер повреждения легких, но и как агент воздействия на патогенетические звенья воспалительной реакции.

Несмотря на существующие методы терапии заболеваний бронхо-легочной системы, не всегда достигается необходимый эффект от проводимой терапии и улучшение прогноза пациентов, страдающих заболеваниями с воспалительным компонентом, хотя методы терапии и основываются на общепринятых принципах комплексности и преемственности лечения больных. В настоящее время

3

чрезвычайно актуальным и приоритетным направлением представляется проблема по разработке и внедрению новых персонализированных подходов терапии с учетом фенотипической пластичности макрофагов, позволяющих достичь определенного баланса М1/М2 фенотипов макрофагов через факторы микроокружения и, прежде всего, БР-О, воздействующие на патогенетические звенья воспалительной реакции уже на начальных этапах формирования воспалительной реакции. Цель исследования

Оценка фенотипа альвеолярных макрофагов и изменений их фенотипической пластичности, анализ роли БР-Э при формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, и разработка на этой основе прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования альвеолярных макрофагов. Задачи исследования

1. Изучение фенотипа альвеолярных макрофагов у мышей различных генетических линий - С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с по функциональной (фагоцитарная способность, миграционная активность), секреторной (продукция нитритов, цитокинов) и морфологической (оценка формы клеток) характеристикам, клеточному ответу (стресс-ответ)

2. Определение роли БР-Э с учетом его количественных и олигомерных характеристик в формировании фенотипа макрофагов и в процессе его репрограммирования у экспериментальных животных.

3. Разработка лабораторного прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования альвеолярных макрофагов у экспериментальных животных: мышей различных генетических линий С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с

4. Определение фенотипа и изменений фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов и роли 8Р-0 в бронхо-легочной системе у больных ХОБЛ. Изучение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования у больных ХОБЛ

5. Оценка фенотипа, изменений фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов и роли ЗР-Э в бронхо-легочной системе у больных БА. Определение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования у больных БА.

6. Определение фенотипа и изменений фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов и роли БР-Э в бронхо-легочной системе у больных ГЭРБ и при сочетанной патологии ГЭРБ и БА. Изучение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов у больных с сочетанной патологией ГЭРБ и БА с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования.

7. Изучение фенотипа и изменений фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов и роли БР-О в бронхо-легочной системе у больных саркоидозом органов дыхания. Определение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования у больных

сод.

Научная новизна

Установлены различия функциональных свойств альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов по показателям клеточного ответа с учетом фагоцитарной, миграционной, секреторной активности клеток и морфологических характеристик, позволяющие конкретно охарактеризовать особенности развития иммунного ответа при дисбалансе М1/М2 фенотипов альвеолярных макрофагов.

Определена роль белка БР-Э в формировании фенотипа макрофагов и в процессе их репрограммирования при заболеваниях легких и ГЭРБ.

Впервые разработан лабораторный прототип новой клеточной биотехнологии репрограммирования альвеолярных макрофагов — как новой стратегии управления иммунным ответом при заболеваниях легких, позволяющий использовать ключевую значимость эндогенных факторов микроокружения макрофагов для направленного репрограммирования макрофагов, с целью формирования необходимого «терапевтического» фенотипа макрофагов при заболеваниях с воспалительным компонентом, поражающих бронхо-легочную систему.

Определены функциональные фенотипы альвеолярных макрофагов при наличии воспалительного компонента в бронхо-легочной системе у больных ХОБЛ, СОД БА, ГЭРБ и сочетании БА и ГЭРБ. Впервые оценены изменения фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов у больных при заболеваниях легких с воспалительным компонентом в бронхо-легочной системе и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни с анализом критериев фенотипа макрофагов: содержания поверхностно-клеточных макрофагальных маркеров М1 и М2 фенотипа, секреторной активности по продукции цитокинов и морфологической характеристики.

Впервые установлена целесообразность применения разработанного лабораторного прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования альвеолярных макрофагов, у больных ХОБЛ на 1-Н стадиях заболевания, при впервые выявленном саркоидозе органов дыхания, у пациентов с БА, не получающих базисной терапии ИГКС, при ГЭРБ с целью формирования необходимого «терапевтического» фенотипа макрофагов. Установлено, что фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов у больных при сочетанной патологии ГЭРБ и БА снижена по сравнению с пациентами, страдающими только одним из указанных заболеваний и клинически здоровыми лицами, что значительно затрудняет процесс репрограммирования макрофагов.

Впервые наряду с количественной оценкой содержания ЭР-Э в биологических жидкостях - БАЛЖ и сыворотке крови - пациентов с заболеваниями легких и гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью проведен анализ изменения олигомерного состава сурфактантного белка Б в бронхо-альвеолярной жидкости пациентов (БАЛЖ). Показана роль белка ЭР-О как эндогенного фактора репрограммирования в фенотипировании и изменении фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при заболеваниях ХОБЛ, БА, СОД и ГЭРБ, что позволяет конкретизировать важные клеточные и молекулярные звенья в концепции воспалительного ответа в бронхо-легочной системе и иммунного ответа в целом при данной патологии.

Теоретическая значимость

Установлено влияние белка SP-D на процесс фенотипирования и репрограммирования макрофагов: отсутствие эндогенной продукции SP-D значимо влияет на клеточные ответы макрофагов разных фенотипов, а также существенно изменяет секреторную функцию макрофагов и приводит к формированию изменений в цитокиновом профиле макрофагов Ml и М2 фенотипов.

Смоделирован процесс репрограммирования макрофагов на основе изменения их микроокружения - концентрации сыворотки в культуральной среде, который может явиться основой для разработки экспериментального прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования макрофагов с целью задания им нужного «терапевтического» фенотипа Ml или М2, что позволит воздействовать на самые начальные звенья формирования воспалительной реакции и достичь необходимой сбалансированности всех звеньев иммунного ответа уже на ранних стадиях патологического процесса.

Разработан лабораторный прототип клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов in vitro на основании изменения концентрации сыворотки и, соответственно, SP-D в культуральной среде.

Практическая значимость

Выявленные различия фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов в зависимости от стадии заболеваний и характера проводимого лечения позволяют персонифицировать патогенетический подход к терапии у больных ХОБЛ, БА, СОД, ГЭРБ и сочетании БА и ГЭРБ.

Локальные и системные изменения качественного и количественного состава SP-D при заболеваниях с воспалительным поражением бронхо-легочной системы могут быть использованы в качестве дополнительных критериев диагностики заболеваний и при оценке тяжести клинического течения заболеваний у больных с поражением бронхо-легочной системы.

Использование эндогенного фактора — сурфактантного белка D для направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов дает новые возможности воздействия на патогенетические звенья воспалительной реакции и достижения необходимой сбалансированности М1/М2 фенотипов альвеолярных макрофагов, что может быть использовано в разработке новых схем патогенетической терапии при воспалительных изменениях бронхо-легочной системы.

Прогрессивное снижение уровня SP-D в БАЛЖ при различных стадиях ХОБЛ, при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА, а также его повышение при БА и СОД по сравнению со здоровыми лицами позволяет рассматривать данный критерий как дополнительный диагностический маркер.

Увеличение уровня SP-D в системной циркуляции при ХОБЛ, БА и СОД и зависимость его уровня от тяжести течения заболевания и проводимой терапии также может служить дополнительным диагностическим критерием при верификации диагноза.

Установленные изменения олигомерного состава SP-D в БАЛЖ в зависимости от тяжести заболевания и проводимой терапии также могут быть использованы как в

диагностике, так и в контроле над эффективностью проводимой терапии заболеваний с воспалительным поражением бронхо-легочной системы.

Полученные данные являются основой для разработки и возможности применения в клинической практике клеточной биотехнологии управления иммунным ответом при лечении пациентов с поражением бронхо-легочной системы, имеющим воспалительный компонент, на начальных стадиях заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

1. Альвеолярные макрофаги Ml и М2 фенотипов обладают специфичностью функциональных ответов по секреторной способности, морфологическим характеристиками, фагоцитозу, миграции и клеточным стресс-ответам. Макрофаги Ml фенотипа характеризуются более выраженной фагоцитарной активностью в отношении микроорганизмов (Staphylococcus aureus) по сравнению с М2 фенотипом. Миграционная активность макрофагов М2 фенотипа в условиях аутологичной бронхо-альвеолярной лаважной жидкости выше по сравнению с показателями Ml фенотипа. Макрофаги М2 фенотипа характеризуются большим базальным уровнем белков HSP32 и HSP70 по сравнению с Ml фенотипом.

2. Сурфактантный белок D является эндогенным бивалентным фактором репрограммирования макрофагов. Мономерные формы белка формируют Ml фенотип макрофагов, олигомерные формы (додекамеры) - формируют М2 фенотип. Изменение концентрации сурфактантного белка D в микроокружении макрофагов направленно меняет фенотип макрофагов.

3. Прототип клеточной биотехнологии репрограммирования макрофагов, разработанный на основе использования эндогенных факторов репрограмирования -изменения концентрации SP-D в культуральной среде, обеспечивает возможности воздействия на звенья формирования воспалительной реакции при поражении бронхо-легочной системы.

4. Изменение фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов является патогенетическим звеном в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при ХОБЛ, БА, СОД, ГЭРБ и сочетании БА и ГЭРБ.

5. Изменение олигомерного состава сурфактантного белка D является патогенетическим фактором нарушения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при ХОБЛ, БА, СОД и сочетании БА и ГЭРБ.

Апробация работы

Материал диссертации доложен и обсужден на V, VI, VII Национальных конгрессах терапевтов (Москва, 2010, 2011, 2012), на XXI и XXII конгрессах Европейского респираторного общества (Амстердам, 2011; Вена, 2012), на ежегодной научной сессии Американского общества по экспериментальной медицине и биологии (Сан Диего, США, 2012); на ежегодной научной конференции ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России (Москва, 2011), на конференции молодых ученых федерального государственного бюджетного учреждения «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» Российской академии медицинских наук «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (Москва, 2012), на ежегодном конгрессе ассоциации по изучению структуры и физиологии артерий «Artery 12» (Вена, 2012г.),

7

на межкафедральной конференции лаборатории клеточных биотехнологий НИМСИ ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, кафедр патологической физиологии лечебного факультета, факультетской терапии и профессиональных болезней, пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии, терапии и семейной медицины ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России (Москва, 2012 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 15 статей в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, пяти глав результатов собственных исследований, включающих экспериментальную и клиническую часть исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка, состоящего из 42 отечественных и 164 иностранных источников. Работа содержит 46 таблиц и 24 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа включала два этапа: экспериментальный и клинический (рисунок 1).

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ

II этап: КЛИНИЧЕСКИЙ

■ Определение роли БР-О и фенотипической пластичности АМ в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе:

• Группа больных ХОБЛ

• Группа больных СОД

• Группа больных БА

• Группа больных ГЭРБ

• Группа больных БА+ГЭРБ • Контрольная группа (клинически

здоровые лица)

■ Разработка прототипа клеточной биотехнологии коррекции начального этапа воспаления

Рисунок 1. Дизайн клинико-экспериментального исследования.

Общая характеристика экспериментальных животных

Экспериментальная часть исследования выполнена на культурах альвеолярных макрофагов (АМ), выделенных из бронхо-альвеолярной лаважной жидкости 200 мышей различных генетических линий - С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с, из которых 20 мышей линии С57/ВЬ6 не имели гена сурфактантного белка В (8Р-0).

I этап: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ

■ Изучение фенотипа АМ (мыши С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с): оценка морфологической, секреторной, функциональной характеристик, клеточных ответов М1 и М2 фенотипа

■ АМ (мыши С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с): оценка морфологической, секреторной, функциональной характеристик, клеточных ответов М1 и М2 фенотипа

■ Анализ роли ЭР-Б в процессе фенотипирования АМ и репрограммирования (мыши С57/ВЬ6 с геном ЭР-О и С57/ВЬ6 без гена ЭР-О, мыши линий С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с)

Исследования экспериментального этапа работы выполнялись на базе ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России и Пенсильванского университета, Филадельфия, США. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с положениями приказа №755 МЗ СССР от 12.08.1977, а также с соблюдением правил Надлежащей лабораторной практики (GLP, Good Laboratory Practice).

В соответствии с задачами исследования все животные были разделены на 2 группы: первая группа включала 160 животных - 80 мышей линий C57/BL6 и 80 Balb/c, во вторую группу были включены 40 животных - 20 мышей генетической линии C57/BL6, имеющие ген SP-D, и 20 мышей C57/BL6, лишенных гена SP-D.

Альвеолярные макрофаги мышей первой группы были использованы для изучения фенотипа макрофагов по функциональной (фагоцитарная способность, миграционная активность), секреторной (продукция нитритов, цитокинов), морфологической (оценка формы клеток) характеристикам и клеточному ответу (стресс-ответ), для разработки модели репрограммирования макрофагов.

Альвеолярные макрофаги мышей второй группы - C57/BL6, с геном и без гена SP-D, были использованы для определения роли сурфактантного белка D (SP-D) в формировании фенотипа макрофагов и его репрограммирования.

Первая и вторая группы животных были сопоставимы по возрасту, весу, полу (таблица 1).

Таблица 1

Характеристика групп экспериментальных животных

Группа исследо вания Генетическая линия мышей Цвет Возраст, нед. Вес, г Пол

I C57/BL6, п=80 Черный 8,75±0,09 23,99±0,22 Самцы

Balb/c, п=80 Белый 9,09±0,07 23,90±0,24 Самцы

II C57/BL6 без гена SP-D, п=20 Черный 8,95±0,17 23,55±0,43 Самцы

C57/BL6 с геном SP-D, п=20 Черный 9,00±0,16 23,80±0,47 Самцы

Животные содержались в условиях аккредитованного вивария ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России и вивария Пенсильванского университета (Филадельфия, США), в стандартных условиях, не допускающих попадания патогенных микроорганизмов при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище (Приказ № 63 МЗ СССР от 10.03.1966; «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» за № 1045-73, утвержденные Главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.1973; протокол Комиссии по содержанию

животных (Пенсильванский университет, США)). Перед началом экспериментов все животные в течение 2 часов находились в условиях лаборатории.

