Исследование структуры полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной и разработка параметров их стандартизации

Корж, Анна Петровна

Диссертации по медицине → Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследование структуры полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной и разработка параметров их стандартизации

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Корж, Анна Петровна Самара 2012 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 14.04.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Исследование структуры полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной и разработка параметров их стандартизации

005017910

На правах рукописи

Корж Анна Петровна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ПОЛИСАХАРИДОВ МАТЬ-И-МАЧЕХИ ОБЫКНОВЕННОЙ И РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ ИХ СТАНДАРТИЗАЦИИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 б дпр 20(2

Самара-2012

005017910

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: Белоусов Михаил Валерьевич

Официальные оппоненты: Кудашкипа Наталья Владимировна

доктор фармацевтических наук

доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующий кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии

Мизина Прасковья Георгиевна

доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» Российской академии сельскохозяйственных наук, главный научный сотрудник

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «_»_2012 г. в_часов на заседании Диссертационного

совета Д 208.085.06 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара,- пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «_»_

2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

И.К. Петрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В результате проведенных ранее исследований (Данилец М.Г. и др., 2009; Данилец М.Г. и др., 2010) было показано, что полисахаридные комплексы (ПСК), выделенные из надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила, листьев мать-и-мачехи, обладают иммуномодулирующими свойствами, стимулируя выработку оксида азота и подавляя аргиназу, что является наиболее выгодной комбинацией для регуляции иммунного ответа. Исходя из этого, полисахариды (ПС) указанных растений могут быть использованы в лечении хронических, вялотекущих инфекционных заболеваний, а также при иммунотерапии онкологических заболеваний. Кроме того, указанные ПСК могут являться основой создания препаратов для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин Е-зависимых) заболеваний (Лигачева A.A. и др., 2008).

Наряду с этим известно, что иммуномодулирующая активность ПС во многом обусловлена особенностями их химической структуры (особенностями строения основной и боковых цепей, конформацией мономеров и 3D-CTpyKTypofi макромолекул, способностью к образованию димеров и агрегатов) и широким диапазоном молекулярных масс (Termeer С. et al., 2000, 2002; Марков П.А. и др., 2010; Попов C.B., 2010).

Таким образом, изучение химической структуры ПС лекарственных растений Сибири, обладающих иммуномодулирующими свойствами, установление связи между структурой и активностью ПС и разработка методик их стандартизации является актуальным направлением исследований.

Цели и задачи исследования. Цель работы - на основании результатов изучения структуры и иммуномодулирующих свойств полисахаридов листьев мать-и-мачехи установить биологически активные компоненты и разработать параметры их стандартизации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Обосновать выбор перспективного объекта исследования на основе сравнительной характеристики полисахаридных комплексов высших растений, обладающих иммуномодулирующей активностью.

2. Выделить индивидуальные компоненты из перспективного объекта исследования - полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи и изучить их химическую структуру.

3. Провести сравнительное исследование иммуномодулирующей активности индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.

4. Разработать параметры стандартизации полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи для проекта ФСП «Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи».

Научная новизна. Впервые охарактеризованы полисахаридные комплексы листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила по компонентному составу, их молекулярной массе и содержанию уроновых кислот. Выявлено, что:

•полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи содержит 26,37±0,09% уроновых кислот и состоит из 5 основных компонентов с молекулярными массами: 590 кДа (8,06%), 415 кДа (8,6%), 338 кДа (20,43%), 82 кДа (38,17%), 20 кДа (24,73%);

•полисахаридный комплекс надземной части клевера лугового содержит 74,64±0,07% уроновых кислот и состоит из 5 компонентов с молекулярными массами: 720 кДа (12,94%), 620 кДа (12,94%), 320 кДа (38,83%), 35 кДа (19,42%), 20 кДа (15,86%);

•полисахаридный комплекс корневищ и корней девясила содержит 51,75±0,13% уроновых кислот и состоит из 5 компонентов с молекулярными массами: 620 кДа (17,16%), 490 кДа (17,16%), 280 кДа (62,4%), 50 кДа (1,72%), 10 кДа (1,56%).

Впервые установлена структура индивидуально выделенных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи, являющихся нейтральными (3 компонента) и кислыми полисахаридами (2 компонента):

нейтральные полисахариды -

1. а-0-галакто-(1,4)-а-0-глюкан, содержащий фрагменты арабиногалактана с разветвлениями, состоящими из остатков а-Ь-рамнопиранозы, а-Ь-арабинофуранозы и маннопиранозы (молекулярная масса 590 кДа);

2. а-В-галакто-(1,4)-а-0-глюкан, содержащий фрагменты арабиногалактана с разветвлениями, состоящими из остатков а-Ь-рамнопиранозы, а-Ь-арабинофуранозы и Р-О-ксилопиранозы (молекулярная масса 415 кДа);

3. а-0-галакто-(1,4)-а-В-глюкан, содержащий фрагменты арабиногалактана с разветвлениями из остатков а-Ь-рамнопиранозы, а-Ь-арабинофуранозы, Р-Э-ксилопиранозы и маннопиранозы (молекулярная масса 338 кДа).

кислые полисахариды -

1. а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-В-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, галактозы и глюкозы (молекулярная масса 82 кДа);

2. а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, глюкозы и галактозы (молекулярная масса 20 кДа).

Впервые проведено изучение влияния индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей. Показано, что ГЮ-стимулирующей активностью обладают следующие кислые полисахариды:

• а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, глюкозы и галактозы (молекулярная масса 20 кДа, уроновых кислот - 57,69±0,03%);

• а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-В-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, глюкозы и галактозы (молекулярная масса 82 кДа, уроновых кислот - 5,02±0,03%).

Практическая значимость. Установленная химическая структура и иммуномодулирующая активность ПС листьев мать-и-мачехи дают основание для их дальнейшего исследования с целью разработки на их основе новых лекарственных средств, предназначенных для терапии аллергических заболеваний, хронических и вялотекущих инфекционных заболеваний, а также для иммунотерапии онкологических заболеваний.

Полученные экспериментальные данные позволили обосновать аналитические подходы к стандартизации биологически активных ПС листьев мать-и-мачехи. Разработана валидированная методика количественного определения кислых ПС в ПСК листьев мать-и-мачехи.

На основании проведенного исследования разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи».

Внедрение. Результаты исследований включены в учебное пособие «Методы количественного определения поли- и олигосахаридов», которое внедрено в научно-исследовательский и учебный процесс кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России и в учебный процесс кафедры фармации ФПК и ППС ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России. На основании результатов диссертационной работы разработаны методические рекомендации «Методика количественного определения кислых полисахаридов в лекарственном растительном сырье и полисахаридных комплексах», которые внедрены в научно-исследовательский процесс Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России и в научный и учебный процесс кафедры фармацевтической химии ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России.

Разработанная методика количественного определения кислых ПС в ПСК листьев мать-и-мачехи, включенная в проект ФСП «Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи», апробирована (акт апробации от 05.05.2010 г.) и внедрена (акт о внедрении от 18.05.2010) в контрольно-аналитической лаборатории Центра по сертификации и контролю качества лекарственных средств Томской области.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты скрининговых исследований полисахаридных комплексов листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила и выбор перспективного объекта исследования - полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.

2. Результаты исследований по выделению, идентификации и установлению структуры полисахаридов листьев мать-и-мачехи.

3. Результаты изучения иммуномодулирующей активности полисахаридов листьев мать-и-мачехи.

4. Результаты разработки параметров стандартизации полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармации ФПК и ППС и Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России и комплексной целевой программой СО АМН Российской федерации «Разработка инновационных технологий новых фармацевтических продуктов на основе природных биологически активных комплексов» (№ государственной регистрации 0121152362).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на X Межрегиональной научно-практической фармацевтической конференции «Современные траектории развития фармацевтической практики» (Новосибирск, 2010); международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2010); Российской научно-практической конференции «Создание лекарственных средств на основе продуктов природного происхождения» (Пермь, 2010); 66-ой региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2011); XII научно-практической конференции «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2011); юбилейной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 60-летию работы Новокузнецкого ГИУВа в Кузбассе «Медицина XXI века» (Новокузнецк, 2011); XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2011); XII Российском конгрессе молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011); X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2011); 69-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2011); XIX Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине,

биологии, фармакологии и экологии New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology IT+M&E» (Украина, Крым, Гурзуф, 2011); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири - развитию отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств» (Новосибирск, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 6 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, выводов, списка литературы и трех приложений. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 33 рисунками. Библиографический указатель включает 244 источника литературы, из них 152 - зарубежных.

Исследования по теме диссертации выполнены при поддержке:

Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили полисахаридные комплексы (ПСК), выделенные из листьев мать-и-мачехи (Tussilago farfara L., сем. Asteraceae), корневищ и корней девясила (Inula helenium L., сем. Asteraceae), надземной части клевера лугового (Trifolium pratense L., сем. Fabaceae), которые, по данным литературы, способны стимулировать иммунный ответ по классическому Thl-типу, что позволяет их рассматривать в качестве перспективных кандидатов на роль новых иммуномодулирующих средств и является основанием для дальнейшей идентификации основного действующего начала в исследуемых ПСК. Растительное сырье исследуемых видов было собрано в 2008-2010 гг. в Томской области.

Суммарные ПСК получали из высушенного растительного сырья экстракцией подкисленной водой с последующим осаждением этанолом и очисткой методом диализа. После диализа образцы лиофилизировали и взвешивали. Содержание углеводов в исследуемых образцах определяли спектрофотометрическим методом (Dubois М. et al., 1956). Количественное определение примесей белка определяли методом Лоури (Lowry О. et al., 1951), нуклеиновых кислот - методом Спирина (Спирин A.C., 1958); уроновые кислоты - спектрофотометрически на основе реакции

с карбазолом в присутствии кислоты сульфаминовой. Измерение оптической плотности растворов проводили па спектрофотометре UNICO 2800 (США). Молекулярно-массовое распределение в образцах определяли методом эксклюзионной ВЭЖХ по времени удерживания, в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярными массами 15, 40, 60, 90, 110, 250 и 500 кДа («Sigma-Aldrich», Германия). Разделение ПСК на индивидуальные компоненты проводили методами ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе («DEAE-32, 52», США) и ультрафильтрации (Vivaspin 20). Идентификацию моносахаридов входящих в состав образцов осуществляли после полного кислотного гидролиза 2 М кислотой трифторуксусной. Моносахариды в гидролизате идентифицировали ГЖХ-МС в виде соответствующих триметилсилильных производных. Спектры ЯМР (,3С и 'Н) образцов записывали на приборах DRX-500 и DRX-300.

Фармакологические исследования проводили на 100 мышах-самцах линии C57BL/6J(H-2d) в возрасте 8-12 недель (1 категории согласно сертификату), полученных из отдела экспериментальных биологических моделей ФБГУ НИИ фармакологии СО РАМН. Перитонеальные макрофаги получали прилипанием к пластику клеток перитонеального экссудата. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере с 5% С02 и абсолютной влажности в среде следующего состава: RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% ЭТС («Hyclone», Великобритания), 20 мМ HEPES («Sigma», США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma», США), 50 мкг/мл гентамицина (РУН «Борисовский завод медицинских препаратов», Россия) и 2 mML-глютамина («Sigma», США). Полученные макрофаги (Мф) мышей культивировали в 96-луночных планшетах в присутствии ПС различных концентрациях; липополисахарида (ЛПС) E.coli (серотип 0111:В4, «Sigma», США) 1 мкг/мл. Продукцию оксида азота (NO) оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса через 48 ч (Green L.C. et al., 1982). Реактив смешивали с эквивалентным объемом надосадка, абсорбцию замеряли на спектрофотометре TitertekMultiskan® МСС («Labsystems», Финляндия) при длине волны 540 нм. Концентрацию NO определяли по градуировочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя пакет программ StatSoft Statistica v 6.0. Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса (Гмурман В.Е., 2001). Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака X и стандартную ошибку средней т. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием однофакторного дисперсионного анализа и t-критерия Даннета. Допустимым уровнем значимости считали р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение полисахаридных комплексов из листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила и их характеристика

ПСК выделяли из растительного сырья по разработанной методике, позволяющей получить максимальный набор ПС в одном образце с минимальным количеством сопутствующих примесей растительного происхождения (рис. 1).

