Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Регуляция активности макрофагов полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственной, девясила высокого

На правах рукописи

УЧАСОВА ЕВГЕНИЯ ГЕННАДЬЕВНА

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ ПОЛИСАХАРИДАМИ МАТЬ-И-МАЧЕХИ ОБЫКНОВЕННОЙ, АИРА БОЛОТНОГО, КАЛЕНДУЛЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ, ДЕВЯСИЛА ВЫСОКОГО

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003474766

Томск-2009

003474766

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук

Вельский Юрий Павлович

доктор медицинских наук, профессор Агафонов Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

Чурин Алексей Александрович

доктор медицинских наук, профессор Иванова Светлана Александровна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Защита состоится «

»

2009 года в

часов на

Автореферат разослан

» июля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что недостаточная либо избыточная поляризация Т-хелперов (Th) лежит в основе патогенеза аутоиммунных, аллергических, хронических инфекционных и онкологических заболеваний. Поиск веществ, способных регулировать баланс Thl/Th2, является одной из ключевых задач современной иммунофармакологии.

Известно, что поляризация лимфоцитов зависит от функционального состояния антиген-презентирующих клеток, среди которых макрофаги занимают особое место, представляя собой важнейший элемент как системы естественной резистентности, так и приобретенного иммунитета. Они обеспечивают направление поляризации, продуцируя в раннюю фазу взаимодействия организма с антигеном цитокины и стимулируя развитие Thl (ИЛ-12) или Th2 типа иммунного ответа (ИЛ-10) [Alzona М. et al, 1995; Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000; Mosser D.M., 2003; Gutcher I., Becher В, 2007].

Подобно Т-хелперам, клетки моноцитарно-макрофагального ряда также поляризуются в макрофаги 1 (Ml) или 2 (М2) типа [Mills C.D. et al., 2000; Mantovani A. et al., 2004]. Ml клетки обладают воспалительными свойствами и способностью поддерживать Thl-зависимые иммунные реакции: продуцируют медиаторы воспаления (например, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, NO, TNF-a), проявляют повышенную способность фагоцитировать микроорганизмы, способствуют деструкции экстра-целлюлярного матрикса, стимулируют апоптоз инфицированных клеток [Goerdt S., Orfanos С.Е., 1999; Ehrt S. et al., 2001; Mosser D.M., 2003; Mantovani A., 2006]. Макрофаги M2 проявляют противовоспалительные характеристики, подавляют Thl ответ и способствуют протеканию Th2 ответа: секретируют вещества, противодействующие воспалению (ИЛ-10, антагонист рецептора ИЛ-1, трансформирующий фактор роста ß), экспрессируют аргиназу 1, продукты которой обеспечивают биосинтез белков, способствуют ангиогенезу, восстановлению поврежденной ткани, ремоделированию, очищают место воспаления от разрушенных тканей (в том числе от клеток, подвергшихся апоптозу), продуцируют хемоаттрактанты для привлечения Th2 [Goerdt S., Orfanos C.E., 1999; Ehrt S. et al., 2001; Mosser D.M., 2003; Mantovani A, 2006].

Одним из важнейших различий этих двух групп макрофагов, их маркерной чертой, является разные пути метаболизма аргинина: классически активированные макрофаги метаболизируют его с помощью индуцибельной NO-синтазы с образованием оксида азота и цитруллина; альтернативно активированные - с помощью аргиназы-1 (Arg), продуктами которой являются мочевина и орнитин [Munder М. et al., 1998; Kreider Т. et al., 2007].

Кроме цитокинового микроокружения тип активации макрофагов определяет и сам микроорганизм. Известно, что антиген-презентирующие клетки (АПК) несут на своей поверхности набор рецепторов (TLR, NLR, маннозный, скавенжер рецептор и др.), с помощью которых они взаимодействуют с патоген-ассоциированными структурами грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, грибов, вирусов [Gordon S. 2002; Medzhitov R., et al., 2000; Crocker P.R. 2005]. Среди компонентов, определяемых паггерн-распознающими структурами

макрофагагтьных клеток, находятся и полисахариды. Показано, что полисахариды микроорганизмов, грибов [Wasser S.P., 2002] и высших растений [Paulsen B.S., 2001; Kayser О. et al., 2003] обладают иммуномодулирующими свойствами благодаря способности изменять функциональное состояние антиген-презентирующих клеток (макрофаги и дендритные клетки) [Vecchiarelli А. 2000; Monari С. et al., 2002; Chiapello L. S. et al., 2003; Monari C. et al., 2003; Vecchiarelli A. et al., 2003; Stingele F. et al., 2004]. Большинство полисахаридов из высших растений обладают низкой токсичностью и отсутствием нежелательных побочных эффектов, свойственных бактериальным и синтетическим полисахаридам, что делает их привлекательными для разработки фармакологических средств с иммуномодули-рующей, противоопухолевой и ранозаживляющей активностью [Schepetkin I.A., et al., 2006].

Известно, что различные полисахариды могут связываться с различными рецепторами антиген-презентирующих клеток [Schepetkin I.A.,Quinn М.Т., 2006], влиять на продукцию иммунорегуляторных цитокинов, на экспрессию различных молекул адгезии [Tzianabos А.О. 2000; Retini С., et al., 2001]. Так, например, полисахарид, выделенный из Acetobacter, распознавался рецептором макрофагов TLR-4 и индуцировал продукцию ИЛ-12, подавляя таким образом развившийся Th2 иммунный ответ [Saito К. et al., 2003] или стимулируя ТЫ иммунный ответ [Li W., et al., 2004]. Полисахариды, выделенные из другого источника (из Cryptococcus neoformans), напротив, индуцировали Th2 тип поляризации, вызывая активацию соответствующего типа макрофагов [Almeida G.M., et al., 2001].

Учитывая огромную роль, которую играют макрофаги, представляется актуальным выявить вещества, обладающие способностью регулировать функциональное состояние этих клеток.

Целью исследования явилось изучение влияния водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственной, девясила высокого на функциональное состояние макрофагов и иммунный ответ Thl и Th2 типов.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние активности NO-синтазы и аргиназы перитонеальных макрофагов при развитии Thl и Th2 типа иммунного ответа.

2. Исследовать влияние in vitro водорастворимых полисахаридов на баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов и продукцию воспалительных и противовоспалительных цитокинов.

3. Вскрыть некоторые механизмы регуляторного действия водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на функциональное состояние перитонеальных макрофагов (роль внутриклеточных мессенджеров PI3K и р38 МАРК).

4. Оценить действие водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на Thl-зависимый иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана.

5. Изучить влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на ТЬ2-зависимый иммунный ответ, индуцированный овальбумином.

Научная новизна. В работе впервые изучен баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов животных с Thl и Th2 иммунным ответом, а также влияние водорастворимых полисахаридов, полученных из мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила, на эти типы ответа. Впервые проведено сравнение действия in vitro растительных полисахаридов (мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственнолй, девясила высокого) и липополисахарида на баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов и обнаружена их способность как к синергичному, так и к антагонистическому действию. Впервые изучено действие полисахаридов (мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственнолй, девясила высокого) на цитокинпродуцирующую активность макрофагов и мононуклеаров периферической крови человека. Показано, что данные вещества по совокупности результатов влияния на продукцию ци-токинов (ИЛ-12, TNF-a и ИЛ-10) поддерживают воспалительные свойства макрофагов. При этом впервые была выявлена роль некоторых внутриклеточных мес-сенджеров (РБК, МАРК) в наблюдаемых эффектах. Впервые показано, что курсовое введение ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила стимулирует Thl тип иммунного ответа. Впервые установлено, что исследуемые растительные полисахариды проявляют противоаллергическое действие, подавляя анафилаксию и продукцию аллерген-специфических иммуноглобулинов.

Практическое значение работы. Полученные данные дают возможность яснее понять механизмы, лежащие в основе регуляции иммунного ответа и роль в этом макрофагальных клеток. Установлено, что исследованные полисахариды (мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственной, девясила высокого) обладают иммуномодулирующей активностью. Результаты, полученные при выполнении данной работы, позволяют обосновать использование данных водорастворимых растительных полисахаридов для коррекции иммунного ответа Thl и Th2 типа. Полученные результаты могут лечь в основу дальнейших исследований с целью получения новых иммуномодуляторов, стимулирующих Thl-зависимые иммунологические реакции, а также средств для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), на X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармако-логии» (Казань, 2009).

