Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Реакции гладкомышечных клеток в морфогенезе сосудов (в норме и при патологии)

РГб ол

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК 2 ^ Ц0Я КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

Примцеаа Ольга Юэефовна

РЕАКЦИИ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК В' МОРФОГЕНЕЗЕ СОСУДОВ ( в норме и при патологии )

14.00.06 - Кардиология 03.00.25.- Клеточная биология

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук (о форме научного доклада)

Москва - 199 3 год

Работа иыполнена в Институте Экспериментальной Кардиологии кардиологического Научного Центра Российской АМН.

Официальные оппоненты;

Доктор биологических наук, профессор Александр Владимирович Зеленин Доктор биологических наук, профессор Всеволод Арсеньевич Ткачук Доктор медицинских наук, профессор Лна толий Борисович Шехтер

Подущая организация Институт хирургии им.А.В.Вишневского Российской АМН.

присуждению ученой степени доктора наук в КНЦ Российской АМН (Москва, 121 552, 3-я Черепковская, д. 15а).

С диссертацией иожно ознакомиться в библиотеке КНЦ РАМН.

часов

1993 года.

Учений секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Т.Ю.Полевая

Основной тип клеток в сосудах животных и человека - гладко-мышечные клетки (ГМК). Многие структурно-функциональные изменения стенки сосудов при патологических состояниях происходят чя счетнарушения нормальных функций ГМК.

Онтогенетически ГМК - производные мезенхимы и таким образом относятся к соединительной ткани. Однако основная функция дифференцированных гладких мышц сосудов - сокращение, лежащее о основе поддержания сосудистого тонуса.

Гладкие мышцы сосудов традиционно относят к аысокодифферен-цированмому типу ткани, не способной в норме к активному обновление (в нормальных сосудах взрослых хипотних зарегистрировано менее 1% клеток, способных включать печеный тимилин, те находящихся в S фазе клеточного цикла). Однако при патологии ГМК способны выходить из состояния покоя и вступать в клеточный цикл. При этом описаны два основных -рила отвага, которые ГМК демонстрируют при различных сосудистых заболеваниях.

Структурные изменения крупных артерий при таком широко распространенном заболевании как гипертония сводятся к общему (но локальному) утолщению стенки сосудов, в основе которого, как ползгапт, лежит гипертрофия гладкомышечных клеток. Гиперплазии (т.е. увеличения числа клеток) при этом не происходит.

Механизмы гипертрофии ГМК изучены недостаточно. Показано, что одна из форм гипертрофии может быть связана с явлением полиллоиднзации, т.е. вступлением ГМК в клеточный цикл (с прохождением S фазы и редупликацией ДНК), не заканчивающийся нормальным цитокинезом. Гипертрофированные клетки способны к гиперпролукции межклеточного матрикса, чтч также способствует утолщению стенки сосудов при гипертонии (Owens; Schwartz 1982, Folkow 1982, Owens, 198S, 1990).

Основываясь на данных, полученных из экспериментов с жипот-ными, истинную пролиферацию (гиперплазию) ГМК связывают с сосудистыми заболеваниями, при которых утолщения стенки сосудов носят локальный характер Это прежде всего атеросклероз*, а такжо взскулиты и стеноэм различной этиологии (Ross н лр. 1976, 1986).

Морфологически ГМК из таких локальных (иитимальных) 'толщений характеризуются раэпитыи синтетическим аппаратом, напоминают фиброблэстм, однако сохраняют при этом специфические для падких мышц ультраструктуриые элементы (фрагменты сократите«!.-

пого аппарата, базальную мембрану, шш-mue тельца) (Campbell и пр 19 85, 1986).

Начиная с 1979 г. в литературе обсуждается гипотеза о возможности ГИК модифнцнроиать свой фенотип от сократительного к синтетическому (или модифицированному). Гипотеза была высказана C.impbell, Campbell и Ross на основании результатов культивировании изолированных ГМК in vitro.

Било показано, что при первичном культивировании ГМК претер-lumuwT морфологические изменения, сходные с, описанными выше для клеток сосудов при патологии. Эти изменения обратимы, и при определенных условиях культивирования ГМК могут вернуться к сократи-

I

тельному фенотипу. ' Модифицированные (синтетического фенотипа) ГМК и культура способны к активному синтезу, миграции и пролиферируют пол дбпегвием ростоиих факторов.

Авторы гипотези рассматривают модификации фенотипа ГМК как облзагелмшй этап функциональных изменений ГМК, предшествующий иролнфй'рании, и предполагают, что именно модифицированные ГМК nrjuimT ключевую роль при патологии.-

Ü последние годи и литературе обсуждается и иная точка зрения, а именно, возможность сохранения и популяции ГМК взрослого сосуда некоторого количества иалодифферепцнроианных клеток, tie имеющих, в отличие от модифицированных, признаков гладкомышечной цифференциропки (Schwartz 199 0). По мнению Schwartz, за структурный изменении сосудов при различных заболеваниях и при репарации ичлеrcTuoima особая субпопуляция клеток.

