Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическая регуляция функционального состояния макрофагов при иммунном ответе

На правах рукописи

ДАНИЛЕЦ МАРИНА ГРИГОРЬЕВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МАКРОФАГОВ ПРИ ИММУННОМ ОТВЕТЕ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 1 АП^ 2011

Томск - 2011

4844310

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

Дыгай Александр Михайлович

доктор медицинских наук

Вельский Юрий Павлович

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор

Чердынцева Надежда Викторовна

д.б.н, профессор

Ветлугина Тамара ГТарфёновна

д.б.н., профессор

Толстикова Татьяна Генрнховна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Москва

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармаколотии СО РАМН.

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Защита состоится «_»

2011 года в

часов на

доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Макрофаги фенотипически и функционально гетерогенны и могут проявлять противоположную по своей сути активность, например, развивать воспаление либо купировать его, индуцировать иммунный ответ либо поддерживать его толерантность, разрушать ткани либо участвовать в их репарации и построении межклеточного матрикса [Stout R.D., SuttJes J., 2004]. Свойства макрофагов являются результатом воздействия многих факторов, включая цитокины, хемокины, адренергические и холинергическне агонисты, гормоны, иммуноглобулины, жирные кислоты. Как элемент врожденного иммунитета, макрофага обеспечивают первую линию защиты от микроорганизмов, аллергенов, трансформированных клеток, вырабатывая микробицидные факторы, привлекая других участников неспецифической резистентности, регулируя сосудистый тонус в месте воспаления, а также фагоцитируя и уничтожая инфекционные агенты.

Макрофаги являются также одним из звеньев, связывающих врожденный и приобретенный иммунитет благодаря способности презентнровать иммунокомпетентным клеткам чужеродные антигены, выделять хемокины, привлекающие лимфоциты к очагу воспаления, а также вырабатывать цитокины, способствующие протеканию иммунологических реакций. От поведения антигенпрезентирующей клетки (прежде всего, макрофага и дендритной клетки) в первую фазу иммунного воспаления зависит тип развивающегося иммунного ответа: продуцируя IL-I2 или IL-I0, они способствуют развитию Thl или Th2 типа иммунного ответа [Alzona М. et al., 1995; Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000; Mosser D.M., 2003; Gutcher I., Becher В., 2007].

В свою очередь, цитокины поляризованных Т-хелперов индуцируют активацию макрофагов, причем качественно различную. Большинство функций макрофагов, которые традиционно ассоциировались с их активацией (фагоцитоз микроорганизмов, микробицидная активность, индукция воспаления, противоопухолевая активность), стимулируются цитокинами Thl, прежде всего, - IFN-y. Такую активацию макрофагов стали называть классической [Gordon S., 2003; Mantovaui A. et al., 2004, 2005]. Цитокины Th2 (ÍL-4, IL-10), в свою очередь, не просто подавляют классическую активацию, но вызывают появление у макрофагов качественно иных свойств. Эти макрофаги способствуют образованию межклеточного матрикса, репарации и ремоделированию тканей, подавляют воспаление, стимулируют сосудообразование, фагоцитируют апоптотические клетки [Martinez F.O., 2008]. Такую активацию макрофагов стали обозначать термином «альтернативная активация» [Gordon S., 2003; Mantovani A. et al., 2004,2005].

Для классически активированных макрофагов (Ml) характерна продукция воспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-12, TNF-a, стимуляция

цнклооксигеназы (СОХ) и индуцибельной NO-синтазьг (iNOS). Для альтернативно активированных макрофагов (M2) характерна продукция противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF-ß, антагониста рецептора IL-I (IL-lRa), экспрессия печеночной аргиназы [Mantovani A. et al., 2004, 2005].

У активированных макрофагов резко повышается потребление L-аргинина: Ml с помощью индуцибельной NO-синтазы преобразуют его в оксид азота и цитруллин; М2 с помощью аргиназы - в мочевину и орнитин [Münder M., 1998]. Макрофаг утилизирует L-аргинин преимущественно по одному из путей - либо через NO-синтазу, либо через аргиназу, что позволило рассматривать метаболизм аргинина как показатель типа активации макрофага [Munder M. et al., 1998; Kreider T. et al., 2007].

Хотя и Ml, и M2 клетки способны к фагоцитозу, это их свойство качественно различается. Известно, что активаторы Ml (IFN-y и TNF-a) увеличивают экспрессию CR3 и чрезвычайно мощно усиливают способность макрофагов к FcyR-опосредованному фагоцитозу и внутриклеточному киллингу патогенов [Erbe D.V. et al., 1990, Corradm S.B. et al., 1991; Drevets D.A. et al., 1996; Trinchieri G., Gerosa F., 1996; Ahmed J.S., 2002; Berclaz P.-Y. et al., 2002]. Фагоцитоз апоптотических клеток является признаком альтернативной активации [Rathmell J.С., Thompson C.B., 1999; Savill J. et al., 2002].

Макрофаги представляют собой важный регуляторный элемент гемопоэза [Дыгай A.M., Жданов В., Удут Е.В., 2009; Дыгай A.M., Жданов В., 2010]. Известно, что при иммунном ответе функционирование кроветворной ткани меняется (ТЫ ответ сопровождается выходом в кровеносное русло нейтрофильных гранулоцитов, а клиническим признаком Th2 является повышенное содержание эозинофильных гранулоцитов). Показано, что сиалоадгезин (CD 169) - иммуноглобулиноподобный рецептор семейства Siglec - экспрессируется на резидентных макрофагах костного мозга и лимфоидных органов [Crocker P.R., Gordon S., 1989], опосредует адгезию Т- и B-лимфоцитов с макрофагами лимфоидной ткани [van den Berg Т.К. et al., 1992], участвует в иммунном воспалении [Hartneil A. et al., 2001; Kumamoto Y. et al., 2004; Ikezumi Y. et al., 2005]. При Thl-зависимых состояниях экспрессия сиалоадгезина повышается [Hartneil A. et al., 2001; Kumamoto Y. et al., 2004]. Рецептор к эритробластам (CD163) -член семейства скавенджер-рецепторов - может связываться с бактериями и индуцировать локальное воспаление [Babs О. et al, 2009]. Воспалительные стимулы (ЛПС, IFN-y и TNF-a) подавляют экспрессию CD 163, а противовоспалительные (IL-10 и дексаметазон), напротив, резко ее повышают [Buechler С. et al., 2000].

В отличие от лимфоцитов, которые, единожды поляризовавшись, не меняют свою ориентацию, макрофаги способны изменять свой поляризационный профиль [Gratchev A. et al., 2006]. Именно благодаря этой пластичности они представляют собой перспективную фармакологическую мишень для регуляции баланса Thl/Th2. Однако в настоящее время не существует иммуномодуляторов, разрешённых к медицинскому

применению, обладающих способностью изменять баланс Thl/Th2 клеток в желаемом направлении [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000а], что объясняет востребованность в поиске препаратов с доказанной селективной способностью к регуляции этого баланса.

В нашей работе в качестве регуляторов функционального состояния были выбраны водорастворимые полисахариды высших растений (аир болотный, береза повислая, девясил высокий, календула лекарственная, клевер луговой, полынь горькая, мать-и-мачеха обыкновенная), альгинат кальция (кальциевая соль альпшовых кислот, полученная из бурых водорослей) и D-глюкуроновая кислота, а в качестве препаратов сравнения были взяты фармакопейные препараты (ликопид, галавит и глутоксим), главной фармакологической мишенью которых является макрофаг. Так, ликопид изменяет функциональное состояние макрофага, взаимодействуя с паттерн-распознающими структурами клетки [Иванов В.Т. и др., 1996; Хаитов P.M., Пинегин Б.В. 1996, 2003], а галавит и глутоксим изменяют функционально-метаболическую активность макрофагов [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003; Мрикаев Б.М., 2005; Мирошник О.А., Редькин Ю.В., 2006].

Действие выбранных нами новых веществ на макрофаги и иммунный ответ ранее не изучалось. В литературе имеются косвенные данные, позволяющие предполагать наличие у них способности изменять функциональное состояние макрофага и проявлять иммуномодулиругощие свойства. Так, известно, что:

- растительные полисахариды могут взаимодействовать со многими рецепторами макрофагов, вызывая при этом развитие воспалительных или противовоспалительных свойств и, как следствие, способствовать протеканию Thl и Th2 типа иммунного ответа [Schepetkin I.A., Quinn М.Т., 2006];

- соли альгиновой кислоты проявляют противоопухолевую активность, в основе которой лежит стимуляция цитотоксических свойств макрофагальных клеток [Otterlei М. et al., 1991; Fujihara М. et al; 1993];

- структуры с высоким содержанием D-глюкуроновой кислоты участвуют в регуляции клеточной адгезии, продукции различных цитокинов, хемокинов и экспрессии их рецепторов [Camenisch T.D., McDonald J.А., 2000], а также функций дендритных клеток [Termeer С.С. et al., 2000].

Учитывая изложенные выше факты, представляется актуальным исследовать специфические характеристики макрофагов при Thl/Th2 иммунном ответе и выявить показатели, которые наиболее адекватно свидетельствовали бы о функциональном состоянии макрофага; опираясь на полученные данные, изучить влияние полисахаридов различной природы на макрофаги и иммунный ответ.

Цель работы: изучить регуляцию функционального состояния макрофагов при Thl/Th2 экспериментальном иммунном ответе водорастворимыми растительными полисахаридами и обосновать их применение для модуляции иммунного ответа.

Задачи:

1. Разработать модели для изучения функционального состояния макрофагов при экспериментальном Thl и Независимом иммунном ответе для отбора веществ, обладающих иммуномодулирующими свойствами.

2. Изучить влияние водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глтокуроновой кислоты на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных животных и исследовать роль сигнальных молекул р38, МЕК 1/2 и PI3K в их NO-стимулирующем действии.

3. Оценить действие водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на метаболизм аргинина перитонеальными макрофагами, стимулированными и нестимулированными липополисахаридом Е. coli.

4. Изучить влияние фракций полисахаридов на баланс продукции NO/аргиназы макрофагами, а также роль внутриклеточных сигнальных молекул в активации продукции оксида азота.

5. Изучить влияние водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов in vitro.

6. Исследовать влияние in vivo водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на Thl и ТЬ2-зависимые гуморальные и клеточные реакции.

Научная новизна. Разработаны модели для изучения функционального состояния макрофагов при Thl/Th2 экспериментальном иммунном ответе in vitro, позволяющие по способу метаболизма аргинина быстро и эффективно проводить скрининг веществ, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Впервые в динамике иммунного ответа выявлено, что при Th2-зависимом иммунном ответе активность аргиназы повышается, а продукция оксида азота не изменяется; в динамике Thl-зависимого иммунного ответа баланс NO/аргииаза постепенно изменяется в сторону аргиназы. Впервые показано, что независимо от типа иммунного ответа фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов значительно увеличивается. Экспрессия костномозговыми макрофагами сиалоадгезина (CD169) снижается, а экспрессия рецептора к эритробластам (CD163) не меняется при Thl и значительно понижается при Th2 типе иммунного ответа.

Исследовано влияние in vitro водорастворимых полисахаридов (выделенных из фармакопейного растительного сырья аира, клевера, мать-и-мачехи, полыни, календулы, берёзы, девясила), а также D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами. Показано, что некоторые из исследованных веществ по своему активирующему действию не уступают липополисахариду Е. coli, но при этом механизм их NO-стимулирующей активности отличается от действия липополисахарида Е. coli и полностью зависим от сигнальной молекулы

фосфотидилинозитол-3-киназы (PI3K), частично от MAP киназ р38 и МЕК1/2.

Впервые показано, что исследуемые водорастворимые растительные полисахариды (за исключением полисахаридов березы), D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция in vitro сдвигают баланс NO/аргиназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону оксида азота. На макрофага, стимулированные липополисахаридом Е. coli, исследуемые вещества могут действовать как синергисты, так и как антагонисты.

У полисахаридов аира, девясила, календулы, клевера и мать-и-мапехи обнаружена уникальная способность увеличивать секрецию провоспалительного цитокина 1L-12 перитонеальными макрофагами мыши, но при этом не влиять на выработку противовоспалительного IL-10. Все тестируемые вещества усиливают выработку TNF-a и ингибируют продукцию IL-10 мононуклеарами человека.

Обнаружено, что фракции полисахаридов березы и клевера сдвигают баланс NO/'аргнназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону продукции оксида азота, установлена роль сигнальных молекул р38, фосфотидилинозитол-3-киназы, МЕК1/2, транскрипционного фактора NF-kB и цАМФ в активации NO-синтазы исследуемыми фракциями.

Впервые проведено комплексное исследование иммуномодулпрующих свойств водорастворимых растительных полисахаридов, D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на моделях Thl и Th2 иммунного ответа. Установлено, что курсовое введение исследуемых веществ стимулирует Thl тип иммунного ответа, кроме того, большинство тестируемых веществ проявляют противоаллергическое действие, подавляя анафилаксию и продукцию аллерген-специфических иммуноглобулинов.

Практическое значение работы. В работе изучены иммунофармакологические свойства растительных полисахаридов, их способность изменять функциональное состояние макрофагов в сторону усиления провоспалительных свойств и регулировать иммунный ответ Thl и Th2 типов. Получены данные о фармакодинамике новых веществ как на уровне системных реакций организма (иммунный ответ), так и на клеточном (макрофаги) и пострецепторном (NF-кВ, цАМФ, р38, PI3K и МЕК1/2) уровне, что может служить основой для дальнейшей разработки этих веществ и получения новых фармакологических иммуномодуляторов, стимулирующих Thl-зависимые реакции, а также средств для профилактики и лечения аллергических (иммупоглобулин-Е-зависимых) заболеваний. На основании результатов работы получено 8 патентов на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При протекании иммунного ответа Thl или Th2 типа in vivo активация макрофагов имеет черты как классической, так и альтернативной активации (смешанная активация). В динамике Thl-зависимого иммунного ответа стимуляция индуцибельной NO-синтазы снижается и выявляется активация аргиназы; при Нгё-зависимом иммунном ответе активность аргиназы повышается, а продукция оксида азота не изменяется.

2. Водорастворимые растительные полисахариды, D-глюкуроновая кислота и алъгинат кальция изменяют функциональное состояние макрофагов. Характерным свойством этих веществ является способность активировать макрофага in vitro классически, стимулируя преобладание провоспалительных черт: усиление синтеза оксида азота и провоспалительных цитокинов IL-12 и TNF-a.