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных статей, из них 5 в изданиях, рекомендуемых ВАК; по результатам проведенных исследований получено 2 патента на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 5 рисунками и 30 таблицами. Библиографический указатель включает 205 источника, в том числе 56 отечественных и 149 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Животные. Эксперименты проведены на мышах линии BALB/c, C57BL/6Y, беспородных мышах и крысах (всего 778 животных), полученных из питомника НИИ фармакологии СО РАМН. Использованы мыши обоего пола в возрасте 8-12 недель (1 категории согласно сертификату), а также крысы-самцы в возрасте 4 мес. Животные содержались в неполной барьерной системе при световом режиме 12:12 на стандартной диете (гранулированный корм), получали кипячёную питьевую воду, подкисленную до pH 4-5.

Получение полисахаридов. Полисахариды (ПС) были выделены из фармакопейного растительного сырья на кафедре химии СибГМУ по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975]. Сырье - листья мать-и-мачехи обыкновенной (Tussilago farfaro L.), корневища аира болотного (Acorns calamus L.), цветы календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), корневища девясила высокого (Inula helenium L.).

Стандартизация и характеристика образцов полисахаридов. Полученные образцы ПС были стандартизованы по содержанию углеводов спектрофотометриче-ским методом [Dubois М et al, 1956], содержанию белка методом Брэдфорда [Bradford М.М., 1976] и нуклеиновых кислот [Спирин A.C., 1958]. Выход ПС составил (% от массы воздушно-сухого сырья): 2,89±0,17 (ПС из листьев мать-и-мачехи обыкновенной), 3,68±1,06 (ПС из корневищ аира болотного), 2,97±1,14 (ПС из корней девясила высокого) и 1,48±0,19 (ПС из цветков календулы лекарственной). Содержание углеводов в образцах составило (%): 97,9±2,26 (листья мать-и-мачехи обыкновенной), 99,8±3,22 (корневища аира болотного), 97,8±1,06 (цветки календулы лекарственной) и 95,6±4,43 (корни девясила высокого). Примеси белка и нуклеиновых кислот в исследуемых образцах были следующие (%): 0,12±0,02 и 0,062±0,012 (корневища аира болотного), 0,21±0,06 и 0,021±0,003 (листья мать-и-мачехи обыкновенной), 1,04±0,12 и 0,077±0,009 (корни девясила высокого), 1,68±0,26 и 0,165±0,024 (цветки календулы лекарственной). На спектре ВЭЖХ образца из корневищ аира болотного обнаружено 5 пиков, соответствующих молекулярной массе 720, 460, 370, 290 и 40 кДа; из листьев мать-и-мачехи обыкновенной - 2 пика, соответствующих молекулярной массе 690 и 350 кДа; из корней девясила высокого - 540 и 390 кДа; из цветков календулы лекарственной -490 и 310 кДа.

Выделение макрофагов. Животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), клетки осаждали, ресуспендировали в культуральной среде, помещали по 1,5-2,0x106 клеток/мл в пластиковые чашки Петри, культивировали 2 ч (в атмосфере 5% С02 и абсолютной влажности) в культуральной среде, после чего собирали только прилипшие к пластику клетки. Полученные макрофаги помещали в плоскодонные 96-луночные планшеты и культивировали 24 и 48 ч. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток.

Условия культивирования. Клетки культивировали в среде следующего состава: RPMI 1640 («Sigma») с добавлением 10% ЭТС («Hyclone»), 20 мМ HEPES

(«Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицина («Flow Lab») и 2 мМ L-глютамина («Sigma»). Культивирование проводили при 37°С в атмосфере с 5% С02 и абсолютной влажности.

Влияние полисахаридов на функциональную активность макрофагов. Макрофаги (2,5-3,0х106 клеток/мл) культивировали в присутствии полисахаридов в диапазоне концентраций от 2,5 мкг/мл до 1 мг/мл; 1 мкг/мл ЛПС (серотип Olli:В4, «Sigma»); 5 и 10 мкг/мл мурамилдипептида (Ы-ацетилмурамил-Ь-аланил-Б-изоглютамин, «Calbiochem»). Через 24 и 48 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок, замеряли в нём количество нитритов и концентрацию цитокинов, а в клетках определяли активность аргиназы.

Определение продукции оксида азота. Продукцию N0 оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [Green L.C. et al., 1982]. Реактив (0,1 мл) смешивали с эквивалентным объемом надосадка, абсорбцию замеряли с использованием спектрофотометра при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.

Определение активности аргиназы. Активность аргиназы определяли по модифицированной нами методике [Munder М. et al., 1998]. Для этого клетки помещали в 96-луночные плоскодонные планшеты, через 24 и 48 ч от начала культивирования удаляли надосадок из лунок, клетки лизировали 0,1 мл 0,1% раствором тритона Х-100, инкубировали при постоянном встряхивании 10 мин при комнатной температуре. Затем для активации аргиназы в лунки вносили 0,1 мл 25 мМ раствора трис-HCl и 0,05 мл 10 мМ раствора хлорида марганца и инкубировали 10 мин при 56°С. После этого к 0,05 мл лизата добавляли 0,05 мл 0,5 М раствора L-аргинина («Sigma», США) с pH 9,7, инкубировали при 37°С 60 мин. Реакцию останавливали добавлением 0,4 мл смеси концентрированных кислот (серной и фосфорной) с водой (в соотношении 1/3/7 по объему). Концентрацию мочевины в полученном растворе определяли с помощью тест-системы «Мочевина-450» («Био-ЛА-Тест», Чехия) согласно приложенному протоколу с использованием спектрофотометра при длине волны 540 нм. За 1 единицу активности фермента принимали количество аргиназы, катализирующей образование 1 мкМ мочевины в минуту.

Определение количества ИЛ-12, ИЛ-10. Количественное определение цитокинов в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным иммунофер-ментным методом при помощи тест-систем («R@D Systems», США) согласно прилагаемым протоколам.

Исследование полисахаридов на наличие примесей эндотоксина. Для изучения возможной примеси эндотоксина в исследуемых образцах полисахаридов в 96-луночный планшет помещали исследуемые образцы полисахаридов и поли-миксин В (10 мкг/мл) («InvivoGen»,CLLlA), культивировали в течение 1 часа. Затем в эти же лунки добавляли суспензию клеток (2,5-3,0х106 клеток/мл), полученные после прилипания перитонеальных клеток к пластику, культивировали 48 ч, после чего определяли концентрацию нитритов в надосадке. В качестве позитивного контроля использовали ЛПС (серотип Ol 11:В4, «Sigma»).

Изучение роли р38 MAP киназы и PI3 киназы в активации макрофагов. Для этого были использованы ингибиторы р38 MAP киназы - SB203580 и PI3 киназы -LY294002 («InvivoGen», США). Рабочая концентрация данных ингибиторов была определена в предварительных экспериментах: SB203580 - 10 мкМ и LY294002 -100 мкМ. Прилипающие клетки, полученные из суспензии перитонеальных клеток, культивировали с ПС в присутствии или отсутствии ингибиторов 48 ч, после чего определяли концентрацию нитритов и активность аргиназы.

Выделение мононуклеаров из периферической крови человека. Жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077 помещали в пробирки, затем осторожно наслаивали цельную кровь с добавлением гепарина (10 ЕД/мл). После 15-минутного центрифугирования при 400 g собирали клетки, сформировавшие кольцо в растворе. Полученные клетки трижды отмывали холодным ФР, ресуспендировали в культурапьной среде и оценивали их жизнеспособность.

Получение супернатантов мононуклеаров периферической крови человека для определения продукции цитокинов. Мононуклеары помещали в 96-луночный планшет (1х106 клеток/мл), продукцию монокинов стимулировали добавлением ЛПС (1 мкг/мл) и вносили изучаемые ПС (20 мкг/мл). Через 24 ч собирали супер-натант, разливали на аликвоты и хранили при -20°С.

Определение количества TNF-ct и ИЛ-10. Количественное определение цитокинов в исследуемых супернатантах мононуклеаров осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («Вектор-Бэст») согласно прилагаемым протоколам.

Определения содержания IgGl и fgE иммуноферментным методом. Для определения иммуноглобулинов животных забивали цервикальной дислокацией через 7 суток после второго введения овальбумина и на 10 сутки после однократной иммунизации, забирали кровь из сердца, получали сыворотку, разливали на аликвоты и хранили при -20°С. Содержание иммуноглобулинов в сыворотках измеряли с использованием соответствующих тест систем («Immunology Consultants Lab.», США) согласно прилагаемому протоколу.

Получение супернатантов Т-лимфоцитов для определения продукции цитокинов. Супернатант получали следующим образом [Williamson Е. et al., 1996]. Спленоциты культивировали в концентрации 5-10x10 клеток/мл в присутствии Т-клеточного митогена (конканавалин A, «Sigma», 4 мкг/мл), через 24 ч клетки удаляли, надосадок разливали на аликвоты и хранили при -20°С.