Характеристика клинического материала

Исследования клинического этапа работы выполнялись на базе ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, ГКБ №70 Департамента здравоохранения (ДЗ) г. Москвы, ГКБ №11 ДЗ г. Москвы, ФКУЗ «ГКГ МВД России» (г. Москва) и ФБГУ «ЦНИИТ» РАМН (г. Москва). В клиническом этапе исследования были использованы бронхо-альвеолярная лаважная жидкость (БАЛЖ) и сыворотка крови пациентов с ХОБЛ, СОД, БА, ГЭРБ и сочетанной патологией ГЭРБ и БА, а также клинически здоровых лиц.

Использован биологический материал 151 человек, из которых у 132 человек по результатам проведения фибробронхоскопии (ФБС) выявлен воспалительный компонент в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и ГЭРБ, и 19 практически здоровых обследуемых — контрольная группа. В группы исследования вошли 41 пациент с ХОБЛ I, II и III стадии (по 12, 15 и 14 человек, соответственно), 30 пациентов с СОД (СОД впервые выявленный без приема глюкокортикостероидов (ПСС) - 15 человек, СОД рецидивирующий с приемом ГКС - 15 человек), 30 больных БА (интермитгирующая БА без применения ингаляционных ГКС (ИГКС) — 15 человек, персистирующая БА с применением ИГКС -.15 человек), 15 больных ГЭРБ (эрозивная форма) и 16 больных сочетанной патологией ГЭРБ и БА (с базисной терапией ИГКС по поводу БА).

Диагнозы были установлены на основании клинических, инструментальных и лабораторных методов исследования в соответствии с принятыми диагностическими критериями.

Контрольную группу составили 19 клинически здоровых лиц, из которых 9 человек были курящими, 10 - некурящими.

Все обследуемые перед проведением инвазивных процедур ФБС и эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) подписывали форму информированного согласия.

Группы исследования были сопоставимы по полу и возрасту.

Критерии включения в исследование:

В исследование включались лица мужского и женского пола, в возрасте 18-70 лет, с установленными диагнозами: ХОБЛ I-III стадии (в соответствии с рекомендациями «Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких», GOLD, 2007) в стадии ремиссии для I-III стадии и без применения гормональной терапии в течение 6 месяцев до включения в исследование для больных с I и II стадией; впервые выявленным или рецидивирующим СОД (наличие диагностических критериев СОД) без применения гормональной терапии в течение 6 месяцев до включения в исследование при впервые выявленном СОД), некурящие; интермиттирующей и персистирующей БА (в соответствии с рекомендациями Глобальной стратегии лечения и профилактики бронхиальной астмы, GINA, 2007) в стадии ремиссии на момент включения в исследование и без применения гормональной терапии в течение 6 месяцев до включения в исследование для больных интермиттирующей БА, некурящие; 10

эрозивной ГЭРБ (диагностические критерии в соответствии с клиническими рекомендациями Российской гастроэнтерологической ассоциации (РГА)) в стадии ремиссии на момент включения в исследование, некурящие; сочетанной патологией ГЭРБ и Б А (диагностические критерии персистирующей БА (Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы, вША, 2007) и эрозивной ГЭРБ (клинические рекомендации РГА) в стадии ремиссии на момент включения в исследование и применением ИГКС по поводу БА, некурящие; с подтвержденными при ФБС воспалительными изменениями бронхо-легочной системы.

Группу контроля составили клинически здоровые добровольцы в возрасте 18 -70 лет, мужского и женского пола без патологии органов дыхания, ЖКТ и наличия других критериев исключения; не применявшие гормональные препараты в течение 6 месяцев до включения в исследование.

Критерии исключения из участия в исследовании: острый инфаркт миокарда, нестабильная стенокардия, недостаточность кровообращения НБ - III стадии, пароксизмальные нарушения ритма сердца, гипертонические кризы, острое нарушение мозгового кровообращения; дыхательная недостаточность III ст.; онкологические заболевания; туберкулез; острые инфекционные заболевания; заболевания соединительной ткани с изменениями функции дыхательной системы; нарушения свертывающей системы крови; сахарный диабет; беременность или кормление грудью, возраст моложе 18 или старше 70 лет.

Терапия пациентов группы исследования соответствовала клиническим статусам и симптоматике.

• Пациенты группы ХОБЛ с I и II стадиями заболевания получали ингаляционные холинолитики и (52-агонисты короткого и пролонгированного действия, пациенты с III стадией ХОБЛ дополнительно принимали ИГКС (средние дозы 1600-2000 мкг/сут в пересчете на беклометазона дипропионат) и Р2-агонисты пролонгированного действия.

• В группе СОД пациенты с впервые выявленным саркоидозом включались в исследование сразу после верификации диагноза до назначения какой-либо терапии. В группе рецидивирующего саркоидоза органов дыхания пациенты получали системные глюкокортикостероиды - средние дозы в пересчете на преднизолон составляли 5-15 мг/сутки.

• В группе БА объем терапии у пациентов основывался на клиническом течении заболевания и существующих стандартах терапии в зависимости от тяжести течения БА. Пациенты с интермиттирующей астмой получали р2-агонисты короткого и пролонгированного действия, пациенты с бронхиальной астмой персистирующего течения - ингаляционные глюкокортикостероиды в средних дозах 800-1500 мкг в пересчете на беклометазона дипропионат и р2-агонисты пролонгированного действия.

Характеристика больных ХОБЛ, СОД, БА, ГЭРБ и БА, ГЭРБ

и клинически здоровых лиц

\Показатели Группа Клинический диагноз Возраст, лет (М±га) Количество обследованных Значения ОФВ[ (%от должного)

Всего Мужчин Женщин

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)

I стадия ХОБЛ, легкое течение 48,66±3,03 12 7 5 90,75±1,93

II стадия ХОБЛ, средне-тяжелое течение 58,0±1,27 15 11 4 58,37±2,70

III стадия ХОБЛ, тяжелое течение 58,6±2,02 14 12 2 38,62±2,51

Саркоидоз органов дыхания (СОД)

сод ГКС(-) СОД впервые выявленный 44,72±3,89 15 8 7 97,1 ±4,6

сод ГКС(+) сод рецидивирующий 45,10±3,06 15 10 5 108,1 ±4,8

Бронхиальная астма (БА)

БА ИГКС(-) Интермиттирующая БА без приема ИГКС 46,56±4,18 15 9 6 88,47±2,90

БА ИГКС(+) Персистирующая БА с приемом ИГКС 48,24±3,27 15 8 7 70,27±5,23

Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ)

ГЭРБ ГЭРБ 46,41±4,18 15 10 5 101,6±4,81

Сочетанная патология: ГЭРБ + БА

ГЭРБ + БА(ИГКС+) Сочетанная патология ГЭРБ и БА 49,30±3,64 16 12 4 75,6±4,27

Клинически здоровые лица

Здоровые Здоровые курящие 53,34±2,48 9 6 3 101,4±3,06

Здоровые некурящие 51,83±3,52 10 7 3 102,7±4,18

• Больным ГЭРБ проводилась терапия антисекреторными средствами — блокаторами протонной помпы (омепразол, 20-40 мг в сутки).

• При сочетанной патологии БА и ГЭРБ больные получали ИГКС в средних дозах 800-1500 мкг в пересчете на беклометазона дипропионат, р2-агонисты пролонгированного действия (базисная терапия БА), блокаторы протонной помпы (20-40 мг омепразола в сутки) для поддерживающей терапии ГЭРБ.

Методики, использованные при проведении экспериментов

Выделение'ЛМ

AM были выделены из бронхо-альвеолярной лаважной жидкости мышей, больных и клинически здоровых лиц. Для получения БАЛЖ у мышей в легкие через внутритрахеальный катетер 4 раза вводилось по 1 мл стерильного фосфатного буфера с температурой +37°С (Lasbury, М.Е., et al., 2003). AM больных и клинически здоровых лиц были выделены из БАЛЖ, полученной в результате проводимой фибробронхоскопии (Thum Т. et al., 2006). Полученный БАЛЖ центрифугировался (Heraeus-biofuge primo R, Германия) 4 минуты при 1000 об/мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл среды RPMI 1640 с доведением концентрации клеток в питательной среде RPMI 1640 до 1-106/мл (Orosi et al., 1993). Одновременно с подсчетом количества клеток в камере Горяева производилось определение жизнеспособности AM методом исключения красителя трипанового синего.

Культивирование AM

AM в стерильных условиях помещались в лунки стерильных культуральных планшетов из расчета 0,5 млн макрофагов на 1 лунку 48-луночного планшета. Планшеты с AM для культивирования помещались в С02 инкубатор (Sanyo, Япония) при 37°С и 5% С02. Через час культивирования во всех лунках с AM производилась замена среды на следующую комбинацию: 0,5 мл RPMI 1640 + сыворотка (FBS, 10%) + антибиотик (пенициллин / стрептомицин, 100 ед/мл /100 мкг/мл). Планшеты вновь помещались в инкубатор при +37°С и 5% С02.

Определение фагоцитарной способности AM

Фагоцитарная функция макрофагов (концентрация клеток 1 х 10 /мл) оценивалась прямым визуальным подсчетом поглощенных микроорганизмов (инактивированный нагреванием штамм Staphylococcus aureus 9198 с концентрацией клеток 1 х 109/мл) при соотношении макрофагигстафилококк - 1:400; 1:600; 1:800; 1:1000 (оптический микроскоп MICROS МС50, Австрия) через 3 часа после начала культивирования (+37+0,5°С, 5% С02). Рассчитывался процент фагоцитирующих клеток от общего числа AM и среднее количество микробов, захваченных одной клеткой (для фагоцитирующих клеток).

Определение миграционной активности AM

Определение миграционной активности AM основано на принципе метода Бойдена - прохождении лейкоцитов из одной половины камеры с взвесью клеток в другую половину камеры, содержащую хемоатрактант, и разделенных между собой мембранным фильтром. Анализ хемотаксиса проводился непосредственно по методике Neuro Probe Protocol (http://www.neuroprobe.com/protocols/BY312-Boyden.html). В качестве хемоаттрактанта была использована БАЛЖ мышей линий C57/BL6 и Balb/c. Подсчет количества мигрировавших клеток проводился в каждой ячейке под оптическим микроскопом (MICROS МС50, Австрия). Миграционная активность оценивалась по индексу миграции — отношение количества мигрировавших клеток к количеству немигрировавших в одной лунке.

Определение морфологической характеристики AM

Морфологическая характеристика (форма клеток) AM оценивалась методом световой микроскопии (MICROS МС50, Австрия). Подсчет клеток округлой и фибробластоподобной расплющенной формы проводился при помощи модифицированного метода Шиллинга в 100 клетках в 5 полях зрения (Шиллинг В., 1926).

Определение уровня продукции нитритов в культуральной среде

Продукция нитритов AM оценивалась спектрофотометрически по содержанию нитритов в культуральной среде с помощью реакции Грисса (Redente E.F., et al., 2009).

У больных с поражением бронхо-легочной системы и здоровых лиц секреторная активность альвеолярных макрофагов по продукции нитритов не оценивалась, поскольку данный критерий не является достоверным у людей (Schneemann М., 2007; Fang F.C., 2007; Murray P.J., 2011).

Определение уровня цитокинов

Уровень цитокинов в БАЛЖ и в культуральной среде после репрограммирования AM экспериментальных животных, больных и клинически здоровых лиц оценивался методом проточной цитофлуорометрии (Beckman Coulter FC500, США) набором для мультиплексного определения 10 цитокинов (BMS820FF) мыши и набором для мультиплексного определения 11 цитокинов (BMS810FF) человека в соответствии с инструкциями производителя. Анализ полученных данных проводился лицензированной программой разработчика FlowCytomix Pro ver. 3.0.

Оценка содержания стресс-белков HSP32 и HSP70

Содержание стресс-белков HSP32 и HSP70 оценивали методом вестерн-блот анализа. Просмотр результатов осуществляли хемилюминесцентно (ECL+, Amersham Inc., Pittsburgh, РА). Количественное определение проводилось путем денситометрического сканирования экспонированных пленок или направленным просмотром на устройстве Kodak 440 Imaging System (New Haven, CT).

Определение содержания поверхностных макрофагальных маркеров человека

Определение поверхностных макрофагальных маркеров проводилось на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter FC500, США) после исходного выделения AM, а также после процедуры репрограммирования клеток. Использованы моноклональные антитела к CD80, CD25, CD163, CD206 (Beckman Coulter; BD Pharmingen для CD 163) (Martinez F.O., et al., 2008). Подготовка проб макрофагов для анализа проводилась по инструкциям производителя. Оценивали процентное содержание маркеров Ml и М2 фенотипов среди всех выделенных макрофагов у конкретного пациента.

Методика репрограммирования макрофагов (Zhang X., Morrison С., 1993г.)

Методика использована для получения Ml и М2 фенотипов макрофагов у мышей C57/BL6 с геном и без гена SP-D. Первичная культура наивных макрофагов разделялась на три пула. В первый пул (формирование Ml) на 6 часов добавлялся 0,5 нг/мл липополисахарида (ЛПС) (Е. coli 0111:В4, List Biologic Laboratories, Campbell, CA); во второй пул (формирование М2) - 5 нг/мл ЛПС. Третий пул являлся контролем 14

(МО фенотип). Для индукции воспалительного ответа использовали ЛПС в концентрации 500 нг/мл. Активация производилась через 6 часов после добавления программирующих концентраций ЛПС или через 7 часов после посадки на планшеты. Через 24 часа после индукции, среда отбиралась из лунок для анализа.