3. Водорастворимые растительные полисахариды, D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция обладают иммуномодулируюшими свойствами, стимулируют Thl и подавляют Th2 тип иммунного ответа, а именно, способствуют усилению реакции ГЗТ и повышению числа антителообразующих ютеток, при этом снижают содержание иммуноглобулинов Е и Gl в сыворотке крови и тяжесть протекания анафилактического шока.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на Республиканской научно-практической конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), на X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), на «IV Съезде физиологов Урала» (Екатеринбург, сентябрь 2009).

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 17 научных статей (в том числе 1 в зарубежном издании), из них 13 в изданиях, рекомендуемых перечнем ВАК; получено 8 патентов на изобретение.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 281 странице машинописного текста и состоит из введет«, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 2 рисунками и _52 таблицами. Библиографический указатель включает 485 источников, в том числе 155 отечественных и 330 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Животные. В экспериментах использовали мышей линий BALB/c(H-2b), C57BL/6J(H-2d), аутбредных мышей (всего 1527) обоего пола в возрасте 8-12 недель, а также аутбредных крыс-самцов (12 голов) в возрасте 4 мес, полученных из отдела экспериментальных биомоделей НИИ фармакологии СО РАМН (1 категории согласно сертификату).

Комплексы водорастворимых полисахаридов (ПС) были выделены на кафедре химии СибГМУ (г. Томск) по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975] из фармакопейного растительного сырья -корневищ аира болотного (Acorus calamus L.) и девясила высокого (Inula helenium L.), листьев берёзы повислой (Betulapendula Roth.) и мать-и-мачехи

обыкновенной (Tussilago farfara /,.), цветов календулы лекарственной (Calendula officinalis /,.), надземной части клевера лугового (Trifolium pratense L) и полыни горькой (Artemisia absintium I..). Полученные образцы ПС были стандартизованы по содержанию углеводов (спектрофотометрический метод [Dubois М. et. al., 1956]), белка (метод Брэдфорда [Bradford М.М., 1976]) и нуклеиновых кислот [Спирин А.С., 1958] (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика образцов полисахаридов (%), (Х+т)_

Исследуемые полисахариды Выход ITC (% от массы воздушно-сухого сырья) Содержание в образцах, %

Углеводы Белки Нуклеиновые кислоты

ПС аира 3,68± 1,06 99,8±3,22 0,12-Ю, 02 0,062±0,012

ПС берёзы 2,52±0,66 98,6±4,09 0,89±0,04 0,030 ± 0,006

ПС девясила 2,97±1,14 95,6±4,43 1,04±0,12 0,077±0,009

ПС календулы 1,48±0,19 97,8±1,06 1,68*0,26 0,165±0,024

ПС клевера 2,77±1,39 97,4±1,05 0,15±0,02 0,042±0,001

ПС мать-и-мачехи 2,89±0,17 97,9±2,26 0,21±0,06 0,021 ±0,003

ПС полыни 1,07±0,19 99,0il,06 0,61±0,11 0,059±0,002

Компонентный состав и молекулярно-массовое распределение исследуемых образцов определялись методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1100 со спектрофотометрическим детектором (детекция при длине волны 190 нм), разделение проводилось на эксклюзионной колонке TSK-gel GMPxi. 300x7.8mm («Supelco»), подвижная фаза - вода, 1,0 мл/мин. Молекулярная масса полисахаридов, входящих в состав исследуемых образцов, определялась по времени удерживания, в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярной массой 15-20 кДа, 40 кДа, 60-90 кДа, 110 кДа, 250 кДа и 500 кДа («Sigma-Aldrich», США). На спектре ВЭЖХ образца из корневищ аира болотного обнаружено 5 пиков, соответствующих молекулярной массе 720, 460, 370, 290 и 40 кДа; из листьев берёзы повислой-3 пика 680, 260 и 170 кДа; из корней девясила высокого - 2 пика 540 и 390 кДа; из цветков календулы лекарственной - 2 пика 490 и 310 кДа; из надземной части клевера лугового - 2 пика 700 и 320 кДа; из листьев мать-и-мачехи обыкновенной - 2 пика 690 и 350 кДа; из надземной части полыни горькой - 2 пика 510 и 305 кДа.

Получение фракций полисахаридов. Из суммы ПС берёзы повислой методом ионообменной хроматографии в институте физиологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар) были выделены две фракции: PS-B1-AG и PS-B2-RG. Главной цепью обеих фракций ПС является (1-4)-галакгуронан. состоящий из остатков галактуроновой кислоты, соединенных 1 -4-

гликозидной связью. Боковые цепи фракции PS-B1-AG построены из остатков арабинозы (Ara - 3%) и галактозы (Gal - 6%), а боковые цепи ПС фракции PS-B2-RG - из рамнозы (Rha - 32%) и галактозы (Gal - 7%). Фракции ПС клевера лугового были получены на кафедре химии СибГМУ (г. Томск). Сумма ПС клевера также была разделена на 2 фракции: PS-62-N300 -нейтральный полисахарид с молекулярной массой больше 300 кДа и PS-62-АсЮО - кислый с молекулярной массой от 100 до 300 кДа.

Альгинат кальция получали из коммерческого альгината натрия, выделенного из бурых водорослей («Kelko», США), в Институте биологии моря им A.B. Жирмунского ДВО РАН (г. Владивосток). Содержание кальция в альгинате определяли атомно-абсорбционным методом, уроновых кислот -дифениловым методом и выражали в процентах [Bluraenkrantz S., Asboe-Haunsen G., 1973]. Характеристическую вязкость определяли в вискозиметре Уббелоде. Молекулярную массу вычисляли, используя уравнение Марка-Хоуинка [Kiavtchenko Т.Р., Pilnik A.A., 1990]. Исследуемый образец альгината кальция имел характеристическую вязкость 1270 мл/'г, молекулярную массу - 403 кДа, уроновых кислот - 77,3%, кальция - 72,5%, карбоксильных групп в виде кальциевой соли - 82,5%.

В работе использовали D-глюкуроновую кислоту («Sigma», США). Перед использованием in vitro или in vivo pH раствора доводили до физиологических показателей ЗМ раствором NaOH (pH 7,6).

Выделение макрофагов. Перитонеальные макрофаги получали прилипанием к пластику клеток перитонеального экссудата.

Выделение мононуклеаров из периферической крови человека. Из цельной периферической крови здоровых доноров, взятой утром натощак из локтевой вены и стабилизированной раствором гепарина (10 ЕД/мл), собирали лейкоцитарную взвесь методом сепарации клеток с использованием жидкости «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich», США).

Условия культивирования клеток. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере с 5% СОг и абсолютной влажности в среде следующего состава: RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% ЭТС («Hyclone», Великобритания), 20 мМ HEPES («Sigma», США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma», США), 50 мкг/мл гентамицина (РУП «Борисовский завод медицинских препаратов», Россия) и 2 мМ L-глютамина («Sigma», США).

Влияние исследуемых веществ на функциональную активность клеток. Полученные макрофаги (Мф) мышей или мононуклеары (Мн) периферической крови человека культивировали в 96-луночных планшетах в присутствии полисахаридов в концентрациях 10 и 20 мкг/мл; глюкуроновой кислоты 10 и 100 мкМ; липополисахарида (ЛПС) E.coli (серотип 0111:В4, «Sigma», США) 1 мкг/мл; мурамилдипептида (М-ацетилмурамил-1--аланил-0-изоглютамин, «Calbiochem», США) 5 и 10 мкг/мл; галавита (ЗАО «ЦСМ «Медикор»», Россия) 10 и 100 мкг/мл; глутоксима (ЗАО «Фарма ВАМ», Россия) 10 и 20 мкг/мл.

Определение продукции оксида азота. Продукцию оксида азота (N0) оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса через 24 и 48 ч [Green L.C. et al., 1982]. Реактив смешивали с эквивалентным объемом надосадка, абсорбцию замеряли с использованием многоканального спектрофотометра Titertek Multiskan® МСС («Labsystems», Финляндия) при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.

Определение активности аргиназы. Активность аргиназы определяли по методике [Munder М. et al., 1998] в нашей модификации. Для этого в клеточном лизате замеряли концентрацию мочевины с помощью тест-системы «Мочевина-450» («Био-ЛА-Тест», Чехия) согласно приложенному к тест-системе протоколу с использованием спектрофотометра (длина волны 540 нм). За I единицу активности фермента принимали количество аргиназы, катализирующей образование 1 мкМ мочевины в минуту.

Исследование полисахаридов на наличие примесей эндотоксина проводили при инкубации исследуемых образцов полисахаридов или ЛПС и полимиксина В («InvivoGen», США), с последующим определением концентрации нитритов в надосадке.

Определение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов проводили по методике [Heasman S.J. et al., 2004] в нашей модификации. Для этого на монослой перитонеальных Мф в 96-луночных плоскодонных планшетах наслаивали 1% раствора туши или предварительно приготовленных апоптотических тимоцитов. Степень окраски оценивали на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

Для определения уровня экспрессии сиалоадгезина (CD169) и рецептора к эритробластам (CD 163) использовали лиганды к данным рецепторам - эритроциты барана и эритробласты эмбриональной печени мышей, соответственно, которые инкубировали с суспензией клеток костного мозга мышей. Препараты окрашивали и мнкроскопировали, принимая за розетку макрофаг, окруженный не менее чем 5 клетками-лигандами [Crocker P.R., Gordon S., 1985; Crocker P.R. et al., 1988].

Определение продукции IL-10. IL-12 макрофагами мышей. Количественное определение цитокинов в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («R&D Systems», США) согласно прилагаемым к ним протоколам.

Определение продукции TNF-a и IL-10 мононуклеарами крови человека. Количественное определение цитокинов в супернатантах мононуклеаров осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («Вектор-Бэст», Россия) согласно прилагаемым к ним протоколам.

Определение содержания IgGl и IgE иммуноферментным методом. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови мышей измеряли иммуноферментным методом с использованием соответствующих тест-

систем («Immunology Consultants Lab.», США) согласно прилагаемым к ним протоколам.

Определение продукции 1L-2 Т-лимфоцитами осуществляли в функциональном тесте по способности их супернатанта стимулировать пролиферацию IL-2-зависимых спленоцитов [Moore S.С. et al., 1992]. Пролиферацию клеток оценивали колориметрическим методом.

Определение продукции IFN-y Т-лимфоцитами в функциональном тесте осуществляли по способности супернатанта спленоцитов индуцировать выработку N0 миелокариоцитами сингенных животных [Moore S.С. et al., 1992].

Оценка пролиферации колориметрическим методом [Mosmann Т., 1983]. За 4 ч до окончания культивирования спленоцитов в лунки с клетками вносили раствор МТТ (3-[4,5-dimetliylthiazol-2-yl]-2,5-diplienyltetrazolium bromide, «Sigma», США), в конечной концентрации 200 мкг/мл. Осадок растворяли диметилсульфоксидом (Димексид, «Татхимфармпрепараты», Россия). Абсорбцию полученных растворов замеряли при помощи многоканального спектрофотометра при длине волны 540 нм.

Изучение роли сигнальных молекул в активации макрофагов. Мф культивировали 48 ч с ингибиторами сигнальных молекул р38 MAP киназы -SB203580 (10 мкМ), PI3 киназы - LY294002 (100 мкМ), МАРК ERK1/2 - PD 98059 (100 мкМ) (все «InvivoGen», США), а также ингибиторами цАМФ -2',5'-дидеоксиаденозин (30 мкМ) и NF-kB - ауротиомалат (50 мкМ) (оба «Calbiochem», США) в указанных выше условиях, после чего оценивали продукцию макрофагами оксида азота.

Моделирование Thl -зависимого иммунного ответа у мышей проводили иммунизацией вакциной BCG или эритроцитами барана [Kawamura I., 1992; Ravn P., 1997]. Мышам линии BALB/c внутрикожно (в основание хвоста) вводили по 100 мкг вакцины туберкулезной («Предприятие по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. акад. Н.Ф. Гамалеи РАМН», Россия) в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда («Difco», США). Контрольной группе животных соответственно вводили по 0,1 мл ФР. Повторные иммунизации проводили с интервалом в 14 суток. В экспериментах использовали одно-, дву- и трёхкратно иммунизированные модели. Суспензию эритроцитов барана 1 х 10s клеток («ЭКОлаб», Россия) вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. Контрольным животным вводили 0,2 мл ФР аналогичным способом. В некоторых экспериментах иммунизацию повторяли трижды с интервалом 7 суток между инъекциями эритроцитов барана.

Развитие Т1г2-зависимого иммунного ответа моделировали у мышей линии BALB/c введением под кожу бедра 100 мкг овальбумина (OVA) и 5'мг гидроокиси алюминия (оба «Sigma», США) в качестве адъюванта в 0,1 мл ФР [Hsieh C.S. et al., 1995; Oshiba A. et al., 1997]. При многократных иммунизациях интервал между инъекциями составлял 14 суток. Мышам контрольной группы аналогично вводили по ОД мл ФР.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). На 6-е сутки после иммунизации эритроцитами барана животным проводили вторую

(разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы -«опытная лапа». В коптрлатеральную лапу вводили ФР («контрольная лапа») Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч. Величину реакции оценивали как разницу массы между контрольной и опытной лапой и выражали в миллиграммах.

Адоптивная реакция ГЗТ. Данную реакцию вызывали у интактных животных, которым вводили под апоневротическую пластинку опытной лапы сннгенные спленоциты, полученные от трёхкратно иммунизированных туберкулёзной вакциной BCG или овальбумином (OVA) мышей, в смеси с соответствующим антигеном (BCG или OVA); в противоположную (контрольную) лапу вводили аналогичное количество сингенных спленоцитов, полученных от интактных мышей, в смеси с теми же количествами антигена. Опытной группе животных кроме спленоцитов и антигена в обе лапы вводил]! ПС. Воспалительную реакцию оценивали через 24 ч.

Определение антителообразующих клеток (АОК) в селезенке определяли методом локального гемолиза [lerne N.K., Nordin A. A.,1963].

Определение титра антител в сыворотке крови оценивали в реакции гемагглютинации [Хаитов P.M. и др., 1999]. Титр выражали величиной log2.