Определение продукции ИЛ-2 Т-лимфоцитами. Осуществляли в функциональном тесте по способности их супернатанта стимулировать пролиферацию ИЛ-2-зависимых спленоцитов [Moore S.С. et al., 1992]. Для получения Независимых спленоцитов клетки селезенки сначала культивировали в концентрации 4х106/мл с конканавалином А (4 мкг/мл) 36 ч, затем митоген удаляли и культивировали еще 48 ч (5x104 клеток/лунку) с различными разведениями исследуемого супернатанта, после чего оценивали пролиферацию клеток радиоизотопным или колориметрическим методом.

Оценка пролиферации радиоизотопным методом. За 16 ч до окончания культивирования клеток вносили по 0,5 мкКю/лунку 3Н-тимидина. Затем содер-

жимое лунок переносили на стекловолокнистые фильтры («Titertek»), промывали ФР, высушивали и переносили в сцинтилляционную жидкость, включение изотопа оценивали на ß-счетчике. Пролиферацию клеток выражали в количестве импульсов в минуту.

Оценка пролиферации колориметрическим методом [Mosmann Т., 1983]. Клетки культивировали 4 суток в круглодонных 96-луночных планшетах (2-5х104 клеток/лунку) в указанных выше условиях. За 4 ч до окончания культивирования в лунки вносили 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (МТТ, «Serva»), концентрация которого в лунках составляла 200 мкг/мл. Затем из лунок удаляли надосадок, а осадок растворяли диметилсульфоксидом (димексид, ООО «Тульская фармацевтическая фабрика»). Абсорбцию полученных растворов замеряли при помощи спектрофотометра («Titertek») при длине волны 550 нм.

Определение продукции интерферона-гамма Т-клетками в функциональном тесте. Осуществляли по способности их супернатанта индуцировать выработку N0 миелокариоцитами интактных сингенных животных [Moore S.C. et al., 1992]. Супернатант Т-лимфоцитов (1/3 и 1/6 от общего объема) добавляли в 96-луночные круглодонные планшеты, содержащие свежевыделенные клетки костного мозга сингенных мышей (по 2-3x105 в лунке), культивировали 48 ч, собирали супернатант и измеряли в нем количество нитритов.

Иммунизация эритроцитами барана ОБ). Суспензию ЭБ предварительно трижды отмывали ФР, подсчитывали их количество и в объеме 0,2 мл внутри-брюшинно вводили по 5x10б для определении числа АОК и титра антител, по 1х108 при проведении реакции гиперчувствительности замедленного типа. Контрольным животным вводили так же 0,2 мл ФР. В некоторых экспериментах иммунизацию повторяли трижды с интервалом 7 суток между инъекциями.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). На 5-е сутки после иммунизации ЭБ животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию ЭБ в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (108 ЭБ в 0,02 мл ФР). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного ФР («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа по разнице массы опытной (Мо) и контрольной (Мк) лап. Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Величину реакции оценивали как разницу между контрольной и опытной лапой и выражали в мг.

Адоптивная реакция ГЗТ. Данную реакцию вызывали у интактных животных, которым вводили под апоневротическую пластинку одной из задних лап по 5x107 сингенных спленоцитов, полученных от иммунизированных БЦЖ или OVA мышей, в смеси с соответствующим антигеном (20 мкг БЦЖ или OVA) в объеме 0,03 мл ФР (контроль). В противоположную (опыт) лапу, кроме спленоцитов и антигена вводили 20 мкг ПС, объем смеси составлял также 0,03 мл. Воспалительную реакцию оценивали через 24 ч.

Определение числа антителообразуюших клеток (АОК) в селезенке методом Ерне [lerne N.K., Nordin A.A., 1963]. Для этого животных забивали на 5-е и 7-е сутки после иммунизации ЭБ, лимфоциты получали гомогенизацией селезенок,

после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным ФР, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199, 0,7% агар «Difco»), 0,2 мл 20%-ой взвеси ЭБ, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента. После ресус-пендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа.

Определение титра антител в сыворотке крови в реакции агглютинации [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого на 5-е и 7-е сутки после иммунизации ЭБ животных забивали цервикальной дислокацией, забирали кровь из сердца, после чего клеточные элементы осаждали центрифугированием. Полученную сыворотку раститровывали в 96-луночном планшете с шагом Vi, добавляли ЭБ, инкубировали при 37°С 2 часа и учитывали реакцию. За титр принимали то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдалась агглютинация.

Иммунизация овальбумином (OVA) [Oshiba A. et al., 1997]. Мышам вводили под кожу бедра OVA (100 мкг/мышь) с гидроокисью алюминия (5 мг/мышь, оба «Sigma») в качестве адъюванта в 0,1 мл ФР. При многократных иммунизациях интервал между инъекциями составлял 14 суток. Мышам контрольной группы вводили по 0,1 мл ФР.

Реакция общей анафилаксии (гиперчувствительность немедленного типа). Указанный тип реакции моделировали, используя иммунизированных OVA мышей линии BALB/c. В ответ на введение разрешающей дозы OVA (по 10 мкг в 0,1 мл ФР в ретроорбитальный синус) у животных развивалась анафилактическая реакция.

Определение количества аллерген-специфических IgE и IgGl в реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Титры IgGl антител, специфических к OVA, определяли на беспородных мышах-самцах. Сыворотку крови иммунизированных OVA мышей в различных разведениях вводили в объёме 0,03 мл внутрикожно в область спины. Разрешающую дозу OVA (0,5 мг в 0,2 мл 0,5% раствора синего Эванса в ФР) вводили мышам в ретроорбитальный синус через 2 часа после внутрикожного введения сыворотки. Интенсивность ПКА оценивали через 30 мин по площади окрашенных участков кожи.

Титры IgE антител, специфических к OVA, определяли на беспородных крысах-самцах. Животным внутрикожно в область живота вводили сыворотку крови иммунизированных OVA мышей в различных разведениях в объёме 0,03 мл. Разрешающую инъекцию OVA делали крысам в хвостовую вену через 24 часа после пассивной иммунизации (100 мкг OVA на 100 г массы тела в 1 мл 0,5% раствора синего Эванса на ФР). Интенсивность ПКА оценивали через 30 мин по площади окрашенных участков кожи.

Иммунизация БЦЖ. Мышам внутрикожно (в основании хвоста) вводили по 100 мкг вакцины туберкулезной («Предприятие по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. акад. Н.Ф. Гамалеи РАМН», г. Москва) в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда («Difco»). Повторные иммунизации проводили с интервалом 14 суток. Контрольной группе внутрикожно (в основании хвоста) вводили по 0,1 мл ФР.

Схемы введения водорастворимых полисахаридов. Оптимальная суточная доза ПС (10 мг/кг массы тела) была подобрана в предварительных экспериментах. В качестве положительного контроля в экспериментах in vivo использовали лико-пид в дозе 2 мг/кг и 10 мг/кг. Схема введения ПС и ликопида (в том числе и длительность курса) также была подобрана в предварительных экспериментах.

Для изучения влияния полисахаридов на иммунный ответ, индуцированный ЭБ, мышам вводили раствор ПС внутрибрюшинно 1 раз в сутки, начиная за 5 дней до иммунизации, всего 10 дней. Спустя 5 дней после иммунизации забирали материал для исследования. Мышам контрольной группы так же вводили то же количество ФР.

Введение ПС на фоне иммунизации OVA проводили по 2 схемам. При двукратной иммунизации животные опытной группы получали ПС в течение 5 дней после каждого введения OVA и за 5 дней до первого. При однократной иммунизации исследуемые вещества вводили 10 раз, начиная за 5 дней до инъекции OVA, а материал для исследования забирали через 5 дней после иммунизации.

Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность NO-синтазы и аргиназы перитонеальных макрофагов при развитии Thl и Th2 типа иммунного ответа. В настоящее время сложилось представление о наличии двух полярных типов активации макрофагов - классического и альтернативного. Классическая активация макрофагов вызывается действием ци-токинов Thl типа, прежде всего ИФН-у, приводит к появлению воспалительных характеристик (Ml), в то время как цитокины Th2 профиля (ИЛ-4, ИЛ-10) активируют макрофаги альтернативно, вызывая появление у них противовоспалительных свойств (М2) [Gordon S., 2003; Mantovani А., 2004]. Одним из важнейших различий этих двух групп макрофагов является разные пути метаболизма аргинина: классически активированные макрофаги метаболизируют его с помощью ин-дуцибельной NO-синтазы с образованием оксида азота и цитруллина; альтернативно активированные - с помощью аргиназы, продуктами которой являются мочевина и орнитин [Munder М., 1998; Kreider Т. et al., 2007].