Рис. 1. Схема выделения полисахаридных комплексов из растительного сырья

Полученные ПСК были охарактеризованы по количеству углеводов, уроновых кислот, примесей белка и нуклеиновых кислот (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика полисахаридных комплексов листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила

Объекты исследования Выход ПСК, % от массы абс. сухого сырья Количественное содержание, % от массы ПСК

углеводы уроновые кислоты Примеси

белок нуклеиновые кислоты

ПСК листьев мать-и-мачехи 3,25±0,05 97,9±0,02 26,37±0,09 0,16+0,01 0,029±0,007

ПСК надземной части клевера лугового 1,53+0,13 98,4±0,05 74,64+0,07 0,56+0,01 0,018+0,013

ПСК корневищ и корней девясила 3,5+0,1 98,2±0,02 51,75+0,13 1,02+ 0,03 0,016+0,011

Все ПСК в своем составе содержат уроновые кислоты (от 26,28 до 74,71%). Характеризуются высоким содержанием углеводов (не менее 97,7%), низким содержанием примесей белка (не более 1,05%) и нуклеиновых кислот (не более 0,036%), что свидетельствует об эффективности используемых подходов для

выделения и очистки ПСК изучаемых растений. Исследование ПСК методом эксклюзионной ВЭЖХ показало, что ПСК листьев мать-и-мачехи состоит из 5 компонентов с молекулярно-массовым распределением (ММР) - 590 кДа (8,06%), 415 кДа (8,6%), 338 кДа (20,43%), 82 кДа (38,17%) и 20 кДа (24,73%). ПСК надземной части клевера лугового состоит из 5 компонентов с ММР - 720 кДа (12,94%), 620 кДа (12,94%), 320 кДа (38,83%), 35 кДа (19,42%), 20 кДа (15,86%). ПСК корневищ и корней девясила состоит из 5 компонентов с ММР - 620 кДа (17,16%), 490 кДа (17,16%), 280 кДа (62,4%), 50 кДа (1,72%) и 10 кДа (1,56%).

Для выбора перспективного объекта исследований было проведено сравнительное исследование иммуномодулирующей активности ПСК листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера, корневищ и корней девясила на модели, оценивающей их влияние на активность NO-синтазы и продукцию окиси азота перитонеальными макрофагами мышей in vitro. Установлено, что ПСК листьев мать-и-мачехи в концентрациях 20 и 100 мкг/мл обладает in vitro выраженной иммуномодулирующей активностью, значительно превышающей аналогичные показатели у ПС надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила и сопоставимой (в дозе 100 мг/мл) с NO-стимулирующей активностью ЛПС (табл. 2).

Таблица 2

Влияние полисахаридных комплексов надземной части клевера лугового, листьев мать-и-мачехи, корневищ и корней девясила на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных мышей линии C57/BL6

Исследуемое вещество и его концентрация (мкг/мл) Концентрация нитритов (мкМ)

Контроль 1 (мф+среда) - 2,96±0,23

Контроль 2 (мф+ЛПС) 1 51,30±2,00*

ПСК листьев мать-и-мачехи 20 30,28±0,09*«

100 47,18 ±0,31 *•

Контроль 1 (мф+среда) - 2,59±0,09

Контроль 2 (мф+ЛПС) 1 40,19+1,72*«

ПСК корневищ и корней девясила 20 5.30+0,07*'

100 29,68±0,76*«

Контроль 1 (мф+среда) - 2,45±0,17

Контроль 2 (мф+ЛПС) 1 20,32±0,56*

ПСК надземной части клевера лугового 20 1,95±0,04»

100 4,51 ±0,25*«

Примечание к таблице 2: * - различия показателя с контролем 1 достоверны, р<0,05;

• - различия показателя с контролем 2 достоверны, р<0,05, п=6.

Таким образом, перспективным объектом дальнейших исследований для разработки средств коррекции иммунного ответа являются полисахариды листьев мать-и-мачехи.

Выделение индивидуальных полисахаридов листьев мать-и-мачехи и исследование их химической структуры

Для выявления компонентов, ответственных за иммуномодулирующую активность, ПСК листьев мать-и-мачехи был разделен на индивидуальные соединения. Для разделения ПСК на индивидуальные соединения был использован метод ионообменной колоночной хроматографии на DEAE-целлюлозе (в СГ-форме). В результате было получено 5 основных компонентов: PST-1, PST-2, PST-3, PST-4 и PST-5 (табл. 3).

Для определения гомогенности и чистоты полученные соединения были проанализированы методом эксклюзионной ВЭЖХ. В результате анализа установлено, что все исследуемые соединения являются индивидуальными веществами с различными молекулярными массами (табл. 3).

Полученные индивидуальные соединения ПСК листьев мать-и-мачехи были охарактеризованы по содержанию уроновых кислот и примесей белка спектрофотометрическим методом (табл. 3).

Таблица 3

Характеристика компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи

Компоненты ПСК Относительное содержание от массы ПСК, % Молекулярная масса, кДа Содержание, % от массы индивидуального соединения

Уроновые кислоты Белок

PST-1 9,34±0,04 590 1,13+0,02 0,91 ±0,01

PST-2 9,29±0,03 415 2,6+0,1 0,95+0,01

PST-3 37,07+0,01 82 5,02±0,03 0,47+0,01

PST-4 18,78+0,05 20 57,69±0,03 0,4±0,01

PST-5 15,83+0,07 338 1,4+0,04 0,21 ±0,02

Из данных, представленных в таблице 3, следует, что полисахариды PST-1, PST-2, PST-3 и PST-5 представлены преимущественно нейтральными сахарами и содержат незначительное количество уроновых кислот (от 1,11 до 5,05%). Полисахарид PST-4 отличается от других высоким содержанием уроновых кислот (57,69±0,03%). Все соединения характеризуются низким содержанием примесей белка (0,19-0,96%).

Мономерный состав полисахаридов листьев мать-и-мачехи устанавливали по времени удерживания (ВУ) ГЖХ-МС методом после предварительного гидролиза 2 М кислотой трифторуксусной с последующей дериватизацией в триметилсилили-рованные производные (рис. 2, табл. 4) в сравнении с ВУ триметилсилилированных производных стандартных образцов моносахаридов.

Таблица 4

Мономерный состав полисахаридов листьев мать-и-мачехи

Моносахарид Относительное содержание моносахаридов, %

РБТ-І РБТ-г РвТ-З Р5Т-4 Р5Т-5

О-арабиноза 27,38 21,96 6,34 24,31 20,91

Р-рамноза 7,55 20,82 32,02 - 15,84

О-ксилоза - 2,29 - - 6,97

Б-манмоза 1,55 - - - 3,28

П-галак'куза 46,01 27,04 56,34 12,41 39,61

Б-глюкоза 17,51 18,6 6,34 - 13,39

О-галактуроновая кислота - - 4,93 63,28 -

Неидентиф. компоненты - 1,51 - - 2,46

Примечание к таблице 4: - «отсутствие моносахарида в гидролизате».

По результатам ГЖХ-МС анализа полисахариды Р8Т-1, РБТ-2 и Р8Т-5 (рис. 2, табл. 4) состоят только из нейтральных моносахаридов, преобладающими компонентами являются галактоза, арабиноза, рамноза и глюкоза.

Полисахарид РБТ-З наряду с нейтральными моносахаридами (галактоза, рамноза, арабиноза и глюкоза) содержит минорные количества галактуроновой кислоты (4,93%).

Полисахарид Р8Т-4 состоит из трех основных Сахаров - арабинозы, галактозы и галактуроновой кислоты в соотношении 5,1:1,9:1,0. В связи с тем, что полимер содержит 63,28% галактуроновой кислоты, мы его отнесли к кислым полисахаридам.

PST-2

дї

Ли, п. 1Ц , .л.

PST-4

Ой

j'fO 14.00 14 10 К.ОО 1С.10 1С.00 It.fO

Рис. 2. ГЖ-хроматограммы мономерного состава компонентов ПСК листьев

мать-и-мачехи

Для установления характера гликозидных связей в макромолекулах полисахаридов использовали ЯМР-спектрометрический анализ. Положение гликозидных связей вычисляли по сдвигам сигналов соответствующих атомов углерода в 13С-ЯМР и атомов водорода в 'Н-ЯМР спектрах исслсдусмых соединений.

Соединение PST-1 (рис. 3. 4). "С-ЯМР: 99.116 (С1), 73.848 (С2), 76.992 (СЗ), 71.136 (С4), 67.934 (С5), 60.048 (С6) м.д. - остатки a-D-глюкопиранозы, связанные а(1->4)-гликозидной связью; 108.8, 106.9 103.7 м.д. - сигналы атомов С1 остатков а-D-галактопиранозы связанных a-гликозидными связями с остатками a-D-глюкопиранозы, a-D-галактопиранозы и a-L-арабинофуранозы. 'Н-ЯМР: 3.2, 1.2 м.д. - остатки a-L-рамнопиранозы; 3.5 - 4.3 м.д. остатки a-D-глюкопиранозы, связанные а(1->4)-гликозидной связью; 2.2-2.49 м.д. - ацетилированная форма остатков Сахаров.

т-чярр,

! І і І і

ІА

І \1 ^avVЛ л

Рис. 3. Спектр 1 С - ЯМР соединения PST-1

N-^nnH ii Гil Пvг ,1 м;ч141 I ¡г " |

Рис. 4. Спектр 'Н-ЯМР соединения PST-1

Соединение PST-2 (рис. 5. 6). 13С-ЯМР: 100.30 и 98.86 м.д. остатки a-D-галактопиранозы и a-D-глюкопиранозы, связанные (1—>-4)-связями; 16.4 м.д. -остатки a-L-рамнопиранозы; 67.8 м.д. - остатки ß-D-ксилопиранозы; 106.5 м.д. -остатки a-L-арабинофуранозы. 'Н-ЯМР: 3.40-3.20, 1.16 м.д. - остатки a-L-рамнопиранозы; 3.67 м.д. - метоксигруппа; 2.2-2.49 м.д. - ацетилированная форма остатков Сахаров.

И IIIMM! I I

I I ; м ! 1

II I I I I I I I I

Рис. 5. Спектр 13С-ЯМР соединения PST-2

П :! г;

1: .1 ; I

! /Да

Ж?//к

<1 /. Г I !':'.!': ''

I ти л

"1'.С

Рис. 6. Спектр 'Н - ЯМР соединения Р5Т-2

Соединение РЯТ-З (рис. 7. 8). ПС-ЯМР: 100.1 (С1), 68.5 (С2), 69.1 (СЗ), 78.1(С4), 72.0(С5), 176.1 (С6) м.д. - а-1,4-0-галактопиранозилуронан; 170.5 м.д. -метилированная карбоксильная группа; 102.9 м.д. - остатки а-О-арабинофуранозы; 52.72 м.д. - метоксигруппа. 'Н-ЯМР: 1.16, 3.4 м.д. - остатки а-Ь-рамнопиранозы; 3.86 м.д. - СЗ остатков а-Б-галактопиранозы и а-Б-глюкопиранозы; 1.19-2.0 м.д. -ацетилированная форма остатков Сахаров; 3.71 м.д. - метоксигруппа.