Реакцию общей анафилаксии (ГНТ) осуществляли внутривенным (в ретроорбитальный синус) введением OVA на 7-й дней после последней иммунизации. В результате развившейся анафилактической реакщга часть животных погибала в течение 2-4 ч.

Локальную реакцию гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) оценивали по методике [Емельяненко И.Н., Душкин В.А., 1971] в нашей модификации. На 7 день после последней иммунизации в подушечку задней лапы вводили OVA - опытная лапа, в контрлатеральную лапу (контрольную) - ФР. Местную воспалительную реакцию оценивали через 4 ч.

Непрямая реакция дегрануляции тучных клеток [Алексеева О.Г., Дуева Л.А., 1978; Радунская С.Ф., 1982]. Сыворотку крови мышей, полученную через 7 суток после второго введения овальбумина, инкубировали с тучными клетками, полученными из брюшной полости интактных крыс. Показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) подсчитывали по формуле:

1а+2б+3с+4д , где а, б, с, д — количество дегранулпрованных клеток с ПДТК= J QQ соответствующей степенью дегрануляции (слабо выраженная,

умеренная, резкая и степень полно» дегрануляции клеток).

Определение количества аллерген-специфических IgE и IgGl в реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) [Хаитов P.M. и др., 1999]. Титры IgGl антител, специфических к OVA, определяли на аутбредных мышах-самцах, и IgE антител - на аутбредных крысах-самцах. Сыворотку крови иммунизированных мышей вводили внутрикожно в различных разведениях, начиная с 1/4. Разрешающую дозу OVA с раствором синего Эванса вводили мышам в ретроорбитальный синус через 2 ч и крысам в хвостовую вену через

24 ч после пассивной сенсибилизации кожи. Интенсивность ГЖА оценивали через 30 мин по площади окрашенных участков кожи в мм*.

Схемы введения исследуемых веществ in vivo. Схема введения и оптимальные суточные дозы исследуемых веществ (растительных полисахаридов и альгината - 10 мг/кг массы тела, глюкуроновой кислоты -50 мг/кг) были подобраны в предварительных экспериментах [Лопатина К.А., 2007]. В качестве положительного контроля в экспериментах in vivo использовали ликопид - 2 мг/кг, галавит - 1,5 мг/кг; глутоксим - 0,5 мг/кг, которые вводили по той же схеме. Препараты вводили внутрибрюшмнной инъекцией в 0,1 мл ФР.

Для изучения влияния исследуемых вещеста на иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана, использовали две схемы введения. «Профилактическая схема» - мышам вводили растворы образцов 1 раз в сутки, начиная за 5 дней до иммунизации, всего 10 дней. «Терапевтическая схема» - исследуемые вещества вводили курсом 1 раз в сутки 5 дней, начиная со дня иммунизации эритроцитами барана. На 5-е сутки после иммунизации осуществляли забор материала.

Введение исследуемых веществ на фоне иммунизации OVA проводили по двум схемам. При двукратной иммунизации животные опытной группы получали тестируемые вещества за 5 дней до первого введения OVA и в течение 5 дней после каждого последующего, всего 15 введений. При однократной иммунизации исследуемые вещества вводили 10 раз, начиная за 5 дней до инъекции антигена. Через 5 дней после последней иммунизации забирали материал для исследования.

Статистическая обработка результатов. Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса [Гмурман В.Е., 2001]. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака X и стандартную ошибку средней ш. Проверка гипотезы о различиях средних проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Связь между количественными параметрами оценивали с помощью метода хи-квадрат. Различия частот встречаемости признаков в группах анализировали с помощью метода сравнения долей (z-преобразования Фишера). Допустимым уровнем значимости принималось р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Одной из принципиальных и важных задач, которая встаёт при поиске веществ, участвующих в регуляции иммунного ответа, является разработка доступных, эффективных и воспроизводимых методов скрининга как in vivo, так и in vitro. Поэтому при изучении функционального состояния макрофагов нами была поставлена цель - исследовать характеристики макрофагов при развитии Thl и Th2 типов иммунного ответа, а также выявить показатели, которые наиболее адекватно отражают функциональное состояние

поляризованных макрофагов. Выявление таких показателей позволило бы в дальнейшем исследовать влияние изучаемых веществ на макрофаги и иммунный ответ. Для этого на моделях Thl и 1Ъ2 иммунного ответов были оценены следующие параметры макрофагов: продукция оксида азота и активность аргиназы, фагоцитоз частиц туши и апоптотических клеток, экспрессия рецепторов, задействованных в регуляции гемопоэза.

Для подтверждения возникновения Thl или Th2 типа поляризации определяли изменение продукции IFN-y и IL-2, реакции ГЗТ и ГНТ. Известно, что повышенная секреция данных цитокинов и усиление реакции ГЗТ являются основными признаками Thl, а понижение их выработки и способность развивать реакцию ГНТ - свойства Th2 [Mosmann Т.К.. et al., 1989]. Следует отметить, что большинство работ, посвященных изучению развития макрофагов в классически или альтернативно активированные, выполнены in vitro. В связи с этим остается невыясненным, появляются ли эти две группы макрофагов при иммунном ответе, когда в организме сочетается множество факторов, влияющих на формирование функциональных признаков макрофагов. Исследования, выполненные in vivo, в основном согласуются с данными, полученными in vitro [Loke P., 2002; Nair M.G., 2005]. С другой стороны, хорошо известно об увеличении экспрессии индуцибельяой NO-синтазы при бронхиальной астме -патолопш, обусловленной Th2 типом иммунного ответа [Barnes P.J., 1998; Sanders S.P., 1999]. В связи этим было изучено состояние продукции оксида азота и уровень активности аргиназы макрофагами, полученными от животных при развитии качественно различных видов иммунного ответа.

Иммунный ответ Thl типа моделировали двумя способами - с использованием вакцины BCG [Kawamura I., 1992; Ravn P., 1997] и эритроцитов барана [Li L., 1994; Yokozeki Н., 2000]. ТЬ2-зависимый иммунный ответ вызывали иммунизацией OVA [Oshiba A. et al., 1997].

На модели Thl-зависимого иммунного ответа, индуцированного BCG, было обнаружено, что в результате трёх введений BCG наблюдалось повышение в 2,2 раза количества продуцируемого макрофагами NO, а также увеличивался в 1,8 раза уровень активности аргиназы (табл. 2). Кроме того, лимфоциты трижды иммунизированных животных индуцировали у интактных мышей реакцию ГЗТ и вырабатывали повышенное количество цитокинов IFN-y и IL-2. Однократная иммунизация не вызывала изменения показателей иммунного ответа и метаболизма аргинина у макрофагов.

Однократное введение эритроцитов барана приводило к увеличению количества продуцируемого макрофагами оксида азота в 1,7 раза, в то время как активность аргиназы достоверно снижалась в 1,6 раза (табл. 2). В результате трёх введений эритроцитов барана повышение продукции оксида азота не наблюдалось, активность аргиназы увеличивалась в 1,6 раза. Лимфоциты однократно сенсибилизированных мышей вызывали реакцию ГЗТ и продуцировали повышенное количество цитокинов: в 1,6 раза (IFN-y)

Таблица 2

Продукция оксида азота и активность аргиназы в макрофагах, секреция лимфоцитами цитокинов и их способность вызывать реакцию ГЗТ и ГНТ в динамике Till и Th2 иммунного ответа у мышей линии BALB/c (X±m)

Thl тип иммунного ответа Th2 тип иммунного ответа

Показатели Группа Число иммунизаций BCG Число иммунизаций эритроцитами барана Число иммунизаций OVA

1 3 1 3 1 3

Концентрация контроль 32,5±2,8 24,0±5,8 36,4±7,4 53,8±7,3 40,7±5,6 27,9±7,0

нитритов, мкМ опыт 38,8±12,8 53,6+7,3* 61,2+2,1* 52,6±6,9 29,4+11,4 18,4±6,4

Активность контроль 21,4±5,5 17,4+2,3 5,91+0,68 3,98+0,68 17,5+3,8 12,1±1,9

аргиназы, ЕА опыт 18,4+2,1 30,7±4,0* 3,60±0,49* 6,27±0,50* 16,3+2,2 25,0±3,8*

1РЫ-у (% от контроль 100,0+10,6 . 100,0+7,3 100,0+8,3 100,0±15,7 100,0+3,9

контроля) опыт 95,3+8,9 150,1±12,8* 159,6±4,8* 103,2+11,3 53,7±4,6*

1Ь-2 (% от контроль 100,0+10,1 100,0±16,1 100,0±9,6 100,0+10,4 100,0±10,9

контроля) опыт 118,8+9,7 175,6±18,6* 145,5+6,9* 92,0±11,2 41,2±6,8*

ГЗТ, мг контроль 0,4±1,6 1,4±1,0 3,2+1,3 9,2±2,9

п=Т0 опыт 1,5±1,9 36,5±4,3* 21,1+3,1* 20,7+2,8*

ГНТ

(% смертности) 11=10 контроль опыт - - - - 0 0 0 92

Примечание: * - различие достоверно при сравнении с соответствующим показателем контроля, р<0,05. п=6.

Хотя альпшат кальция, использованный в настоящей работе, ранее не изучался, а имеющиеся сведения касаются химически иных альгинатов (олигомеров), всё же основная часть имеющейся информации подтверждает возможность проявления у них способности классически стимулировать макрофага [Son E.H. et.al., 2001; Flo Т.Н. et.al., 2002; Otterlei M. et.al., 1991.].

Действие D-глюкуроновой кислоты на макрофаги ранее не исследовалось. Однако имеются данные о том, что низкомолекулярные фрагменты гиалуроновой кислоты, в состав которой входит D-глюкуроновая кислота [Laurent Т.С., Fraser J.R.E., 1992; Knudson C.B., Knudson W., 1993], при их культивировании in vitro с макрофагами мышей стимулировали активность NO-синтазы, действуя при этом через активацию NF-кВ [МсКее С.М. et al., 1997]. Известно, что активация этого нуклеофильного фактора обеспечивает транскрипцию веществ, характерных для классической активации (IL-1,1L-6, IL-12, TNF-a, СОХ и iNOS) [Bonizzi G., Karin M., 2004; Cameron P. et al., 2004]. Недавно появилось сообщение о том, что морфин-3-глкжуронид через глюкуроновый сайт связывается с TLR4 на клетках микроглии (клетки макрофагалытого ряда) и стимулирует продукцию провоспалительного цитокина IL-lß [Lewis S.S. et al., 2010]. Т.е., глюкуроновая кислота может взаимодействовать с паттерн-распознающими структурами макрофага и активировать NF-кВ и, таким образом, классически активировать макрофаги.

Необычное сочетание активности выявлено у ПС берёзы: эти полисахариды не влияли на продукцию оксида азота, стимулировали активность аргиназы, но подавляли её ЛПС-стимулировапную активность; вдвое увеличивали выработку мононуклеарами человека TNF-a, но не влияли на секрецию IL-10 перитонеальными макрофагами мышей. Концентрация IL-12 в культурах макрофагов, культивированных с ПС березы, была высокой 16,5±9,0 иг/мл (в контроле - 4,4±5,1 пг/мл), хотя различия с контролем были недостоверны. Это может быть связано с наличием в образцах противоположных по действию начал, одно из которых способно активировать макрофаги классически, а другое, напротив, альтернативно.

Это предположение подтвердилось в экспериментах с фракциями ПС берёзы. Водорастворимый комплекс ПС берёзы по заряду молекул был разделён на две фракции ПС: PS-B1-AG и PS-B2-RG, которые состояли из пектинов, отличающихся строением разветвленных областей: фракции практически не различались по содержанию галактозы, но фракция PS-B2-RG содержала большее количество рамнозы, в том числе, и по сравнению с другими известными пектинами. В работе также использовали 2 фракции ПС клевера: нейтральную - PS-62-N300 с молекулярной массой больше 300 кДа и кислую - PS-62-AclOO (молекулярная масса от 100 до 300 кДа).

В отличие от сум.мы полисахаридов, фракции ПС берёзы увеличивали активность NO-синтазы уже в концентрации 2,5 мкг/мл (PS-B1-AG) в 5,6 раза и 5,5 раза (PS-B2-RG). Усиление NO-стимулирующего действия было

дозозависимо, максимальная концентрация фракций ПС березы (20 мкг/мл) вызывала увеличение концентрации нитритов в 12 и в 13 раз относительно спонтанного уровня, данное повышение не отличалось от ЛПС-стимулированного показателя. Стимулирующее действие фракций ПС клевера оказалось более слабым. ПС обеих фракций вызывали усиление продукции оксида азота только в концентрации 20 мкг/мл. Однако практически шестикратное увеличение концентрации нитритов при инкубации с фракциями было сравнимо со стимулирующим действием Л ПС.

Таким образом, по сравнению с действием суммы водорастворимых ПС на активность Мф, фракции, выделенные из комплекса Г1С берёзы, оказывали диаметрально противоположное действие, приводя к значительному усилению активности NO-сиптазы, а фракции, выделенные из ПС клевера, сохраняли свое стимулирующее действие на продукцию оксида азота.

Механизмы активации макрофага фракциями ПС берёзы и клевера изучали в экспериментах с использованием ингибиторов сигнальных молекул MAP киназы р38 (SB203580), МЕК 1/2 (PD 98059), PI3K (LY294002), цАМФ (2',5'-дидеоксиаденозин) и транскрипционного фактора NF-кВ (ауротиомалат).

Ингибитор PI3K снижал как спонтанный, так и стимулированный фракциями ПС берёзы (в 17 раз при культивировании с PS-B1-AG и 20 раз -PS-B2-RG) и ПС клевера (в 6 раз - PS-62-N300 и 7 раз - PS-62-AclOO) уровень выработки оксида азота практически до нулевых значений (табл. 10). Ингибитор киназы МЕК1/2 не влиял ни на спонтанную, ни на стимулированную ПС продукцию оксида азота. Ингибитор киназы р38 не оказывал влияния на базисный уровень активности NO-синтазы, однако приводил к резкому угнетению стимулирующего действия всех фракций ПС. Концентрация нитритов при культивировании с фракциями ПС берёзы уменьшалась в 4,4 раза (PS-B1-AG) и в б раз (PS-B2-RG), при культивировании с фракциями ПС клевера снижалась до спонтанного уровня в 4,8 (PS-62-N300) и 2,3 раза (PS-62-AclOO). Инкубация с ингибитором цАМФ приводила к стимуляции активности NO-синтазы, повышая в 1,3 раза концентрацию нитритов как в присутствии фракции ПС берёзы и клевера, так и в контроле. Ингибитор транскрипционного фактора NF-кВ снижал базисный уровень активности NO-синтазы интактных макрофагов в 2,4 раза и стимулированный фракциями ПС берёзы в 1,5 и 2,4 раза (PS-B1-AG и PS-B2-RG) и практически в 2 и 1,7 раза при стимуляции фракциями ПС клевера.