Лабораторный прототип направленного репрограммнрования AM при изменении концентрации сыворотки в питательной среде

Репрограммирование в Ml фенотип:

AM в среде RPMI 1640 в стерильных условиях помещались в лунки стерильных культуральных планшетов (0,5 млн AM на 1 лунку 48-луночного планшета) и находились в течение 1 часа в инкубаторе (Sanyo) (+37°С, 5% С02). Затем питательная среда во всех лунках заменялась на следующую комбинацию: RPMI 1640, сыворотка FBS (0%), пенициллин / стрептомицин, 100ед/мл/100 мкг/мл. Планшеты помещались в инкубатор (Sanyo) (+37°С, 5% С02). Через 12 часов культивирования в лунки добавлялся ЛПС (500 нг/мл), после чего AM культивировались еще в течение 24 часов. Таким образом, общее время культивирования AM составляет 37 часов. Результаты изменения маркеров фенотипа, функциональных и клеточных ответов оценивались через 24 часа после стимуляции ЛПС.

Репрограммирование в М2 фенотип:

AM в среде RPMI 1640 в стерильных условиях помещались в лунки стерильных культуральных планшетов (0,5 млн AM на 1 лунку 48-луночного планшета) и находились в течение 1 часа в инкубаторе (Sanyo) (+37°С, 5% С02). Затем питательная среда во всех лунках заменялась на следующую комбинацию: RPMI 1640, FBS (40%), пенициллин / стрептомицин, 100ед/мл / 100 мкг/мл. Планшеты помещались в инкубатор (Sanyo) (+37°С, 5% С02). Через 12 часов культивирования в лунки добавлялся ЛПС (500 нг/мл), после чего AM культивировались еще в течение 24 часов. Таким образом, общее время культивирования AM составляет 37 часов. Результаты изменения маркеров фенотипа, функциональных и клеточных ответов оценивались через 24 часа после стимуляции ЛПС.

Репрограммирование AM с использованием сыворотки, не содержащей

SP-D

За 48 часов до проведения эксперимента сыворотка FBS подвергалась предварительной обработке: на 1 мл FBS было добавлено по 20 мкл ЮОмМ СаС12 и по 30 мкл гранул мальтозы (М5895 Sigma, США). Полученная смесь инкубировалась при 4°С в течение 48 часов. Через 48 часов подготовленная смесь центрифугировалась в течение 5 минут при 400g. Полученный супернатант FBS не содержал SP-D и был использован для процедуры репрограммнрования наряду с обычной FBS. Процедура репрограммнрования AM при использовании FBS, содержащей SP-D, и без SP-D проводилась в соответствии с методикой, представленной выше.

Получение сыворотки крови пациентов и здоровых лиц

Венозная кровь пациентов и здоровых лиц забиралась в пробирки VACUETTE® с активатором образования сгустка для получения сыворотки. После забора крови пробирка осторожно однократно переворачивалась и выдерживалась в

15

течение 60 минут в вертикальном положении при комнатной температуре (не ниже +20°С), затем центрифугировалась при 3000 об./мин в течение 15 минут (центрифуга Eppendorf 5415 R, Германия) с последующим отделением сыворотки крови.

Количественное определение уровня SP-D в БАЛЖ и сыворотке человека

Уровень SP-D в БАЛЖ и сыворотке больных и здоровых лиц определялся методом иммуноферментного анализа ELISA (BioVendor). Результаты уровня SP-D в БАЛЖ представлены с учетом фактора разведения, т.е. содержания уровня общего белка в БАЛЖ. Определение уровня общего белка в БАЛЖ проводилось методом Брэдфорда (Beirne Р, et al., 2009).

Определение олигомерных форм SP-D

Определение олигомерного состояния белка SP-D в БАЛЖ и сыворотке крови проводили методом вестерн-блот анализа с использованием трис-ацетатных гелей (Invitrogen NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Gel, cat # EA03752BOX) и антител против SPD. Антитела против SP-D были предоставлены Пенсильванским университетом (США).

Методы статистической обработки

Статистическую обработку полученных числовых результатов выполняли на персональном компьютере с использованием программы Statistica 8.0 for Windows (StatSoft Inc, США). Все выборки проверялись на нормальность распределения. Для определения значимости различий между исследуемыми признаками в выборке с нормальным распределением были использованы параметрические методы статистики (t-критерий Стьюдента). Сравнение средних осуществлялось в несвязанных массивах посредством расчета критерия Стьюдента (Места) методом непрямых разностей (вероятность ошибки р<0,05 оценивалась как значимая, р<0,01 -очень значимая и р<0,001 — максимально значимая). В случаях, когда распределение данных не соответствовало нормальному и в случае анализа малых выборок, для определения статистической значимости различий использовался непараметрический U-тест по методу Манна и Уитни для независимых выборок. Различия считали статистически достоверными при значениях р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фенотипическая активность альвеолярных макрофагов Ml и М2 фенотипов мышей различных генетических линий — C57/BL6 и BALB/c

В результате проведенных экспериментальных исследований выявлены существенные различия функциональных (фагоцитоз, миграционная активность, секреторная способность), клеточных ответов (стресс-ответ) альвеолярных макрофагов мышей Ml и М2 фенотипов.

Более выраженной фагоцитарной активностью в отношении микроорганизмов (на примере Staphylococcus aureus) обладали макрофаги Ml фенотипа по сравнению с М2 фенотипом. При максимальном соотношении 1 AM : 1000 Staphylococcus aureus фагоцитарная активность Ml макрофагов превышала показатели М2 макрофагов более чем в 2 раза. Установлена более выраженная зависимость фагоцитарной

активности Ml фенотипа от концентрации Staphylococcus aureus, чем у М2 фенотипа (рисунок 2).

Рисунок 2. Фагоцитарная активность альвеолярных макрофагов М1 фенотипа (мыши С57/ВЬ6), и макрофагов М2 фенотипа (мыши ВАВЬ/с)

Миграционная способность альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов (мыши С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с) изучалась в отношении наиболее «свойственного» альвеолярным макрофагам хемоаттрактанта - бронхо-апьвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ). Выявлено, что способность макрофагов мигрировать в направлении «собственной» БАЛЖ была существенно выше по сравнению с хемоаттракцией «чужеродной» БАЛЖ (таблица 3).

Таблица 3

Оценка миграционной активности альвеолярных макрофагов М1 фенотипа (мыши С57/ВЬ6) и М2 фенотипа (мыши ВАЬВ/с)

Линия мышей C57/BL6 Линия мышей Balb/c

(Ml макрофаги) (М2 макрофаги)

Индекс миграции, абс. Хемоаттрактант «собственная» БАЛЖ

UOiO,!!1 1,88±0,13 #§

Хемоаттрактант «чужеродная» БАЛЖ

1,12±0,12 0,93±0,12

р<0,05 относительно использования хемоаттрактанта «собственной» БАЛЖ у М1 макрофагов (линия мышей С57/ВЬ6), р<0,001 относительно использования хемоаттрактанта «чужеродной» БАЛЖ у М2 макрофагов (линия мышей

Ва1Ь/с), *р<0,05 относительно использования хемоаттрактанта «чужеродной» БАЛЖ у М1 макрофагов (линия мышей С57/ВЬ6), 5р<0,001 активность макрофагов М2 (линия Ва1Ь/с) относительно активности М1 (линия С57/ВЬ6) при использовании хемоаттрактанта БАЛЖ ВАЬВ/с

Соотношение количества макрофагов и _Staphylococcus aureus_

Показатели миграционной активности макрофагов М2 фенотипа, полученных от мышей ВАЬВ/с, в ответ на собственную БАЛЖ ВАЬВ/с были в 2 раза выше, чем при применении чужеродной БАЛЖ С57/ВЬ6 (1,88+0,13 уб 0,93+0,12, р<0,001), а миграционная активность макрофагов М1 фенотипа мышей С57 в ответ на БАЛЖ С57/ВЬ6 была почти в 1,5 раза выше по сравнению с хемоатгракцией чужеродной БАЛЖ ВАЬВ/с (1,50+0,11 УЭ 1,12+0,12, р<0,05). В случае применения в качестве хемоаттрактанта БАЛЖ ВАЬВ/с, активность макрофагов М2 (линия Ва1Ь/с) была существенно выше, по сравнению с М1 (линия С57/ВЬ6) (1,88+0,13 уб 1,12+0,12, р<0,001). В том же случае, когда в качестве хемоаттрактанта использовался БАЛЖ С57/ВЬ6, активность макрофагов М1 существенно превышала показатели М2 фенотипа (1,50+0,11 уз 0,93+0,12, р<0,001).

Секреторная активность АМ М1 и М2 фенотипов анализировалась по продукции нитритов и цитокинов. Продукция нитритов оценивалась в условиях культуры клеток по показателям культуральной среды с активированными клетками, т.е. среды с макрофагами после добавления ЛПС. Показано, что продукция нитритов АМ мышей С57/ВЬ6 была почти в 2 раза выше по сравнению с АМ мышей линии Ва1Ь/с (8,4 мкМ и 4,3 мкМ, соответственно (рисунок 3).

*р<0,05 относительно продукции нитритов макрофагами мышей линии Ва1Ь/с

Рисунок 3. Продукция нитритов альвеолярными макрофагами М1 фенотипа (мыши С57/ВЬ6) и М2 фенотипа (мыши ВАВЬ/с).

Анализ продукции цитокинов в БАЛЖ мышей линий С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с выявил преобладание цитокинов ТЫ профиля у С57/ВЬ6 и ТИ2 профиля - у Ва1Ь/с (таблица 4). Учитывая, что у животных линии С57/ВЬ6 преобладают макрофаги М1 фенотипа, а у линии Ва1Ь/с - М2 фенотипа, установлено, что макрофаги М1 фенотипа преимущественно секретируют провоспалительные ТЫ цитокины, а макрофаги М2 фенотипа - ТЬ2 противовоспалительные (таблица 4). 18

Уровень цитокинов в БАЛЖ мышей С57/ВЬ6 и ВАЬВ/с

Цитокины Уровень цитокинов в БАЛЖ, пг/мл

Линия мышей С57ЛЗЬ6 (п=80) Линия мышей Ва1Ь/с (п=80)

1Ь-2 (ТЫ) 35,17±3,22 21,74±2,01"

1Ь-5 (ТЬ2) 36,55±5,3 41,81±5,81 '

1Ь-6 (ТЫ) 197,18±25,90 173,14± 17,34

ЕМРу (ТЫ) 69,47±9,23 63,50±8,35

1Ь-4 (ТЬ2) 74,97±7,25 81,64±6,54 '

ТЫР-а(ТЫ) 14,76±1,84 7,93±2,15 "

1Ь-17 (ТЬ1) 18,70±3,55 11,60±8,31

вМ-СЗР (ТЫ) 86,64±6,84 87,37±6,54

»--

р<0,05 относительно линии мышей С57/ВЬ6, р<0,001 относительно линии мышей С57/ВЬ6

Проведенный анализ морфологической характеристики АМ показал, что при стандартных условиях культивирования клеток (10% РВв, +37 С, 5% С02) через 36 часов от момента посадки макрофагов на плашку у С57/ВЬ6 преобладали АМ округлой формы (87,43±2,41%), что соответствует преобладанию М1 фенотипа макрофагов (рисунок 4). У линии Ва1Ь/с — клетки расплющенной фибробластоподобной формы, характерной для М2 фенотипа, составляли 31,42±3,14% (рисунок 4).

округлые М1 клетки расплющенные М2 клетки

Рисунок 4. Форма АМ мышей С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с через 36 часов от начала культивирования в стандартных условиях (10% РВв, 5% С02).

Клеточные ответы АМ М1 и М2 фенотипов анализировались по показателям стресс-ответа — продукции белков теплового шока Н8Р32 и Н8Р70. Установлено значимое превышение показателей базальной продукции Н8Р32 и Н8Р70 у макрофагов М2 фенотипа по сравнению с М1 макрофагами (таблица 5).

Таблица 5

Продукция HSP32 альвеолярными макрофагами Ml и М2 фенотипа

Фенотип макрофагов Продукция HSP32, опт.ед. М+т

М1 макрофаги, исходно (мыши С57/ВЬ6, п=80) 5,41+0,08

М2 макрофаги, исходно (мыши Ва1Ь/с, п=80) 6,74+0,41'

М1 макрофаги, стимулированные ЛПС (мыши С57/В1Д п=80) 9,57+2,46

М2 макрофаги, стимулированные ЛПС (мыши Ва1Ь/с, п=80) 8,48+1,85

р<0,001 относительно линии мышей C57/BL6

Полученные данные определяют специфичность функциональных и клеточных ответов макрофагов разных фенотипов, что позволяет выделить дополнительные признаки, характеризующие особенности развития иммунного ответа в бронхо-легочной системе при воспалительных изменениях.

Определение роли SP-D в формировании фенотипа макрофагов и в процессе его репрограммирования

Показано, что фактор микроокружения альвеолярных макрофагов SP-D является эндогенным фактором репрограммирования. В ходе экспериментов на AM мышей второй группы - C57/BL6 без гена SP-D и с геном SP-D, проводился анализ роли SP-D в формировании фенотипа и его репрограммировании по критериям фенотипа макрофагов: секреторной активности макрофагов (продукция цитокинов), показателям клеточного ответа AM (продукция стресс-белка HSP70).

Анализ продукции цитокинов макрофагами Ml и М2 фенотипа (фенотип AM задан по методике X. Zhang, D.C. Morrison, 1993) у мышей второй группы показал, что SP-D существенным образом влиял на фенотипическую активность AM. Отсутствие гена SP-D не влияло на продукцию Thl цитокинов IL-12 и TNF-a в М2 фенотипе макрофагов, но приводило к увеличению секреции IL-12 и к снижению продукции TNF-a в Ml фенотипе. Отсутствие гена SP-D приводило к увеличению продукции IL-6 в Ml и М2 фенотипе. Выявлена зависимость эффектов SP-D от фенотипа макрофагов и на примере IL-10, и наиболее ярко она проявилась на примере IL-13 - отсутствие SP-D не влияло на продукцию указанных цитокинов AM Ml фенотипа и повышало ее у AM М2 фенотипа. Исключение составил лишь один из исследуемых цитокинов - IFN-y: удаление гена SP-D не приводило к изменению продукции этого цитокина ни в одном из фенотипов макрофагов (таблица 6). Данные о зависимости влияния SP-D на продукцию разных Thl и Th2 цитокинов от фенотипа макрофагов предопределяет и изменение баланса Thl / Th2 цитокинов. В Ml фенотипе отсутствие SP-D оказывает разнонаправленный эффект на различные Thl и Th2 цитокины, а в М2 фенотипе за счет увеличения продукции Th2 цитокинов баланс Thl/Th2 сдвигается в сторону Th2 цитокинов (таблица 6).