) !; I \1

Рис. 7. Спектр 13С- ЯМР соединения Р5Т-3

I ! I

I I

—^Ас

___

Рис. 8. Спектр 13С- ЯМР соединения РБТ-З

Соединение Р8Т-4 (рис. 9. 101 ВС-ЯМР: 100.0 (С1), 68.5 (С2), 69.1 (СЗ), 78.1 (С4), 72.0(С5), 176.1 (С6) м.д. - а-1,4-В-галактопиранозилуронан; 103.7 м.д. -остатки а-Ь-арабинофуранозы; 52.7 м.д. - метоксигруппа; 99.65 м.д. - остатки а-Б-галактопиранозы и а-Б-глюкопиранозы, связанных (1—>4)-связями; 170.2 м.д. -метилированная карбоксильная группа; 17.4 м.д. - остатки а-Ь-рамнопиранозы. 'Н-ЯМР: 3.40 и 1.16 м.д. - остатки а-Ь-рамнопиранозы; 3.86 м.д. - СЗ остатков а-Э-галактопиранозы и а-Б-глюкопиранозы; 3.71 м.д. - метоксигруппа; 4.0-4.5 м.д. -остатки а-Э-глюкопиранозы, связанные а(1->4)-гликозидной связью; 2.0-2.1 м.д. -ацетилированная форма остатков Сахаров.

Ї Г

II- -

^ґ -іґііг^ґ^г- Sґ "іґ

Рис. 10. Спектр 'Н-ЯМР соединения Р8Т-4

Соединение Р5Т-5 (гжс. 11. 12). 13С-ЯМР: 99.5 98.45 60.1 м.д. - остатки оЯ> галактопиранозы и а-Б-глюкопиранозы, связанные (1—>4)-связями; 17.4 м.д. -остатки а-Ь-рамнопиранозы; 65.8 м.д. - остатки Р-Э-ксилопиранозы; 103.7 м.д. -остатки а-Ь-арабинофуранозы. 'Н-ЯМР: 3.9-4.3 м.д. - остатки а-О-галактопираиозы и а-О-глюкопиранозы, связанные (1 —»4)-связями; 3.40-3.20 и 1.28 м.д. - остатки а-Ь-рамнопиранозы; 2.0-2.1 м.д. - ацетилированная форма остатков Сахаров; 3.71 м.д. -метоксифуппа.

99.ЬО Э8.4Ь

2UO 190 18(J 170 1 fco 1-JÜ 110 130 1 го 1 1 О 1DO МО И LI 70 6 U iiU 4U JO 30 10

Рис. 11. Спектр 13C- ЯМР соединения PST-5

'1 м =i Vit l тУ-Г'гГ

Рис. 12. Спектр Н-ЯМР соединения PST-5

Резюме. Методом эксклюзионной ВЭЖХ установлено, что в составе ПСК листьев мать-и-мачехи, разделенного на индивидуальные вещества методом ионообменной хроматографии, содержится пять основных компонентов, представленных двумя кислыми и тремя нейтральными ПС, химическая структура которых определена методами ЯМР и ГЖХ-МС. Нейтральные полисахариды: a-D-галакто-( 1,4)-a-D-r.noKan, содержащий фрагменты арабиногалактана с разветвлениями, состоящими из остатков a-L-рамнопиранозы, a-L-арабинофуранозы и маннопиранозы (Мм 590 кДа) (PST-1); а-0-галакто-(1,4)-а-В-глюкан, содержащий фрагменты арабиногалактана с разветвлениями, состоящими из остатков a-L-рамнопиранозы, a-L-арабинофуранозы и ß-D-ксилопиранозы (Мм 415 кДа) (PST-2); а-В-галакто-(1,4)-а-В-глюкан, содержащий фрагменты арабиногалактана с разветвлениями из остатков a-L-рамнопиранозы, a-L-арабинофуранозы, ß-D-ксилопиранозы и маннопиранозы (Мм 338 кДа) (PST-5). Кислые полисахариды: а(1,2)^-рамно-а(1,4)-В-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, галактозы и глюкозы (Мм 82 кДа) (PST-3); а(1,2)-L-paMiio-a( 1,4)-0-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, глюкозы и галактозы (20 кДа) (PST-4).

Исследование иммуномодулирующей активности индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи

Влияние индивидуальных соединений ПСК листьев мать-и-мачехи на антиген-презентирующие клетки оценивали по их способности стимулировать продукцию NO перитонеальными макрофагами интактных мышей линии C57/BL6 in vitro при культивировании 4В часов. Выявлено статистически достоверное стимулирующее действие веществ при использовании концентрации 100 мкг/мл у соединений PST-3 и PST-4 в 1,4 раза и 8,9 раза с 2,96±0,23мкМ до 4,29±0,29мкМ и 26,50±0,16мкМ, соответственно (табл. 5). Из результатов данного эксперимента следует, что основными действующими веществами ПСК листьев мать-и-мачехи являются соединения PST-3 и PST-4, представляющие собой кислые полисахариды (рамногалактуронаны). В связи с этим мы полагаем, что количественное определение ПСК целесообразно проводить по содержанию кислых полисахаридов в пересчете на кислоту галактуроновую.

Таблица 5

Влияние полисахаридов мать-и-мачехи на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами интактных мышей линии C57/BL6

Исследуемое вещество и его концентрация, мкг/мл Концентрация нитритов, мкМ

Контроль 1 (мф+среда) - 2.96±0,23

Контроль 2 (мф+среда) 1 51,30+2,00*

PST-1 20 3,45±0,21»

100 3,25+0,07«

PST-2 20 2,98±0,01»

100 2,82±0,06»

PST-3 20 3,35±0,08»

100 4,29±0,29*»

PST-4 20 3,55+0,08»

100 26,50±0,16*»

PST-5 20 2,87±0,07»

100 3,30±0,07»

Примечание к таблице 5: *-различия показателя с контролем 1 достоверны, р<0,05;

• - различия показателя с контролем 2 достоверны, р<0,05. п=6.

Разработка параметров стандартизации полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи

Для установления подлинности ПСК листьев мать-и-мачехи использовали: качественную реакцию с 1 % раствором тимола в концентрированной кислоте серной (коричнево-желтое окрашивание) и определяли ММР компонентов ПСК методом эксклюзионной ВЭЖХ. При этом точную навеску ПСК (0,001 г) растворяли в 500 мкл воды очищенной, перемешивали и проводили ВЭЖХ анализ на жидкостном

хроматографе Agilent 1100 (США) с эксклюзионной колонкой TSK-gel GMPXi. 300x7.8mm («Supelco», Япония), подвижная фаза - вода, 1,0 мл/мин. Регистрацию компонентов проводили с помощью спектрофотометрического детектора при длине волны 190 нм.

Молекулярно-массовое распределение ПСК листьев мать-и-мачехи должно соответствовать представленной хроматограмме (рис. 13).

Таким образом, ПСК листьев мать-и-мачехи должен состоять из пяти основных компонентов с молекулярно-массовым распределением: 590 кДа, 415 кДа, 338 кДа, 82 кДа и 20 кДа.

Посторонние примеси. Несмотря на несколько стадий очистки при выделении ПСК из растительного сырья, в его составе могут присутствовать вещества, обладающие схожими физико-химическими свойствами с полисахаридами (белки, нуклеиновые кислоты). Наличие этих примесей в образце может оказывать существенное влияние на их биологическую активность и в свою очередь вызвать нежелательные побочные эффекты. Поэтому определение содержания примесей белка и нуклеиновых кислот в составе ПСК является их обязательной характеристикой. Белок определяли методом Лоури (Lowry О. et а!., 1951) в пересчете на бычий сывороточный альбумин (БСА). В результате определения было установлено, что содержание примесей белка в ПСК листьев мать-и-мачехи в пересчете на БСА не превышает 0,17%. Примеси нуклеиновых кислот определяли по методу Спирина (Спирин A.C., 1958). Установлено, что содержание примесей нуклеиновых кислот в ПСК листьев мать-и-мачехи не превышает 0,036%.

Разработка методики количественного определения кислых полисахаридов в полисахаридном комплексе листьев мать-и-мачехи

Количественный анализ полисахаридов - сложная задача, решение которой требует разработки индивидуальных подходов с учетом: особенностей объекта исследования, в котором определяется полисахарид (растительное сырье);

Рис. 13. ВЭЖ-хроматограмма ПСК листьев мать-и-мачехи

присутствия веществ, мешающих определению (белки, нуклеиновые кислоты, низкомолекулярные соединения и другие полисахаридные молекулы (крахмал, декстраны и т.д.); химической структуры определяемого вещества; его физико-химических свойств и задач анализа.

Для количественного определения кислых ПС мы использовали спектрофотометрический метод, основанный на реакции продуктов дегидратации уроновых кислот с карбазолом в кислой среде. В предварительных исследованиях было установлено, что максимумы поглощения растворов нейтральных (гексоза (глюкоза) и пентоза (арабиноза)) и кислых (кислота галактуроновая) моносахаров после реакции с карбазолом совпадают (рис. 14). Это свидетельствовало о том, что присутствие нейтральных Сахаров в образце будет оказывать существенное влияние на результаты определения. Из данных литературы известно, что добавление кислоты сульфаминовой, препятствует реакции карбазола с образовавшимися при гидролизе ПС альдозами (Са1атЬоз .1.Т., 1967). Поэтому было изучено влияние кислоты сульфаминовой (0,08-0,56 моль/л) в анализируемых пробах на интенсивность поглощения продуктов реакции нейтральных Сахаров и уроновых кислот с концентрированной кислотой серной и карбазолом (рис. 15 -1, II, III, IV).

Рис. 14. УФ-спектры растворов (а) галактуроновой кислоты, (Ь) глюкозы и (с) арабинозы после реакции с концентрированной кислотой серной и карбазолом

Из рисунка 15 следует, что при концентрации кислоты сульфаминовой 0,56 моль/л интенсивность поглощения продуктов, образованных нейтральными сахарами подавляется полностью, а образованных кислотой галактуроновой остается на прежнем уровне, а добавление одно-, пяти- и десятикратного избытка глюкозы не оказывало влияния на результаты количественного определения кислоты галактуроновой карбазольным методом в присутствии 0,56 моль/л кислоты сульфаминовой (рис. 16).

Рис. 15. УФ-спектры продуктов реакции а) кислоты галактуроновой, (Ь) глюкозы и (с) арабинозы с концентрированной кислотой серной и карбазолом в присутствии разных концентраций кислоты сульфаминовой: (I) - 0,08 моль/л (5 мкл); (II) - 0,24 моль/л (15 мкл); (III) 0,4 моль/л (25 мкл); (VI) - 0,56 моль/л (35 мкл)

№ jvck'iidhimn)

Рис. 16. УФ-спектры растворов модельных смесей моносахаридов: (а) - кислота галактуроновая, (Ь) - смесь кислота галактуроновая : глюкоза (4:1), (с) - смесь кислота галактуроновая : глюкоза (1:1), ((1) - смесь кислота галактуроновая : глюкоза (1:4), (і) - смесь кислота галактуроновая : глюкоза (1:10) после реакции с концентрированной кислотой серной и карбазолом в присутствии кислоты сульфаминовой (0,56 моль/л)

Опираясь на полученные результаты, мы применили данную методику для количественного определения кислых полисахаридов листьев мать-и-мачехи (26,37±0,09%). Разработанная методика была валидирована по показателям: повторяемость (ЯЯБ = 1,21%), внутрилабораторная прецизионность (1150=1,82 %),

межлабораторная прецизионность (1*80=1,94%) правильность (99,11%) и линейность (у=1,23х+0,0004,1*2=0,999).

Также были установлены показатели определения доброкачественности ПСК листьев мать-и-мачехи (кислых полисахаридов в пересчете на кислоту галактуроновую - не менее 26,28%; влажность - не более 1,8%; примесей белка - не более 0,2%; примесей нуклеиновых кислот - не более 0,04%; тяжелых металлов - не более 0,01%; микробиологическая чистота (соответствие требованиям ГФ XII издания, вып. 1, стр. 160 (статья 32, ОФС 42-0067-07)), включенные в проект ФСП «Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи».