Таким образом, ингибиторы PI3K и NF-кВ подавляли базисный уровень продукции оксида азота, ингибиторы киназы МЕК 1/2 и киназы р38 не влияли на него, а ингибитор цАМФ приводил к стимуляции активности NO-синтазы. Исследуемые фракции полисахаридов стимулировали продукцию оксида азота, причем ингибитор PI3K отменял этот эффект, ингибиторы киназы р38 и NF-кВ резко ослабляли, не отменяя полностью действие исследуемых веществ; ингибитор киназы МЕК1/2 не влиял, а

ингибитор цАМФ способствовал усилению продукции оксида азота макрофагами.

Полученные результаты показали, что фракции водорастворимых полисахаридов берёзы и клевера обладают NO-стимулирующей активностью, которая зависит от цАМФ, сигнальных молекул р38, фосфотидилинозитол-3-киназы и транскрипционного фактора NF-кВ; при этом МЕК1/2 не принимает участия в активации NO-синтазы.

Таблица 10

Влияние ингибиторов сигнальных молекул MAP киназ р38 (SB203580) и МЕК1/2 (PD 98059), PI3K (LY294002), транскрипционного фактора NF-kB (ауротиомалата) и цАМФ (2',5'-дидеоксиаденозин) на активность NO-синтазы макрофагов мышей при стимуляции фракциями полисахаридов берёзы и клевера (обобщённые данные)

Ингибиторы

сигнальных Фракции ПС берёзы Фракции ПС клевера

молекул

PI3K I

р38 1 1

NF-KB 1 1

цАМФ ! =

МЕК 1/2 = =

Примечание: f - показатель повышается, ! - снижается, = - не

изменяется.

Выявленный факт зависимости NO-стимулирующего действия фракций полисахаридов от NF-кВ согласуется с многочисленными данными литературы, говорящими о том, что NF-кВ является главным транскрипционным фактором, проводящим провоспалительные сигналы и вызывающим увеличение активности индуцибельной NO-синтазы [Vila-del Sol V. et af., 2007].

Известно, что митоген-активируемые протеин-киназы включают в себя ряд молекул, которые активируются в ответ на митогены, стресс и воспалите и могут выступать в роли передатчиков как воспалительных, так и противовоспалительных сшиалов, хотя чаще наблюдаются проведение воспалительных сигналов [Kyriakis J.M., Avruch J., 2001; Lang R. et al., 2006]. Нужно сказать, что, манипулируя МАР-киназами, исследователи добиваются переключения активаций макрофагов [Lang R. et al., 2006]. Из двух изученных МАР-киназ (р38 и МЕК1/2) только р38 задействована в активационном каскаде, индуцированном полисахаридами.

Активация пути PI3K, как правило, приводит к увеличению пролиферации, подавлению апоптоза, увеличению транспорта глюкозы

[Elgliazi L. et al., 2006]. В литературе имеется много сообщений как о воспалительных, так и о противовоспалительных свойствах PI3K [Hazeki К., et al., 2007]. Мы обнаружили, что данная киназа участвует в проведении активирующего макрофаг сшпала при воздействии фракций ПС. Это вполне логично, ведь активированному макрофагу нужна энергия для наработки различных медиаторов.

Еще один важный фактор, принимающий участие в активации макрофага - цАМФ. Этот фактор активируется через рецепторы, ассоциированные с G-белком, многими гормонами и ростовыми факторами [Don J., Stelzer G., 2002]. К основным его стимуляторам относят адреналин и простагландины Е, которые оказывают мощное супрессорное действие на Thl и Ml [Elenkov I.J. et al., 2000]. Повышение уровня цАМФ в макрофагах ведет к снижению продукции ими IL-12 и повышению IL-10 [Feng W.G. et al., 2002; Kelschenbach J. et al., 2008]. Таким образом, индуцированный при воспалении и проводящий противовоспалительные сигналы цАМФ способствует затуханию воспаления, т.е. является молекулой отрицательной обратной связи. Действительно., в нашей работе было обнаружено, что ингибирование цАМФ приводило к повышению как спонтанной, так и стимулированной ПС продукции макрофагами оксида азота.

Исследование иммуномодулирующих свойств водорастворимых растительных полисахаридов, D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на гуморальное звено иммунитета проводили на модели Thl-зависимого иммунного ответа, индуцированного однократным введением эритроцитов барана. Влияние веществ оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) и по их функциональной активности, а именно продукции гемагглютининов. Обнаружено, что курсовое введение тестируемых веществ приводило к достоверному увеличению числа АОК: в 2,7 раза (ПС аира), в 2,8 раза (ПС берёзы), в 2,9 раза (ПС календулы), в 2,2 раза (ПС клевера), в 2,1 раза (ПС мать-и-мачехи), в 3,4 раза (ПС полыни), в 1,7 раза (альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота). ПС девясила не влияли на этот показатель, а фармакопейные препараты его увеличивали - в 2 раза (ликопид), в 4 раза (глутоксим) и в 2,4 раза (галавит). Кроме того, наблюдалось усиление синтеза антител, вырабатываемых В-лимфоцитами, при введешти ПС берёзы и ПС девясила - в 1,4 раза, ПС мать-и-мачехи - в 1,5 раза, D-глюкуроновой кислоты - в 1,3 раза, альгината - в 1,2 раза, а также ликопида - в 1,5 раза. При этом необходимо отметить, что ПС девясила хотя и не влияли на число АОК, но увеличивали количество синтезируемых антител.

Эти данные согласуются с результатами некоторых авторов. Так при однократном внутрибрюшинном введении мышам водорастворимых ПС гриба агарика бразильского Agaricus blazei Murill наблюдалось увеличение количества АОК селезёнки в ответ на эритроциты барана [Nakajima A. et al., 2002]; смесь полисахаридов, выделенная из корня алтея лекарственного Althea officinalis, стимулировала гуморальный иммунный ответ [Бакуридзе А.Д. и др., 1993]. Водорастворимые ПС из листьев донника жёлтого Melilotus

officinalis (L.) Desr. повышали количество В- и Т-лимфоцитов в крови крыс, увеличивали количество АОК в селезенке [Сычев И.А., 2008].

Исследование влияния на реакцию клеточного иммунитета (ГЗТ) показало, что её величина повышалась у мышей, получавших: D-глюкуроновую кислоту - в 2,6 раза; ПС аира, ПС берёзы, ПС девясила, ПС мать-и-мачехи и альгината кальция - в 2 раза; при введении ПС клевера - в 1,7 раза, ПС полыни - в 1,6 раза, ликопида - в 1,9 раз и в 1,4 раза при введении галавита и глутоксима. ПС календулы не влияли на этот показатель.

Таким образом, курсовое введение водорастворимых ПС аира, IIC берёзы, ПС девясила, ПС календулы, ПС клевера, ПС мать-и-мачехи, ПС полыни, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты стимулируют 'Независимый иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана.

В настоящее время доказано, что полисахариды обладают широким спектром иммуномодуляторных потенций, они способны изменять продукцию различных иммунорегуляторных цитокинов, экспрессию различных молекул адгезии [Tziaiiabos А.О., 2000, Retini С. et al., 2001]. Показано, что полисахариды могут влиять на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антиген-презентирующих клеток: например, выделенный из Acetobacter ПС распознавался рецептором макрофагов (TLR-4) и индуцировал продукцию ИЛ-12, подавляя таким образом, развившийся Th2 иммунный ответ [Saito К. et al., 2003] или стимулируя Thl иммунный ответ [Li W., et al., 2004]. В то же время имеются данные о том, что полисахариды, выделенные из Cryptococcus neoformans, могут стимулировать и Th2 тип поляризации [Tzianabos А.О., 2000: Almeida G.M. et al., 2001]. Полученные в данной работе результаты позволяют говорить о том, что выявленная способность изз'чаемых веществ стимулировать Thl иммунный ответ является общим свойством полисахаридов.

Иммуномодулирующие свойства альгината кальция ранее не изучались. Имеются сведения о наличии у альгината натрия значительной противоопухолевой активности при экспериментальном опухолевом росте [Fujihara М. et al., 1984]. Другая группа исследователей, изучая модифицированный альгинат (состоящий только из остатков (3-D-маннуроновой кислоты), обнаружила, что в основе механизма активации макрофагов этим веществом лежит его взаимодействие с TLR4 и TLR2, а также запуск сигналинга, вовлекающего NF-кВ, который и обеспечивает синтез провоспалительных медиаторов [Flo Т.Н. et al., 2002]. В совокупности данные этих двух групп авторов позволяют предполагать способность альгината кальция стимулировать Thl иммунный ответ.

О влиянии D-глюкуроновой кислоты на Thl иммунный ответ в литературе данных нет. Следует сказать, что в НИИ фармакологии Томского научного центра РАМН были проведены исследования влияния глюкуроната натрия на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов и устойчивость к инфекции [Патент RU 2058137 от 09.06.89 г.], которые

показалг, что введение глюкуроната натрия повышало микробицндную функцию нейтрофилов и увеличивало выживаемость мышей линия СВА, зараженных St. albus. Вероятно, при данной экспериментальной инфекции развивается Thl иммунный ответ, хотя в работе этого не показано. Таким образом, косвенно можно ожидать, что D-глюкуроновая кислота будет активировать Th 1 ответ, что и было нами подтверждено экспериментально.

Действие веществ с различной структурой на Т112-зависимый иммунный ответ в сравнении с фармакопейными препаратами изучали на модели двукратной иммунизации овальбумином [Denzler K.L., 2001; Oshiba А., 1997]. Влияние тестируемых веществ на ТЬ2-зависимый иммунный ответ оценивали по тяжести анафилактического шока, реакции локальной ГНТ, содержанию в сыворотке крови иммуноглобулинов классов Е и Gl, характерных для данного типа поляризации [Milburn HJ., 1997; Gehlhar К., 1999; Matsui Е.С., 2005], а также по способности сыворотки иммунизированных животных, получавших курс различных веществ, вызывать дегрануляцию тучных клеток.

Курсовое введение ПС клевера, ПС мать-и-мачехи, ПС аира, ПС календулы, ПС полыни, альгината кальция, D-глюкуроновой кислоты и ликопида снижало смертность животных в результате анафилактического шока: на 50% - альгинат кальция и глюкуроновая кислота, на 38% - ПС клевера, на 33% - ПС мать-и-мачехи, на 25% - ПС аира, на 20% - ПС девясила, на 13% - ПС полыни, на 10% - ПС календулы и ликопид. Глутоксим и галавит не влияли на величину летальности, а ПС берёзы увеличивали её на 33%.

Известно, что IgE и IgGl являются ключевым звеном в реализации анафилактических реакций и важными показателями Т112-зависимого иммунного ответа [Gehlhar К. et al., 1999]. Для оценки влияния исследуемых веществ на продукцию иммуноглобулинов классов Е и Gl было использовано 2 схемы: 1 - при однократной иммунизации исследуемые вещества вводили 1 раз в сутки, начиная за 5 дней до иммунизации овальбумином (всего 10 инъекций); 2 - при двукратной иммунизации инъекции проводили в течение 5 дней после каждого введения овальбумина и за 5 дней до первого. Сыворотку крови для исследования забирали на 7 сутки после последней иммунизации. Аллерген-специфические (овальбумин-специфические) иммуноглобулины определяли методом пассивной кожной анафилаксии и иммуноферментным методом с использованием тест-систем.

На фоне однократной иммунизации курсовое введение ликопида, галавита, глутоксима и альгината не изменяло уровня IgE в сыворотке крови мышей; водорастворимые растительные полисахариды агажали их содержание в 2,4 раза (ПС полыни), в 2,3 раза (ПС календулы), в 2 раза (ПС клевера), в 1,9 раза (ПС девясила), в 1,7 раза (ПС мать-и-мачехи) и в 1,6 (ПС аира). Содержание IgE в сыворотке крови двукратно иммунизированных мышей было оценено при введении ПС аира, ПС мать-и-мачехи и ликопида. Все эти вещества снижали данный показатель (ликопид - в 3,6 раза, IIC мать-и-мачехи - в 3,4 раза и ПС аира - в 2,6 раза).

На фоне двукратной нммуннзации препараты сравнения галавит, глутоксим и ликопид снижали содержание IgGl в 2,3 раза, в 1,9 раза ив 1,8 раз соответственно. Все растительные полисахариды за исключением ПС березы также снижали в сыворотке крови содержание данного иммуноглобулина: в 2,2 раза - ПС клевера, в 2 - раза ПС аира, ПС девясила и ПС календулы, в 1,6 раза - ПС полыни и в 1,3 раза - ПС мать-и-мачехи.

Уровень овальбумин-специфических иммуноглобулинов методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА) определяли в сыворотке крови сенсибилизированных мышей, получавших курс ПС мать-и-мачехи и D-глюкуроновой кислоты. При оценке титра IgE было обнаружено, что в максимальном разведении 1/16 сыворотка 20% мышей, получавших ПС мать-и-мачехи, и 30% получавших глюкуроновую кислоту не вызывала реакции, в отличие от сыворотки животных контрольной группы. Площадь окрашенных участков кожи при этом разведении в опыте была в десятки раз ниже, чем в контроле. Другие разведения сыворотки опытных групп животных индуцировали реакцию, но многократно слабее, чем сыворотки контрольных животных. Аллерген-специфические антитела IgGl в реакции ПКА у опытных животных, получавших D-глюкуроновую кислоту, обнаруживались только в титрах 1/4 и 1/8. Площадь окрашенного участка уменьшалась в 3 и 4 раза соответственно. В максимальном разведении сыворотки реакция снижалась в 455 раз. Эти данные с в идете ль ств уют о значительном снижении количества овальбумин-специфических антител классов Е и G1 в сыворотке крови мышей после курсового введения ПС мать-и-мачехи и D-глюкуроновой кислоты.