Следует отметить, что большинство работ, посвященных изучению классической или альтернативной активации макрофагов, выполнены in vitro. В связи с этим остается не выясненным, появляются ли эти две группы макрофагов при иммунном ответе, когда в организме сочетается множество факторов, влияющих на формирование функциональных признаков макрофагов. Исследования, выполненные in vivo, в основном согласуются с данными, полученными in vitro [Loke P., 2002.; Nair M.G., 2005]. С другой стороны, хорошо известно об увеличении экспрессии индуцибельной NO-синтазы при бронхиальной астме - патологии, обусловленной Th2 типом иммунного ответа [Barnes P.J., 1998; Sanders S.P., 1999]. В связи с этим мы изучили состояние продукции оксида азота перитонеальными макрофагами и активность аргиназы.

На модели Thl-зависимого иммунного ответа (иммунизация БЦЖ [Kawamura I., 1992; Ravn P., 1997]) было обнаружено, что в результате трех введений БЦЖ наблюдалось повышение в 2,2 раза количества продуцируемого макрофагами N0, а также увеличивался в 1,8 раза уровень активности аргиназы (табл. 1). Кроме того, лимфоциты трижды иммунизированных животных индуцировали у интактных мышей ГЗТ и вырабатывали повышенное количество цито-кинов (IFN-y и ИЛ-2).

Иммунный ответ, индуцированной иммунизацией ЭБ, представляет собой еще одну модель Thl-зависимого иммунного ответа. Однократное введение ЭБ приводило к увеличению количества продуцируемого макрофагами оксида азота в 1,7 раза, в то время как активность аргиназы достоверно снижалась в 1,6 раза (табл. 1). В результате трех введений ЭБ повышения продукции оксида азота не наблюдалось, при этом активности аргиназы увеличивалась в 1,6 раз. Кроме того, однократно сенсибилизированные мыши вызывали реакцию ГЗТ и продуцировали повышенное количество цитокинов: в 1,6 раза (IFN-y) и 1,5 раза (ИЛ-2) больше контрольного уровня. При трехкратном введении ЭБ также увеличивалась реакция ГЗТ.

На модели ТЬ2-зависимого иммунного ответа, вызванного иммунизацией овальбумином [Oshiba A. et al., 1997; Denzler K.L. et al., 2001], в результате трехкратных сенсибилизирующих введений происходило повышение активности аргиназы, при этом наблюдалась тенденция к снижению продукции оксида азота (табл. 1). Полученные результаты согласуются с данными литературы о сдвиге баланса NO/аргиназы в сторону аргиназы при Th2 типе иммунного ответа [Сиа D.J., Stohlman S.A., 1997; Goerdt S., Orfanos C.E., 1999; Mosser D.M., 2003; Mantovani A. et al., 2004]. Выработка цитокинов лимфоцитами селезенки у однократно иммунизированных мышей не отличалась от контрольных значений. При этом резко снижалось количество продуцируемых лимфоцитами IFN-y и ИЛ-2 у мышей, сенсибилизированных трижды. Введение разрешающей дозы OVA на 7-й день после однократной иммунизации вызвало у всех животных (п=10 в каждой группе) анафилактическую реакцию слабой степени. Введение разрешающей дозы OVA трехкратно иммунизированным мышам привело к развитию тяжелой анафилактической реакции, исходом которой явилась гибель 92% животных. Полученные данные свидетельствуют о том, что для выраженной активации иммунитета однократного введения OVA было не достаточно; в результате же трех сенсибилизирующих инъекций развивался ТТ12-зависимый иммунный ответ.

Таким образом, можно заключить, функциональное состояние макрофагов (метаболизм аргинина) при развитии Thl типа иммунного ответа, индуцированного БЦЖ или эритроцитами барана, имеет черты как классической, так и альтернативной активации. Напротив, состояние макрофагов, появляющихся при развитии Th2 типа иммунного ответа, вызванного OVA, имеет черты альтернативной активации.

Таблица 1

Активность аргиназы и NO-сиитазы перитопеальных макрофагов прм иммунизации БЦЖ, эритроцитами барана и OVA (X+m)

Количество иммунизации Исследуемая группа Показатели

NO (конц. нитритов, мкМ) Аргиназа (единицы активности)

БЦЖ

1 Интактные (контроль) Иммунизированные (опыт) 32,5 ± 2,8 38,8+12,8 21,4 + 5,5 18,4 ±2,1

3 Интактные (контроль) Иммунизированные (опыт) 24,0 ± 5,8 53,6 + 7,3* 17,4 ±2,3 30,7 ± 4,0*

Эритроциты барана

1 Интактные (контроль) Иммунизированные (опыт) 36,4 ± 7,4 61,2 + 2,1* 5,91 ±0,68 3,60 ±0,49

3 Интактные (контроль) Иммунизированные (опыт) 53,8 ±7,3 52,6 ± 6,9 3,98 ± 0,68 6,27±0,50*

OVA

1 Интактные (контроль) Иммунизированные (опыт) 40,7 + 5,6 29,4+11,4 17,5 ±3,8 16,3 ±2,2

3 Интактные (контроль) Иммунизированные (опыт) 27,9 ± 7,0 18,4 + 6,4 12,1 ± 1,9 25,0 + 3,8*

Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) при сравнении с соответствующим показателем контрольной группы животных.

Исследование влияния водорастворимых ПС мать-и-мачехи in vivo на функциональное состояние макрофагов в модели Thl типа иммунного ответа показало, что курсовое введение ПС мать-мачехи при однократной иммунизации ЭБ приводило к увеличению продукции макрофагами N0 и не влияло на активность аргиназы. Препарат сравнения (ликопид) не влиял на данные показатели.

Влияние in vitro водорастворимых ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на баланс NO-синтазы/аргиназы и продукцию воспалительных и противовоспалительных цитокинов. В последние годы в мировой литературе появились сообщения о влиянии полисахаридов природного происхождения на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию макрофагальных клеток. Опираясь на литературные данные, для регуляции функционального состояния макрофагов были выбраны водорастворимые ПС из высших растений. В предварительных экспериментах были установлены оптимальные концентрации in vitro исследуемых веществ - до 20 мкг/мл. Кроме того, в экспериментах с использованием полимиксина В было установлено, что NO-активирующее действие растительных ПС не связано с наличием примеси эндотоксина в исследуемых образцах.

Действие полисахаридов мать-и-мачехи, календулы, аира, девясила на продукцию оксида азота макрофагами интактных мышей было оценено в сравнении со стандартным активатором макрофагов - липополисахаридом (ЛПС). Все ис-

следуемые вещества по действию на активность NO-синтазы макрофагов можно разделить на две группы (рис. 1): 1 - ПС мать-и-мачехи и аира по своему активирующему действию не уступали ЛПС; 2 - ПС девясила и календулы активировали NO-синтазу, но слабее, чем ЛПС. Из литературы известно, что активация макрофагов липополисахаридом индуцирует мощный Thl тип иммунного ответа за счет секреции ИЛ-12р70 [Barton G.M., Medzhitov R., 2002], что позволяет предполагать возможность стимуляции Thl типа иммунного ответа исследуемыми веществами.

ПС мать-и-мачехи ПСаира ПСкалендулы ПСдевясила

Рисунок 1. Влияние растительных полисахаридов на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами при их культивировании 48 часов. Примечание: *- различия с контролем достоверны, р<0,05.

Далее мы исследовали влияние ПС на баланс NO/Arg макрофагов. Если все изучаемые ПС повышали продукцию оксида азота, то действие на активность аргиназы было не однозначным (рис. 2). Так, ПС аира (10 мкг/мл) и календулы к 24 ч стимулировали, а к 48 ч подавляли активность аргиназы. ПС мать-и-мачехи сначала не влияли, а позже также ингибировали изучаемый показатель. ПС девясила, единственные из всех изученных веществ, после супрессивного действия к концу 48-часового культивирования проявляли стимулирующее действие.

□ контроль □ опыт

Ь—ri

Рисунок 2. Влияние растительных полисахаридов на активность аргиназы перитонеальных макрофагов при их культивировании 48 ч. Примечание: *- различия с контролем достоверны, р<0,05.

ПС матъ-и- ПС аира ПС ПС девясила

мачезд календулы

Действие растительных полисахаридов на продукцию основного воспалительного (ИЛ-12) и противовоспалительного цитокина (ИЛ-10) определяли в су-пернатантах культур макрофагов, выделенных из перитонеальной полости ин-тактных мышей, после 24 ч культивирования в присутствии 1 мкг/мл ЛПС (табл. 2). Получено, что ЛПС-индуцированная продукция ИЛ-10 под действием исследуемых полисахаридов не изменялась. Выработка ИЛ-12р70, напротив, значи-

тельно стимулировалась: в 5,3 раза (ПС аира), 9,8 раза (ПС мать-и-мачехи), 11,8 раза (ПС календулы) и 14,5 раза (ПС девясила).