ВЫВОДЫ

1. Разработанная методика выделения ПСК из растительного сырья позволяет получать максимальный спектр полисахаридов с минимальным содержанием примесей. ПСК листьев мать-и-мачехи характеризуется наличием уроновых кислот (26,37±0,09%) и содержит пять компонентов с молекулярными массами в диапазоне от 20 до 590 кДа. ПСК надземной части клевера лугового содержит 74,64±0,07% уроновых кислот и состоит из пяти компонентов с молекулярными массами в диапазоне от 20 до 720 кДа. ПСК корневищ и корней девясила содержит 51,75+0,13% уроновых кислот и состоит из пяти компонентов с молекулярными массами в диапазоне от 10 до 620 кДа.

2. Перспективным объектом исследования является ПСК листьев мать-и-мачехи, проявивший в дозе 100 мкг/мл выраженную иммуномодулирующую активность, значительно увеличивая продукцию окиси азота перитонеальными макрофагами мышей.

3. ПСК листьев мать-и-мачехи состоит из пяти компонентов, являющихся: а-О-галакто-П ,4)-а-0-глюканом с молекулярной массой 590 кДа; а-0-галакто-(1,4)-а-О-глюканом с молекулярной массой 415 кДа; а-Б-галакто-(1,4)-а-В-глюканом с молекулярной массой 338 кДа; а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронаном с молекулярной массой 82 кДа и с содержанием уроновых кислот - 5,02±0,03%; а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-В-галактопиранозилуронаном с молекулярной массой 20 кДа и с содержанием уроновых кислот - 57,69±0,03%.

4. За реализацию иммуномодулирующего действия ПСК листьев мать-и-мачехи ответственны преимущественно кислые полисахариды. Наиболее выраженной активностью обладает а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-В-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, галактозы, глюкозы с молекулярной массой 20 кДа и с содержанием уроновых кислот - 57,69+0,03%.

5. Количественное определение кислых полисахаридов в ПСК листьев мать-и-мачехи целесообразно проводить спектрофотометрическим методом, после реакции с

карбазолом в присутствии кислоты сульфаминовой в пересчете на кислоту галактуроновую. Разработанная методика соответствует требованиям валидности по показателям: повторяемость (RSD=1,21%), внутрилабораторная прецизионность (RSD=1,82%), межлабораторная прецизионность (RSD=1,94%) правильность (99,11%) и линейность (у=1,23х+0,0004, R2=0,999).

6. Установленные параметры качества (описание, растворимость, подлинность, чистота, количественное определение, потеря в массе при высушивании, тяжелые металлы, микробиологическая чистота) позволяют провести стандартизацию ПСК листьев мать-и-мачехи для включения их в проект фармакопейной статьи предприятия «Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Корж, А.П. Моносахаридный состав полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи / А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, М.С. Юсубов, M.J1. Белянин // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - № 5. - С. 62-65.

2. Корж, А.П. Фракционный состав и химическая структура биологически активных растительных полисахаридов / А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, М.С. Юсубов, M.J1. Белянин // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №3/1. - С.63-64.

3. Корж, А.П. Содержание кислых моносахаридов в полисахаридном комплексе Inula helenium / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2011. - Спецвыпуск 1. - С. 178179.

4. Корж, А.П. Водорастворимые полисахариды подземной части Imtla helenium (Asteraceae) / А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов и др. // Растительные ресурсы. - 2011. - Т. 47, вып. 3. - С. 88-92.

5. Корж, А.П. Химический состав водорастворимых полисахаридов из травы клевера лугового (Trifolium pratense L.) / А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, М.С. Юсубов // Химия растительного сырья. - 2011. - № 2. - С. 47-50.

6. Корж, А.П. Определение содержания уроновых кислот в полисахаридах мать-и-мачехи, клевера, девясила / А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, М.С. Юсубов // Химия растительного сырья. - 2011. -№ 4. - С. 259-264.

7. Корж, А.П. Определение содержания уроновых кислот в полисахаридном комплексе мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.) / А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов и др. // Вестник ПГФА. - 2010. - № 7. - С. 95-97.

8. Корж, А.П. Определение содержания уроновых кислот в полисахаридах Trifolium pratense L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, М.С. Юсубов //Актуальные проблемы химии природных соединений: сб. статей по материалам международной конференции. - Ташкент, 2010. - С. 244.

9. Корж, А.П. Водорастворимые полисахариды корневищ с корнями Inula helenium / А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, М.С. Юсубов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. ст. по материалам 66 -ой региональной конференции по фармации и фармакологии,— Пятигорск: Издательство Пятигорская ГФА, 2011. - С. 121.

10. Корж, А.П. Полисахариды Trifolium pratense L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Молодежь и медицинская наука в XXI веке: сб. ст. по материалам XII научно-практической конференции. - Киров: Издательство Кировская государственная медицинская академия, 2011. - С. 198.

11. Корж, А.П. Водорастворимый полисахаридный комплекс Trifolium pratense L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье: сб. ст. по материалам XIV Всероссийской медико-биологической конференции с международным участием. - Санкт-Петербург: Издательство Санкт-Петербургский государственный университет, 2011. - С. 127128.

12. Корж, А.П. Выделение и исследование мономерного состава полисахаридного комплекса из травы Trifolium pratense L. / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Науки о человеке: сб. ст. по материалам XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием. - Томск: Издательство Сибирский государственный медицинский университет, 2011. - С. 82-83.

13. Корж, А.П. Полисахариды Inula helenium / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Медицина XXI века: сб. ст. по мат. юбилейной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 60-летию работы Новокузнецкого ГИУВа в Кузбассе. -Новокузнецк, 2011.-С. 197-199.

14. Корж, А.П. Полисахаридный комплекс Tussilago farfarae / А.П. Корж, А.М. Гурьев // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: сб. ст. по мат. 69-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. - Волгоград, 2011. - С. 313-314.

15. Корж, А.П. Химическая структура полисахаридов некоторых растений Сибири / А.П. Корж, А.М. Гурьев, М.В. Белоусов, М.С. Юсубов, M.JI. Белянин // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: сб. ст. по мат. международной конференции. - Гурзуф, 2011. - С. 175-177.

Подписано в печать 10 апреля 2012 г. Усл.печ. л. 1,0. Тираж 110 экз. Печать на ризографе Заказ № 87. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08

Оглавление диссертации Корж, Анна Петровна :: 2012 :: Самара

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Характеристика растений, ПСК которых обладают выраженными иммуномодулирующими свойствами.

1.2 Иммуномодулирующая активность полисахаридов.

1.3 Сравнительный анализ методов, используемых для изучения полисахаридов.

Глава 2 Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделение полисахаридных комплексов из растительного сырья.

2.2.2 Методы химического исследования.

2.2.3 Методы исследования иммуномодулирующей активности.

2.3 Статистическая обработка результатов.

Глава 3 Общая характеристика полисахаридных комплексов листьев мать-и-мачехи, корневищ и корней девясила, надземной части клевера лугового и выбор перспективного объекта исследований.

3.1 Выделение полисахаридных комплексов из листьев мать-и-мачехи, корневищ и корней девясила, надземной части клевера лугового.

3.2 Характеристика полисахаридных комплексов листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила по молекулярно-массовому распределению, содержанию углеводов, общего белка, уроновых и нуклеиновых кислот.

3.3 Сравнительное исследование иммуномодулирующей активности полисахаридных комплексов листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила и

Глава 4 Разделение полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи на индивидуальные соединения и изучение их структуры

4.1 Разделение полисахаридного комплекса на индивидуальные полисахариды и их характеристика по молекулярной массе, содержанию уроновых кислот и белка.

4.2 Исследование мономерного состава индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи

4.3 ЯМР-спектроскопия индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.

Глава 5 Исследование иммуномодулирующей активности индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.

Глава 6 Разработка параметров стандартизации полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.

6.1 Разработка методик определения подлинности и чистоты полисахаридного комплекса.

6.2 Разработка методики количественного определения кислых полисахаридов в полисахаридном комплексе листьев мать-и-мачехи.

6.3 Валидация методики количественного определения кислых полисахаридов в полисахаридном комплексе листьев мать-и-мачехи. выбор перспективного объекта

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Корж, Анна Петровна, автореферат

Актуальность проблемы. В настоящее время интерес к растительным полисахаридам (ПС), как к самостоятельному классу соединений, существенно возрос, что связано, прежде всего, с широким спектром их фармакологической активности (противовоспалительная [39, 52, 53, 65, 79, 87, 175, 176], гиполипидемическая [32, 221], антисклеротическая [105, 197], антиангиогенная, противоязвенная [61,72], противоопухолевая [73, 130, 146, 147, 150, 155, 159, 220].

В последние годы значительное внимание исследователей уделяется изучению иммуномодулирующих свойств растительных ПС [41, 64, 189, 197, 212]. Предварительные скрининговые исследования, проведенные сотрудниками ГБОУ ВПО СибГМУ (г. Томск) совместно с ГУ НИИ фармакологии СО РАМН (г. Томск) показали, что полисахаридные комплексы (ПСК), выделенные из надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила, листьев мать-и-мачехи обладают иммуномодулирующими свойствами, стимулируя выработку оксида азота и подавляя аргиназу, что является наиболее выгодной комбинацией для регуляции иммунного ответа [19, 21, 22, 23, 24, 56, 57, 82]. Исходя из этого, полисахариды данных растений могут быть использованы в лечении хронических, вялотекущих инфекционных заболеваний, а также при иммунотерапии онкологических заболеваний. Кроме того, данные ПСК могут быть основой при создании препаратов для профилактики и лечения аллергических (иммуноглобулин Е-зависимых) заболеваний [20, 40, 54, 58, 59].

Наряду с этим известно, что иммуномодулирующая активность ПС во многом обусловлена особенностями их химической структуры (особенностями строения основной и боковых цепей, конформацией мономеров и ЗЭ-структурой макромолекул, способностью к образованию димеров и агрегатов) и широким диапазоном молекулярных масс [41, 64, 90, 105, 186, 187, 195, 197, 198, 204, 205].

Таким образом, изучение химической структуры полисахаридов лекарственных растений Сибири, обладающих иммуномодулирующими свойствами, установление корреляции между структурой и активностью ПС и разработка методик их стандартизации является актуальным направлением исследований.

Цель диссертационной работы - на основании результатов изучения структуры и иммуномодулирующих свойств полисахаридов листьев мать-и-мачехи установить биологически активные компоненты и разработать параметры их стандартизации.

Задачи исследования:

Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы полисахаридные комплексы листьев мать-и-мачехи, надземной части клевера лугового, корневищ и корней девясила по молекулярной массе входящих в его состав компонентов и содержанию уроновых кислот. Выявлено, что:

• полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи содержит

26,37±0,09% уроновых кислот и состоит из 5 основных компонентов с 6 молекулярными массами: 590 кДа (8,06%), 415 кДа (8,6%), 338 кДа (20,43%), 82 кДа (38,17%), 20 кДа (24,73%);

• полисахаридный комплекс надземной части клевера лугового содержит 74,64±0,07% уроновых кислот и состоит из 5 компонентов с молекулярными массами: 720 кДа (12,94%), 620 кДа (12,94%), 320 кДа (38,83%), 35 кДа (19,42%), 20 кДа (15,86%);

• полисахаридный комплекс корневищ и корней девясила содержит 51,75±0,13% уроновых кислот и состоит из 5 компонентов с молекулярными массами: 620 кДа (17,16%), 490 кДа (17,16%), 280 кДа (62,4%), 50 кДа (1,72%), 10 кДа (1,56%).

1. а-0-галакто-(1,4)-а-0-глюкан, содержащий фрагменты арабино-галактана с разветвлениями, состоящими из остатков а-Ь-рамнопиранозы, а-Ь-арабинофуранозы и маннопиранозы (молекулярная масса 590 кДа);

2. а-0-галакто-(1,4)-а-0-глюкан, содержащий фрагменты арабино-галактана с разветвлениями, состоящими из остатков а-Ь-рамнопиранозы, а-Ь-арабинофуранозы и р-О-ксилопиранозы (молекулярная масса 415 кДа);

3. а-О-гал акто-( 1,4)-а-0-глюкан, содержащий фрагменты арабино-галактана с разветвлениями из остатков а-Ь-рамнопиранозы, а-Ь-арабинофуранозы, Р-О-ксилопиранозы и маннопиранозы (молекулярная масса 338 кДа).