Продукция цитокинов ТЫ и ТЬ2 профиля АМ мышей С57/ВЬ6 с геном и без гена 8Р-Э

Цигокины TNF-a, IL-12, INF-Y, IL-6, 1L-10, IL-13,

пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл пг/мл

Линия

мышей,

фенотип AM

C57/BL6 Ml 8714±865"; 51,0±3,01 798±84 31000±2000"1 329±40 6,0±2,0

с геном М2 4412±468 11,0±2,0" 533±44" 21500І20001 780±35"! s.Oii.s1

SP-D,

п=20

C57/BL6 Ml 6142±432"# 70,0±8,0*# 901 ±66"" 43000±2000в# 218±44 4,0±2,3

без гена

SP-D, п=20 М2 3655±275 10,0±2,5 622±77 28000±1000 526±54#" 12,0*2,5™

------—ш--

р<0,001 относительно МО макрофагов линии С57/ВЬ6 с геном 8Р-0; р<0,001

относительно МО макрофагов линии С57/ВЬ6, лишенных гена БР-О;1 р<0,001 относительно

макрофагов линии С57/ВЬ6 без гена 8Р-0

Клеточный ответ AM мышей второй группы оценивался по продукции стресс-белка HSP70. У мышей с геном SP-D после стимуляции макрофагов 500 нг/мл ЛПС (по методике X. Zhang, D.C. Morrison, 1993) и в Ml, и в М2 фенотипах макрофагов отмечалось увеличение синтеза HSP70 (рисунок 5). Содержание HSP70 увеличивалось более, чем в 100 раз.

КОНТРОЛЬ SP-D (-/-)

программирование стимулирование программирование стимулирование

ЛПС, нг/мл 500 нг/мл ЛПС ЛПС, нг/мл 500 нг/мл ЛПС

0 0,5 5,0 МО Ml М2 0 0,5 5,0 МО Ml М2

МО М1 М2 МО N11 М2 МО Ml М2 МО M1 М2

Рисунок 5. Увеличение содержания ШР70 в макрофагах мышей линии С57/ВЬ6, имеющих ген БР-И (контроль), и лишенных гена БРТЗ (5Р-С>(-/-)), МО, М1 и М2 фенотипов в ответ на действие 500 нг/мл ЛПС в течение 24 часов.

При этом было установлено, что предварительное репрограммирование макрофагов на М1 и М2 фенотипы практически не повлияло на способность

нормальных макрофагов индуцировать синтез защитных стресс-белков. Наблюдалась лишь тенденция к снижению ЛПС-индуцированного синтеза НБР70 в М1 фенотипе по сравнению с М2 фенотипом. В макрофагах мышей, лишенных гена БР-О, в ответ на стимуляцию ЛПС (500 нг/мл) синтез ШР70 в М1 фенотипе практически не изменялся (р>0,05), а в М2 фенотипе был более чем в 2 раза увеличен (р<0,001) по сравнению с соответствующим фенотипом макрофагов мышей, генотип которых содержал ген БР-Э. Полученные данные указывают, что БР-Б существенным образом влияет на синтез Н8Р70 в зависимости от фенотипа макрофагов (рисунок 5).

Показана значимая роль БР-Б в процессах фенотипирования и репрограммирования АМ и как фактора микроокружения. Установлено, что в сыворотке, добавляемой в питательную среду при культивировании клеток, содержится БР-Э (рисунок 6).

ІІіІІІІІІІШІІІІЯ^ШІ ■■■■■■мш

: : - : і ■ : і | ■ : И 1 ; ? ? ' і Ы !

и с ч

о

сл о Ш

и О

и с ч ^ + с ч + С ч

СЛ + сл +

т и. к о с; Щ и. о ^

о си —■ п. £ о ю и < ^ о ю и <

сл СО В.

О С

ч

Додекамеры Мономеры

о

х С

+ Ч

И +

СО *

2 I £ Е

о Э

^ <

Рисунок 6. Олигомерный состав БР-О в сыворотке РВБ различных концентраций (0%, 10%, 40%) и в сыворотке РВБ при добавлении активных гранул мальтозы, блокирующих БР-П.

При этом подтверждена гипотеза об изменении количества БР-О в сыворотке соответственно изменению концентрации самой сыворотки. Проведенный анализ качественного состава БР-Б (олигомеры) при изменении концентрации сыворотки показал, что в бессывороточной среде (0% РВБ) БР-Э отсутствует. При увеличении концентрации РВБ до 10% и 40% в питательной среде общее количество 8Р-Б пропорционально возрастало. При увеличении содержания БР-Б его олигомерный состав изменялся пропорционально изменению концентрации белка в питательной среде (рисунок 6, таблица 7). Установлено, что при добавлении к сыворотке активных гранул мальтозы, блокирующих БР-О, белок в сыворотке не определялся (рисунок 6, таблица 7). Полученные данные об изменении содержания и олигомерного состава БР-О в зависимости от концентрации сыворотки позволяют предположить, что увеличение концентрации сыворотки в питательной среде с возросшим количеством мультимерных форм БР-Э способствуют направленному репрограммированию альвеолярных макрофагов в сторону М2 фенотипа, а снижение концентрации сыворотки и уменьшение уровня БР-Э со снижением количества мультимеров - в сторону М1 фенотипа.

Олигомерный состав БР-О при различных концентрациях РВЭ в питательной среде

Олигомерная форма БР-О, опт. ед. Концентрация сыворотки РВБ в питательной среде

100% 40% 10% 0%

Мономеры 18,53±0,06 6,49±0,06 4,69±0,13 -

Додекамеры 9,69±0,08 5,03±0,06 4,20±0,01 -

Мультимеры 6,62 - - -

При оценке роли БР-Б как фактора микроокружения в процессе фенотипирования и репрограммирования макрофагов анализировались

общепринятые критерии фенотипа макрофагов: секреторная способность (продукция нитритов), морфологическая характеристика АМ.

Продукция нитритов АМ мышей генетических линий С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с значимо различалась при культивировании клеток с добавлением стандартной сыворотки и сыворотки, содержащей антитела, блокирующие БР-О. При культивировании АМ с сывороткой, содержащей блокирующие БР-О антитела, продукция нитритов была существенно выше, чем при использовании стандартной сыворотки и составляла 63,13±26,10 мкМ уэ 21,32±0,39 мкМ для 10% концентрации и 27,38±3,28 мкМ уэ 4,96±0,06 для 40% концентрации, соответственно. Аналогичная динамика наблюдалась и у АМ мышей линии Ва1Ь/с: 9,90±0,14 мкМ уб 7,12±0,23 мкМ для 10% концентрации и 5,19±0,96 мкМ ув 1,93±0,45 мкМ для 40% концентрации, соответственно. Полученные данные указывают на то, что в отсутствие БР-Б как фактора микроокружения отмечается тенденция к репрограммированию АМ в сторону М1 фенотипа.

Анализ морфологической характеристики АМ М1 и М2 фенотипов показал, что при культивировании АМ с 10 и 40% сывороткой, содержащей блокирующие БР-Б антитела, процентное содержание клеток расплющенной формы (М2) у АМ мышей линий С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с достоверно снижалось по сравнению с аналогичными концентрациями стандартной сыворотки (таблица 8).

Таким образом, установлено влияние БР- О на процесс фенотипирования и репрограммирования макрофагов: отсутствие эндогенной продукции БР-Б существенно изменяло секреторную функцию макрофагов и приводило к формированию изменений в цитокиновом профиле макрофагов М1 и М2 фенотипов, а также значимо влияло на клеточные ответы макрофагов разных фенотипов. Отсутствие БР-Б в микроокружении макрофагов приводило к изменению фенотипирования макрофагов и их репрограммирования, что подтверждено существенным изменением секреторной способности макрофагов на примере продукции нитритов и выраженным изменением морфологических характеристик клеток в процессе репрограммирования.

Таблица 8

Морфологическая характеристика макрофагов при репрограммировании клеток различными концентрациями сыворотки БВБ

Концентрация РВ8 в питательной среде, % Клетки округлой формы, % Клетки расплющенной формы, %

С57/В1А п=80

0 уб 0+АГблок 90,70±1,11 УЭ 90,90±0,89 9,30±1,11 УБ 9,10±0,89

10 уб 10+АГблок 83,25±3,69 УЭ 89,00±4,60 16,75±3,69 УБ 11,00+4,60*

40 уб 40+АГблок 61,50±5,29 УБ 83,00±3,29 38,50+5,29 УБ 17,00+3,29"

Ва1Ь/с, п=80

0 уб 0+АГблок 89,60±1,02 УБ 90,20±1, 10,40+1,02 УБ 9,80+1,06

10 уб 10+АГблок 67,75±4,03 УБ 78,77±3,92 32,25+4,03 Ув 21,33+3,92"

40 уб 40+АГблок 49,00±7,0 Ув 83,00±1,35 51,00+7,0 уб 17,00+1,35"

*р<0,05 относительно РВБ без добавления блокирующих активных гранул мальтозы (АГблок), "р<0,001 относительно РВ5 без добавления блокирующих активных гранул мальтозы

Разработка лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов мышей генетических линий С57/ВЬ6 и Ва1Ь/с

В основу разработки лабораторного прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования макрофагов положена способность макрофагов существенно модифицировать/репрограммировать свой фенотип в зависимости от микроокружения. Показано, что изменение концентрации сыворотки, добавляемой в питательную среду при культивировании альвеолярных макрофагов, способно вызывать направленное изменение фенотипа клеток в сторону М1 или М2 фенотипа, что подтверждено такими общепринятыми критериями фенотипа, как секреторная активность макрофагов по продукции нитритов и цитокинов и изменением морфологической характеристики клеток.

Выбранная продолжительность культивирования и точки тестирования были определены в ходе пилотных экспериментов. Выбор пониженных и повышенных концентраций РВБ при культивировании макрофагов также проводился экспериментально.

Увеличение продукции нитритов АМ обеих линий животных при снижении концентрации сыворотки РВЭ в культуральной среде с 10% до 0%, что свойственно М1 фенотипу макрофагов. Повышение концентрации РВЗ с 10% до 40% приводило к достоверному снижению продукции нитритов у АМ обеих линий, что свидетельствует о репрограммировании фенотипа АМ в сторону М2 (таблица 9).

Характеристика секреторной функции макрофагов М1 и М2 фенотипов при их репрограммировании различными концентрациями сыворотки

Альвеолярные макрофаги мышей линии С57/ВЬ6, п=80

0% РВ8 5% РВ8 10% РВ8 20% РВ8 30% РВ8 40% РВ8

Продукция нитритов, мкМ 68,00±15,60" 39,42±9,16 21,50±11,4б" 25,39±12,46 7,66±0,64* 5,23±1,15*

Альвеолярные макрофаги мышей линии Ва1Ь/с, п=80

Продукция нитритов, мкМ 13,52±0,94" 8,62±2,84 7,57 ±1,23 5,86±1,76 4,13±0,34* 2,80±1,48"

р<0,05 по сравнению с оценкой аналогичных параметров у линии Ва1Ь/с

"р<0,05 по сравнению с данными для 10% РВ8 для аналогичной линии животных

В процессе репрограммирования альвеолярных макрофагов их секреторная активность также оценивалась по продукции макрофагальных цитокинов в культуральной среде. Показано, что при снижении концентрации сыворотки в культуральной среде до 0% у макрофагов мышей обеих линий преобладает продукция цитокинов ТЫ профиля при снижении уровня антивоспалительных Т112 цитокинов, что характерно для макрофагов М1 фенотипа. Повышение концентрации РВ8 в питательной среде до 40% приводило к достоверному увеличению продукции антивоспалительных цитокинов при снижении уровня провоспалительных цитокинов, что свойственно М2 макрофагам.

Установлено, что снижение концентрации сыворотки в питательной среде при культивировании макрофагов до 0% и повышение ее до 40% достоверно изменяло соотношение клеток округлой и расплющенной формы у обеих линий мышей.

При этом увеличение концентрации ЕВБ до 40% в питательной среде при культивировании макрофагов максимально увеличивало процентное содержание клеток расплющенной формы и снижало количество круглых клеток у обеих линий экспериментальных животных, что позволяет рассматривать концентрацию ЕББ 40% как максимально эффективную для репрограммирования макрофагов в сторону М2 фенотипа. Снижение концентрации РВБ до 0% являлось наиболее эффективной концентраций для репрограммирования макрофагов в сторону М1, поскольку именно на этой концентрации РВ8 были достигнуты максимальные показатели увеличения содержания клеток округлой формы у обеих генетических линий животных (таблица 10).

Эффективность процедуры репрограммирования макрофагов оценивалась по макрофагальному (морфологический) индексу, показано, что увеличение концентрации РВБ в питательной среде с 10% до 40% вызывало прогрессивное достоверное увеличение величины макрофагального индекса в 4,7 раза у мышей линии С57/ВЬб и в 2,8 раза у мышей линии Ва1Ь/с (р<0,001) (таблица 10), а снижение концентрации РВБ в питательной среде до 0% достоверно снижало

25

показатели макрофагального индекса по сравнению с 10% FBS в 1,7 раза у мышей линии C57/BL6 (р<0,05) и в 3,75 раза у мышей линии Balb/c (р<0,001) (таблица 10). Таким образом, проведенный анализ параметров фенотипа альвеолярных макрофагов продемонстрировал эффективность разработанного на основании изменения концентрации сыворотки и, соответственно, SP-D, в ■ культуральной среде лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов in vitro.