Полученные результаты показывают, что все исследуемые вещества, за исключением ПС березы, глутоксима и галавита, обладали способностью подавлять общую анафилаксию. Наиболее выраженная активность при этом обнаружилась у ПС аира, девясила, клевера, мать-и-мачехи, а также альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты. По-видимому в основе механизма их ингибиторного действия лежит подавление продукции IgE и IgGl. Можно предположить, что альгинат кальция снижал тяжесть анафилактического шока также за счет связывания аллергенспецифических антател, т.к. на фоне однократной иммунизации овальбумином снижения продукции иммуноглобулинов выявлено не было.

Известно, что анафилаксия представляет собой иммунный ответ, связанный с гиперактивацией Tli2 цитокинов, что ведет к увеличению количества В-лимфоцитов, вырабатывающих аллергенспецифические иммуноглобулины Е и G1, увеличению числа эозинофилов и базофилов [Calder V.L., 2002; Mackay I.R., Rosen F.S., 2001]. При вторичном попадании аллергена образующийся комплекс аллергена и иммуноглобулинов Е и G1 связывается с рецепторами эффекгорных клеток (прежде всего, эозинофилов, базофилов и тучных клеток), что ведет к выбросу медиаторов воспаления (гистамина, серотонина, брадикинина), повышению проницаемости кровеносных сосудов, развитию отеков тканей, бронхоспазму, гиперсекреции мокроты в дыхательных путях, слизистых глаза, кожному зуд, диарее и

другим клиническим проявлениям анафилаксии. Таким образом, в основе механизма антианафилактического действия может лежать не только ингибирование продукции IgE и TgGl, но и стабилизация мембран тучных клеток. Показано, что вещества-стабилизаторы мембран тучных клеток (препараты кетотифен, кромогексал, цетиризин) препятствуют входу кальция в тучные клетки и, как следствие этого, тормозят их дегрануляцию [Энциклопедия лекарств, 2004].

Для оценки действия исследуемых веществ на тучные клетки было изучено влияние курсового введения ПС аира, ПС девясила, ПС календулы, ПС берёзы, альгината кальция и ликопида па способность сыворотки животных вызывать непрямую дегрануляцию тучных клеток интактных животных. Во всех случаях сыворотка крови мышей контрольной группы (получавших ФР на фоне иммунизации OVA) в присутствии исследуемых веществ не вызывала дегрануляцию тучных клеток интактных животных, в присутствии же антигена было выявлено двукратное увеличение показателя. Инкубация тучных клеток с сывороткой крови сенсибилизированных мышей, получавших курс ПС аира, ПС девясила, ПС календулы, альгината и ликопида, как в присутствии овальбумина, так и исследуемых веществ не приводила к достоверному изменению показателя. Исключение составили ПС берёзы, при курсовом введении которых сыворотка крови вызывала трёхкратное увеличение дегрануляции тучных клеток при инкубации с антигеном и четырёхкратное - при инкубации с ПС.

Таким образом, курсовое введение ПС аира, календулы и альгината кальция на фоне иммунизации овальбумином способствует стабилизации мембран тучных клеток. Введение ПС берёзы приводит к усилению экспериментального ТЬ2-зависимого иммунного ответа.

Действие ПС аира на поляризованные лимфоциты было также оценено в адоптивной реакции ГЗТ (Thl-зависимая реакция) и адоптивной реакции локального воспаления (ТЬ2-зависимая реакция). Для этого интактным мышам контрольной труппы в подушечку контрольной лапы вводили спленоциты, выделенные из селезёнок интактных мышей, а в опытную лапу спленоциты, полученные от животных, трёхкратно иммунизированных OVA или вакциной BCG, и соответствующий антиген (OVA или BCG) в обе лапы. Животные опытной группы (интактные мыши) получали аналогично спленоциты, антиген и дополнительно ПС аира (20 мкг/лапу). Возникающий воспалительный ответ оценивали через 24 ч. Введение ПС аира приводило к повышению интенсивности Thl-зависимой иммунной реакции, которая увеличивалась в 1,8 раз. Воспаление, развивающееся при введении спленоцитов, полученных от мышей иммунизированных OVA (Th2-зависимая реакция), совместно с антигеном и ПС аира, напротив, снижалось в 9,3 раза. Эти результаты свидетельствуют о том, что ПС аира обладают способностью сдвигать баланс Thl/Th2 в сторону Thl типа поляризации.

Проведённые исследования показали, что растительные водорастворимые полисахариды, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота стимулируют ировоспалительные свойства макрофага, при этом

механизмы действия имеют некоторые особенности. Вероятно, такое однообразие действия изученных веществ обусловлено тем, что они взаимодействуют с подобными паттерн-распознающими структурами клетки.

В заключении следует подчеркнуть, что полученные данные позволяют яснее понять механизмы, лежащие в основе регуляции иммунного ответа, и роль в этом процессе макрофагапьных клеток. Исследованные вещества проявили способность классически активировать макрофаги с развитием воспалительных свойств, что позволяет рассматривать водорастворимые растительные полисахариды, альгннат кальция и D-глюкуроновую кислоту в качестве кандидатов на роль фармакологических корректоров иммунного ответа. Такие лекарственные средства, стимулирующие ТЫ-зависимые иммунологические реакции, могут быть полезны в лечении хронических, вялотекущих инфекционных заболеваний, а также при иммунотерапии онкологических заболеваний. Выявленная в работе способность растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты подавлять Th2 тип иммунного ответа может быть основой для создания препаратов для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны модели для изучения фармакологической регуляции функционального состояния макрофагов при разных типах иммунного ответа. Показано, что в динамике Thl типа иммунного ответа метаболизм аргинина в перитонеальных макрофагах мышей характеризуется первоначальным усилением продукции оксида азота и снижением активности аргиназы, сменяющимся одновременным увеличением этих показателей, после чего продукция оксида азота устанавливается на уровне интактного контроля, а активность аргиназы остается повышенной. При Tli2-зависимом иммунном ответе наблюдается усиление активности аргиназы перитонеальных макрофагов, при этом уровень продукции оксида азота не изменяется. Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов мышей при Thl и Th2 типах иммунного ответа значительно увеличивается.

2. Водорастворимые растительные полисахариды (за исключением полисахаридов берёзы), D-глюкуроновая кислота и алыинат кальция стимулируют продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных животных.

3. NO-стимулирующая активность водорастворимых полисахаридов девясила, календулы, клевера полностью зависит от сигнальных молекул PI3K и киназы р38, частично от МАРК 1/2. Активационный каскад, индуцируемый липополисахаридом Е. coli, лишь частично зависит от киназы р38, что свидетельствует о различном механизме действия данных растительных полисахаридов и липополисахарида Е. coli.

4. Водорастворимые полисахариды (за исключением полисахаридов берёзы), D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция сдвигают баланс

NO/аргиназы интактных леритонеальных макрофагов в сторону продукции оксида азота. При этом полисахариды аира, клевера, мать-и-мачехи и полыни ингибируют активность аргиназы, альгинат кальция не влияет, а полисахариды берёзы и D-глгокуроновая кислота стимулируют активность фермента. Полисахариды девясила и календулы в зависимости от длительности воздействия оказывают разнонаправленное действие.

5. Полисахариды календулы и клевера ингибируют стимулированную липополисахаридом Е. coli выработку N0 перитонеальными макрофагами. Полисахариды аира, берёзы, мать-и-мачехи, полыни и альгинат кальция не влияют, а полисахариды девясила и D-глнжуроновая кислота повышают продукцию оксида азота.

Стимулирова1шую липополисахаридом Е. coli активность аргиназы перитонеальных макрофагов подавляют полисахариды берёзы, клевера и мать-и-мачехи, не влияют на показатель полисахариды девясила, альгинат кальция и D-глгокуроновая кислота. Полисахариды полыни, аира и календулы действуют на активность аргиназы разнонаправлено, в зависимости от длительности культивирования.

6. Полисахариды аира, девясила, календулы, клевера и мать-и-мачехи значительно увеличивают, а полисахариды березы, полыни, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота не влияют на секрецию IL-12 перитонеальными макрофагами мышей. Исследуемые вещества не оказывают влияния на продукцию IL-10 макрофагами мышей, а альгинат кальция ее подавляет. Все исследуемые полисахариды, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота усиливают стимулированную липополисахаридом Е. coli продукцию TNF-a мононуклеарами человека и снижают стимулированную липополисахаридом выработку IL-10.

7. Фракции полисахаридов берёзы в отличие от действия суммарного комплекса полисахаридов обладают способностью дозозависимо стимулировать продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей. Фракции полисахаридов клевера сохраняют NO-стимулиругощее действие. Изучаемые фракции не влияют на активность аргиназы перитонеальных макрофагов.

NO-стимулирующая активность фракций водорастворимых полисахаридов берёзы и клевера зависит от цАМФ, сигнальных молекул р38, фосфотидгошнозитол-З-киназы и транскрипционного фактора NF-кВ; при этом МЕК1/2 не принимает участия в активации NO-синтазы.

8. Курсовое введение животным водорастворимых полисахаридов (за исключением полисахаридов календулы), D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на модели Thl-зависимого иммунного ответа, вызванного иммунизацией эритроцитами барана, способствует усилению реакции ГЗТ. Курсовое применение водорастворимых полисахаридов (за исключением полисахаридов девясила), альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты повышает число антителообразующих клеток. У животных, получавших курс полисахаридов берёзы, девясила, мать-и-мачехи, D-глюкуроновой кислоты и альгината, усиливается синтез антител, вырабатываемых В-лимфоцитами.

9. На модели Игё-зависимого типа иммунного ответа, вызванного введением овальбумина, курсовое введение полисахаридов аира, календулы, клевера, мать-и-мачехи, полыни, D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция приводит к снижению смертности животных в результате анафилактического шока, индуцированного овальбумином, а полисахариды берёзы увеличивают величину летальности.

10. Уровень IgE в сыворотке крови иммунизированных овальбумином мышей снижается при введении водорастворимых растительных полисахаридов аира, девясила, календулы, клевера, мать-и-мачехи, полыни и не меняется после курсового введения альгината кальция и полисахаридов березы. Курсовое введение растительных полисахаридов (кроме полисахаридов берёзы) приводит к уменьшению содержания IgGl в сыворотке крови иммунизированных овальбумином животных.

11. Курсовое введение полисахаридов аира, календулы и альгината кальция на фоне иммунизации овальбумином способствует стабилизации мембран тучных клеток. Введение полисахаридов берёзы оказывает выраженное гистаминлиберагорное действие, усиливая экспериментальный ТЬ2-зависимый иммунный ответ.

12. Водорастворимые полисахариды аира способствуют повышению интенсивности адоптивной ТЫ -зависимой и подавлению адоптивной Th2-зависимой реакции локального воспаления.

13. Водорастворимые растительные полисахариды (кроме полисахаридов берёзы), D-глюкуроновая кислота, алыинат кальция классически активируют макрофаги in vitro; при введении in vivo способствуют поддержанию ТЫ и подавляют Th2 иммунный ответ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции кроветворения на модели цитостатической миелосупрессии // Бюлл. эксперта, биол. и медицины. 2001. Т. 132. № 8. С. 156-160 (соавторы В.В. Жданов, Е.В. Удут, JI.A. Гурьянцева, A.M. Дыгай, Е.Д. Гольдберг).

2. Влияние цитокинов и их комбинаций на экспрессию сиалоадгезина макрофагами костного мозга // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2003. Т. 136. № 8. С. 160-162 (соавторы С.А. Кусмарцев, Н.В. Вельская, В.И. Агафонов, A.M. Дыгай, Е.Д. Гольдберг).

3. Экспрессия аргиназы перитонеальньши макрофагами и продукция ими оксида азота при Thl- и ТЬ2-зависимом иммунном ответе // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2007. Приложение 1. С. 97-100 (соавторы Ю.П. Вельский. Н.В. Вельская, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов).

4. Исследование иммунорегуляторных свойств полисахаридов из растительного сырья // Создание новых лекарственных препаратов (материалы конференции). Издательство Томского университета.

Томск, 2007. С. 53-55 (соавторы Ю.П. Вельский, Е.С. Трофимова, Н.В. Вельская, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов, A.M. Гурьев, MB. Белоусов).

5. Противоаллергическое действие D-глтокуроновой кислоты // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2008. Т. 71. № 5.' С. 37-39 (соавторы Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, A.A. Лигачева, В.И. Агафонов).

6. Молекулы внутриклеточного сигналинга активации макрофага при опухолевом росте: поиск терапевтических мишеней // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т. 23, № 3. Вып. 1. С. 84-85 (соавторы Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, Е.Г. Учасова, A.A. Лигачева, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов).

7. Влияние водорастворимых полисахаридов девясила на продукцию NO и экспрессию аргиназы макрофагами мыши // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23, № 3. Вып. 1. С. 121-122 (соавторы Е.Г. Учасова, A.A. Лигачева, Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский, Е.С. Трофимова, A.M. Гурьев, М.В. Белоусов, P.P. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).

8. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию TgE и IgGl // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т. 23, № 3. Вып. 1. С. 102 (соавторы A.A. Лигачева, Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, A.M. Гурьев, М.В. Белоусов, P.P. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).

9. Роль р38 и PI3K в активации макрофагов водорастворимыми полисахаридами календулы и клевера // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т. 23, № 3. Вып. 1. С. 92 (соавторы Ю.П. Вельский, Е.Г. Учасова, Н.В. Вельская, A.A. Лигачева, Е.С. Трофимова, A.M. Гурьев, М.В. Белоусов, P.P. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).

10.Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию иммуноглобулинов классов Е и Gl лимфоцитами мышей, сенсибилизированных овальбумином // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2008. Т. 146. № 11. С. 520-522 (соавторы Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, A.A. Лигачева, A.M. Гурьев, М.В. Белоусов, P.P. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).

11.Макрофаги как фармакологическая мишень для регуляции баланса Thl/Tli2 // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2008. Приложение № 2. С. 63-68 (соавторы A.M. Гурьев, Н.В. Вельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Вельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, A.A. Лигачева, P.P. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).

12.Противоатопическое действие полисахаридов аира // Российский аллергологический журнал. 2009. Mi 3. Вып. 1. С. 442 (соавторы Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, A.A. Лигачева, A.M. Гурьев, М.В. Белоусов, В.И. Агафонов).