1. а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, галактозы и глюкозы (молекулярная масса 82 кДа);

Впервые проведено изучение влияния индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей и показано, что N0-стимулирующей активностью обладают кислые полисахариды:

• а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, глюкозы и галактозы (молекулярная масса 82 кДа, уроновых кислот - 5,02±0,03%).

Практическая значимость. Установленная химическая структура и иммуномодулирующая активность ПС листьев мать-и-мачехи дает основание для их дальнейшего исследования с целью разработки на их основе новых лекарственных средств, предназначенных для терапии аллергических заболеваний, хронических и вялотекущих инфекционных заболеваний, а также при иммунотерапии онкологических заболеваний.

Полученные экспериментальные данные позволили обосновать аналитические подходы к стандартизации биологически активных полисахаридов листьев мать-и-мачехи. Разработана валидированная методика количественного определения кислых полисахаридов в ПСК листьев мать-и-мачехи.

Степень внедрения. Результаты исследований включены в учебное пособие «Методы количественного определения поли- и олигосахаридов», которое внедрено в научный и учебный процесс кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России и в учебный процесс кафедры фармации ФПК и ППС ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России. На основании результатов диссертационной работы разработаны методические рекомендации «Методика количественного определения кислых полисахаридов в лекарственном растительном сырье и полисахаридных комплексах», которые внедрены в научно-исследовательский процесс Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России и в научный и учебный процесс кафедры фармацевтической химии ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России.

На защиту выносятся:

3. Результаты изучения иммуномодулирующей активности полисахаридов листьев мать-и-мачехи.

4. Результаты разработки параметров стандартизации полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармации ФПК и ППС и Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России и комплексной целевой программой СО АМН Российской Федерации «Здоровье человека в Сибири» (№ государственной регистрации 0121152362).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, выводов, списка литературы и трех приложений. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 33 рисунками. Библиографический указатель включает 221 источник литературы, из них 134 - зарубежных.

Заключение диссертационного исследования на тему "Исследование структуры полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной и разработка параметров их стандартизации"

выводы

1. Разработанная методика выделения полисахаридных комплексов из растительного сырья позволяет получать максимальный спектр полисахаридов с минимальным содержанием примесей. Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи характеризуется наличием уроновых кислот (26,37±0,09%) и содержит пять компонентов с молекулярными массами в диапазоне от 20 до 590 кДа. Полисахаридный комплекс надземной части клевера лугового содержит 74,64±0,07% уроновых кислот и состоит из пяти компонентов с молекулярными массами в диапазоне от 20 до 720 кДа. Полисахаридный комплекс корневищ и корней девясила содержит 51,75±0,13% уроновых кислот и состоит из пяти компонентов с молекулярными массами в диапазоне от 10 до 620 кДа.

2. Перспективным объектом исследования является полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи, проявивший в дозе 100 мкг/мл выраженную иммуномодулирующую активность, значительно увеличивая продукцию окиси азота перитонеальными макрофагами мышей.

3. Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи состоит из пяти компонентов, являющихся: а-0-галакто-(1,4)-а-0-глюканом с молекулярной массой 590 кДа; а-0-галакто-( 1,4)-а-0-глюканом с молекулярной массой 415 кДа; а-0-галакто-(1,4)-а-0-глюканом с молекулярной массой 338 кДа; а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронаном с молекулярной массой 82 кДа и с содержанием уроновых кислот - 5,02±0,03%; а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронаном с молекулярной массой 20 кДа и с содержанием уроновых кислот - 57,69±0,03%.

4. За реализацию иммуномодулирующего действия полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи ответственны преимущественно кислые полисахариды. Наиболее выраженной активностью обладает а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров - арабинозы, галактозы, глюкозы с молекулярной массой 20 кДа и с содержанием уроновых кислот - 57,69±0,03%.

5. Количественное определение кислых полисахаридов в полисахаридном комплексе листьев мать-и-мачехи целесообразно проводить спектрофотометрическим методом после реакции с карбазолом в присутствии кислоты сульфаминовой в пересчете на кислоту галактуроновую. Разработанная методика соответствует требованиям валидности по показателям: повторяемость (1180=1,21%), внутрилабораторная прецизионность (1180=1,82%), межлабораторная прецизионность (1180=1,94%) правильность (99,11%) и линейность (у=1,23х+0,0004,112=0,999).

6. Установленные параметры качества (описание, растворимость, подлинность, чистота, количественное определение, потеря в массе при высушивании, тяжелые металлы, микробиологическая чистота) позволяют провести стандартизацию полисахаридного комплекса листьев мать-и-мачехи для включения их в проект фармакопейной статьи предприятия «Полисахаридный комплекс листьев мать-и-мачехи».

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Корж, Анна Петровна

1. Аладышева, Ж. И. Практические аспекты работ по валидации аналитических методик / Ж. И. Аладышева, В. В. Беляев, В. В. Береговых // Фармация. 2008. - № 7. - С. 9-14.

2. Арзамасцев, А. П. Валидация аналитических методов / А. П. Арзамасцев, Н. П. Садчикова, Ю. А. Харитонов // Фармация. 2006. - № 4. -С. 8-12.

3. Арыстанова, Т. А. Стандартизация корней лопуха гладко-семянного по полисахаридам / Т. А. Арыстанова, Б. И. Турсубекова // Фармация Казахстана. 2006. - № 11. - С. 37-39.

4. Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений СССР / под ред. П. С. Чикова. М. : ГУГК, 1983. - 340 с.

5. Атлас лекарственных растений СССР / под ред. Н. В. Цицина. -М. : Гос. изд-во мед. лит-ры, 1962. 704 с.

6. Беляков, К. В. Количественное определение полисахаридов в листьях мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.) / К. В. Беляков, Д. М. Попов // Фармация. 1999. - № 1. - С. 23-24.

7. Беляков, К. В. Определение инулина в корневищах и корнях девясила {Inula helenium) / К. В. Беляков, Д. М. Попов // Фармация. 1998. -№ 1. - С. 34-36.

8. Биохимические методы анализа растений / под ред. М. Н. Запрометова. М. : Издательство иностранной литературы, 1960. - 592 с.

9. Блинова, М. П. Углеводный состав подземной части Adenophora pereskiifolia (Campanulaceae) / М. П. Блинова, В. Г. Дударев, Н. И. Котова // Раст. ресурсы. 2007. - Вып. 4. - С. 95-101.

10. Булохов, А. Д. Определитель растений Юго-Западного Нечерноземья России (Брянская, Калужская, Смоленская области) / А. Д. Булохов, Э. М. Величкин. 2-е изд. - Брянск : БГПУ, 1998. - 380 с.

11. Верещагин, В. И. Полезные растения Западной Сибири / В. И. Верещагин, К. А. Соболевская, А. И. Якубова. M.-JI. : АН СССР, 1959. -348 с.

12. Гольдберг, Е. Д. Методы культуры ткани в гематологии / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, В. П. Шахов. Томск : изд-во ТГУ, 1992. - 264 с.

13. Горшкова, С. Г. Девясил Inula L. / С. Г. Горшкова // Флора СССР. - Т. 25. - Л. : АН СССР, 1959. - С. 433-473.

14. ГОСТР ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений. М. : ИПК изд-во стандартов, 2002. - 42 с.

15. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд. - М. : Медицина, 1987. - 336 с.

16. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырьё / МЗ СССР. 11-е изд. - М. : Медицина, 1989. - 400 с.

17. Государственная фармакопея Российской Федерации: Ч. 1. М. : Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. - 704 с.

18. Гублер, Е. В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов / Е. В. Гублер. Л. : Медицина, 1978. - 193 с.

19. Данилец, М. Г. Исследование иммунорегуляторных свойств полисахаридов из растительного сырья / М. Г. Данилец, Ю. П. Вельский,

20. Н. В. Вельская и др. // Создание новых лекарственных препаратов: матер, конф. / отв. ред. Е. Д. Гольдберг. Томск, 2007. - С. 53-55.

21. Данилец, М. Г. Влияние растительных полисахаридов на NO106синтазу и аргиназу макрофагов мыши / М. Г. Данилец, А. М. Гурьев, Н. В. Вельская и др. // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2009.-Т. 25, №2.-С. 49-50.

22. Данилец, М. Г. Макрофаги как фармакологическая мишень для регуляции баланса Thl/Th2 / М. Г. Данилец, Н. В. Вельская, Ю. П. Вельский и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. -Приложение 2. - С. 63-68.

23. Данилец, М. Г. Роль р38 и PI3K в активации макрофагов водорастворимыми полисахаридами календулы и клевера / М. Г. Данилец, Ю. П. Вельский, Е. Г. Учасова и др. // Сибирский медицинский журнал. -2008.-Т. 23, №3 .-С. 92.

24. Данилец, М. Г. Влияние полисахаридов из растительного сырья на Thl-зависимый иммунный ответ (скрининговое исследование) / М. Г. Данилец, Ю. П. Вельский, А. М. Гурьев и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. - Т. 73, № 6. - С. 19-22.

25. Девясил высокий адаптоген и антигипоксант / под ред. К. П. Зеленской, В. Г. Пашинского. - Томск : изд-во ТГПУ, 2004. - 312 с.

26. Дроздова, И. J1. Анализ полисахаридного состава листьев растений рода Arctium (Asteraceae) флоры Центрального Черноземья / И. JI. Дроздова // Раст. ресурсы. 2005. - Вып. 2. - С. 101-105.

27. Дудченко, JI. Г. Пряно-ароматические и пряно-вкусовые растения / JI. Г. Дудченко, А. С. Козьяков, В. В. Кривенко. К. : Наукова думка, 1989. - 304 с.

28. Енгалычева, Е. И. О противовоспалительной активности полисахаридов мать-и-мачехи / Е. И. Енгалычева, В. Н. Рожкова, Е. Я. Ладигина // Фармация. 1982. - Т. 31, № 2. - С. 37-40.

29. Запорожец, Т. С. Клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия биополимеров морских гидробионтов : автореф. дис. . д-ра мед. наук / Т. С. Запорожец. Владивосток, 2006. -49 с.

30. Захарова, И. Я. Методы изучения микробных полисахаридов / И. Я. Захарова, JI. В. Косенко. Киев: Наукова Думка, 1982. - 201 с.

31. Зориков, П. С. Основные лекарственные растения Приморского края: учебное пособие / П. С. Зориков. Владивосток : Дальнаука, 2004. -129 с.

32. Зяблицева, Н. С. Изучение полисахаридов клубней топинамбура и создание на их основе лечебно-профилактических средств : автореф. дис. . канд. фарм. наук / Н. С. Зяблицева. Пятигорск, 1998. - 24 с.

33. Ильина, Т. А. Большая иллюстрированная энциклопедия лекарственных растений : более 300 растений средней полосы России / Т. А. Ильина. М. : ЭКСМО, 2008. - 298 с.

34. Йорданов, Д. Фитотерапия / Д. Йорданов, П. Николов, А. Бойчинов. София : Медицина и физкультура, 1976. - 233 с.

35. Казаков, A. JI. Хемотаксономическое изучение рода Trifolium L. / A. JI. Казаков, С. Ф. Джумырко // Растительные ресурсы. 1979. - Т. 15, № 3. - С. 344-355.

36. Киньябулатов, С. С. Девясил высокий {Inula helenium L.) на Южном Урале: популяционная структура и вопросы охраны : дис. . канд. биол. наук / С. С. Киньябулатов. Пермь, 2010. - 130 с.

37. Кирпичников, М. Э. Семейство сложноцветные, или астровые (Asteraceae, или Compositae) // Жизнь растений. В 6 т. Т. 5, Ч. 2. Цветковые растения / под ред. A. JI. Тахтаджяна. М. : Просвещение, 1981. - С. 462-476.