Таблица 10

Морфологическая характеристика макрофагов при репрограммировании клеток

различными концентрациями сыворотки FBS

Линия C57/BL6, п=80

Концентрация FBS в Клетки округлой Клетки Макрофагальный

питательной среде, % формы, % расплющенной (морфологический)

формы, % индекс

0 90,80±1,11 1 9Д0±1,11 0,10±0,01

5 91,60±1,36"? 8,40±1,36 0,09±0,02

10 81,43±2,41 13,57±2,41 " 0,17±0,03

20 67,23±0,86 32,77±0,861 0,49±0,02

30 57,41±1,20 42,59±1,20 0,74±0,03

40 55,0±0,55" 45,0±0,55 * 0,81±0,02

Линия Balb/c, п=80

0 89,2± 1,02 і 10,8±1,02 0,12±0,03

5 79,0±0,681 21,0±0,68 0,27±0,02

10 69,58±3,14 31,42±3,14 0,45±0,03

20 57,6±3,65 42,4±3,65 "1 0,74±0,03

30 49,4± 1,72 50,6±1,72 1,02±0,02

40 43,8±1,15 * 56,2±1,15 * 1,28±0,01

р<0,001 по сравнению с равнозначной концентрацией FBS у линии Balb/c * р<0,001 по сравнению с концентрацией FBS 10% для одноименной линии животных "р<0,001 по сравнению с концентрацией FBS 20% для одноименной линии животных

Оценка фенотипической активности альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов и роли вР^ при формировании воспалительного компонента в бронхо-легочиой системе у больных с заболеваниями легких и ГЭРБ

Для решения клинических задач по рациональной терапии больных, особенно с учетом современных позиций развития клеточных технологий, несомненна значимость оценки фенотипа и фенотипической пластичности АМ при хронических заболеваниях с поражением бронхо-легочной системы. Способность АМ быстро изменять свой фенотип играет значимую роль в формировании иммунного ответа. Возможно, именно патологическое снижение пластичности АМ и утрата ими способности адекватно изменять свой фенотип вносит определенный вклад в развитие воспалительных заболеваний. Таким образом, оценка фенотипа макрофагов и их пластичности может обладать диагностическим и прогностическим значением.

Привлечение новых направлений протеиномики в клиническую медицину и определение роли важных белковых фракций в патогенезе заболеваний и их влиянии 26

на течение воспалительных реакций, и, прежде всего, БР-Э как фактора микроокружения альвеолярных, макрофагов при поражении бронхо-легочной системы, несомненно, обеспечит развитие перспективных направлений в патогенетических подходах терапии еще на ранних стадиях развития заболеваний с воспалительными изменениями в бронхо-легочной системе.

Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при ХОБЛ

Изучение фенотипа и оценка изменений фенотипической пластичности АМ у больных ХОБЛ ¡п укго проводились по следующим критериям фенотипа: содержанию на поверхности клеток макрофагальных маркеров М1 и М2 фенотипа, продукции цитокинов (оценка секреторной функции), морфологической характеристике в условиях культуры клеток.

Анализ указанных критериев фенотипа выявил смещение баланса М1/М2 фенотипов АМ в сторону М1 с зависимостью от стадии заболевания. Полученные данные свидетельствовали о нарушении процесса фенотипирования альвеолярных макрофагов и прогрессировании дисбаланса ТЬ1/ТЬ2 ответов с утяжелением заболевания. Показано, что прогрессирование клинического течения заболевания и нарастание обструктивных изменений (ОФВ|) у больных ХОБЛ по сравнению с клинически здоровыми некурящими лицами сопровождается увеличением содержания М1 маркеров С025 (в 1,23 раза при I стадии ХОБЛ ив 1,62 раза при III стадии) и СБ80 (в 3,11 раза при I стадии и в 4,85 раза при III стадии), снижением содержания М2 маркеров СШ63 (в 1,21 раза при I стадии, в 1,45 раза при III стадии) и СВ206 (в 1,54 раза при I стадии, в 1,63 раза при III стадии). Прогрессирование ХОБЛ и нарастание обструктивных изменений сопровождалось возрастанием в культуре клеток количества АМ округлой формы (М1 фенотип) по сравнению с клинически здоровыми лицами - на 6,4% при I стадии и на 5,17% при III стадии; отмечен дисбаланс ТЫ/ТЬ2 цитокинов с выраженным преобладанием продукции ТЫ цитокинов (1Ь-12р70,1Ь-1(3) и снижением - ТЪ2 цитокинов (1Ь-4).

Полученные данные свидетельствуют о выраженном изменении функциональных свойств АМ при ХОБЛ по сравнению с клинически здоровыми лицами, а также о зависимости нарушения функций АМ от стадии заболевания и выраженности обструктивных изменений (ОФВ,). Наиболее значимые нарушения функциональных свойств АМ отмечены на III стадии ХОБЛ.

Анализ фенотипической пластичности АМ и ее изменений у больных с различными стадиями ХОБЛ проводился т укго с помощью лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов, разработанного на экспериментальном этапе работы на основе изменения концентрации стандартной сыворотки и БР-О в культуральной среде по критериям, использованным для исходного определения фенотипа АМ при ХОБЛ.

При снижении концентрации сыворотки РВБ с 10% до 0% в питательной среде фенотип АМ направленно менялся в сторону М1, что подтверждено увеличением содержания маркеров М1 фенотипа: С025 в 1,30 раза при I стадии, в 1,15 раза при II

27

стадии, в 1,17 раза при III стадии (р<0,05), С080 в 1,08 раза при I стадии, 1,32 раза при II стадии, в 1,31 раза при III стадии; и снижением содержания маркеров М2 фенотипа: СИ 163 в 1,19 раз при I стадии, в 1,24 раза при II стадии, в 1,81 раза при III стадии и СШ06 в 1,69 раз при I стадии, 1,28 раз при II. стадии, в 1,42 раза при III стадии; увеличением содержания в культуре клеток АМ округлой формы в 1,05 раз при I стадии, в 1,07 раз при II и III стадиях; преобладанием продукции ТЫ цитокинов при снижении ТЪ2.

Увеличение концентрации сыворотки ИЗБ с 10% до 40% в питательной среде способствовало изменению фенотипа АМ больных ХОБЛ в сторону М2, о чем свидетельствует увеличение содержания поверхностных маркеров М2 фенотипа: СБ 163 в 1,24 раза при I стадии, в 1,46 раз при II стадии и в 1, 07 раза при III стадии и СБ206 в 1,22 раза, в 1,33 раза ив 1, 42 раза при I, II и III стадии, соответственно, снижение содержания М1 маркеров: СЭ25 в 1,45, 1,22 и 1,28 раз при I, II и III стадии; и СБ80 в 1,77, 1,47 и 1,21 раза при I, II и III стадии, соответственно; снижение содержания в культуре клеток АМ округлой формы в 1,15 раз при I стадии, в 1,14 раз при II стадии и в 1,12 раз при III стадии ХОБЛ; снижение уровня цитокинов ТЫ профиля при увеличении продукции ТЬ2 цитокинов.

Фенотипическая пластичность (ФП) АМ при ХОБЛ по содержанию поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и морфологической характеристике оценивалась количественно и представлена как фенотипическая пластичность в сторону М1 (ФП-М1) - при действии фактора репрограммирования макрофагов (0% сыворотки), фенотипическая пластичность в сторону М2 (ФП-М2) - при действии фактора репрограммирования макрофагов (40% сыворотки) и суммарная фенотипическая пластичность (ФПсум) (рисунок 7, 8).

Установлено, что АМ больных ХОБЛ обладают способностью к фенотипической пластичности при применении лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования, при этом способность к фенотипической пластичности зависит от стадии заболевания. Анализ показателей фенотипической пластичности АМ при ХОБЛ показал, что наиболее низкой ФП характеризуются АМ больных III стадией ХОБЛ, принимающих ИГКС.

Таким образом, коррекция дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ при ХОБЛ наиболее целесообразна при I и II стадиях заболевания. Полученные результаты могут явиться основой для персонализации патогенетического подхода терапии у больных при I и II стадиях заболевания ХОБЛ для достижения необходимой сбалансированности М1/М2 фенотипов АМ, что может быть использовано в разработке новых стратегий патогенетической терапии при ХОБЛ.

Рисунок 7. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных ХОБЛ и здоровых лиц в условиях культуры клеток по содержанию поверхностно-клеточных маркеров.

Рисунок 8. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных ХОБЛ (морфологическая характеристика клеток) и клинически здоровых лиц.

Роль сурфактантного белка О (вР-Э) в формировании воспалительного компонента при ХОБЛ

Проведен анализ уровня и олигомерного состава БР-Э в БАЛЖ больных ХОБЛ, а также уровня вР-Б в сыворотке больных. Полученные данные сопоставлены с результатами клинически здоровых лиц. Показано, снижение уровня 8Р-[) в БАЛЖ по мере прогрессирования ХОБЛ и нарастания обструктивных изменений в легких (ОФВ,): с 390,86±69,49 нг/мл при I стадии ХОБЛ до 287,01±53,62 нг/мл при III

стадии ХОБЛ. У больных ХОБЛ уровень БР-О в БАЛЖ был существенно ниже, чем у клинически здоровых некурящих лиц - в 1,4 раза при I стадии ХОБЛ и в 1,8 раза -при III стадии (р<0,05). Тогда как в сыворотке крови уровень БР-О возрастал с увеличением тяжести заболевания - в 1,4-2,6 раз при 1-Ш стадии ХОБЛ, по сравнению с клинически здоровыми некурящими лицами (р>0,05).

Для анализа роли и значения БР-О в патогенезе ХОБЛ оценивался олигомерный состав 8Р-0 в БАЛЖ на различных стадиях заболевания. У клинически здоровых лиц 5Р-Б в БАЛЖ присутствовал в форме мономеров, тримеров и додекамеров (таблица 11).

Таблица 11

Уровень и олигомерный состав БР-О в БАЛЖ при ХОБЛ и у клинически здоровых лиц

Показатели Отсутствие терапии ИГКС | Терапия ИГКС Отсутствие терапии ИГКС

Стадия ХОБЛ Здоровые лица

I (в=12) II (п=15) III (п=14) Здоровые курящие (п=9) Здоровые некурящие (п=10)

Возраст, лет 58,66±1,76 58,87±1,56 58,71±2,92 53,34±2,48 51,83±3,52

ОФВ], % 90,75±1,93 58,37±2,70 38,62±2,51 86,44±2,96 97,63±1,14

БР-Эв БАЛЖ, нг/мл 390,86±40,12* 336,74±17,67" 287,01±18,96" 394,00±27,67 533,20±21,12

ЗР-Бв сыворотке, нг/мл 76,87±20,79 106,61±25,54** 144,52±18,4б" 137,00± 19,24 54,60±4,77

Мономеры ЗР-О, опт.ед. 4,19±0,56 2,86±0,14* 3,26±0,26 4,79±0,31 4,37±0,66

Тримеры ЗР-Д опт.ед. 3,02±0Д4 - - 3,94±0,26 3,65±0,29

Додекамеры 5Р-Д опт.ед. 2,36±0,18* - - 2,95±0,32 3,92±0,28

р<0,05 относительно здоровых некурящих; р<0,001 относительно здоровых некурящих

В зависимости от стадии ХОБЛ олигомерный состав БР-Э в БАЛЖ изменялся: при I стадии отмечены все определяемые формы - мономеры, тримеры и додекамеры; при II и III стадии - только мономерные формы белка (таблица 11).

Полученные данные показали, что при прогрессировании ХОБЛ и нарастании обструктивных изменений (ОФВ]) существенно изменяется не только уровень, но и олигомерный состав ЗР-Э. Установленные изменения олигомерного состава позволяют судить о значимой роли сурфактантного белка Э в фенотипировании альвеолярных макрофагов и тенденции к формированию М1 фенотипа АМ, что было подтверждено при изучении фенотипа АМ при разных стадиях ХОБЛ.

Таким образом, анализ количественного и качественного состава SP-D не только позволяют оценить роль данного белка в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при ХОБЛ, но и может быть использован при диагностике заболевания и его тяжести в качестве дополнительных критериев.

Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при БА

Оценка фенотипа и анализ изменений фенотипической пластичности AM у больных БА in vitro проводились по критериям фенотипа: содержание на поверхности клеток макрофагальных маркеров Ml и М2 фенотипа, продукции цитокинов (оценка секреторной функции), морфологической характеристике в условиях культуры клеток.

Анализ указанных критериев фенотипа и сравнение с клинически здоровыми лицами выявили смещение М1/М2 фенотипов AM при Б А в сторону М2, наиболее выраженное при интермиттирующей БА без применения ИГКС. Наличие дисбаланса М1/М2 фенотипов и его выраженность подтверждены увеличением содержания М2 поверхностных маркеров по сравнению с клинически здоровыми лицами: CD 163 в 2,18 раза при интермиттирующей Б А без применения ИГКС и в 1,99 раз при персистирующей БА(ИГКС+), a CD206 в 1,38 раза у больных БА(ИГКС-) и в 1,32 раза у больных БА(ИГКС+), а так же снижением содержания Ml маркеров: CD25 в 1,37 раза у больных БА(ИГКС-) и в 1,19 раза у больных БА(ИГКС+), повышением CD80 в 1,07 раза в группе БА(ИГКС-) и снижением его в 1,13 раза у больных БА(ИГКС+). Кроме того, по сравнению с клинически здоровыми лицами количество AM округлой формы снижалось в 1,05 раза при БА(ИГКС-) ив 1,21 раза - в группе БА(ИГКС+). Изменения Thl и Th2 цитокинового профиля по сравнению с клинически здоровыми лицами в БАЛЖ при БА носили разнонаправленный характер, но изменения уровня цитокинов определялись степенью тяжести заболевания. Наиболее значимо по сравнению с клинически здоровыми был снижен уровень Thl цитокина IL-12p70 в 2,4 раза в группе БА(ИГКС-) и в 1,8 раза в группе БА (ИГКС+), при этом уровень некоторых других Thl цитокинов был повышен: IL-2 в 9 раз в группе БА(ИГКС-) и в 5,5 раз в группе БА(ИГКС+), a TNF-a в 7 раз в группе БА(ИГКС-) и в 4,2 раза в группе БА(ИГКС+). Выявлены также разнонаправленные изменения уровня Th2 цитокинов при различной тяжести БА. По сравнению с клинически здоровыми лицами установлено повышение уровня IL-4 - в 4 раза в группе БА(ИГКС-) и в 2,5 раза в группе БА(ИГКС+), но при этом уровень IL-10 снижался - в 4 раза в группе БА(ИГКС-) и в 2,14 раза в группе БА(ИГКС+).