Таблица 2

Влияние растительных полисахаридов на ЛПС-ивдуцированную продукцию ИЛ-12, ТКТ-а, ИЛ-10 пернтонеальными макрофагами мыши и мононуклеарами человека (Х±гп)

Исследуемое ИЛ-12 ИЛ-10 ТОТ-а

вещество (иг/мл) (нг/мл и пг/мл)# (пг/мл)

макрофаги

ЛПС (контроль) 4,4 ±5,1 2,28 ± 0,06

ПС мать-и-мачехи 43,2 ± 10,3* 2,57 ± 0,03

ПС аира 23,3 ± 2,7* 2,28 ± 0,07 -

ПС календулы 52,1 ± 9,0* 2,25 ± 0,01

ПС девясила 67,3 ±13,7* 2,47 ± 0,04

мононуклеары

ЛПС (контроль) 45,6 ±2,1 33,8 ±0,8

ПС мать-и-мачехи 49,1 ±4,3 76,7 ±5,1*

ПС аира - 45,1 ± 5,5 84,9 ± 7,8*

ПС календулы 40,4 ± 4,2 76,8 ± 9,4*

ПС девясила 44,6 ±2,1 76,9 ± 8,9*

Примечание: *- различия с контролем достоверны, р<0,05; # - единица измерения концентрации цитокина в культурах макрофагов составляет нг/мл, в культурах мононуклеа-ров - пг/мл.

Также было оценено влияние ПС на продукцию цитокинов воспалительного (ЮТ-а) и противовоспалительного (ИЛ-10) профиля мононуклеарами человека (табл. 2). Все исследуемые вещества стимулировали ЛПС-индуцированную продукцию ЮТ-альфа. Большинство полисахаридов (ПС мать-и-мачехи, календулы и девясила) увеличили продукцию цитокина в 1,6 раза, ПС аира в 1,8 раза. Наибольшее активирующее действие оказал мурамилдипептид, который увеличил выработку ТОТ-а в 2,4 раза. Стимулированные ЛПС мононуклеары периферической крови человека продуцировали достоверно больше ИЛ-10, при этом все изученные полисахариды подавляли продукцию ИЛ-10, стимулированную ЛПС, практически до уровня спонтанного контроля.

Таким образом, водорастворимые растительные полисахариды, полученные из фармакопейного сырья мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила, классически активируют макрофаги.

Некоторые механизмы действия ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на функциональное состояние перитонеальных макрофагов. Важную роль в передаче сигнала от рецептора к конкретному гену, а, следовательно, в определении признаков классической или альтернативной активации играют такие сигнальные молекулы, как МАРК и РОК. В связи с этими, мы исследовали роль внутриклеточных сигнальных молекул р38 и РБК в активации макрофага ПС календулы и девясила. Для этого были использованы ингибиторы р38 и РОК.

Культивирование самого ингибитора р38 с макрофагами не влияло на продукцию ими оксида азота. Стимулированная ЛПС продукция оксида азота значительно, но не полностью, подавлялась ингибитором р38. Стимулированная поли-

сахаридами продукция оксида азота была полностью супрессирована использованным ингибитором. Действие данного ингибитора на активность аргиназы было иным: ингибитор р38 не влиял на активность аргиназы, однако ее ЛПС-стимулированный уровень он полностью подавлял, что говорит о вовлечении р38 в механизм действия ЛПС. Активированная полисахаридами аргиназа не менялась в присутствии ингибитора р38, т.е. ПС не вовлекают р38 в активацию аргиназы.

Ингибитор другой сигнальной молекулы - PI3 киназы - резко снижал базисный уровень выработки оксида азота, примерно настолько же он подавлял продукцию N0 в культурах, содержащих ПС. Это говорит о том, что N0-стимулирующее действие полисахаридов полностью зависит от PI3 киназы. Ингибитор PI3 киназы также очень выражено снизил базисную активность аргиназы. Однако стимулированный как ЛПС, так и ПС уровень хотя и значительно снижался, но не подавлялся полностью. При этом в случае ПС это снижение было более выражено, чем в случае ЛПС. Эти результаты позволяют сказать, что в механизмах действия полисахаридов на аргиназу макрофагов PI3 киназа играет очень существенную роль.

Действие ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на ТЫ-зависимый иммунный ответ, индуцированный ЭБ. Известно, что при введении мышам ЭБ наблюдается развитие Thl-зависимого иммунного ответа [Li L. et al, 1994; Yokozeki H., 2000; Вельская H.B. и др., 2005]. Используя данную модель, мы изучили влияние водорастворимых растительных ПС на протекание Thl типа иммунного ответа, его клеточного и гуморального звена. В качестве позитивного контроля был использован ликопид. Курсовое введение ликопида и ПС мать-и-мачехи, календулы, аира активировало образование антителообразующих клеток у мышей, получавших ПС мать-и-мачехи, календулы, аира, ликопида (рис. 3). Так, ПС мать-и-мачехи повышали число АОК в 2,1 раза, ПС календулы - в 2,9 раза, ПС аира - в 2,7 раза. Ликопид также увеличивал число АОК в 1,8 раза и в 2 раза для большей и меньшей дозы соответственно. ПС девясила не влияли на этот показатель. Кроме того, ПС мать-и-мачехи и девясила стимулировали функциональную активность антителопродуцентов.

□ контроль в опыт

Z

Ф

Ф • С

£ СП О

ПС матъ-и- ПС аира мачехи

ПС ПС девясила ликопид календулы

Рисунок 3. Влияние растительных полисахаридов на количество АОК.

Примечание: *- различия с контролем достоверны, р<0,05.

При сопоставлении результатов экспериментов, показавших, что на фоне иммунизации полисахариды увеличивают число антителообразующих клеток, но не всегда оказывают влияние на синтез гемагглютининов, возник вопрос: не связано ли это с прямым митогенным действием полисахаридов на В-лимфоциты? Для ответа на этот вопрос и для выяснения наличия у ПС костимуляторных свойств, было оценено влияние полисахаридов на пролиферацию лимфоцитов селезенки интактных мышей (прямое митогенное действие) и на пролиферацию В-лимфоцитов, индуцированную липополисахаридом (костимуляторное действие). В качестве вещества сравнения использовали мурамилдипептид (МДП) в концентрации 5 мкг/мл. Проведенные эксперименты показали, что только МДП стимулировал пролиферацию лимфоцитов, культивированных без митогена и в присутствии ЛПС. Все исследованные полисахариды не оказывали митогенного действия и не стимулировали митогениндуцированную пролиферацию В-лимфоцитов. То есть, увеличение количества АОК не связано с прямым действием полисахаридов на В-клетки.

Влияние ПС и ликопида на клеточное звено ТЫ типа иммунного ответа было оценено по интенсивности реакции ГЗТ (рис. 4). Курсовое введение ПС аира, мать-и-мачехи и девясила усиливало реакцию ГЗТ почти в 2 раза. Ликопид также почти вдвое увеличивал реакцию, а ПС календулы не влияли на нее.

□ контроль п опыт

ПС иать-и- ПС аира ПС ПС ликопид

мачехи календулы девясила

Кроме того, действие ПС аира на поляризованные лимфоциты было также оценено в адоптивной реакции ГЗТ (Thl-зависимая реакция) и адоптивной реакции локального воспаления (Т112-зависимая реакция). Для этого интактным мышам в подушечки задних лап кроме сингенных спленоцитов трижды иммунизированных БЦЖ или OVA животных с соответствующим антигеном (БЦЖ или OVA) вводили либо ФР (контроль), либо ПС аира (опыт). Через 24 ч было получено, что в присутствии ПС аира наблюдалось усиление в 1,8 раза Thl-зависимой реакции и снижение почти до нуля Независимой реакции. Эти результаты свидетельствуют о том, что ПС аира обладают способностью сдвигать баланс Thl/Th2 в сторону Thl.

Действие ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на ТЪ2-зависимый иммунный ответ, индуцированный овальбумином. Исследование действия ПС на ТЬ2 тип иммунного ответа показало, что они подавляли реакции ТЪ2 типа. Так, растительные полисахариды уменьшали летальность животных в результате анафилактического шока, при этом действие ликопида и ПС календулы было незначительным (снижение летальности на 10%), а ПС мать-и-мачехи уменьшали смертность на 33%, ПС аира на 25%, ПС девясила на 20%. Кроме того, курсовое введение изучаемых ПС приводило к снижению содержания ^Е и в сыворотке крови (рис. 4). Так, концентрация ^Е у однократно иммунизированных мышей уменьшалась в 1,5 раза после курса полисахаридов мать-и-мачехи и аира; и в 2 раза после инъекций полисахаридов календулы и девясила. При двукратной иммунизации были исследованы только полисахариды мать-и-мачехи и аира, содержание которых снизилось более чем в 2,5 и 3,5 раза, соответственно. Ликопид на фоне однократной сенсибилизации не влиял на данный показатель, а при двукратной понижал его в 3,4 раза.