38. Лагерь, А. А. Фитотерапия / А. А. Лагерь. Красноярск : Изд-во Красноярского ун-та, 1988. - 272 с.

39. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия / под ред. Г. П. Яковлева, К. Ф. Блиновой. СПб. : СПХФА, 2004. - 765 с.

40. Лигачева, А. А. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию IGE и IGG1 / А. А. Лигачева, М. Г. Данилец, Н. В. Бельская и др. // Сибирский медицинский журнал. 2008. - Т. 23, № 3. -С. 102.

41. Марков, П. А. Противовоспалительная активность пектинов и их галактуронанового кора / П. А. Марков, С. В. Попов, И. Р. Никитина и др. // Химия растительного сырья. 2010. - № 1. - С. 21-26.

42. Матасова, С. А. Получение сухого экстракта из корней девясила высокого и изучение его химического состава / С. А. Матасова, Н. А. Митина, Г. JI. Рыжова и др. // Химия растительного сырья. 1999. - № 2. - С. 119-123.

43. Махлаюк, В. П. Лекарственные растения в народной медицине / В. П. Махлаюк. Саратов : Приволж. кн. изд-во, 1991. - 544 с.

44. Методы химии улеводов / под ред. Р. И. Красновой. М. : Мир, 1967.-507 с.

45. Моисеева, Г. Ф. Иммуностимулирующие полисахариды высших растений / Г. Ф. Моисеева, В. Г. Беликов // Фармация. 1992. - № 3. - С. 7984.

46. Облучинская, Е. Д. Полисахариды бурых водорослей / Е. Д. Облучинская, Г. М. Воскобойников, С. А. Минина // Фармация. 2004. -№ 3. - С. 15-18.

47. Оводов, Ю. С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность / Ю. С. Оводов // Биоорганическая химия. -1998.-Т. 24, №6.-С. 483-501.

48. Оводов, Ю. С. Современные представления о пектиновых веществах / Ю. С. Оводов // Биоорганическая химия. 2009. - Т. 35, № 3. - С. 293-310.

49. Олейников, Д. Н. Методика количественного определения суммарного содержания полисахаридов в семенах льна (Linum usitatissimum L.) / Д. Н. Олейников, JI. М. Танхаева // Химия растительного сырья. 2007. - № 4. - С. 85-90.

50. Олейников, Д. Н. Применение метода Дрейвуда дляколичественного анализа листьев Plantago major L. / Д. Н. Олейников, JI. М.

51. Танхаева // Химия природных соединений. 2006. - № 1. - С. 221-223.109

52. Пасту шенков, JI. В. Лекарственные растения / Л. В. Пастушенков. СПб. : Лениздат, 1990. - 384 с.

53. Пастушенков, Л. В. Фармакотерапия с основами фитотерапии / Л. В. Пастушенков, Е. Е. Лесиовская. СПб. : СПХФИ, 1995. - 247 с.

54. Пат. 2337700 Российская Федерация, МПК51 А61К36/28,

55. А61К31/715, А61Р37/02. Средство, обладающее иммуномодулирующейактивностью / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, М. Г. Данилец и др. ; заявительи патентообладатель Томск. ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, ГОУ110

56. ВПО СибГМУ, ООО "Инновационные коммуникации". № 2007109200/15; заявл. 12.03.2007; опубл. 10.11.2008, Бюл. № 31.

57. Передрий, В. А. Рецептурный справочник фитотерапевта / В. А. Передрий. Киев : Обереги, 1995. - С. 398-410.

58. Пилат, Т. Л. Биологически активные добавки к пище / Т. Л. Пилат, А. А. Иванов. М. : Аввалон, 2002. - 710 с.

59. Полле, А. Я. Выделение и общая характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной, мать-и-мачехи и лопуха / А. Я. Полле, Р. Г. Оводова, С. В. Попов // Химия растительного сырья. 1999. - № 1. - С. 3338.

60. Попов, С. В. Взаимодействие фагоцитов млекопитающих с полисахаридами растений. Сыктывкар : Коми НЦ УрО РАН, 2002. - 210 с.

61. Попов, С. В. Иммуномодулирующее действие пектиновых полисахаридов: автореф. дис. . док-ра фарм. наук / С. В. Попов. -Сыктывкар, 2010. 39 с.

62. Растения для нас. Справочное издание / под ред. Г. П. Яковлева, К. Ф. Блиновой. СПб. : Учебная книга, 1996. - 654 с.

63. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Hidrangeaceae-Haloragacea / под ред. П. Д. Соколова JI. : Наука, 1987. - 326 с.

64. Редькина, Н. Н. Популяционная структура девясила высокого на Южном Урале / Н. Н. Редькина, Р. Ю. Муллагулов, С. С. Киньябулатов и др. // Аграрная наука. 2008. - № 8. - С. 18-20.

65. Руководство ICH «Валидация аналитических методик. Содержание и методология» Q2(R1)*; Официальные документы // Фармация. -2008.-№4.-С. 7-10.

66. Руководство для предприятий фармацевтической промышленности: метод, рекомендации. М. : Спорт и Культура, 2007. -192 с.

67. Сагдуллаев, Б. Т. Липиды и углеводы корней Althaea nudiflora и A. armeniaca / Б. Т. Сагдуллаев, P. X. Шахдоятов, М. А. Ходжаева и др. // Химия природных соединений. 2001. - № 3. - С. 181-184.

68. Сергеев, А. В. Иммуномодулирующая и противоопухолевая активность полисахаридов растительного происхождения / А. В. Сергеев,

69. Е. С. Ревазова, С. И. Денисова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1985. - № 12. - С. 741-743.

70. Смагунова, А. Н. Способы оценки правильности результатов анализа / А. Н. Смагунова // Журнал аналитической химии. 1997. - Т. 52, № 10.-С. 1022-1029.

71. Соколов, С. Я. Фитотерапия и фитофармакология / С. Я. Соколов.- М. : Мед. информ. агентство, 2000. 967 с.

72. Солодухин, Е. Д. Аптека в лесу : научно-популярная литература / Е. Д. Солодухин. М. : Агропромиздат, 1989. - 348 с.

73. Спирин, А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот / А. С. Спирин // Биохимия. 1958. - Т. 23, №5.-С. 656-662.

74. Ткаченко, В. И. Inula L. Девясил / В. И. Ткаченко // Флора Киргизской ССР. Т. 12. - Фрунзе : АН КиргССР, 1965. - 132 с.

75. Турова, А. Д. Биологическая активность полисахаридов растительного происхождения / А. Д. Турова, А. С. Гладких // Фармакология и токсикология. 1965. - Т. 28, вып. 4. - С. 498-504.

76. Турова, А. Д. Лекарственные растения СССР и их применение / А. Д. Турова. М. : Медицина, 1974. - 425 с.

77. Универсальная энциклопедия лекарственных растений / под ред. И. Н. Путырского. М.: Махаон, 2000. - С. 115-116.

78. Учасова, Е. Г. Влияние водорастворимых полисахаридов девясила высокого на продукцию NO и экспрессию аргиназы макрофагами мыши / Е. Г. Учасова, А. А. Лигачева, М. Г. Данилец и др. // Сибирский медицинский журнал. 2008. - Т. 23, № 3. - С. 121-122.

79. Флора Сибири. Araceae-Orchidaceae / под ред. Л. И. Малышева, Г. А. Пешковой. Новосибирск : Наука, 1987. - 345 с.

80. Ходжаева, М. А. Углеводы Allium. II. Новый тип глюкофруктана из Allium sativum / М. А. Ходжаева, 3. Ф. Исмаилов, Е. С. Кондратенко и др. // Химия природных соединений. 1982. -№ 1. - С. 23-28.

81. Чиков, П. С. Лекарственные растения: справочник / П. С. Чиков.- М. : Агропромиздат, 1989. 428 с.

82. Юлдашева, Н. П. Полисахариды Eremurus. XXVI. Изучение строения пектина из листьев Eremurus regelii / Н. П. Юлдашева, Д. А. Рахимов, М. Т. Турхожаев // Химия природных соединений. 1993. - № 2. -С. 191-194.

83. Abe, Т. Liver injury due to sequential activation of natural killer cells and natural killer T cells by carrageenan / T. Abe, H. Kawamura, H. Watanable et al. // J. Hepatol. 2002. - Vol. 36, N 3. - P. 614-623.

84. Ahmed, A. E. R. A simplified method for accurate determination of cell wall uronide content / A. E. R. Ahmed, J. M. Labavitch // Journal of Food Biochemistry. 1977.-Vol. l.-P. 361-365.

85. Aldington, S. Rhamnogalactoronan II a biologically active fragment / S. Aldington, S. C. Fry // J. Exp. Bot. 1994. - Vol. 45. - P. 287-293.

86. Almeida, G. M. The capsular polysaccharides of Cryptococcus neoformans activate normal CD4+ T cells in a dominant Th2 pattern / G. M. Almeida, R. M. Andrade, С. M. Bento // J. Immunol. 2001. - Vol. 167. - P. 5845-5851.

87. Alzona, M. IL-12 activates IFN-y production through the preferential activation of CD30+T-cells / M. Alzona et al. // Immunol. 1995. - Vol. 154. - P. 916.

88. Anthon, G. E. Combined enzymatic and colorimetric method for determining the uronic acid and methylester content of pectin: Application to tomato products / G. E. Anthon, D. M. Barret // Food Chemistry. 2008. - Vol. 110.-P. 239-247.

89. Ayestaran, B. Quantification of major grape polysaccharides (Tempranillo v.) released by maceration enzymes during the fermentation process /

90. B. Ayestaran, Z. Guadalupe, D. Leon // Analytica Chimica Acta. 2004. - Vol. 513.-P. 29-39.

91. Bailey, R. W. Carbohydrate composition of particulate preparations from mung bean (Phaseolus aureus) shoots / R. W. Bailey, S. Haq, W. Z. Hassid // Phytochemistry. 1967. - Vol. 6, N 2. - P. 293-301.

92. Belska, N. V. Water-soluble polysaccharide obtained from Acorus calamus L. classically activates macrophages and stimulates Thl response / N. V. Belska, A. M Guriev, M. G. Danilets et al. // Inter. Immunopharm. 2010. - Vol. 10.-P. 933-942.

93. Bitter, T. A modified uronic acid carbazole reaction / T. Bitter, H. M. Muir // Anal. Biochem. 1962. - Vol. 4. - P. 330-334.

94. Blakeney, A. B. A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis / A. B. Blakeney, P. J. Harris, R. J. Henry et al. // Carbohydr. Res. 1983. - Vol. 113. - P. 291-299.

95. Blakeney, A. B. Determination of non-starch polysaccharides in cereal grains with near-infared reflectance spectroscopy / A. B. Blakeney, P. C. Flinn // Mol. Nutr. Food Res. 2005. - Vol. 49. - P. 546-550.

96. Blakeney, A. B. Methylation of carbohydrates with lithium methylsulphinyl carbanion / A. B. Blakeney, B. A. Stone // Carbohydr. Res. -1985.-Vol. 140.-P. 319-324.

97. Blanche, D. E. The distribution of galactose and mannose in the cellwall polysaccharides of red clover (Trifolium pratense) leaves and stems / D. E. Blanche, R. W. Bailey / Phytochemistry. 1968. - Vol. 7, N 11. - P. 2037-2044.

98. Blumenkrantz, N. New method for quantitative determination of uronic acids / N. Blumenkrantz, G. Asboe-Hansen // Analytical Biochemistry. -1973. Vol. 54. - P. 484-489.

99. Bollag, D. M. Protein Methods / D. M. Bollag, S. J. Edelstein. New York : Wiley-Liss, 1994. - P.72-3.

100. Buchala, A. S. A galactoglucomannan from the leaf and stem tissues of red clover (Trifolium pratense) / A. S. Buchala, H. Meier // Carbohydrate Research. 1973. - Vol. 31, N 1. - P. 87-92.