13.Влияние растительных полисахаридов на NO-синтазу и аргиназу макрофагов мыши // Вестник Уральской медицинской академической

науки. 2009. № 2. Вып. 25. С. 49-50 (соавторы A.M. Гурьев, Н.В. Вельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Вельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, A.A. Лигачева, P.P. Ахмеджанов, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).

14.Перспективы фармакологической регуляции активности макрофагов через модуляцию внутриклеточного сигнального каскада // Вестник Российской АМН. 2009. № 11. С. 21-25 (соавторы Вельский Ю.П., Вельская Н.В., Трофимова Е.С., Учасова Е.Г., Лигачева A.A., Агафонов В.И,).

15.Water-soluble polysaccharide obtained from Acorus calamus L. classically activates macrophages and stimulates Thl response /7 International Immunopharmacology. 2010. Vol. 10. № 8. P. 933-942 (соавторы Belska N.V., Guriev A.M., Trophimova E.S., Uchasova E.G., Ligatcheva A.A., Belousov M.V., Agaphonov V.l., Golovchenko V.G., Yusubov M.S., Belsky Y.P.).

16.Моделирование системной анафилаксии на мышах линии BALb/c // Биомедицина. 2010. № 1. С. 37-50 (соавторы Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, О.С. Борсук, В.И. Агафонов).

17.Влияние полисахаридов из растительного сырья на Thl-зависимый иммунный ответ (скрининговое исследование) // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. Т. 73. № 6. С. 19-22 (соавторы Ю.П. Вельский, A.M. Гурьев, М.В. Белоусов, Н.В. Вельская, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, P.P. Ахмеджанов, A.A. Лигачева, М.С. Юсубов, В.И. Агафонов).

Патенты

1. Патент РФ № 2240801 от 27.11.2004 г. Средство, обладающее противоаллергическим действием (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.И. Агафонов, Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, Е.С. Трофимова).

2. Патент РФ № 2318525 от 29.06.2006 г. Способ получения поляризованных лимфоцитов для моделирования Th2-индуцированного отека (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.И. Агафонов, Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, Е.С. Трофимова).

3. Патент РФ № 2329821 от 27.07.2008 г. Средство, обладающее иммуномодулируклцей активностью (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, A.M. Гурьев, Н.В. Вельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Вельский, М.С, Юсубов, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов).

4. Патент РФ № 2337699 от 10.11.2008 г. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, A.M. Гурьев, Н.В. Вельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Вельский, М.С. Юсубов, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов).

5. Патент РФ № 2337700 от 10.11.2008 г. Средство, обладающее противоаллергическим действием (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, А.М. Гурьев, Н.В. Вельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, М.С. Юсубов, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов, Е.Г. Учасова).

6. Патент РФ № 2347562 от 27.02.2009 г. Средство, обладающее иммуномодулиругощей активностью (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, Н.В. Вельская, Ю.П. Бельский, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов).

7. Патент РФ № 2378004 от 10.01.2010 г. Средство, обладающее противоаллергическим действием (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, A.M. Гурьев, Н.В. Вельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, М.С. Юсубов, Е.С. Трофимова, P.P. Ахмеджанов, A.A. Лигачева, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов)

8. Патент РФ № 2379047 от 20.01.2010 г. Средство, обладающее противоаллергическим действием (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, A.M. Гурьев, Н.В. Вельская, М.В. Белоусов, Ю.П. Бельский, М.С. Юсубов, Е.С. Трофимова, P.P. Ахмеджанов, A.A. Лигачева, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов).

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АОК - антителообразующие клетки

АПК - антиген-презентиругощне клетки

ГЗТ - реакция гиперчувствительности замедленного типа

ГНТ - реакция гиперчувствительности немедленного типа

ЕА - единица активности

ЛГ1С - липополисахарид Е. coli

Ml и М2 - макрофага 1 и 2 типа

МДП - мурамилдипептид (К-ацстилмурамнл-Ь-алашш-О-изот лутамин) Мн - мононуклеары Мф - макрофаги

М-КСФ - макрофагальный колонисстимулирующий фактор

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ПГЕ - простапшшдип С

ПКА - пассивная кожная анафилаксия

ПС - полисахариды

ФР - физиологический раствор хлорида натрия

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

BCG - (Bacillus Calmette-Guerrin) туберкулёзная вакцина БЦЖ

СОХ - (cyclooxygenase) циклооксигеназа

CD - (claster of differentiation) поверхностные дифференцировочные молекулы

лейкоцитов, определяемые с помощью моноклональных антител

IFN - (interferon) интерферон

Ig - (immunoglobulins) иммуноглобулины

IL - (intcrleukins) интерлейкины

iNOS - (inducibale nitric oxide synthase) индуцибельная NO-синтаза MAP - (mitogen activated proteins) митогенактивируемые протеины (семейство кииаз - регуляториых молекул, контролирующих экспрессию генов под воздействием факторов межклеточной сигнализации)

МАРК - (mitogen associated proteins kinases) митогенактивируемая протеин-киназа МЕК1/2 - MAP киназа

NF-кВ - (nuclear transcription factor кВ) ядерный фактор транскрипции каппа Б NO - (nitric oxide) оксид азота

NOD - (nucleotide-binding oligomerization domain) нуклеотидсвязывающий олигомеризационный домен цотоплазматических паттсрнраспознающих рецепторов OVA - овальбумин р38 - MAP киназа

РАМР - (patogen-associated molecular patterns) патогенассоциированные

молекулярные паттерны

PI3K - (phosphoinositide-3-kinasa) - MAP киназа

STAT - (signal transducer and activation transcription) сигнальный белок трансакции и активатор транскрипции

TGF-p - (transfonrung growth factor P) транформирующий фактор роста бэта Th - (Т helpers) Т-хелперы

TLR - (toll-like receptor) толлподобные рецеитры (семейство консервативных трансмембранных белков)

TNF-a - (tumor necrosis factor а) фактор некроза опухоли альфа

Подписано в печать: 10.03.2011 г. Бумага: офсетная Тираж: 110 экз. Печать: трафаретная

Формат: 60x84/16 Усл. печ. л.: 2,55

Заказ: 572/Н

Издательство

Томского государственного педагогического университета

г. Томск, ул. Герцена, 49. Тел. (3822) 52-12-93 e-mail: publish@tspu.edu.ru

Актуальность проблемы. Макрофаги фенотипически и функционально гетерогенны и могут проявлять противоположную по своей сути активность, например, развивать и поддерживать воспаление либо купировать его, индуцировать иммунный ответ либо поддерживать толерантность, разрушать ткани либо участвовать в их репарации и построении межклеточного матрикса [Stout R.D., Suttles J., 2004.]. Свойства макрофагов являются результатом воздействия многих факторов, включая цитокины, хемокины, адренергические и холинергические агонисты, гормоны, иммуноглобулины, жирные кислоты. Как элемент врождённого иммунитета, макрофаги обеспечивают первую линию защиты от микроорганизмов, аллергенов, трансформированных клеток, вырабатывая микробицидные факторы, привлекая других участников неспецифической резистентности, регулируя сосудистый тонус в месте воспаления, а также фагоцитируя и уничтожая инфекционные агенты.

Макрофаги являются также одним из звеньев, связывающих врождённый и приобретенный иммунитет благодаря способности презентировать иммунокомпетентным клеткам чужеродные антигены, выделять хемокины, привлекающие лимфоциты к очагу воспаления, а также вырабатывать цитокины, способствующие протеканию иммунологических реакций. От поведения антигенпрезентирующей клетки (прежде всего, макрофага и дендритной клетки) в первую фазу иммунного воспаления зависит качество развивающегося иммунного ответа: продуцируя IL-12 или IL-10, они способствуют развитию ТЫ или Th2 тип иммунного ответа [Alzona М. et al, 1995; Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000; Mosser D.M., 2003; Gutcher I., Becher В., 2007].

В свою очередь, цитокины поляризованных Т-хелперов индуцируют активацию макрофагов, причем качественно различно. Большинство функций макрофагов, которые традиционно ассоциировались с их активацией (фагоцитоз микроорганизмов, микробицидная активность, индукция воспаления, противоопухолевая активность), стимулируются цитокинами Thl, прежде всего, - IFN-y. Такую активацию макрофагов стали называть классической [Gordon S., 2003; Mantovani A., et al., 2004, 2005]. Цитокины Th2 (IL-4, IL-10), в свою очередь, не просто подавляют классическую активацию, но вызывают появление у макрофагов качественно иных свойств. Эти макрофаги способствуют образованию межклеточного матрикса, репарации и ремоделированию тканей, подавляют воспаление, стимулируют сосудообразование, фагоцитируют апоптотические клетки [Martinez F.O., 2008]. Такую активацию макрофагов стали обозначать термином «альтернативная активация» [Gordon S., 2003; Mantovani A., et al., 2004, 2005].

Для классически активированных макрофагов (Ml) характерна продукция воспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-2, фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), стимуляция циклооксигеназы (СОХ) и индуцибельной NO-синтазы (iNOS). Для альтернативно активированных макрофагов (М2) характерна продукция противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF-ß, антагониста рецептора IL-1 (IL-lRa), экспрессия печеночной аргиназы [Mantovani A., et al., 2004,2005].

У активированных макрофагов резко повышается потребление L-аргинина: Ml с помощью iNOS преобразуют его в оксид азота и цитруллин; М2 с помощью аргиназы - в мочевину и орнитин [Munder М., 1998]. Макрофаг утилизирует L-аргинин преимущественно по одному из путей -либо через NO-синтазу, либо через аргиназу, что позволило рассматривать метаболизм аргинина как показатель типа активации макрофага [Munder М. et al., 1998; Kreider Т. et al., 2007].

Хотя и Ml, и М2 клетки способны к фагоцитозу, но это их свойство качественно различается. Известно, что активаторы Ml (IFN-y и TNF-a) увеличивают экспрессию CR3 и чрезвычайно мощно усиливают способность макрофагов к FcyR-опосредованному фагоцитозу и внутриклеточному киллингу патогенов [Erbe D.V. et al., 1990; Corradin S.B. et al., 1991; Drevets D.A. et al., 1996; Trinchieri G., Gerosa F., 1996.; Ahmed J.S., 2002; Berclaz P.-Y. et al., 2002]. Фагоцитоз апоптотических клеток является признаком альтернативной активации (М2) [Rathmell J.C., Thompson C.B. , 1999; Savill J. et al., 2002].

Макрофаги представляют собой важный регуляторный элемент .гемопоэза [Дыгай A.M., Жданов В., Удут Е.В., 2009; Дыгай A.M., Жданов В., 2010]. Известно, что при иммунном ответе функционирование кроветворной ткани меняется (Thl сопровождается выходом в кровеносное русло нейтрофильных гранулоцитов, а клиническим признаком Th2 ответа является повышенное содержание эозинофильных гранулоцитов). Известно, что сиалоадгезин (CD 169) — иммуноглобулиноподобный рецептор семейства Siglec - экспрессируется на резидентных макрофагах костного мозга и лимфоидных органов [Crocker P.R., Gordon S., 1989], опосредует адгезию Ти В-лимфоцитов с макрофагами лимфоидной ткани [Van den Berg Т.К. et al., 1992], участвует в иммунном воспалении [Hartnell A. et al., 2001; Kumamoto Y. et al., 2004; Ikezumi Y. et al., 2005]. При Thl-зависимых состояниях экспрессия сиалоадгезина повышается [Hartnell A. et al., 2001; Kumamoto Y. et al., 2004]. Рецептор к эритробластам (CD163) - член семейства скавенджер рецепторов — может связываться с бактериями и индуцировать локальное воспаление [Babs О. et al., 2009]. Воспалительные стимулы (ЛПС, IFN-y и TNF-a) подавляют экспрессию CD 163, а противовоспалительные (IL-6, IL-10 и дексаметазон), напротив, резко ее повышают [Buechler С. et al., 2000].

В отличие от лимфоцитов, которые, единожды поляризовавшись, не меняют свою ориентацию, макрофаги способны изменять свой поляризационный профиль [Gratchev A. et al., 2006]. Именно благодаря этой пластичности они представляют собой перспективную фармакологическую мишень для регуляции баланса Thl/Th2. Однако в настоящее время не существует иммуномодуляторов, разрешённых к медицинскому применению, обладающих способностью изменять баланс Thl/Th2 клеток в желаемом направлении [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000а], что объясняет востребованность поиска препаратов с доказанной селективной способностью к регуляции этого баланса.

В нашей работе в качестве регуляторов функционального состояния были выбраны водорастворимые полисахариды высших растений (аир болотный, берёза повислая, девясил высокий, календула лекарственная, клевер луговой, полынь горькая, мать-и-мачеха обыкновенная), альгинат кальция (кальциевая соль альгиновых кислот, полученная из бурых водорослей) и D-глюкуроновая кислота. В качестве препаратов сравнения были взяты фармакопейные препараты ликопид, галавит и глутоксим, главной фармакологической мишенью которых является макрофаг. Так, ликопид изменяет функциональное состояние макрофага, взаимодействуя с паттерн-распознающими структурами клетки [Иванов В.Т. и др., 1996; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996, 2003], а галавит и глутоксим изменяют функционально-метаболическую активность макрофагов [Хаитов P.M., Пинегин Б .В., 2003; Мрикаев Б.М., 2005; Мирошник O.A., Редькин Ю.В., 2006].

Действие выбранных нами веществ на макрофаги и иммунный ответ ранее не изучалось. В литературе имеются косвенные данные, позволяющие предполагать наличие у них способности изменять функциональное состояние макрофага и проявлять иммуномодулирующие свойства. Так, известно, что:

- растительные полисахариды могут взаимодействовать со многими рецепторами макрофагов, вызывая при этом развитие воспалительных или противовоспалительных свойств и, как следствие, способствовать протеканию Thl и Th2 типа иммунного ответа [Schepetkin I.A., Quinn М.Т. 2006];

- соли альгиновой кислоты проявляют противоопухолевую активность, в основе которой лежит стимуляция цитотоксических свойств макрофагальных клеток [Otterlei М. et al., 1991; Fujihara М. et al; 1993]; структуры с высоким содержанием D-глюкуроновой кислоты участвуют в регуляции клеточной адгезии, продукции различных цитокинов, хемокинов и экспрессии их рецепторов [Camenisch T.D., McDonald J.A., 2000], а также функций дендритных клеток [Termeer С.С. et al., 2000].