Таким образом, выявлено наличие нарушений функциональной способности AM у больных БА, наиболее выраженное у лиц с интермиттирующей БА, не принимавших ИГКС, что, вероятно, и объясняет дальнейшее прогрессирование заболевания и зачастую отсутствие контроля над течением БА.

Анализ ФП AM и ее изменений у больных с БА проводился in vitro с помощью лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов, разработанного на экспериментальном этапе работы на основе изменения концентрации стандартной

31

сыворотки и БР-О в культуральной среде по критериям, использованным для исходного определения фенотипа АМ.

Снижение концентрации сыворотки РВБ с 10% до 0% в питательной среде способствовало направленному изменению фенотипа АМ в группе БА(ИГКС-) в сторону М1, что подтверждено увеличением содержания маркеров С025 и СЭ80 в 1,30 и 1,36 раз, соответственно, снижением содержания М1 маркеров СЭ25 и СБ80 в 1,11 и 1,77 раз, соответственно; увеличением количества АМ округлой формы в культуре клеток в 1,2 раза, а также возрастанием продукции цитокинов ТЫ профиля.

У больных БА(ИГКС+) снижение концентрации сыворотки РВБ с 10% до 0% изменяло фенотип АМ в сторону М2, что подтверждено снижением содержания М1 маркеров: СИ25 и С080 в 1,44 и 1,29 раз, соответственно, увеличением М2 маркеров С0163 и С0206 в 1,32, 1,27 раз, соответственно; снижением количества АМ округлой формы в культуре клеток в 1,17 раза; возрастанием продукции Т1г2 цитокинов.

При оценке макрофагальных маркеров на поверхности АМ у больных БА с интермиттирующей формой без применения ИГКС увеличение концентрации сыворотки РВБ с 10% до 40% сопровождалось увеличением содержания маркеров М2 фенотипа: СО 163 в 1,49 раз, С0206 в 1,40 раза, и снижением маркеров М1 фенотипа: С025 в 1,11 и СБ80 в 1,77. Кроме того, снижение количества АМ округлой формы в культуре клеток в 1,15 раза и увеличение продукции цитокинов ТЬ2 профиля также подтверждают направленность процесса репрограммирования в сторону М2 фенотипа.

При персистирующей БА с применением ИГКС повышение концентрации сыворотки РВБ с 10% до 40% приводило к увеличению содержания М1 маркеров: СБ25 в 1,32 раза, СЭ80 в 1,48 раза, а также снижению содержания М2 маркеров: С0163 в 1,37 раза и СЭ206 в 1,12 раза. Количество АМ округлой формы в культуре клеток возрастало в 1,27 раза, увеличивалась продукция ТЫ цитокинов. Полученные данные подтверждают репрограммирование АМ при персистирующей БА с применением ИГКС в сторону М1 фенотипа.

Изменения фенотипической пластичности АМ при БА оценивались количественно по изменению содержания поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и формы клеток при действии различных концентраций сыворотки (рисунок 9, 10).

В результате установлено, что независимо от проводимой терапии и тяжести течения БА АМ обладают способностью к ФП. Показатели суммарной ФП АМ больных интермиттирующей БА, не получавших ИГКС, были сопоставимы с показателями клинически здоровых лиц, за исключением маркера С080.

С080

147,2

-36,6

БА(ИГКС.)

С0206

70,8

г ' '

-43,6

БА(ИГКС->

С0163

45,5

БА(ИГКС+) Заорояые некурящие «ФП-М1 ЯФП-М2 ЫФПсум

-59.5

БА(ИГКС+) Здоровые некурящие есфП-МІ ЯФП-М2 афПсум

"31 БА(ИГКС+) ЙФП-М1

-23

БА(ИГКС-)

-26,8 -26,4

БА(ИГКС+) Здоровые некурящие ЙФП-М1 ЯФП-М2 аФПсум

Рисунок 9. Фенотипическая пластичность по содержанию поверхностно-клеточных маркеров альвеолярных макрофагов больных БА и клинически здоровых лиц в условиях культуры клеток.

Рисунок 10. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных БА и клинически здоровых лиц (морфологическая характеристика клеток).

При БА с применением ИГКС показатели ФП были инвертированы по сравнению с группой БА(ИГКС-) и здоровыми лицами, что свидетельствует о возможном влиянии ИГКС на ФП, однако при этом не выявлено значимого влияния применения ИГКС на исходные характеристики фенотипа. Выявленные нарушения функциональной способности АМ при БА, наиболее выраженные при интермиттирующей БА без приема ИГКС, а также показатели ФП данной категории лиц позволяют определить целесообразность персонализированного подхода к патогенетической терапии у данной категории больных БА и применение у них биотехнологии направленного репрограммирования АМ с целью направленной коррекции баланса М1/М2 фенотипов АМ.

Роль сурфактантного белка О (вР-О) в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе у больных БА

Проведен анализ уровня и олигомерного состава БР-Э в БАЛЖ больных БА, а также уровня ЗР-Э в сыворотке больных. Полученные данные сопоставлены с результатами клинически здоровых лиц. Показано, что уровень 8Р-0 в БАЛЖ превышает показатели клинически здоровых лиц, при этом более высокие значения БР-О в БАЛЖ характерны для персистирующей БА с применением ИГКС (таблица 12). Содержание БР-Б в системной циркуляции при БА любой степени тяжести и независимо от применения ИГКС было существенно повышено по сравнению со здоровыми лицами (таблица 12).

Выявлена зависимость изменения олигомерного состава ЗР-Б в БАЛЖ при БА от тяжести течения и проводимой терапии ИГКС (таблица 12).Установлено, что при более тяжелом течении БА с применением ИГКС по сравнению со здоровыми лицами значимо повышается уровень 8Р-0, при этом его качественный состав характеризуется изменением соотношения олигомерных форм белка относительно здоровых. При более легком течении БА - интермиттирующем, без приема ИГКС, уровень БР-О в БАЛЖ также увеличен по сравнению с клинически здоровыми лицами, однако в БАЛЖ белок присутствует только в форме мономеров, что является значимым фактором, влияющим на взаимодействие БР-Б с АМ на уровне рецепторов, поскольку предполагает нарушение процесса фенотипирования альвеолярных макрофагов и формирование более выраженного дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ у данной категории больных.

Таблица 12

Уровень и олигомерный состав 8Р-Б в БАЛЖ больных БА и здоровых лиц

Показатели Интермиттирующая БА без ИГКС, п=15 Персистирующая Б А с ИГКС, п=15 Здоровые некурящие, п=10

Возраст, лет 46,56±4,18 48,24±3,89 51,83±3,52

ОФВ,, %от должного 88,47±2,90 70,27±5,23 97,63±1,14

ЗР-О в БАЛЖ, нг/мл 671,1±52,05 748,32±69,25" 533,20±21,12

БР-Б в сыворотке, нг/мл 68,56±7,07' 71,21±6,97" 54,60±4,77

Мономеры БР-Э, опт.ед. 5,20+0,36 4,99+0,17 4,37±0,66

Тримеры ЭР-Э, опт.ед. - 4,92+0, 27' 3,65±0,29

Додекамеры БР-О, опт.ед. • 4,38+0,22 3,92±0,28

----л---

р<0,05 относительно здоровых некурящих, р<0,001 относительно здоровых некурящих

Изменения фенотипа и феиотипической пластичности альвеолярных макрофагов при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА

Изучение фенотипа и оценка изменений феиотипической пластичности АМ у больных ГЭРБ и сочетанием ГЭРБ и БА т уйго проводилось по следующим критериям фенотипа: содержание на поверхности клеток макрофагальных маркеров М1 и М2 фенотипа, продукция цитокинов (оценка секреторной функции), морфологическая характеристика в условиях культуры клеток.

Выявлено смещение баланса М1/М2 фенотипов АМ в сторону М1 фенотипа при ГЭРБ. По сравнению с клинически здоровыми лицами на АМ при ГЭРБ существенно возрастало содержание маркеров М1 фенотипа С025 (в 1,08 раз) и С080 (в 3,25), снижалось содержание М2 маркера СБ206 (в 1,21 раз); в БАЛЖ больных ГЭРБ по сравнению со здоровыми был преимущественно увеличен уровень ТЫ цитокинов - наиболее значимо - 1Ь-6 (в 28 раз) и 1Ь-1[5 (в 14,4 раза). При этом выраженных различий по количеству АМ округлой формы в культуре клеток у больных ГЭРБ по сравнению со здоровыми не выявлено (79,00±3,61% УБ 81,67±0,58%, соответственно), что может быть объяснено частичным «отмыванием» фенотипа АМ при культивировании.

Дисбаланс М1/М2 фенотипов АМ выявлен также при сочетании ГЭРБ и БА: по сравнению с клинически здоровыми лицами содержание АМ, имеющих маркеры М1 фенотипа, возрастало на 16%, маркеры М2 фенотипа - на 79%; в культуре клеток в 1,8 раза возрастал процент АМ расплющенной формы (М2 фенотип). При сочетании ГЭРБ и БА по сравнению с клинически здоровыми уровень ТЫ цитокинов в БАЛЖ преимущественно снижался, за исключением 1Ь-2 (был повышен в 1,71 раза) и 1Ь-6 (повышен в 6,8 раз), а изменения ТЪ2 цитокинов были разнонаправленными -возрастал уровень 1Ь-5 (в 3,42 раза), но снижался 1Ь-4 (в 1,4 раза) и 1Ь-10 (в 2,23 раза). Сравнение основных критериев фенотипа АМ при сочетанной патологии с больными ГЭРБ и больными БА показал, что присоединение ГЭРБ достоверно смещает фенотип макрофагов у пациентов с БА в сторону М1 (содержание С025 и С080 на АМ возрастает в 1,08 и 1,93 раза, соответственно). Эти данные позволяют предположить, что более тяжёлое течение БА при её сочетании с ГЭРБ может быть обусловлено именно сдвигом фенотипа макрофагов в сторону провоспалительного М1 фенотипа, и, соответственно, усилением воспаления в бронхо-легочной системе.

Анализ ФП АМ и ее изменений у больных ГЭРБ и сочетанием ГЭРБ и БА проводился по критериям фенотипа АМ ш укго с помощью разработанного экспериментально лабораторного прототипа направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов, на основе изменения концентрации стандартной сыворотки и 5Р-Э в культуральной среде.

На АМ больных ГЭРБ при снижении концентрации сыворотки РВБ с 10% до 0% в питательной среде возрастало содержание маркеров М1 фенотипа (С025 - в 1,19 раз, СБ80 - в 1,46 раз), снижалось содержание маркеров М2 фенотипа (С0163 - в 1,63 раз, С0206 — в 1,32 раза); количество АМ округлой формы в культуре клеток возрастало на 8,86%; увеличивалась продукция цитокинов ТЫ профиля, что характерно для приобретения клетками М1 фенотипа.

Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% в питательной среде способствовало направленному репрограммированию АМ больных ГЭРБ в сторону М2 фенотипа, что подтверждено увеличением содержания поверхностных макрофагальных маркеров М2 фенотипа (CD 163 в 1,77 раз, CD206 в 1,63 раза), снижением - Ml фенотипа (CD25 в 1,29 раза, CD80 в 2,17 раза), преимущественным возрастанием продукции цитокинов Th2 профиля и увеличением количества АМ расплющенной формы в культуре клеток на 46,04%.

На АМ больных с сочетанием ГЭРБ и БА снижение концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% приводило к значимому возрастанию содержания М2 маркеров (CD163 в 1,26 раза, CD206 в 1,23 раза), содержание Ml маркеров изменялось разнонаправленно - содержание маркера CD25 было снижено в 1,08 раза, CD80 -увеличено в 1,37 раза. Полученные данные характерны для приобретения AM М2 фенотипа макрофагов. Также выявлено преимущественно увеличение продукции цитокинов Th2 профиля, однако количество АМ расплющенной формы в культуре клеток практически не изменялось (65,00+3,46% vs 65,66+2,72%).

Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% способствовало in vitro увеличению содержания на АМ при сочетании ГЭРБ и Б А маркеров Ml фенотипа (CD25 в 1,13 раз, CD80 в 1,19 раз), снижению - М2 фенотипа (CD163 в 1,3 раза, CD206 в 1,14 раза), увеличивалось количество АМ округлой формы в культуре клеток (на 17,3%); возрастала продукция цитокинов Thl, т.е. АМ направленно приобретали М1 фенотип.

Изменения ФП АМ при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА оценивались количественно по изменению содержания поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и формы клеток при действии различных концентраций сыворотки (рисунок 11,12). _

ГЭРБ ГЭРБ и БА(ИПСС+) Здоровые

БЛСИГКС+) некурящие

«ФП-М1 ИФП-М2 «ФПсуы

ГЭРБ ГЭРБ и _31 ЕАСИГКО) Здоровые БА(ИГКС+) некурящие

ЙФП-М1 ■ ОП-М2 йФПсум

______-26.5 -26,4

-39,8 ГЭРБ ГЭРБ и БАШГКС-) Здоровые БА(ИГКС+) некурящие _аФП-Ml ИФП-Ш афПсум

-10,8

ГЭРБ ГЭРБ а БАСИПСС+Г^ Здоровые

БА(ИГКС+) " ' некурящие

«ФП-М1 ИФП-М2 ЫФПсум

Рисунок 11. Фенотипическая пластичность по содержанию поверхностно-клеточных маркеров АМ при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА в условиях культуры клеток.

Рисунок 12. Фенотипическая пластичность AM по содержанию клеток округлой формы при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА.