101. Camenisch, T. D. Perspective: Hyaluronan-Is bigger better? / T. D. Camenisch, J. A. McDonald // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2000. - Vol. 23. -P. 1-3.

102. Confer, D. R. Molecular Weight Distribution of Hydrolysis Products during Biodégradation of Model Macromolecules in Suspended and Biofilm Cultures II: Dextran and Dextrin / D. R. Confer, B. E. Logan // Wat. Res. Vol. 31, N 9. - P. 2127-2145.

103. Cuesta, G. Quantitative determination of pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14 using a modification of phenol-sulfuric acid method / G. Cuesta, N. Suarez, M. I. Bessio et al. // Journal of Microbiological Methods. -2003.-Vol. 52.-P. 69-73.

104. Cui, W. NMR characterization of a 4-0-methyl-p-D-glucuronic acid-containing rhamnogalctouronan from yellow mustard (Sinapis alba L.) mucilage / W. Cui, M. N. A. Eskin, C. G. Biliaderis et al. II Carbohydr. Res. 1996. - Vol. 292.-P. 173-183.

105. Dang, F. Ultrafast analysis of oligosaccharides on microchip with light-emitting diode confocal fluorescence detection / F. Dang et al. // Electrophoresis. 2003. - Vol. 24. - P. 714-721.

106. Ding, K. Capillary Electrophoresis of polysaccharides and it application / K. Ding, J. Fang // Chinese Journal of Chromatography. 1999. -Vol. 17.-346-350.

107. Dische, Z. A modification of the carbazole reaction of hexuronic acids for the study of polyuronides / Z. Dische // J. Biol. Chem. 1950. - Vol. 183. - P. 489-494.

108. Dische, Z. A new specific color reaction of hexuronic acids / Z. Dische // J. Biol. Chem. 1947. - Vol. 167. - P. 189-198.

109. Dubois, M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton et al. // Anal. Chem. -1956. Vol. 28.-P. 350-356.

110. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other scientific purposes. Strasburg: Counsil of Europe, 1986.-51 p.

111. Filippov, M. P. Determination of the Content and Degree of Esterification of Uronic Acids in Plant Tissues and Products of Their Processing / M. P. Filippov, G. V. Chernei // Applied Biochemistry and Microbiology. 2002. -Vol. 38, N 1. -P. 68-71.

112. Fox, J. D. Miniaturization of three carbohydrate analyses using a microsample plate reader / J. D. Fox, J. F. Robyt // Anal. Biochem. 1991. - Vol. 195.-P. 93-96.

113. Fuller, K. W. A micro method for the separation and determination of polysaccharides by zone electrophoresis / K. W. Fuller, D. H. Northcote // Biochem. J. 1956. - Vol. 64. - P. 657.

114. Galambos, J. T. The reaction of carbazole with carbohydrates: I. Effect of borate and sulfamate on the carbazole color of sugars / J. T. Galambos // Anal. Biochem. 1967. - Vol. 19. - P. 119-132.

115. Gary, A. L. Determination of galacturonic acid content of pectin using a microtiter plate assay / A. L. Gary // Proc. Fla. State Hort. Soc. 2004. - Vol. 117.-P. 416-421.

116. Gidley, M. J. Quantification of the structural features of starch polysaccharides by NMR- spectroscopy / M. J. Gidley // Carbohydrate Research. 1985.-Vol. 139.- P. 85-93.

117. Goubet, F. Polysaccharide Analysis Using Carbohydrate Gel Electrophoresis: A Method to Study Plant Cell Wall Polysaccharides and Polysaccharide Hydrolases / F. Goubet et al. // Anal. Biochem. 2002. - Vol. 300. -P. 53-68.

118. Green, L. C. Analysis of nitrate, nitrite and 15N. nitrite in biological fluids / L. C. Green, D. A. Wagner, J. Glogowski et al. // Anal. Biochem. 1982. -Vol. 126.-P. 131-143.

119. Harris, P. J. An improved procedure for the methylation analysis of oligosaccharides and polysaccharides / P. J. Harris, R. J. Henry, A. B. Blakeney et al. // Carbohydr. Res. 1984. - Vol. 127. - P. 59-73.

120. Heri, W. J. Chromatographische Fraktionierung von Pekntinstoffen an DEAE-Cellulose / W. J. Heri, H. Neukom, H. Deuel // Helv. Chim. Acta. 1961. -Vol. 44.-P. 1931-1939.

121. Hodge, J. E. Determination of reducing sugars and carbohydrates / J. E. Hodge, B. T. Hofreiter // Carbohydrate Chem. 1962. - Vol. 115. - P. 380-394.

122. Hsu, J. W. Ganoderma lucidum Polysaccharides Induce Macrophage-like Differentiation in Human Leukemia THP-1 Cells via Caspase and p53 Activation / J. W. Hsu, H.-C. Huang, S.-T. Chen et al. // ECAM. 2009. - P. 1-13.

123. Jager, S. Characterisation and quantification of polysaccharides in extracts from Viscum album L. with CE-UV / S. Jager, M. Beffert, K. Hoppe et al. // Phytomedicine. 2007. - Vol. 14. - P. 47.

124. Kaur, S. Quantitative estimation of polysaccharides in molasses using Near Infra Red spectroscopy / S. Kaur, R. S. S. Kaler // Sugar Tech. 2008. - Vol. 10, N3.-P. 265-268.

125. Kardosova, A. Chemical and C13 NMR of a arabinoramnogalactan from the leaves of Plantago lanceolata L. var. Libor / A. Kardosova, P. Capek // Coll. Czech. Chem. Commun. 1994. - Vol. 59. - P. 2714-2719.

126. Kawamura, I. INF-y- producing ability as T cell against a possible marker for the protective Mycobacterium bouis BBG in mice / I. Kawamura, H. Tsukada, H. Yoshikawa et al. // J. Immunol. 1992. - Vol. 148. - P. 2887-2893.

127. Kayser, O. Natural products and synthetic compounds as immunomodulators / O. Kayser, K. N. Masihi, A. F. Kiderlen // Expert Rev. Anti. Infect.-2003.-Vol. 1.-P. 319-335.

128. Keenan, M. H. J. A 13C-NMR study of sugar-beet pectin / M. H. J. Keenan, P. S. Belton, J. A. Matthew et al. // Carbohydr. Res. 1985. - Vol. 138. -P. 168-170.

129. Kim, G. Y. Effect of water-soluble proteoglycan isolated from Agaricus blazei on the maturation of murine bone marrow-derived dendritic cells / G. Y. Kim, M. Y. Lee, H. J. Lee et al. // Int. Immunopharmacol. 2005. - Vol. 5, N 10.-P. 1523-1532.

130. Kim, J. Y. Angelan isolated from Angelica gigas Na-kai induces dendritic cell maturation through toll-like receptor 4 / J. Y. Kim, Y. D. Yoon, J. M. Ahn et al. // Int. Immunopharmacol. 2007. - Vol. 7, N 1. - P. 78-87.

131. Kintner, P. K. Carbohydrate interference and its correction in pectin analysis using the m-hydroxydiphenyl method / P. K. Kintner, J. P. Van Buren // Journal of Food Science. 1982. - Vol. 47. - P. 756-759.

132. Komalavilas, P. The acetylation at 0-3 of galacturonic acid in the rhamnose-rich portion of pectins / P. Komalavilas, A. J. Mort // Carbohydr. Res. -1989. Vol. 189. - P. - 261-272.

133. Koseki, M. Determination of Pectin in the Presence of Food Polysaccharides / M. Koseki, N. Kitabatake, E. Doi et al. // Journal of Food Science. 1986. - Vol. 51, N 5. - P. 1329-1332.

134. Kreider, T. Alternatively activated macrophages in helminth infections / T. Kreider, R. M. Anthony, J. F. Urban et al. // Curr. Opin. Immunol. -2007. Vol. 19, N 4. - P. 448-53.

135. Lahaye, M. Seaweed dietary fibres: structure, physicochemical and biological properties relevant to intestinal physiology / M. Lahaye, B. Kaeffer // Sciences and Aliments. 1997. - Vol. 17. - P. 563-584.

136. Lavi, I. An aqueous polysaccharide extract from the edible mushroom Pleurotus ostreatus induces anti-proliferative and pro-apoptotic effects on HT-29 colon cancer cells /1. Lavi, D. Friesem, S. Geresh et al. // Cancer Lett. 2006. -Vol. 244.-P. 61-70.

137. Li, J. An improved methodology for the quantification of uronic acid units in xylans and other polysaccharides / J. Li, K. Kisara, S. Danielsson et al. // Carbohydrate Research. 2007. - Vol. 342. - P. 1442-1449.

138. Li, W. Study of nanofiltration for purifying fructo-oligosaccharides II. Extended pore model / W. Li, J. Li, T. Chen et al. // J. Membr. Sci. 2005. - Vol. 258.-P. 8-15.

139. Liu, F.T. Galectins as modulators of tumour progression / F.T. Liu, G.A. Rabinovich // Nat. Rev. Cancer. 2005. - Vol. 5. - P. 29-41.

140. Liu, K. Y. Phytochemical and pharmacological research progress in Tussilago farfara / K. Y. Liu, T. J. Zhang, W. Y. Gao et al. // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006. - Vol. 31. - P. 1837-1841.

141. Liu, Y. F. HPLC fingerprint of chemical constituents of Flos Farfarae / Y. F. Liu, X. W. Yang // Yao Xue Xue Bao. 2009. - Vol. 44, N 5. - P. 510-524.

142. Lowry, O. H. Protein measurment with the folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosbrough, A. L. Farr et al. // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193.-P. 265-270.

143. Mantovani, A. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization / A. Mantovani et al. // Trends Immunol. 2004. - Vol. 25.-P. 677-686.

144. Mao, F. Anticancer effect of Lycium barbarum polysaccharides on colon cancer cells involves G0/G1 phase arrest / F. Mao, B. Xiao, X. Jiang et al. // Med. Oncol. 2011. - Vol. 28. - P. 121-126.

145. Markowitz, A. S. A rapid specific method for the isolation of pneumococcal polysaccharide / A. S. Markowitz, J. R. Henderson // Nature. -1958.- Vol. 181. -P. 771-772.

146. Matsuno, Y. Fast analysis of glycosaminoglycans by microchip electrophoresis with in situ fluorescent detection using ethidium bromide / Y. Matsuno, M. Kinoshita, K. Kakehi // J. Pharmac. Biomed. Anal. 2005. - Vol. 37. - P. 429-436.

147. Miao, Y. Growth inhibition and cell-cycle arrest of human gastric cancer cells by Lycium barbarum polysaccharide / Y. Miao, B. Xiao, Z. Jiang et al. // Med. Oncol. 2010. - Vol. 27. - P. 785-790.

148. Mills, C. D. M-l/M-2 macrophages and the Thl/Th2 paradigm / C. D. Mills et al. // J. Immunol. 2000. - Vol. 164. - P. 6166-6173.

149. Milner, Y. A copper reagent for the determination of hexuronic acids and certain ketohexoses / Y. Milner, G. Avigad // Carbohydrate Research. 1967. -Vol. 4.-P. 359-361.

150. Monari, C. Differences in outcome of the interaction between Cryptococcus neoformans glucuronoxylomannan and human monocytes and neutrophils / C. Monari, C. Retini, A. Casadevall et al. 11 Eur. J. Immunol. 2003. -Vol. 33.-P. 1041-1047.

151. Monsoor, M. A. Determination of polygalacturonic acid content in pectin extracts by diffuse reflectance Fourer transform infrared spectroscopy / M. A. Monsoor, U. Kalapathy, A. Proctor // Food Chemistry. 2001. - Vol. 74. -P. 233-238.

152. Nasal ova, G. Antitussive activity of a rhamnogalacturonan isolated from the roots of Althaea officinalis L., var. Robusta / G. Nasal ova, A. Strapkova, A. Kardosova et al. // J. Carbohydr. Chem. 1993. - Vol. 12. - P. 589-596.