Рисунок 5. Влияние растительных полисахаридовна на содержание IgE в сыворотке крови иммунизированных OVA мышей.

Примечание: *- различия с контролем достоверны, р<0,05.

однократная иммунизация двухкратная иммунизация □ контроль в ПС мать-и-мачехи □ ПС аира

□ ПС календулы

в ПС девясила

Курсовое введение исследуемых веществ приводило также к снижению концентрации иммуноглобулинов G1 в сыворотке крови дважды иммунизированных мышей: в 2,1 раза (ПС аира), в 1,3 раза (ПС мать-и-мачехи), в 1,9 раза (ПС календулы) и в 2 раза (ПС девясила). Ликопид уменьшал данный показатель в 1,8 раза.

5 -

Рисунок 6. Влияние растительных полисахаридов на содержание IgGl в сыворотке крови иммунизированных OVA мышей.

Примечание: *- различия с контролем достоверны, р<0,05.

двухкратная иммунизация □ контроль □ ПС мать-и-мачехи пПСаира

а ПС календулы в ПС девясила □ ликопид

Также было оценено влияние полисахаридов, полученных из мать-и-мачехи, на продукцию 1цЕ- и -аллерген-специфических антител в сыворотке иммунизированных овальбумином мышей с использованием метода пассивной кожной анафилаксии. В результате курсового введения ПС наблюдалось снижение уровня специфических к овальбумину ^С1 антител в сыворотке крови мышей: реакция ПКА снижалась на 60%, на 85% и на 90% при разведениях сыворотки 1/4, 1/8 и 1/16 соответственно. Кроме того, наблюдалось снижение уровня аллерген-специфических 1§Е антител: реакция ПКА уменьшалась более чем на 70% в зависимости от разведения сыворотки.

Таким образом, изучение влияния водорастворимых растительных полисахаридов на иммунную систему показало, что данные вещества, во-первых, обладают иммунотропной активностью, а, во-вторых, при курсовом введении стимулируют ТЫ и подавляют ТИ2 тип иммунного ответа.

В заключении следует заметить, что полученные данные позволяют яснее понять механизмы, лежащие в основе регуляции иммунного ответа и роль в этом макрофагальных клеток. Исследованные вещества проявили способность классически активировать макрофаги, с развитием воспалительных свойств, что позволяет рассматривать растительные полисахариды в качестве кандидатов на роль фармакологических корректоров иммунного ответа. Такие лекарственные средства, стимулирующие ТЫ-зависимые иммунологические реакции, могут быть полезны в лечении хронических, вялотекущих инфекционных заболеваний, а также при иммунотерапии онкологической болезни. Кроме того, обнаруженные нами способности растительных полисахаридов подавлять ТЪ2 тип иммунного ответа может быть развито в препараты для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. При развитии как ТЫ, так и ТЬ2 типа иммунного ответа активность аргиназы перитонеальных макрофагов повышается. Синтез оксида азота увеличивается только при ТЫ типе ответа.

2. Курсовое введение водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи при однократной иммунизации эритроцитами барана приводит к увеличению продукции оксида азота перитонеальными макрофагами и не влияет на активность аргиназы.

3. Водорастворимые растительные полисахариды стимулируют продукцию перитонеальными макрофагами оксида азота, при этом полисахариды мать-и-мачехи и аира по своему действию не уступают ЛПС, а полисахариды девясила и календулы активируют ЫО-синтазу слабее, чем ЛПС. Активирующее действие водорастворимых растительных полисахаридов не связано с примесью в исследуемых образцах эндотоксина.

4. На фоне активации макрофагов липополисахаридом полисахариды аира не влияют на продукцию оксида азота, полисахариды календулы ее ингибируют, а полисахариды мать-и-мачехи и девясила, напротив, стимулируют. При этом полисахариды мать-и-мачехи ингибируют активность аргиназы, в то время как поли-

сахариды аира, календулы и девясила влияют разнонаправлено в зависимости от длительности культивирования.

5. Растительные полисахариды стимулируют продукцию провоспалитель-ных цитокинов: ИЛ-12 перитонеальными макрофагами и TNF-альфа мононуклеа-рами периферической крови человека. Растительные полисахариды не влияют или полностью подавляют ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-10 (перитонеальными макрофагами и мононуклеарами периферической крови человека, соответственно).

6. По механизму действия водорастворимые полисахариды календулы и девясила отличаются от ЛПС: их NO-активирующее влияние полностью зависит от р38 и PI3 киназы, а стимуляция активности аргиназы не требует вовлечения р38, но частично зависит от PI3K пути.

7. Курсовое введение водорастворимых растительных полисахаридов стимулирует Thl иммунный ответ, при этом полисахариды девясила влияют только на клеточное его звено, а полисахариды календулы - на гуморальное. Все исследованные вещества не оказывают прямого митогенного действия на В-лимфоциты.

8. Курсовое введение водорастворимых растительных полисахаридов подавляет Th2 иммунный ответ: все изученные вещества ингибируют продукцию В-лимфоцитами иммуноглобулинов классов Е и Gl, а полисахариды мать-и-мачехи и аира существенно уменьшают тяжесть анафилактического шока.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Экспрессия аргиназы перитонеальными макрофагами и продукция ими оксида азота при Thl- и ТЬ2-зависимом иммунном ответе // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2007. Приложение 1. С. 97-100 (соавторы М.Г. Данилец, Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов).

2. Влияние водорастворимых полисахаридных комплексов из листьев мать-и-мачехи на Thl- и ТЬ2-зависимый иммунный ответ / Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии (материалы конференции). Изд-во Томского университета. Томск, 2007. С. 88-90.

3. Исследование иммунорегуляторных свойств полисахаридов из растительного сырья. / Создание новых лекарственных препаратов (материалы конференции). Издательство Томского университета. Томск, 2007. С. 53-55 (соавторы М.Г. Данилец, Ю.П. Вельский, Е.С. Трофимова и др.).

4. Молекулы внутриклеточного сигналинга активации макрофага при опухолевом росте: поиск терапевтических мишеней // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23, № 3 (вып. 1). С. 84-85 (соавторы Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, М.Г. Данилец и др.).

5. Влияние водорастворимых полисахаридов девясила на продукцию NO и экспрессию аргиназы макрофагами мыши // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23, № 3 (вып. 1). С. 121-122 (соавторы A.A. Лигачева, М.Г. Данилец, Н.В. Вельская и др.).

6. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию IgE и IgGl // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23, № 3 (вып. 1). С. 102 (соавторы A.A. Лигачева, М.Г. Данилец, Н.В. Вельская и др.).

7. Роль р38 и PI3K в активации макрофагов водорастворимыми полисахаридами календулы и клевера // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23, № 3 (вып. 1). С. 92 (соавторы М.Г. Данилец, Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская и др.).

8. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию иммуноглобулинов классов Е и Gl лимфоцитами мышей, сенсибилизированных овальбумином // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2008. Т. 146 (№ 11). С. 520-522 (соавторы М.Г. Данилец, Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский и др.).

9. Макрофаги как фармакологическая мишень для регуляции баланса Thl/Th2 // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2008. Приложение № 2. С. 63-68 (соавторы М.Г. Данилец, A.M. Гурьев, Н.В. Вельская и др.).

Ю.Противоатопическое действие полисахаридов аира. // Российский аллерголо-гический журнал (Сб. трудов X Международного Конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Казань, 20-23 мая 2009, поев. 100-летию со дня рожд. акад. АМН А.Д. Адо.). 2009. № 3, вып. 1. С. 442. (соавторы М.Г Данилец., Н.В Вельская., Ю.П Вельский и др.)

ПАТЕНТЫ

1. Патент РФ № 2337699 от 10.11.2008 г. «Средство, обладающее иммуномоду-лирующей активностью» (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, М.Г. Данилец и др.).