Учитывая изложенные выше факты, представляется актуальным исследовать специфические характеристики макрофагов при Thl/Th2 иммунном ответе и выявить показатели, которые наиболее адекватно свидетельствовали бы о функциональном состоянии макрофага; опираясь на полученные данные, изучить влияние полисахаридов различной природы на макрофаги и иммунный ответ.

Цель работы: изучить регуляцию функционального состояния макрофагов при Thl/Th2 экспериментальном иммунном ответе водорастворимыми растительными полисахаридами и обосновать их применение для модуляции иммунного ответа.

Задачи:

1. Разработать модели для изучения функционального состояния макрофагов при экспериментальном Thl и ТЪ2-зависимом иммунном ответе для отбора веществ, обладающих иммуномодулирующими свойствами.

2. Изучить влияние водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных животных и исследовать роль сигнальных молекул р38, МЕК1/2 и PI3K в их NO-стимулирующем действии.

3. Оценить действие водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на метаболизм аргинина перитонеальных макрофагов, стимулированных и не стимулированных липополисахаридом Е. coli.

4. Изучить влияние фракций полисахаридов на баланс продукции NO/аргиназы макрофагами, а также роль внутриклеточных сигнальных молекул в активации продукции оксида азота.

5. Изучить влияние водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов in vitro.

6. Исследовать влияние in vivo водорастворимых растительных полисахаридов, альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты на Thl и ТЬ2-зависимые гуморальные и клеточные реакции.

Научная новизна. Разработаны модели для изучения функционального состояния макрофагов при Thl/Th2 экспериментальном иммунном ответе in vitro, позволяющие по способу метаболизма аргинина быстро и эффективно проводить скрининг веществ, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Впервые в динамике иммунного ответа выявлено, что при Независимом иммунном ответе активность аргиназы повышается, а продукция оксида азота не изменяется; в динамике Thl-зависимого иммунного ответа баланс NO/аргиназа постепенно изменяется в сторону аргиназы. Впервые показано, что независимо от типа иммунного ответа фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов значительно увеличивается. Экспрессия костномозговыми макрофагами сиалоадгезина (CD169) снижается, а экспрессия рецептора к эритробластам (CD163) не меняется при Thl и значительно понижается при Th2 типе иммунного ответа.

Исследовано влияние in vitro водорастворимых полисахаридов (выделенных из фармакопейного растительного сырья аира, клевера, мать-и-мачехи, полыни, календулы, берёзы, девясила), а также D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами. Показано, что некоторые из исследованных веществ по своему активирующему действию не уступают липополисахариду Е. coli, но при этом механизм их N0-стимулирующей активности отличается от действия липополисахарида Е. coli и полностью зависим от сигнальной молекулы фосфотидилинозитол-3-киназы (PI3K), частично от MAP киназ р38 и МЕК1/2.

Впервые показано, что исследуемые водорастворимые растительные полисахариды (за исключением полисахаридов березы), D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция in vitro сдвигают баланс NO/аргиназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону оксида азота. На макрофаги, стимулированные липополисахаридом Е. coli, исследуемые вещества могут действовать как синергисты, так и антагонисты.

У полисахаридов аира, девясила, календулы, клевера и мать-и-мачехи обнаружена уникальная способность увеличивать секрецию провоспалительного цитокина IL-12 перитонеальными макрофагами мыши, но при этом не влиять на выработку противовоспалительного IL-10. Все тестируемые вещества усиливают выработку TNF-a и ингибируют продукцию IL-10 мононуклеарами человека.

Обнаружено, что фракции полисахаридов берёзы и клевера сдвигают баланс NO/аргиназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону продукции оксида азота, установлена роль сигнальных молекул р38, фосфотидилинозитол-3-киназы, МЕК1/2, транскрипционного фактора NF-kB и цАМФ в активации NO-синтазы исследуемыми фракциями.

Впервые проведено комплексное исследование иммуномодулирующих свойств водорастворимых растительных полисахаридов, D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на моделях Thl и Th2 иммунного ответа. Установлено, что курсовое введение исследуемых веществ стимулирует Thl тип иммунного ответа, кроме того, большинство тестируемых веществ проявляют противоаллергическое действие, подавляя анафилаксию и продукцию аллерген-специфических иммуноглобулинов.

Практическое значение работы. В работе изучены иммунофармакологические свойства растительных полисахаридов, их способность изменять функциональное состояние макрофагов в сторону усиления провоспалительных свойств и регулировать иммунный ответ Thl и

Th.2 типов. Получены данные о фармакодинамике новых веществ как на уровне системных реакций организма (иммунный ответ), так и на клеточном (макрофаги) и пострецепторном (NF-кВ, цАМФ, р38, PI3K и МЕК1/2) уровне, что может служить основой для дальнейшей разработки этих веществ и получения новых фармакологических иммуномодуляторов, стимулирующих ТЫ -зависимые реакции, а также средств для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний. На основании результатов работы получено 8 патентов на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При протекании иммунного ответа Thl или Th2 типа in vivo активация макрофагов имеет черты как классической, так и альтернативной активации (смешанная активация). В динамике Thl-зависимого иммунного г ответа стимуляция индуцибельной NO-синтазы снижается и выявляется активация аргиназы; при ТЬ2-зависимом иммунном ответе активность аргиназы повышается, а продукция оксида азота не изменяется.

2. Водорастворимые растительные полисахариды, D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция изменяют функциональное состояние макрофагов. Характерным свойством этих веществ является способность активировать макрофаги in vitro классически, стимулируя преобладание провоспалительных черт: усиление синтеза оксида азота и провоспалительных цитокинов IL-12 и TNF-a.

3. Водорастворимые растительные полисахариды, D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция обладают иммуномодулирующими свойствами, стимулируют Thl и подавляют Th2 тип иммунного ответа, а именно, способствуют усилению реакции ГЗТ и повышению числа антителообразующих клеток, при этом снижают содержание иммуноглобулинов Е и G1 в сыворотке крови и тяжесть протекания анафилактического шока.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на Республиканской научно-практической конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), научной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008), на X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009); на «IV Съезде физиологов Урала» (Екатеринбург, сентябрь 2009).

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 17 научных статей (в том числе 1 в зарубежном издании), из них 13 в изданиях, рекомендуемых перечнем ВАК; получено 8 патентов на изобретение.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 281 странице машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 2 рисунками и 52 таблицами. Библиографический указатель включает 485 источников, в том числе 155 отечественных и 330 иностранных.

выводы

1. Разработаны модели для изучения фармакологической регуляции функционального состояния макрофагов при разных типах иммунного ответа. Показано, что в динамике Thl типа иммунного ответа метаболизм аргинина в перитонеальных макрофагах мышей характеризуется первоначальным усилением продукции оксида азота и снижением активности аргиназы, сменяющимся одновременным увеличением этих показателей, после чего продукция оксида азота устанавливается на уровне интактного контроля, а активность аргиназы остается повышенной. При Th2-зависимом иммунном ответе наблюдается усиление активности аргиназы перитонеальных макрофагов, при этом уровень продукции оксида азота не изменяется. Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов мышей при Thl и Th2 типах иммунного ответа значительно увеличивается.

2. Водорастворимые растительные полисахариды (за исключением полисахаридов берёзы), D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция стимулируют продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных животных.

3. N0-стимулирующая активность водорастворимых полисахаридов девясила, календулы, клевера полностью зависит от сигнальных молекул PI3K и киназы р38, частично от МАРК 1/2. Активационный каскад, индуцируемый липополисахаридом Е. coli, лишь частично зависит от киназы р38, что свидетельствует о различном механизме действия данных растительных полисахаридов и липополисахарида Е. coli.

4. Водорастворимые полисахариды (за исключением полисахаридов берёзы), D-глюкуроновая кислота и альгинат кальция сдвигают баланс NO/аргиназы интактных перитонеальных макрофагов в сторону продукции оксида азота. При этом полисахариды аира, клевера, мать-и-мачехи и полыни ингибируют активность аргиназы, альгинат кальция не влияет, • а полисахариды берёзы и D-глюкуроновая кислота стимулируют активность фермента. Полисахариды девясила и календулы в зависимости от длительности воздействия оказывают разнонаправленное действие.

5. Полисахариды календулы и клевера ингибируют стимулированную липополисахаридом Е. coli выработку NO перитонеальными макрофагами. Полисахариды аира, берёзы, мать-и-мачехи, полыни и альгинат кальция не влияют, а полисахариды девясила и D-глюкуроновая кислота повышают продукцию оксида азота.

Стимулированную липополисахаридом Е. coli активность аргиназы перитонеальных макрофагов подавляют полисахариды берёзы, клевера и мать-и-мачехи, не влияют на показатель полисахариды девясила, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота. Полисахариды полыни, аира и календулы действуют на активность аргиназы разнонаправлено, в зависимости от длительности культивирования.

6. Полисахариды аира, девясила, календулы, клевера и мать-и-мачехи значительно увеличивают, а полисахариды берёзы, полыни, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота не влияют на секрецию IL-12 перитонеальными макрофагами мышей. Исследуемые вещества не оказывают влияния на продукцию IL-10 макрофагами мышей, а альгинат кальция ее подавляет. Все исследуемые полисахариды, альгинат кальция и D-глюкуроновая кислота усиливают стимулированную липополисахаридом Е. coli продукцию TNF-a мононуклеарами человека и снижают стимулированную липополисахаридом выработку IL-10.

7. Фракции полисахаридов берёзы в отличие от действия суммарного комплекса полисахаридов обладают способностью дозозависимо стимулировать продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей. Фракции полисахаридов клевера сохраняют NO-стимулирующее действие. Изучаемые фракции не влияют на активность аргиназы перитонеальных макрофагов.

NO-стимулирующая активность фракций водорастворимых полисахаридов берёзы и клевера зависит от цАМФ, сигнальных молекул р38, фосфотидилинозитол-3-киназы и транскрипционного фактора NF-кВ; при этом МЕК1/2 не принимает участия в активации NO-синтазы.

8. Курсовое введение животным водорастворимых полисахаридов (за исключением полисахаридов календулы), D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция на модели ТЫ -зависимого иммунного ответа, вызванного иммунизацией эритроцитами барана, способствует усилению реакции ГЗТ. Курсовое применение водорастворимых полисахаридов (за исключением полисахаридов девясила), альгината кальция и D-глюкуроновой кислоты повышает число антителообразующих клеток. У животных, получавших курс полисахаридов берёзы, девясила, мать-и-мачехи, D-глюкуроновой кислоты и альгината, усиливается синтез антител, вырабатываемых В-лимфоцитами.

9. На модели ТЬ2-зависимого типа иммунного ответа, вызванного введением овальбумина, курсовое введение полисахаридов аира, календулы, клевера, мать-и-мачехи, полыни, D-глюкуроновой кислоты и альгината кальция приводит к снижению смертности животных в результате анафилактического шока, индуцированного овальбумином, а полисахариды березы увеличивают величину летальности.

10. Уровень IgE в сыворотке крови иммунизированных овальбумином мышей снижается при введении водорастворимых растительных полисахаридов аира, девясила, календулы, клевера, мать-и-мачехи, полыни и не меняется после курсового введения альгината кальция и полисахаридов берёзы. Курсовое введение растительных полисахаридов (кроме полисахаридов березы) приводит к уменьшению содержания IgGl ' в сыворотке крови иммунизированных овальбумином животных.

11. Курсовое введение полисахаридов аира, календулы и альгината кальция на фоне иммунизации овальбумином способствует стабилизации мембран тучных клеток. Введение полисахаридов берёзы оказывает выраженное гистаминлибераторное действие, усиливая экспериментальный Независимый иммунный ответ.

12. Водорастворимые полисахариды аира способствуют повышению интенсивности адоптивной Thl-зависимой и подавлению адоптивной Th2-зависимой реакции локального воспаления.

13. Водорастворимые растительные полисахариды (кроме полисахаридов берёзы), D-глюкуроновая кислота, альгинат кальция классически активируют макрофаги in vitro; при введении in vivo способствуют поддержанию Thl и подавляют Th2 иммунный ответ.

235

Заключение

Макрофаги входят в систему мононуклеарных фагоцитов, происходят из общей полипотентной стволовой клетки, после ряда преобразований, происходящих в костном мозге, в виде моноцита выходит в периферическую кровь.

Многочисленные экспериментальные исследования и клинические наблюдения не оставляют сомнений в важной роли макрофагальных клеток в регуляции гемопоэза. Свою функцию регулятора гемопоэза макрофаги осуществляют как через тесный контакт с созревающими клетками в гемопоэтическом островке костного мозга, так и через цитокины, способность секретировать которые резко увеличивается при воздействии бактериальных продуктов, цитокинов Т-лимфоцитов и других факторов.

Сиалоадгезин (CD169) - один из основных рецепторов макрофага, связывающий его с созревающими миелоидными клетками, обнаруживается в местах контакта стромального макрофага и развивающегося гранулоцита, а также макрофага и эритробласта. Экспрессируется также на резидентных макрофагах лимфоидных органов (маргинальная зона селезёнки), что позволяет предполагать его участие в выполнении специализированных функций иннатного и адаптивного иммунитета. Сиалоадгезин может опосредовать адгезию Т- и В-лимфоцитов с макрофагом, важен при воспалении (например, его экспрессия резко повышена при ревматоидном артрите, при кожной ГЗТ у мышей, при мезангиальном пролиферативнбм нефрите у крыс и пролиферативном гломерулонефрите у человека).

Рецептор к эритробластам (CD 163) - ещё один рецептор, который обеспечивает связывание макрофага и эритроидных клеток. Относится к семейству скавенджер рецепторов, высоко экспрессируется в местах контакта макрофагальных клеток с незрелыми эритроидными в костном мозге и в местах экстрамедуллярного кроветворения. Его экспрессия резко снижена у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями с подавленным эритропоэзом. Воспалительные стимулы (ЛПС, IFN-y и TNF-a) подавляют его экспрессию, IL-6 и IL-10 резко повышают, иммуносупрессанты (кортизол и циклоспорин) не влияют, а дексаметазон ее значительно стимулирует. Предполагается, что этот рецептор является сенсором иннатного иммунного ответа и индуктором локального воспаления.