В сравнении с клинически здоровыми лицами и больными ГЭРБ при сочетанной патологии выявлена инверсия показателей ФП макрофагов, а также наиболее низкие показатели суммарной ФП. Совокупность полученных данных ограничивает возможность применения технологии направленного репрограммирования AM при сочетанной патологии ГЭРБ и БА. При анализе поверхностных маркеров фенотипа установлено, что максимальной ФП в сторону М2 фенотипа обладали AM при ГЭРБ, что, учитывая выраженность дисбаланса М1/М2 фенотипов при данной нозологии, позволяет использовать направленное репрограммирование AM при ГЭРБ как один из вариантов персонифицированного подхода к патогенетической терапии для коррекции воспалительных изменений в бронхо-легочной системе.

Роль сурфактантного белка D (SP-D) в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА

Выполнена оценка уровня и олигомерного состава сурфактантного белка D в БАЛЖ и уровня SP-D в сыворотке больных ГЭРБ и сочетанной патологией ГЭРБ и БА. Проведено сопоставление полученных данных с показателями клинически здоровых лиц.

По сравнению со здоровыми лицами наиболее снижен уровень SP-D в БАЛЖ при ГЭРБ (в 3,4 раза), при сочетанной патологии уровень SP-D в БАЛЖ был ниже в 1,3 раза. Кроме того, уровень SP-D в БАЛЖ при сочетанной патологии был в 2,7 раза выше, чем при ГЭРБ, но в 1,8 раза ниже, чем при БА(ИГКС+). Полученные данные позволяют предположить, что присоединение ГЭРБ к БА приводит к снижению уровня SP-D в БАЛЖ. Значимых изменений уровня SP-D в системной циркуляции при ГЭРБ и сочетанной патологии по сравнению с клинически здоровыми лицами не выявлено (р>0,05) (таблица 13).

Таблица 13

Уровень и олигомерный состав БР-О в БАЛЖ при ГЭРБ и сочетанной патологии

Показатели ГЭРБ, п=15 Сочетание ГЭРБ и БА с применением ИГКС, п=16 Персистирующая БАс применением ИГКС, п=15 Здоровые некурящие, п=10

Возраст, лет 46,41±4,18 49,30±3,64 48,24±3,89 51,83±3,52

БР-О в БАЛЖ, нг/мл 155,83±18,13 414,72±50,22 748,32±69,25" 533,20±21,12

БР-Эв сыворотке, нг/мл 49,05±6,00 57,92±7,79 71,21±6,97" 54,60±4,77

Мономеры БР-опт.ед. 5,93±0,12 5,41±0,06 4,99+0,17 4,37±0,66

Тримеры БР-О, опт.ед. - - 4,92+0,27' 3,65±0,29

Додекамеры БР-Б, опт.ед. - ■ 4,38+0,22 3,92±0,28

р<0,05, р<0,001 относительно здоровых некурящих

Выявлены существенные нарушения олигомерного состава ЗР-Э в БАЛЖ при ГЭРБ и сочетанной патологии по сравнению со здоровыми лицами - в БАЛЖ при данных нозологиях отсутствуют тримерные и додекамерные формы белка. Анализ распределения олигомерных форм БР-Б в БАЛЖ показал, что присоединение ГЭРБ к БА приводит к исчезновению в БАЛЖ тримерных и додекамерных форм БР-О по сравнению с БА (таблица 13). Выраженное изменение олигомерного состава БР-И и его уровня при ГЭРБ и сочетанной патологии предопределяют изменения взаимодействия белка с АМ на рецепторном уровне и провоспалительную направленность его действия, что было подтверждено при исходном определении фенотипов АМ и формировании дисбаланса М1/М2 фенотипов при ГЭРБ и сочетанной патологии.

Изменения фенотипа и феиотипической пластичности альвеолярных макрофагов при СОД

Фенотип и изменения ФП АМ больных СОД различного течения (впервые выявленный и рецидивирущий СОД) ¡п укго оценивались по критериям фенотипа: содержание на поверхности АМ макрофагальных маркеров, свойственных М1 или М2 фенотипу, секреторная способность АМ (продукция цитокинов), морфологическая характеристика. . -

Установлено, что выраженность дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ по сравнению с клинически здоровыми лицами определялась характером течения заболевания и проводимой терапией. Впервые выявленный СОД, нелеченный ГКС,

характеризовался в 4 раза большим преобладанием альвеолярных макрофагов, имеющих маркеры М1 фенотипа (СБ80 18,84±3,61% 4,68±0,96%), а рецидивирующий СОД с применением ГКС - в 3,5 раза (С080 16,72±3,11% уз 4,68±0,96%) по сравнению с клинически здоровыми лицами. Содержание М2 маркеров СО 163 и СИ206 на АМ больных СОД по сравнению с клинически здоровыми лицами также было изменено, однако значимым было изменение только содержания С0206 и только в группе впервые выявленного СОД — снижение по сравнению со здоровыми лицами составило 1,7 раза (р<0,05), при этом содержание СО 163 относительно группы контроля практически не изменялось (22,79±11,20% уэ 23,12±3,87%). При рецидивирующем СОД содержание М2 маркеров по сравнению с клинически здоровыми лицами существенно не изменялось (р>0,05). Анализ морфологической характеристики АМ показал, что при впервые выявленном СОД 77,56±4,71% клеток имели округлую форму, при рецидивирующем СОД -72,57±7,76%, что однако значимо не отличалось от клинически здоровых лиц (81,67±0,58%). При этом независимо от течения заболевания в БАЛЖ больных выявлен выраженный дисбаланс ТЫ/ТЬ2 цитокинов. При СОД по сравнению с клинически здоровыми лицами в БАЛЖ достоверно снижался уровень таких ТЫ цитокинов, как ПЧР-у и 1Ь-8, но в то же время возрастал уровень других ТЫ цитокинов - 1Ь-6 и ЮТ-а. Независимо от течения СОД в БАЛЖ больных был снижен уровень ТЬ2 цитокинов - 1Ь-10,1Ь-4 и 1Ь-5.

Анализ ФП АМ и ее изменений у больных СОД проводился по критериям фенотипа АМ т укго с помощью экспериментально разработанного лабораторного прототипа биотехнологии направленного репрограммирования АМ, на основе изменения концентрации стандартной сыворотки и БР-Э в культуральной среде.

Показано, что при впервые выявленном СОД снижение концентрации сыворотки РВБ с 10% до 0% способствовало репрограммированию АМ в сторону М1 фенотипа, что подтверждает увеличение содержания М1 маркеров С025 (в 1,47 раз) и С080 (в 1,52 раза) и снижение М2 маркеров СЭ163 (в 1,22 раза) и С0206 (в 1,36 раза); увеличение продукции ТЫ цитокинов АМ; достоверное увеличение в 1,15 раз количества АМ округлой формы в культуре клеток.

Увеличение концентрации сыворотки РВБ с 10% до 40% при впервые выявленном СОД направленно репрограммировало АМ в сторону М2 фенотипа: на АМ снижалось содержание М1 маркеров С025 (в 1,14 раз), С080 (в 1,96 раз), возрастало - М2 маркеров СО 163 (в 1,23 раза), С0206 (в 1,24 раза); увеличивалась продукция АМ ТЪ2 цитокинов и количество АМ расплющенной формы в культуре клеток (в 1,73 раза).

При рецидивирующем СОД снижение концентрации сыворотки РВБ с 10% до 0% способствовало репрограммированию АМ в сторону М2 фенотипа, что подтверждено снижением содержания М1 маркера С080 (в 1,26 раз) и увеличением содержания М2 маркера СБ206 (в 1,14 раз), однако при этом достоверно не изменялось содержание маркера СБ25 (35,70±4,85% уб 35,81±4,50%) и снижалось содержание С0163 (в 1,21 раз); снижалась продукция АМ ТЫ цитокинов и увеличивалось количество клеток расплющенной формы (в 1,58 раза).

Изменение концентрации сыворотки ИЗБ с 10% до 40% при рецидивирующем СОД направленно репрограммировало АМ в сторону М1 фенотипа, о чем свидетельствует увеличение содержания М1 маркеров С025 (в 1,59 раз) и С080 (в 1,27 раз) и снижение М2 маркера С0206 (в 1,4 раза), при этом содержание М2 маркера СО 163, наоборот, возрастало (в 1,19 раз); продукция ТЫ цитокинов возрастала, при этом в культуре клеток на 7,3% увеличивалось количество АМ округлой формы.

Изменения ФП АМ при СОД оценивались количественно по изменению содержания поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и формы клеток при действии различных концентраций сыворотки (рисунок 13, 14).

Установлено, что наибольшей ФП характеризуются АМ при впервые выявленном СОД нелеченом ГКС. Анализ полученных данных обосновывает возможность применения направленного репрограммирования АМ лишь при впервые выявленном СОД, поскольку показатели суммарной ФП при рецидивирующем течении СОД были существенно ниже и преимущественно инвертированы по сравнению данными при впервые выявленном СОД. Таким образом, проведение анализа фенотипа и показателей ФП у АМ для персонализированного подхода к патогенетической терапии целесообразно у больных впервые выявленным СОД.

Рисунок 13. Фенотипическая пластичность АМ по содержанию поверхностно-клеточных маркеров при СОД в условиях культуры клеток.

Рисунок 14. Фенотипическая пластичность АМ по содержанию клеток округлой формы при СОД.

Роль БР-О в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при СОД

Изучен уровень и олигомерный состав 8Р-Э в БАЛЖ, уровень БР-О в сыворотке больных СОД. Выполнено сопоставление полученных данных с показателями клинически здоровых лиц. Уровень 8Р-Г) в БАЛЖ при рецидивирующем СОД был на 17% повышен относительно клинически здоровых лиц, при впервые выявленном — на 23% (таблица 14).

Таблица 14

Уровень и олигомерный состав вР-Э в БАЛЖ при СОД

Впервые выявленный СОД без применения ГКС, п=15 Рецидивирующий СОД с применением ГКС, п=15 Здоровые некурящие, п=10

Возраст, лет 44,72±3,89 45,10±3,06 51,83±3,52

Уровень вР-Э в БАЛЖ, нг/мл 660,45±46,71 628,00±58,82* 533,20±21,12

Уровень БР-О в сыворотке, нг/мл 83,72±9,55* 72,25± 11,44" 54,60±4,77

Мономеры БР-О в БАЛЖ, опт.ед. 5,40±0,31 5,06±0,21 4,37±0,66

Тримеры 8Р-0 в БАЛЖ, опт.ед. - 4,31 ±0,18* 3,65±0,29

Додекамеры 8Р-Э в БАЛЖ, опт.ед. 5,29±0,45" 5,52±0,27* 3,92±0,28

р<0,05 относительно здоровых некурящих

В системной циркуляции уровень SP-D при СОД также превышал значения здоровых лиц — на 32% при рецидивирующем СОД и на 53% - при впервые выявленном СОД (таблица 14).

В зависимости от течения СОД различался олигомерный состав SP-D в БАЛЖ. При впервые выявленном СОД в БАЛЖ отсутствовали тримеры SP-D, при рецидивирующем течении - присутствовали все олигомерные формы белка (мономеры, тримеры и додекамеры), однако их соотношение отличалось от показателей клинически здоровых лиц (таблица 14).

Изменение уровня SP-D в сочетании с измененным олигомерным составом белка в БАЛЖ влияет на изменение взаимодействия SP-D с AM на уровне рецепторов, что отражено в нарушении процесса фенотипирования AM при СОД и формировании дисбаланса М1/М2 фенотипов AM. Увеличение уровня SP-D в БАЛЖ и системной циркуляции при СОД может быть использовано в качестве дополнительного диагностического маркера заболевания.

выводы

1. Альвеолярные макрофаги Ml фенотипа по сравнению с альвеолярными макрофагами М2. фенотипа in vitro характеризуются более выраженной фагоцитарной активностью в отношении бактериальных агентов (Staphylococcus aureus), более высоким (в 2 раза) уровнем продукции нитритов и повышенной продукцией цитокинов Thl профиля (с достоверными различиями по IL-2 и TNF-a, р<0,05), но более низкой (в 1,25 раза) выраженностью клеточного стресс ответа, подтвержденной различием в продукции белков теплового шока HSP32 и HSP70. Миграционная активность альвеолярных макрофагов Ml и М2 фенотипов зависит от используемого хемоаттрактанта: способность к миграции макрофагов на «собственный» хемоаттрактант - БАЛЖ существенно выше, чем на «чужеродный»; миграционная активность М2 фенотипа существенно выше по сравнению с Ml фенотипом.

2. SP-D как фактор микроокружения альвеолярных макрофагов является эндогенным фактором репрограммирования. SP-D влияет на формирование фенотипа, а именно на функциональную активность и морфологическую характеристику альвеолярных макрофагов в процессе их репрограммирования. Повышение уровня SP-D с возрастанием количества мультимерных форм способствует направленному репрограммированию альвеолярных макрофагов в сторону М2 фенотипа, а снижение уровня SP-D с уменьшением количества мультимеров —в сторону Ml фенотипа.

3. Увеличение концентрации сыворотки в культуральной среде до 40% способствует изменению исходного фенотипа макрофагов в сторону М2, снижение концентрации сыворотки до 0% - в сторону Ml фенотипа. Разработанный лабораторный прототип клеточной биотехнологии с использованием различных концентраций сыворотки, содержащей SP-D, направленно репрограммирует альвеолярные макрофаги.

4. У больных ХОБЛ соотношение М1/М2 альвеолярных макрофагов смещено в сторону Ml фенотипа по сравнению с клинически здоровыми лицами. Выраженность дисбаланса сопряжена с утяжелением клинического статуса больных ХОБЛ. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных ХОБЛ снижается с увеличением тяжести ХОБЛ.

5. Локальный (в БАЛЖ) и системный (в сыворотке крови) уровни SP-D, а также олигомерный состав данного белка у больных ХОБЛ существенно отличаются от здоровых лиц. Прогрессирование ХОБЛ сопровождается снижением SP-D в БАЛЖ относительно уровня клинически здоровых лиц в 1,4-1,8 раз и повышением уровня SP-D сыворотке в 1,4-2,6 раз. Олигомерный состав SP-D в БАЛЖ на I стадии ХОБЛ характеризуется снижением количества додекамеров по сравнению с клинически здоровыми лицами и наличием лишь мономерных форм при II и III стадии.