2. Патент РФ № 2337700 от 10.11.2008 г. «Средство, обладающее противоаллергическим действием» (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, М.Г. Данилец и др.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОК - антителообразующие клетки

АПК - антиген-презентирующие клетки

ГЗТ - реакция гиперчувствительности замедленного типа

ГНТ - реакция гиперчувствительности немедленного типа

ЕА - единица активности

ИЛ - интерлейкины

ЛПС - липополисахарид

Ml и М2 - макрофаги 1 и 2 типа

МДП - мурамилдипептид

ПКА - пассивная кожная анафилаксия

ПС - полисахариды

ФР - физиологический раствор хлорида натрия

ЭБ - эритроциты барана

IFN -интерферон

Ig- иммуноглобулины

МАРК - митоген-активируемая протеин-киназа (mitogen associated protein kinase)

NO - оксид азота

OVA - овальбумин

PI3K - фосфоинозитол-3-киназа

Th- Т-хелперы

TNF - фактор некроза опухоли

Отпечатано в ООО «Графика» 634050, Россия, г. Томск, ул. Беленца, 17 тел. (382-2) 52-65-15 E-mail:gra£ic@mail.tomsknet.ru www.grafica.tomsk.ru Заказ № 2561 от 07.07.2009 Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы. Известно, что недостаточная либо избыточная поляризация Т-хелперов (Th) лежит в основе патогенеза аутоиммунных, аллергических, хронических инфекционных и онкологических заболеваний. Поиск веществ, способных регулировать баланс Thl/Th2, является одной из ключевых задач современной иммунофармакологии.

Известно, что поляризация лимфоцитов зависит от функционального состояния антиген-презентирующих клеток, среди которых макрофаги занимают особое место, представляя собой важнейший элемент как системы естественной резистентности, так и приобретенного иммунитета. Они обеспечивают направление поляризации, продуцируя в раннюю фазу взаимодействия организма с антигеном цитокины и стимулируя развитие Thl (ИЛ-12) или Th2 тип иммунного ответа (ИЛ-10) [Alzona М. et al, 1995; Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000; Mosser D.M., 2003; Gutcher I., Becher В., 2007].

Подобно Т-хелперам, клетки моноцитарно-макрофагального ряда также поляризуются в макрофаги 1 (Ml) и макрофаги (М2) типа [Mills C.D. et al., 2000; Mantovani A. et al., 2004]. Ml клетки обладают воспалительными свойствами и способностью поддерживать Thl-зависимые иммунные реакции: продуцируют медиаторы воспаления (например, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, NO, TNF-a), проявляют повышенную способность фагоцитировать микроорганизмы, способствуют деструкции экстрацеллюлярного матрикса, стимулируют апоптоз инфицированных (а также трансформированных) клеток [Goerdt S., Orfanos С.Е., 1999; Ehrt S. et al., 2001; Mosser D.M., 2003; Mantovani A., 2006]. Макрофаги M2 проявляют противовоспалительные характеристики, подавляют Thl ответ и способствуют протеканию Th2 ответа: секретируют вещества, противодействующие воспалению (ИЛ-10, антагонист рецептора ИЛ-1, трансформирующий фактор роста ß), экспрессируют аргиназу 1, продукты которой обеспечивают биосинтез белков, способствуют ангиогенезу, восстановлению поврежденной ткани, ремоделированию, очищают место воспаления от разрушенных тканей (в том числе от клеток, подвергшихся апоптозу), продуцируют хемоаттрактанты для привлечения Th2 [Goerdt S., Orfanos C.E., 1999; Ehrt S. et al., 2001; Mosser D.M., 2003; Mantovani A., 2006].

Одним из важнейших различий этих двух групп макрофагов, их маркерной чертой, является разные пути метаболизма аргинина: классически активированные макрофаги метаболизируют его с помощью индуцибельной NO-синтазы с образованием оксида азота и цитруллина; альтернативно активированные - с помощью аргиназы, продуктами которой являются мочевина и орнитин [Munder М. et al., 1998; Kreider Т. et al., 2007].

Кроме цитокинового микроокружения тип активации макрофагов определяет и сам микроорганизм. Известно, что антиген-презентирующие клетки (АПК) несут на своей поверхности набор рецепторов (TLR, NLR, маннозный, скавенжер рецептор и др.), с помощью которых взаимодействует с патоген-ассоциированными структурами грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, грибов, вирусов [Gordon S. 2002; Medzhitov R., et al., 2000; Crocker P.R. 2005]. Среди компонентов, определяемых паттерн-распознающими структурами макрофагальных клеток, находятся и полисахариды. Показано, что полисахариды микроорганизмов, грибов [Wasser S.P., 2002] и высших растений [Paulsen B.S., 2001; Kayser О. et al., 2003] обладают иммуномодулирующими свойствами благодаря способности изменять функциональное состояние антиген-презентирующих клеток (макрофаги и дендритные клетки) [Vecchiarelli А. 2000; Monari С. et al., 2002; Chiapello L. S. et al., 2003; Monari C. et al., 2003; Vecchiarelli A. et al., 2003; Stingele F. et al., 2004]. Большинство полисахаридов из высших растений обладают низкой токсичностью и отсутствием нежелательных побочных эффектов, свойственных бактериальным и синтетическим полисахаридам, что делает их привлекательными для разработки фармакологических средств с иммуномодулирующей, противоопухолевой и ранозаживляющей активностью [Schepetkin I.A., et al., 2006].

Известно, что различные полисахариды могут связываться практически со всеми рецепторами антиген-презентирующих клеток [Schepetkin I.A.,Quinn М.Т., 2006], влиять на продукцию иммунорегуляторных цитокинов, на экспрессию различных молекул адгезии [Tzianabos А.О. 2000; Retini С., et al., 2001]. Так, например, полисахарид, выделенный из Acetobacter, распознавался рецептором макрофагов TLR-4 и индуцировал продукцию ИЛ-12, подавляя таким образом развившийся Th2 иммунный ответ [Saito К. et al, 2003] или стимулируя Thl иммунный ответ [Li W., et al., 2004]. Полисахариды, выделенные из другого источника (из Cryptococcus neoformans), напротив, индуцировали Th2 тип поляризации, вызывая^ активацию соответствующего типа макрофагов [Almeida G.M., et al., 2001].

Учитывая огромную роль, которую играют макрофаги, представляется, актуальным выявить вещества, обладающие способностью регулировать функциональное состояние этих клеток.

Целью исследования явилось изучение влияния водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственнолй, девясила высокого на функциональное состояние макрофагов и иммунный ответ Thl и Th2 типов.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние активности NO-синтазы и аргиназы перитонеальных макрофагов при развитии Thl и Th2 типа иммунного ответа.

2. Исследовать влияние in vitro водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов и продукцию воспалительных и противовоспалительных цитокинов.

3. Вскрыть некоторые механизмы регуляторного действия водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на функциональное состояние перитонеальных макрофагов (роль внутриклеточных мессенджеров PI3K и р38 МАРК).

4. Оценить действие водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на Thl-зависимый иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана.

5. Изучить влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила на ТЬ2-зависимый иммунный ответ, индуцированный овальбумином.

Научная новизна. В работе впервые изучен баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов животных с Thl и Th2 иммунным ответом, а также влияние водорастворимых полисахаридов, полученных из мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила, на эти типы ответа. Впервые проведено сравнение действия in vitro растительных полисахаридов (мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственнолй, девясила высокого) и липополисахарида на баланс NO-синтазы/аргиназы перитонеальных макрофагов и обнаружена их способность как к синергичному, так и к антагонистическому действию. Впервые изучено действие полисахаридов (мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственнолй, девясила высокого) на цитокинпродуцирующую активность макрофагов и мононуклеаров периферической крови человека. Показано, что данные вещества по совокупности результатов влияния на продукцию цитокинов (ИЛ-12, TNF-a и ИЛ-10) поддерживают воспалительные свойства макрофагов. При этом впервые была выявлена роль некоторых внутриклеточных мессенджеров (PI3K, МАРК) в наблюдаемых эффектах. Впервые показано, что курсовое введение ПС мать-и-мачехи, аира, календулы и девясила стимулирует Thl тип иммунного ответа. Впервые установлено, что исследуемые растительные полисахариды проявляют противоаллергическое действие, подавляя анафилаксию и продукцию аллерген-специфических иммуноглобулинов.

Практическое значение работы. Полученные данные делают возможность яснее понять механизмы, лежащие в основе регуляции иммунного ответа и роль в этом макрофагальных клеток. Результаты, полученные при выполнении данной работы, позволяют обосновать-использование водорастворимых растительных полисахаридов (мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственнолй, девясила высокого) для коррекции иммунного ответа ТЫ и ТЫ типа. Установлено, что исследованные полисахариды обладают иммуномодулирующей активностью. Полученные данные могут лечь в основу дальнейших исследований с целью получения новых фармакологических иммуномодуляторов, стимулирующих ТЫ-зависимые иммунологические реакции, а также средств для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Функциональное состояние макрофагов (метаболизм аргинина) при развитии^ ТЫ типа иммунного ответа, индуцированного БЦЖ или эритроцитами барана, имеет черты как классической, так и альтернативной активации. Напротив, состояние макрофагов, появляющихся при развитии ТИ2 типа иммунного ответа, вызванного овальбумином, имеет черты альтернативной активации.