Одной из важных функций макрофагов является их участие в обеспечении неспецифической резистентности организма (врождённого или иннатного иммунитета). Пусковым событием иннатного иммунитета является фагоцитоз, обеспечивающий удаление микробных патогенов, апоптозных и некротизированных частиц. Различают опсонин-зависимый и опсонин-независимый фагоцитоз. Паттерн-распознающие рецепторы (PRRs) макрофагов представлены растворимыми внеклеточными рецепторами, подобными комплементу, связанными с мембраной — TLR и внутриклеточными рецепторами группы NOD. Семейство TLR состоит из 13 членов (у человека пока описано только 12), распознают, например, пептидогликаны грампозитивных бактерий, липополисахариды грамнегативных бактерий, двуцепочечную вирусную РНК, липопептиды, бактериальный флагеллин, а также участвуют в распознавании ряда различных по строению компонентов поврежденной ткани. Физиологическая роль TLR не ограничивается распознаванием патогенов, их элиминацией, участием в развитии антигенспецифического ответа и поддержании гомеостаза тканей. NOD рецепторы (NOD-like рецепторов — NLRs) включают в себя активирующий фактор апоптотической протеазы 1, NOD-LRR и белки млекопитающих. К настоящему времени описано около 20 членов семейства

NLR, которых объединяет схожесть структуры. NOD рецепторы распознают бактериальные пептидогликаны, которые являются основным компонентом бактериальной стенки грампозитивных микроорганизмов, а также олигопептиды грамнегативных бактерий.

Известно, что макрофаги способны продуцировать и секретировать более 100 различных молекул, большая часть из них являются индуцибельными. Важнейшими продуктами секреции макрофагов являются цитокины, которые по своим физиологическим свойствам разделяются на провоспалительные (IL-1, IL-6, TNF-a, IL-8, IL-12) и противовоспалительные (IL-10, TGF-ß, IL-lra). Макрофаги используют фагоцитоз и для выполнения другой своей миссии - инициации адаптивного иммунного ответа, обеспечивая иммунокомпетентные клетки информацией об антигенах. В определении качества иммунного ответа антигенпрезентирующие клетки (макрофаги и дендритные клетки) играют чрезвычайно важную роль. Кроме презентации антигена они создают цитокиновое микроокружение, которое является критическим для определения типа иммунного ответа. Баланс продукции IL-12 и IL-10 макрофагальными клетками в сторону IL-12 предопределяет Thl тип иммунного ответа, а в сторону IL-10 - Th2 тип. ILIO, цитокин с противовоспалительными свойствами, подавляет секрецию IL-12, чем опосредованно сдвигает дифференцировку лимфоцитов в ТЬ2.

В свою очередь, поляризованные Т-хелперы активируют макрофаги, превращая их в М1 (классическая активация) или М2 (альтернативная активация) клетки. Поляризованные макрофаги различаются по экспрессируемым рецепторам, продукции цитокинов, эффекторным функциям и репертуару хемокинов. М1 обладают провоспалительными свойствами, вырабатывают цитокины TNF-a, IL-12, IL-lß, IL-6, способствуют развитию и поддержанию Thl типа иммунного ответа. М2 секретируют противовоспалительные медиаторы (такие как IL-10 и агонист рецептора к IL-1), способствуют протеканию Th2 типа иммунного ответа, ранозаживлению, васкуляризации поврежденной ткани.

Известно, что главной отличительной чертой активированных тем или иным путем макрофагов является состояние метаболизма аргинина: у М1 макрофагов он утилизируется через индуцибельную Ж)-синтазу с образованием оксида азота, в то время как у М2 клеток — через аргиназу с образованием полиаминов и орнитина.

Сегодня уже накоплен немалый экспериментальный материал о внутриклеточных сигнальных путях, задействованных в активации антигенпрезентирующих клеток. Ключевыми фигурами классической активации являются два транскрипционных фактора: БТАТ! и МР-кВ. ШГЧ-у, ЛПС, а также, например, двуспиральная РНК, полисахаридные молекулы — индукторы М1 - приводит к активации №-кВ, который и обеспечивает транскрипцию молекул, характерных для классической активации (1Ь-1,1Ь-6, 1Ь-12, ТЫЕ-а, СОХ и 1>Ю-синтаза). В отличие от активации ШЫ-у, РАМР через ТЬЯ вызывают, смешанную активацию с превалированием классических или альтернативных свойств, чаще всё же классических. Индукторы альтернативной активации - 1Ь-4 и 1Ь-13 - активируют транскрипционный фактор 8ТАТ6. При активации макрофага могут активироваться МАР-киназы (ЕЯК1/2 (или ЕКК - р44/р42 МАРК), р38, ЖК (БАРК) и ЕИК5), которые передают сигнал дальше, приводя к синтезу веществ, регулирующих широкий круг процессов, включая пролиферацию, дифференцировку, адаптацию, апоптоз. МАР-киназы могут выступать в роли передатчиков как воспалительных, так и противовоспалительных сигналов. При активации ТЬК активируется также Р13-киназа (фосфотидилинозитол-3-киназа), что, как правило, приводит к увеличению пролиферации, подавлению апоптоза, увеличению транспорта глюкозы. В литературе имеется достаточно информации как о воспалительных, так и противовоспалительных свойствах Р13К. Имеются данные об участии цАМФ в проведении как воспалительных, так и противовоспалительных сигналов. Этот фактор активируется через рецепторы, ассоциированные с в-белком. Индуцированный при воспалении и проводящий противовоспалительные сигналы, дАМФ способствует затуханию воспаления, т.е. является молекулой отрицательной обратной связи.

Управление функциональным состоянием макрофагов и, как следствие, иммунным ответом, при помощи фармакологических субстанций позволит реализовать этиотропный подход в терапии патологий иммунной системы. Однако в настоящее время не существует иммуномодуляторов, разрешённых к медицинскому применению, с доказанной селективной способностью изменять баланс ТИ1/ТЬ2 клеток в желаемом направлении.

В настоящее время выделяют 7 основных групп лекарственных препаратов с иммуномодулирующими свойствами: микробные, тимические, костномозговые, цитокины, нуклеиновые кислоты, растительные, синтетические. Не все эти препараты способны влиять на функциональное состояние макрофага. Рассмотрим те группы, которые активны в отношении макрофагов. Препараты микробного происхождения первого поколения были вакцина ВСв, пирогенал и продигиозан; второе поколение представлено лизатами (бронхомунал, бронховаксом, ИРС-19, имудон) и рибосомами (рибомунил) бактерий. На основании фрагмента пептидогликана клеточной стенки микобактерии - мурамилдипептида - разработан целый клон препаратов (мурабутид, ромуртид, иттТЪег, ликопид и др.). Глюкозамилмурамилдипептид, являющийся общим повторяющимся фрагментом пептидогликана клеточной стенки всех известных бактерий, лёг в основу микробного препарата третьего поколения - ликопида. Его главная мишень - клетки врождённого иммунитета, экспрессирующие рецептор N00-2, действуя через который препарат усиливает экспрессию НЬА-БК-антигенов, повышает их микробицидную активность, стимулирует синтез ТОТ-а, 1Ь-6, 11,-12 и 1Ь-1. Созданы также препараты, содержащие комплекс патоген-ассоциированных молекулярных паттернов условно-патогенных микроорганизмов (например, Иммуновак ВП-4).

Препараты тимического (тактивин, а1-тимозин, тимопоэтин, тимопентин и имунофан) и костномозгового происхождения (миелопид) не влияют непосредственно на макрофаги, но способны опосредованно (через активацию Т-лимфоцитов) повышать их фагоцитарную активность. Группа препаратов, созданных на основе цитокинов (лейкинферон, суперлимф, беталейкин, ронколейкин, молграмостин) и нуклеиновых кислот (дезоксинуклеозиды, дезоксинуклеотиды и экстракты ДНК) стимулирует функциональную активность практически всех клеток иммунной системы (нейтрофилов, моноцитов/макрофагов, Т-хелперов и Т-киллеров).

Большинство из применяемых иммуномодуляторов растительного происхождения представляют собой отдельные группы биологически активных веществ (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, производные госсипола и т.д.) и способны стимулировать биохимические процессы «респираторного взрыва», выработку макрофагами in vitro IL-1(3, TNF-a, IL-6 и усиливать антителозависимую цитотоксичность мононуклеаров периферической крови человека. Данная группа представлена препаратами, полученными из эхинацеи пурпурной Echinacea purpurea L. и расторопши пятнистой Silybum marianum L.

Синтетические иммуномодуляторы представлены целым рядом известных лекарственных средств, относящихся к различным фармакологическим группам (например, левамизол (декарис), дибазол, диуцифон, некоторые антибиотики последнего поколения - ровомицин, рулид и др.) стимулируют фагоцитоз и индуцируют синтез некоторых цитокинов. Галавит и глутоксим напрямую воздействуют на функционально-метаболическую активность макрофагов. Полиоксидоний связывается в большей степени с моноцитами и нейтрофилами (поглощение путём эндоцитоза) и в меньшей - с лимфоцитами, повышает уровень продукции внутриклеточной перекиси водорода, активирует бактерицидную функцию, стимулирует систему комплемента. К этой группе также относятся индукторы интерферона, такие как арбидол и циклоферон. Способность влиять на функциональное состояние макрофагов обнаруживается также у витаминов Е и С. Они влияют также на молекулярный, клеточный и медиаторный механизмы регуляции иммунной системы.

Наиболее хорошо изучены иммуномодулирующие свойства полисахаридов микроорганизмов и грибов. Показано, что они влияют в первую очередь на антигенпрезентирующие клетки (моноциты и макрофаги), а также на Т- и В-лимфоциты, нейтрофилы, натуральные киллеры. Наиболее хорошо охарактеризованы следующие химические группы полисахаридов: амфотерные полисахариды капсулярного полисахаридного комплекса микроорганизмов (например, полисахарид А), (3-(1-3)-глюканы (например, выделенный из пекарских дрожжей), связанные с протеинами полисахариды (ПС К и ПС Р), маннаны, гиалуроновая кислота. Основной недостаток полисахаридов микотического и микробного происхождения - высокая токсичность.

Показано, что полисахариды растительного происхождения обладают противовоспалительными, антибактериальными, антигипогликемическими и противоопухолевыми свойствами, способностью изменять продукцию различных цитокинов, экспрессию молекул адгезии. Имеются сообщения о том, что водорастворимые полисахариды, выделенные из солодки уральской Glycyrrhiza uralensis Fish, дудника гигантского Angelica gigas Nakai, гриба агарика бразильского Agaricus blazei Murill, алтея лекарственного Althea officinalis L, душистой Viola odorata L, мальвы низкой Malva pusilla Smith, донника жёлтого Melilotus officinalis (L.) Desr, сафлора красильного Carthamus tinctorius L, из трёхкрыльника Tripterygium wilfordii, из слоевищ ульвы жесткой Ulva rigida, способны активировать макрофаги мышей. Водорастворимые полисахариды, представленные в данной работе, ранее не исследовались.

Альгинат, выделенный из бурых водорослей рода Lessonia, Laminaria и др, принадлежит к линейным сополимерам P-D-маннуроновой и a-L-гулуроновой кислот с очень вариабельным их соотношением, которое зависит от источника и способа выделения альгинатов. Действие альгината кальция на макрофаги и иммунный ответ изучено мало. Так, показано, что альгинаты обладают противоопухолевой активностью, вероятно, за счёт повышения цитостатической и цитолитической активности макрофагов. Имеются сведения о способности некоторых альгинатов стимулировать in vitro продукцию оксида азота, супероксидрадикала и TNF-a макрофагами мышей, синтез TNF-a, IL-6 и IL-1 моноцитами человека, а у олигомеров альгината обнаружено свойство взаимодействовать с паттерн-распознающими рецепторами TLR2 и TLR4, активировать NF-кВ и стимулировать продукцию TNF-a, Г- и ГМ-КСФ, IL-la, IL-ip, IL-6, IL-9 макрофагами.

D-глюкуроновая кислота является частью гиалуроновых структур . и может входить в состав лигандов к молекулам адгезии, которые, как известно, определяют качество и интенсивность иммунного ответа. Получены данные о непосредственном участии D-глюкуроновой кислоты в связывании с TLR4 при активации клеток микроглии in silico и in vivo, а также в составе гиалуроновых структур в антигенпрезентации. О прямом действии D-глюкуроновой кислоты на макрофаги, а также о наличии у неё иммуномодулирующих свойств в литературе информации нет.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Животные. В экспериментах использовали мышей линий BALB/c(H-2b), C57BL/6J(H-2d), аутбредных мышей (всего 1527) обоего пола в возрасте 8-12 недель, а также аутбредных крыс-самцов (12 голов) в возрасте 4 мес., полученных из отдела экспериментальных биомоделей НИИ фармакологии СО РАМН (1 категории согласно сертификату).

Животные содержались в неполной барьерной системе (воздухообмен составлял 10-12 крат/ч, температура - 22±2°С, влажность - 55±10 %, световой режим - 12:12 ч). Животные размещались в клетках (VELAZ) со стерилизованной мелкой стружкой в качестве подстила, имели постоянный доступ к пище (стерилизованный гранулированный корм) и воде (кипячёная питьевая вода, подкисленная соляной кислотой до рН 4-4,5). Эксперименты проводили в осеннее-зимний период, забивку животных осуществляли в утренние часы методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Распределение животных по сериям экспериментов представлено в таблице 1.

Исследуемые вещества. В работе использованы водорастворимые полисахариды, выделенные из различных растений (см. ниже), альгинат кальция, полученный из альгината натрия (см. ниже), D-глюкуроновая кислота («Sigma», США). Исследуемые вещества непосредственно перед использованием в экспериментах растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия или культутуральной среде. Перед использованием in vitro или in vivo рН раствора D-глюкуроновой кислоты доводили ЗМ раствором NaOH до физиологических показателей (рН 7,6).

Препаратами сравнения выступали ликопид (ЗАО «Пептек», Россия), галавит (ЗАО «ЦСМ «Медикор», Россия) и глутоксим (ЗАО «Фарма ВАМ», Россия). Кроме того, в экспериментах in vitro были также использованы следующие вещества: ЛПС - липополисахарид E.coli (серотип 0111:В4, «Sigma», США), мурамилдипептид (ТЧ-ацетилмурамил-Ь-аланил-Оизоглютамин, «СаИэюсЬет», США), глюконат кальция 10% для инъекций (ООО «Алвилс», Россия) и хлорид кальция 10% для инъекций (ООО «Алвилс», Россия).