153. Neiss, T. G. NMR and statistical analysis of the galacturonic acid and methyl ester distributions in pectic polysaccharides / T. G. Neiss, H. N. Cheng,

154. P. J. Daas et al. // Polymer Preprint. 1998. - Vol. 21. - P. 688-689.122

155. Neukom, H. Chromatographische Fraktionerung von Polysackariden an Cellulose-Anionenaustauschern / H. Neukom, H. Deuel, W. J. Heri et al. // Helv. Chim. Acta. 1960. - Vol. 43. - P. 64-68.

156. O' Neill, M. The PecticPolysaccharides of Primary Cell Walls / M. O. Neill, P. Albersheim, A. Darvill // Methods in Plant Biochemistry. 1990. - Vol. 2.-P. 415-441.

157. Otterlei, M. Induction of cytokine production from human monocytes stimulated with alginate / M. Otterlei, K. Ostgaard, G. Skjak-Braek et al. // J. Immonother. 1991. - Vol. 10. - P. 286-291.

158. Pauli, G. F. A routine experimental protocol for qHNMR illustrated with Taxol / G. F. Pauli, B. U. Jaki, D. C. Lankin // J. Nat. Prod. 2007. - Vol. 70. - P. 589-95.

159. Pauli, G. F. Quantitative 1H NMR: development and potential of a method for natural products analysis / G. F. Pauli, B. U. Jaki, D. C. Lankin // J. Nat. Prod. 2005. - Vol. 68. - P. 133-49.

160. Paulsen, B. S. Plant polysaccharides with immunostimulatory activities / B. S. Paulsen // Curr. Org. Chem. 2001. - Vol. 5. - P. 939-950.

161. Paulsen, B. S. Bioactive Pectic Polysaccharides / B. S. Paulsen, H. Barsett // Adv. Polym. Sci. 2005. - Vol. 186. - P. 69-101.

162. Popov, S. V. Adjuvant effect of lemnan, pectic polysaccharides of callus culture of Lemna minor L. at oral administration / S. V. Popov, E. A. Gunter, P. A. Markov et al. // Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2006. - Vol. 28. - P. 141-152.

163. Popov, S. V. Preventive effect of a pectic polysaccharide of the common cranberry Vaccinium oxycoccos L. on acetic acid-induced colitis in mice / S. V. Popov, P. A. Markov, I. R. Nikitina et al. // World J. Gastroenterol. 2006. -Vol. 41.-P. 6646-6651.

164. Ramos, G. P. LC Determination of Four Isoflavone Aglycones in Red Clover (Trifolium pratense L.) / G. P. Ramos, P. M. B. Dias, C. B. Morais et al. // Chromatographia. 2008. - Vol. 67, N 1-2. - P. 125-129.

165. Robertson, G. L. The fractional extraction and quantitative determination of pectic substances in grapes and musts / G. L. Robertson // American Journal of Enology and Viticulture. 1979. - Vol. 30, N 3. - P. 182186.

166. Saha, S. K. Determination of the concentrations of oligosaccharides, complex type carbohydrates, and glycoproteins using the phenol-sulfuric acid method / S. K. Saha, C. F. Brewer // Carbohydr. Res. 1994. - Vol. 254. - P. 157167.

167. Samuelson, A. B. Characterization of a biologically active pectin from Plantago major L. / A. B. Samuelson, B. S. Paulsen, J. K. Wold et al. // Carbohydr. Polym. 1996. - Vol. 30. - P. 37-44.

168. Sanz, M. L. Recent developments in sample preparation for chromatographic analysis of carbohydrates / M. L. Sanz, I. Martinez-Castro // J. Chromatography. 2007. - Vol. 1153. - P. 74-89.

169. Scott, R. W. Colorimetric determination of hexuronic acids in plant materials / R. W. Scott // Analytical Chemistry. 1979. - Vol. 51, N 7. - P. 936941.

170. Schepetkin, I. A. Botanical polysaccharides: Macrophage immunomodulation and therapeutic potential /1. A. Schepetkin, M. T. Quinn // Int. Immunopharmacology. 2006. - Vol. 6. - P. 317-333.

171. Schepetkin, I. A. Macrophage immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Opuntia polyacantha / I. A. Schepetkin, G. Xie, L. N. Kirpotina et al. / Int. Immunopharmacology. 2008. - Vol. 8. - P. 14551466.

172. Sevag, M. G. Deproteinization and removal of capsular polysaccharides / M. G. Sevag // Biochem. Z. 1934. - Vol. 273. - P. 419-423.

173. Shimizu, N. The core structure and immunological activities of glycyrrhizan UA, the main polysaccharide from the root of Glycyrrhiza uralensis / N. Shimizu, M. Tomoda, K. Takada // Chem. Pharm. Bull. 1992. - Vol. 40. -P. 2125.

174. Shimizu, N. Characterization of a polysaccharide having activity on the reticuloendothelial system from the stolon of Glycyrrhiza glabra var. Glandulifera / N. Shimizu, M. Tomoda, M. Satoh et al. // Chem. Pharm. Bull. -1991.-Vol. 39.-P. 2082-2086.

175. Shin, K. S. Rhamnogalacturonan II from the leaves of Panax ginseng C. A. Meyer as a macrophage Fc receptor expression-enhancing polysaccharide / K. S. Shin, H. Kiyohara, T. Matsumoto et al. // Carbohydr. Res. 1997. - Vol. 300.-P. 239-249.

176. Shin, J. Y. Immunostimulating effects of acidic polysaccharides extract of Panax ginseng on macrophage function / J. Y. Shin, J. Y. Song, Y. S. Yun et al. // Immunotoxicol. 2002. - Vol. 24. - P. 469-482.

177. Spectral Database for Organic Compounds (SDBS) Electronic resource. Mode of access: http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/ directframetop. cgi.

178. Swennen, K. Ultrafiltration and ethanol precipitation for isolation of arabinoxylooligosaccharides with different structures / K. Swennen, C. M. Courtin, B. Van der Bruggen et al. // Carbohydr. Polym. 2005. - Vol. 62. - P. 283-292.

179. Tadeta, K. Potential activity of carrageenan to enhance antibacterial host-defense system in mice / K. Tadeta, K. Irifune, K. Tomono et. al. // J. Infect. Chemother. 1995. - Vol. 1. - P. 59-63.

180. Taylor, A. R. Complement fixing antigens in neoplastic tissue extracts / A. R. Taylor, A. Gillen, F. B. Brandon // Virology. 1959. - Vol. 7. - P. 348.

181. Termeer, C. Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cells via toll-like receptor 4 / C. Termeer, F. Benedix, J. Sleeman and al. // J. Exp. Med. -2002.- Vol. 195.-P. 99-111.

182. Termeer, C. C. Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells / C. C. Termeer, J. Hennies, U. Voith and al. // J. Immunol. -2000.-Vol. 165.-P. 1863-1870.

183. Thakur, B. R. Chemistry and uses of pectin a review / B. R. Thakur, P. K. Singh, A. K. Handa // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. - 1997. - Vol. 37, N 1. - P. 47-73.

184. Thesleff, I. Signalling networks regulating dental development / I. Thesleff, P. Sharpe // Mech. Dev. 1997. - Vol. 67. - P. 111-123.

185. Thibault, J. F. Automatisation du dosage des substances pectiques par la methode au meta-hidroxydiphenyl / J. F. Thibault // Lebensmittel-Wissenschaft und Technolologie. 1979. - Vol. 12, N 5. - P. 247-251.

186. Toba, T. A new method for the quantitative determination of microbial extracellular polysaccharide production using a disposable ultrafilter membrane unit / T. Toba, H. Uemura, T. Itohoh // Letters in Applied Microbiology. 1992. - Vol. 14. - P. 30-32.

187. Tojo, E. A simple 'H NMR method for the quantification of carrageenans in blends / E. Tojo, J. Prado // Carbohydrate Polymers. 2003. - Vol. 53.- P. 325-329.

188. Tomoda, M. Water-soluble carbohydrates of Zizyphi fructus. II. Isolation of two polysaccharides and structure of an arabinan / M. Tomoda, M. Takahashi, S. Nakatsuka // Chem. Pharm. Bull. 1973. - Vol. 21. - P. 707-711.

189. Tomoda, M. Plant mucilages. XXIX. Isolation and characterization of a mucous polysaccharide, Plantago-mucilage A, from the seeds of Plantago major var. asiatica / M. Tomoda, M. Yokoi, K. Ishikawa // Chem. Pharm. Bull. 1981. -Vol. 29.-P. 2877-2884.

190. Tullia, M. C. Measurement of uronic acids without interference from neutral sugars / M. C. Tullia, C. Filisetti-Cozzi, N. C. Carpita // Analytical Biochemistry. 1991.-Vol. 197, N l.-P. 157-162.

191. Ungewis, J. Quantitative determination of cationic modified polysaccharides on hair using LC-MS and LC-MS-MS / J. Ungewis, J.-P. Vietzke, C. Rapp et al. // Anal, and Bioanal. Chem. 2005. - Vol. 381. - P. 1401-1407.

192. Vecchiarelli, A. The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans interferes with human dendritic cell maturation and activation / A. Vecchiarelli, D. Pietrella, P. Lupo et al. // J. Leukocyte Biol. 2003. - Vol. 74. -P. 370-374.

193. Volpi, N. Electrophoretic approaches to the analysis of complex polysaccharides / N. Volpi, F. Maccari // J. Chromatogr. 2006. - Vol. 834. - P. 1-13.

194. Waffenschmidt, S. Assay of reducing sugars in the nanomole range with 2,2-bicinchoninate / S. Waffenschmidt, L. Jaenicke // Analytical Biochemistry. 1987. - Vol. 165. - P. 337-340.

195. Wan, A. W. Macrophage immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Glycyrrhiza uralensis fish / A. W. Wan, F. C. Cheng, J. Q. Wang et al. // Int. Immunopharmacology. 2008. - Vol. 8. - P. 4350.

196. Wang, Q. Determination of the compositions of polysaccharides from Chinese herbs by capillary zone electrophoresis with amperometric detection / Q. Wang, F. Ding, N. Zhu et al. // Biomed. Chromatogr. 2003. - Vol. 17. - P. 483488.

197. Wang, X. L. The possibility of separation saccharides from a NaCl solution by using nanofiltration in diafiltration mode / X. L. Wang, C. Zhang, P. Ouyang // J. Membr. Sci. 2002. - Vol. 204. - P. 271 -281.

198. Wang, Z. NMR quantification for monitoring heparosan K5 capsular polysaccharide production / Z. Wang, Z. Zhang, S. A. McCallum et al. // Analytical Biochemistry. 2010. - Vol. 398. - P. 275-277.

199. Wasser, S. P. Medicinal mushrooms as a source of anti-tumor and immunomodulating polysaccharides / S. P. Wasser // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - Vol. 60. - P. 258-274.

200. Williams, M. A. K. Analysis of Partially Methyl-Esterified Galacturonic Acid Oligomers by Capillary Electrophoresis / M. A. K. Williams, G. M. C. Buffet, T. J. Foster // Anal. Biochem. 2002. - Vol. 301. - P. 117-122.

201. Xua, Q. Characterization and quantification of C-polysaccharide in Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide preparations / Q. Xua, C.

202. Abeygunawardanaa, A. S. Nga et al. // Analytical Biochemistry. 2005. - Vol. 336. - P. 262-272.

203. Yakovlev, A. I. Polysaccharides of the inflorescenes of Tilia cordata / A.I. Yakovlev // Khimiya Prirodnykh Soedinenii. 1985. - N. 1. - P. 116-117.

204. Yamada, H. Pectic polysaccharides from Chinese herbs: structure and biological activity / H. Yamada // Carbohydr. Polymers. 1994. - Vol. 25. - P. 269-276.

205. Yarema, K. J. Chemical approaches to glycobiology and emerging carbohydrate-based therapeutic agents / K. J. Yarema, C. R. Bertozzi // Current Opinion in Chemical Biology. 1998. - Vol. 2. - P. 49-61.