2. Водорастворимые растительные полисахариды, полученные из фармакопейного сырья мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, календулы лекарственной и девясила высокого, классически активируют перитонеальные макрофаги.

3. Водорастворимые растительные полисахариды при курсовом введении стимулируют ТЫ и подавляют ТЫ тип иммунного ответа.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), на X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных статей, из них 5 в изданиях, рекомендуемых ВАК; по результатам проведенных исследований получено 2 патента на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 5 рисунками и 30 таблицами. Библиографический указатель включает 205 источник, в том числе 56 отечественных и 149 иностранных.

132 ВЫВОДЫ

1. При развитии как ТЫ, так и 1112 типа иммунного ответа активность аргиназы перитонеальных макрофагов повышается. Синтез оксида азота увеличивается только при ТЫ типе ответа.

2. Курсовое введение водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи при однократной иммунизации эритроцитами барана приводит к увеличению продукции оксида азота перитонеальными макрофагами и не влияет на активность аргиназы.

3. Водорастворимые растительные полисахариды стимулируют продукцию перитонеальными макрофагами оксида азота, при этом полисахариды мать-и-мачехи и аира по своему действию не уступают ЛПС, а полисахариды девясила и календулы активируют ТЧО-синтазу слабее, чем ЛПС. Активирующее действие водорастворимых растительных полисахаридов не связано с примесью в исследуемых образцах эндотоксина.

4. На фоне активации макрофагов липополисахаридом полисахариды аира не влияют на продукцию оксида азота, полисахариды календулы ее ингибируют, а полисахариды мать-и-мачехи и девясила, напротив, стимулируют. При этом полисахариды мать-и-мачехи ингибируют активность аргиназы, в то время как полисахариды аира, календулы и девясила влияют разнонаправлено в зависимости от длительности культивирования.

5. Растительные полисахариды стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов: ИЛ-12 перитонеальными макрофагами и ТИБ-альфа мононуклеарами периферической крови человека. Растительные полисахариды не влияют или полностью подавляют ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-10 (перитонеальными макрофагами и мононуклеарами периферической крови человека, соответственно).

6. По механизму действия водорастворимые полисахариды календулы и девясила отличаются от ЛПС: их ТЫО-активирующее влияние полностью зависит от р38 и Р13 киназы, а стимуляция активности аргиназы не требует вовлечения р38, но частично зависит от Р13К пути.

7. Курсовое введение водорастворимых растительных полисахаридов стимулирует ТЫ иммунный ответ, при этом полисахариды девясила влияют только на клеточное его звено, а полисахариды календулы - на гуморальное. Все исследованные вещества не оказывают прямого митогенного действия на В-лимфоциты.

8. Курсовое введение водорастворимых растительных полисахаридов подавляет ТЪ2 иммунный ответ: все изученные вещества ингибируют продукцию В-лимфоцитами иммуноглобулинов классов Е и 01, а полисахариды мать-и-мачехи и аира существенно уменьшают тяжесть анафилактического шока.

Заключение

Макрофаги являются частью системы мононуклеарных фагоцитов, которая объединяет монобласты, промоноциты, моноциты и тканевые макрофаги. Тканевые макрофаги-резиденты первыми реагируют на индукторы воспаления, генерируя широкий набор биологичеки активных веществ. Считается, что они играют роль сенсоров воспаления и тканевой регенерации. В случае какого-либо локального отклонения ткани от нормы, например, при инфекции, нарушениеи самовосстановления ткани, заживлениеи раны, опухолевом росте, злокачественной трансформации, развивается быстрое рекрутирование макрофагов. Этот процесс обозначают как активация макрофагов, качество таких макрофагов зависит от их локализации и индуцирующих стимулов.

Одними из важнейших функций макрофагов является фагоцитоз и секреция различных молекул. Макрофаги способны распознать патоген непосредственно через мембранные рецепторы для опсонинов либо через лектины микробов и фагоцитов. Кроме того, макрофаги способны продуцировать и секретировать более 100 различных молекул. К ним относят различные гормоны, ингибиторы протеаз, компоненты комплемента, компоненты внутриклеточного матрикса (хондроитин сульфат, тромбоспондин), различные кислородные радикалы, ростовые факторы и лизоцим. Важнейшими продуктами секреции макрофагов являются провоспалительные (ИЛ-1, ИЛ-6, TNF-a, ИЛ-8 на ИЛ-12) и противовоспалительные (ИЛ-10, TGF-f3, ИЛ-1га) цитокины.

Поляризованные лимфоциты создают условия для активации макрофагов. Цитокины Thl профиля классически активируют макрофаги, поляризуя их в М1 тип с преобладанием воспалительных свойств. Цитокины Th2 альтернативно активируют макрофаги с развитием у них противовоспалительных характеристик (М2). Поляризованные макрофаги различаются по экспрессируемым рецепторам, продукции цитокинов, эффекторным функциям и репертуару хемокинов.

М1 осуществляют защиту от внутриклеточных микроорганизмов, обладают противоопухолевой активностью и способны поддерживать Thl тип иммунного ответа. М2 в здоровом организме присутствуют в плаценте и легких, где предотвращают развитие нежелательного воспаления или иммунологических реакций. М2 клетки обнаружены в фазу заживления раны в ходе острых воспалительных реакций, при хронических воспалительных заболеваниях, при гельминтозах.

Важнейшими активаторами макрофагов являются микроорганизмы. Макрофаги распознают практически все микроорганизмы, связываясь с их патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (РАМР) через особые рецепторы - паттерн-распознающие структуры (PPR). Выделяют 3 группы PPR: растворимые рецепторы, подобные комплементу, Toll-like рецепторы (TLR) и внутриклеточные рецепторы группы NOD.

Полисахариды представляют собой структурный элемент бактериальной стенки, вероятно, поэтому многие ПС могут активировать макрофагальные клетки. Показано, что иммуномодулирующими свойствами обладают полисахариды микроорганизмов, грибов и высших растений. Полисахариды растительного происхождения могут проявлять противовоспалительные, антигипогликемические, антибактериальные и противоопухолевые свойства. Наиболее хорошо охарактеризованы следующие химические группы ПС: амфотерные ПС капсулярного полисахаридного комплекса микроорганизмов, (3-(1-3)-глюканы, маннаны, связанные с протеинами полисахариды, гиалуроновая кислота.

Большинство полисахаридов из высших растений обладают низкой токсичностью, отсутствием нежелательных побочных эффектов, свойственных бактериальным и синтетическим ПС, способностью стимулировать цитотоксическую, противомикробную и противоопухолевую активность макрофагов. Растительные ПС могут активировать макрофагальные клетки через TLR4, CR3, скавенжер рецептор, маннозный рецептор и дектин-1. Это приводит к активации сигнальных каскадов, в результате чего изменяется продукция цитокинов и других медиаторов.

Таким образом, растительные полисахариды обладают низкой токсичностью, высокой иммунотропной активностью и являются перспективным инструментом регуляции функционального состояния макрофагальных клеток.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Животные. Эксперименты проведены на мышах линии Balb/c, C57BL/6Y, беспородные мыши и крысы (всего 778): Распределение животных по сериям экспериментов представлено в таблице 1. Использованы животные обоего пола в возрасте 8-12 недель, полученные из питомника НИИ фармакологии СО РАМН (1 категории согласно сертификату), а также крысы-самцы в возрасте 4 мес. Животные содержались в неполной барьерной системе (воздухообмен составлял 10-12 крат/ч, температура 22±2°С, влажность 55±10 %, световой режим 12:12 ч). Животные размещались в клетках (VELAZ) со стерилизованной мелкой стружкой в качестве подстила, имели постоянный доступ к пище (стерилизованный гранулированный корм) и воде (кипяченая питьевая вода, подкисленная соляной кислотой до pH 4-4,5).

Получение полисахаридов. Полисахариды (ПС) были выделены из фармакопейного растительного сырья на кафедре химии СибГМУ по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975]. Сырье -листья мать-и-мачехи обыкновенной (Tussilago farfara L.), корневища аира болотного (Acorus calamus L.), цветы календулы лекарственной {Calendula officinalis L.), корневища девясила высокого (Inula helenium L.) - измельчали и просеивали через сита с размером пор 1 и 3 мм, экстрагировали водой при перемешивании в течение 30-180 мин при нагревании на водяной бане (температура 80-100°С), при соотношении сырье: экстрагент от 1:10 до 1:50. После этого сырье с экстрагентом оставляли на время от 6 до 36 часов в прохладном месте для настаивания. Затем экстрагент отделяли от сырья фильтрованием, экстракцию повторяли вновь в тех же условиях. После фильтрации полученные извлечения объединяли и упаривали до 1/5 объема.