6. У больных БА М1/М2 баланс альвеолярных макрофагов смещен в сторону М2 фенотипа по сравнению с клинически здоровыми лицами. Более выраженный

43

дисбаланс М1/М2 фенотипов выявлен при легком течении БА, у пациентов, не применяющих ИГКС. Показатели суммарной фенотипической пластичности, определяемой по поверхностным маркерам и морфологической характеристике альвеолярных макрофагов, у пациентов с БА, не получавших ИГКС, были сопоставимы с показателями клинически здоровых лиц.

7. Уровень SP-D системный (в сыворотке крови) и локальный (в БАЛЖ) при БА повышен по сравнению с клинически здоровыми лицами в 1,3 и 1,2-1,4 раза, соответственно. Утяжеление течения БА с применением ИГКС повышает уровень SP-D в БАЛЖ на 15%. Олигомерный состав SP-D у больных БА изменяется при утяжелении БА и изменении проводимой терапии: у больных интермиттирующей БА, не получающих ИГКС, преобладают мономерные формы, а на фоне приема ИГКС у больных персистирующей БА олигомерный состав SP-D аналогичен здоровым.

8. У больных ГЭРБ М1/М2 баланс альвеолярных макрофагов смещен в сторону Ml по сравнению со здоровыми лицами. При сочетании ГЭРБ и БА М1/М2 дисбаланс фенотипов альвеолярных макрофагов характеризуется увеличением количества клеток с маркерами Ml фенотипа на 16%, а с маркерами М2 фенотипа - на 79% по сравнению с клинически здоровыми лицами. При сочетании ГЭРБ и БА суммарная фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов снижена по сравнению с клинически здоровыми лицами и больными с БА и с ГЭРБ.

9. Как у больных ГЭРБ, так и при сочетании ГЭРБ и БА уровень SP-D в БАЛЖ снижен по сравнению с клинически здоровыми лицами в 3,4 раза и 1,3 раза, соответственно. В сыворотке крови у обеих категорий пациентов уровень SP-D значимо не изменен. Олигомерный состав SP-D при обеих клинических ситуациях характеризуется наличием лишь мономерных форм белка в отличие от клинически здоровых лиц, у которых в БАЛЖ присутствовали все олигомерные формы SP-D.

10.У больных с СОД выраженность М1/М2 дисбаланса альвеолярных макрофагов по сравнению с клинически здоровыми лицами определялась характером течения заболевания и проводимой терапией. Впервые выявленный СОД не леченный ГКС, характеризовался четырехкратным преобладанием клеток с маркером Ml фенотипа (CD80), а рецидивирующий СОД с применением ГКС - его увеличением в 3,5 раза по сравнению с клинически здоровыми лицами. Альвеолярные макрофаги у больных с впервые выявленным СОД обладают большей суммарной фенотипической пластичностью по сравнению с клетками, выделенными от пациентов с рецидивирующим течением заболевания, но более низкой - по сравнению с клинически здоровыми лицами.

И.У больных СОД уровень SP-D в БАЛЖ повышен по сравнению с клинически здоровыми лицами на 23% при впервые выявленном заболевании и на 18% при рецидивирующем СОД, леченном ГКС. В сыворотке крови по сравнению со здоровыми лицами содержание SP-D возрастало при впервые выявленном СОД в 1,3 раза, при рецидивирующем СОД - в 1,5 раза. В олигомерном составе SPD в БАЛЖ при впервые выявленном СОД преобладали мономерные формы

белка, тогда как при рецидивирующем СОД с применением ГКС в БАЛЖ наряду с мономерами присутствовали тримеры и додекамеры с изменением соотношения олигомерных форм по сравнению с клинически здоровыми лицами.

12. Выявленные локальные и системные изменения уровня БР-Э, а также его олигомерного состава в БАЛЖ при патологии, сопряженной с воспалительным поражением бронхо-легочной системы (подтвержденным данными ФБС и цитокиновым профилем), являются дополнительными маркерами дифференциальной диагностики заболеваний и оценки тяжести их течения. Изменения содержания и олигомерного состава 5Р-0 в БАЛЖ влияют на процесс фенотипирования альвеолярных макрофагов, участвуя в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и ГЭРБ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вассерман E.H., Абрамова Е. В., Круглов С. В., Лямина С. В., Шимшелашвили Ш.Л., Малышев Ю.И., Беарс М.Ф., Гоу А.Д., Малышев И.Ю. Отсутствие гена SP-D приводит к усилению ЛПС-индуцированного синтеза HSP70 в М2, но не в Ml фенотипе перитонеальных макрофагов: возможная роль интерлейкина - 10 // Фундаментальные исследования. — 2010. - №6. - С. 19-27

2. Вассерман E.H., Лямина C.B., Шимшелашвили Ш.Л., Абрамова Е.В., Назаров В.А., Круглов C.B., Малышева Е.В., Беарс М.Ф., Гоу А.Д., Малышев И.Ю. SPD контролирует баланс Thl и Th цитокинов и обладает признаками эндогенного фактора репрограммирования макрофагов // Фундаментальные исследования. — 2010. - №6. - С. 28-36

3. Лямина C.B., Круглов C.B., Веденикин Т.Ю., Малышев И.Ю. Новая стратегия управления иммунным ответом при заболеваниях легких — роль сурфактантного белка D как бивалентного фактора репрограммирования макрофагов // Фундаментальные исследования. — 2011. - №1. - С. 90-98

4. Малышев И.Ю., Лямина C.B., Шимшелашвили Ш.Л., Вассерман E.H. Функциональные ответа альвеолярных макрофагов, сурфактантный белок D и заболевания легких // Пульмонология. — 2011. - №3. — С. 101-107

5. Лямина C.B., Маев И.В., Юренев Г.Л., Малышев И.Ю. Бронхиальная астма и гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь: взгляд клинициста и патофизиолога // Терапевтический архив. - 2011. - №6. — С. 73-78

6. Лямина C.B., Круглов C.B., Веденикин Т.Ю. Бородовицына O.A., Суворова И.А., Шимшелашвили Ш.Л., Малышев И.Ю. Альтернативное репрограммирование М1/М2 фенотипа перитонеальных макрофагов мышей in vitro с помощью интерферона гамма и интерлейкина 4 // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - №4, — С. 235-239

7. Лямина C.B., Веденикин Т.Ю., Малышев И.Ю. Современный подход к анализу иммунного ответа при заболеваниях легких: сурфактантный белок D и его роль // Современные проблемы науки и образования. — 2011. - №4.-http://www.science-education.ru/98-4717

8. Лямина C.B., Веденикин Т.Ю., Круглов C.B., Шимшелашвили Ш.Л., Буданова О.П., Малышев И.Ю. Особенности фагоцитарной и миграционной активности альвеолярных макрофагов Ml и М2 фенотипов // Фундаментальные исследования.-2011. -№11(3).-С. 536-539

9. Лямина C.B., Круглов C.B., Калиш C.B., Малышев И.Ю. Репрограммирование альвеолярных макрофагов — новая возможность управления иммунным ответом // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. -2011,-№4.-С. 42-46

Ю.Лямина C.B. Новая стратегия управления иммунным ответом при заболеваниях легких // Терапевт. - 2011. - №2. - С. 47-48

11. Лямина C.B., Шимшелашвили Ш.Л., Малышев И.Ю. Сурфактантный белок D — эндогенный регулятор воспаления и иммунной защиты // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. — 2012. - №1. — С. 60-66

12.Лямина С.В., Малышев И.Ю. Сурфактантный белок D в норме и при заболеваниях легких // Российский медицинский журнал. - 2012. - №1. - С. 5055

И.Лямина С.В., Веденикин Т.Ю., Бородовицына О.А., Суворова И.А., Шимшелашвили Ш.Л., Малышев И.Ю., Круглое С.В. Репрограммирование механизмов синтеза оксида азота у Ml и М2 фенотипов перитонеальных макрофагов мышей in vitro в присутствии разных концентраций сыворотки // Медицинская иммунология. - 2012. - №1-2. - Том 14. - С. 127-132

14.Малышев И.Ю., Круглое С.В., Лямина С.В. Гипоксия, воспаление и фенотипическая пластичность макрофагов: центральная роль HIF-1 и NF-kB // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С. 42-50

15.Лямина С.В., Веденикин Т.Ю., Бородовицына О.А., Круглов С.В., Малышев И.Ю. Показатели функциональной активности макрофагов фенотипов Ml и М2 - необходимые компоненты оценки врожденного иммунного ответа // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2012. - №8 — С. 1030-1035

16.Karoli N., Rebrov A., Lyamina N.. Senchikhin V., Lyamina S. Changes in nitric oxide production in patients with COPD // Europ. Resp. J. - 2006. - Vol. 28. - P. 190s

17.Atochina-Vasserman E.N., Abramova H., Lyamina S.V., Monastyrskaya E.A., Nazarov V.A., Kruglov S.V., Beers M.F., Gow A.J., Malyshev I.Y.. Regulation of NO metabolism and cytokines production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated peritoneal macrophages // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2010. - Vol. 181. -A2453

18. Лямина C.B., Вассерман E.H., Круглов C.B., Малышев И.Ю. Роль модулирующего цитокина, SP-D и стресс-белков в регуляции воспалительной реакции // Материалы V Национального конгресса терапевтов. Москва, 2010. — С. 157

19.Lyamina S.V., Monastyrskaya Е.А., Borodovitsina О.А., Belousova D.A., Manukhina E.B., Malyshev I.Y. Alveolar Macrophages Phenotype: Adaptive Programming and Disorders in Pulmonary Diseases. Adaptation Biology and Medicine (Volume 6: Cell Adaptations and Challenges) // Editors: P. Wang, C.-H. Kuo, N. Takeda and P.K. Singal; 2011. - Narosa Publishing House Pvt. Ltd., New Delhi, India, P. 209-225

20.Лямина C.B., Сметнева H.C., Попкова A.M., Малышев И.Ю. SP-D -дополнительный специфический маркер тяжести заболевания при хронической обструктивной болезни легких // Материалы VI Национального конгресса терапевтов. Москва, 2011, —С. 131

21.Лямина С.В. Регуляция пластичности иммунного ответа - путь к успеху в лечении заболеваний легких // Материалы VI Национального конгресса терапевтов. Москва, 2011. - С. 267

22.Лямина С.В., Калиш С.В., Игонина Н.П., Попкова A.M., Малышев И.Ю. Особенности фенотепирования альвеолярных макрофагов при бронхиальной

астме, гастроэзофагеалыюй рефлюксной болезни и их сочетании // Материалы VII Национального конгресса терапевтов. Москва, 2012.-С. 121-122

23.Lyamina S.V., Vedenikin T.Yu., Malyshev I.Yu. Long-term exposure to tobacco smoke on alveolar macrophages phenotype with regard to genetic and age predisposition // Eur Respir J. - 2012. -Vol. 40. - Suppl. 56. - P3743

24.Lyamina S.V., Kalish S.V., Malyshev I.Yu. Regulation of immune response plasticity - a path to success in pulmonary diseases management // Eur Respir J. -2012.-Vol. 40. - Suppl. 56. - P810

25.Lyamina S.V., Kalish S.V., Malyshev I.Yu.. Change of phenotype and phenotypic plasticity of alveolar macrophages in COPD // Eur Respir J 2012. - Vol. 40. - Suppl. 56.-P811

26.Smetneva N.S., Popkova A.M., Lyamina S.V., Seregin A.A., Malyshev I.Yu.. Association between endothelium-dependent vasodilatation and serum pulmonary surfactant protein D concentration in patients with chronic obstructive pulmonary disease//Artery Research. - 2012. - Vol. 6(4). - P. 200.

Lyamina Svetlana Vladimirovna

Formation of bronchopulmonary inflammatory component in pulmonary diseases and gastroesophageal reflux disease: the role of surfactant protein D and macrophages reprogramming

Abstract

Inflammatory reactions play a crucial role in the development of pulmonary diseases. Macrophages and their microenvironment take direct part in inflammatory reactions. The aim of the study was to assess the phenotype and changes of phenotypic flexibility of alveolar macrophages, to analize the role of surfactant protein D (SP-D) in the formation of inflammatory component in bronchopulmonary system in lung diseases and gastroesophageal reflux disease, and to use the resulting data for the development of the prototype of cell biotechnology for alveolar macrophages reprogramming.

In consequence of the study, specificity of functional responses of Ml and M2 alveolar macrophages phenotypes was educed. These phenotypes specifically differ on secretory capacity, morphological characteristics, ability for phagocytosis and migration, differ on their cellular stress-response. M2 macrophages are characterized by major basal production of HSP32 and HSP70 proteins in comparison with Ml phenotype. Ascertained, that surfactant protein D is an endogenous bivalent reprogramming factor for macrophages. Monomelic forms of SP-D assemble Ml macrophages phenotype, oligomeric forms (dodecamers) - M2 phenotype. Laboratory prototype of the new cell biotechnology for alveolar macrophages reprogramming was developed. This prototype allows to use the core role of endogenous reprogramming factors for the purpose of direct macrophages reprogramming and formation of essential "therapeutic" potential of the immune response in the diseases with bronchopulmonary inflammation.

It was shown that changes of macrophages phenotype and phenotypic flexibility are the pathogenetic component in inflammatory formation in such diseases as chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary sarcoidosis, bronchial asthma, gastroesophageal reflux disease and the combination of asthma and gastroesophageal reflux disease. The change of surfactant protein D oligomeric structure is the pathogenetic factor for disorders of macrophages phenotype and phenotypic flexibility in chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary sarcoidosis, bronchial asthma, gastroesophageal reflux disease and the combination of asthma and gastroesophageal reflux disease.

The identified changes of oligomeric structure of surfactant protein D in broncho-alveolar lavage fluid in terms of the disease severity and administered therapy can be used as diagnostic criteria and criteria for the response rate in patients with bronchopulmonary inflammation.

Подписано в печать: 15.01.2013г. Тираж: 100 экз. Заказ №22 Объем: 2,0 усл.п.л. Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва ул. Новослободская, д.20,стр.4 8(495)971-77-88, www.reglet.ru