Таким образом, к настоящему времени принципиальные вопросы об источниках ГМК, ответственных за реакции сосудистой стенки при патологии, остаются открытыми:

- способны ли иисокоцифференцированные ГМК сосуда к модификации фенотипа In vivo?

- сохраняется ли субпопуляция малодифференцированных (без признаков гладкомышечной дкфференцкроаки) клеток в процессе нормального развития сосудов, и какую роль они играют в патологии?

• и, наконец, определяется яи характер клеточной реакции гладких мышц факторами, действующими на одни и тс же ГМК, или при различных сосудистых заболеваниях за структурные изменения сосудистой стенки ответственны различные субпо-iiy/тцин ГМК.

Иными спорами, практически не исследован один из аспектов фундаментально!! проблемы клеточной биологии сосудов - оопрос о функциональной гетерогенности популяции гладких мышц и ео возможной роли d развитии различных сосудистых заболепаний.

Трудности в решении данной проблемы связаны, прежде iicero, с геи, что до настоящего времени не найдены маркеры, специфичные для ГМК различного фенотипа, которые позволили бы проследить судьбу этих клеток в процессе нормального развития и патологии.

Цалн u задачи сайтам-

Цель настоящей работы - анализ функциональной гетерогенности популяции ГИК сосудов и определяемой со разноиаправленностн клеточных реакций при различных сосудистых заболеваниях. В работе были поставлены следующие задачи:

1. используя гибридомную технологии, получить монок лоналышо

айтитела к антигенам, специфичным для активированных ГМК (модифицированного и/или фетального фенотипа) человека и животных

2. охарактеризовать свойства и функции выявленных антигенов

3. с помощью полученных антител изучить характер распределения

антиген-положительных клеток в процессе нормального развития и при сосудистых заболеваниях у человека, связанных с разнонаправленной клеточной реакцией гладких мышц: локальным и общим утолщением стенки сосудов (о частности, при атеросклерозе .и гипертонической болезни)

4. изучить закономерности экспрессии вняпляемых антигенов при

модификации фенотипа и активации пролиферации ГМК in vitro, а также in vivo на модели дезндотелиэацни (инициация локального интимального утолщения) сонной артерии крис ,

5. исследовать особенности пролифератиппого нонс/юния ГМК сосу-

дов в норме и при гипертонии. Попытаться пыяпнн. субнопуляцив ГМК, вступающих в клеточную реакцию гипертонического типа (клеточная гипертрофия)

6. охарактеризовать действие некоторых мазоакгимных исщсстп (каго-

холамины, ангиотепзинен II) как возможных модиатсрон реакции гипертонического типа.

3

llaxuttaa нянина il рректическад HSHUgCTt? работы

Используя гибрндомную технологию удалось получить монокло-чапыше антитела против ГМК модифицированного фенотипа. Показано, что распознаваемые ими антигены представляют собой молекулы адгезии VCAM 1 (сосудистая молекула клеточной адгезии 1), ICAM 1 (молекула межклеточной адгезии 1) с молекулярными массами 110 кД и 'J0 кД соответственно, ранее не описанные для ГМК.

Охарактеризована динамика экспрессии данных антигенов в процессе нормального развития и при-патологии. Обнаружено, что антигени экспресснрованы транзиторно на клетках сосудов в ходе нормального развития. Во взрослом организме а сосудах различного калибра антиген-положительными оказывается только эндотелмальные клетки, а ГМК реэкспрессируют указанные мезенхимальные антигены при г|атологии, причем, только в случае структурных изменений, связанных с локальным утолщением стенки сосуда.

Результаты экспериментов, проведенных на животных, позволяют считать, что ГМК взрослого сосуда способны к модификации фенотипа in vivo (и соответствии с экспрессией выявляемых молекул адгезии как маркеров модификации), однако в формировании интимального утолщения сосудов участвуют,.по крайней мере, две субпопуляции ГМК (относительно их способности экспрессировать молекулу VCAM I). ■ ''

В работе обнаружено также, что ГМК взрослых сосудов гегеро-генны по способности к пролиферации. Впервые в крупных артериях человека и животных показано существование особой сублолуляции ГМК (находящихся в S фазе клеточного цикла), имеющей тенденцию к иолиплолризации in vitro. Описана однонаправленность возрастных и гипертонических изменений гладких мышц'крупных сосудов человека (накопление клеток с тетраплоидным содержанием ДНК).

В работе исследованы некоторые аспекты гипертонической реакции клеток при воздействии иорадреналина (НА) и ангиотензина II (All).

Обнаружено, что фенотип ГМК не влияет на их способность к гипертонической реакции. Последняя определяется характером распределения специфических по отношение - к упомянутым агентам рецепторов на поверхности клетки. Причем НА вызывает полиплондиэацию через синергизм альфа-, и бета-рецепторов, a All, связываясь со специфическими рецепторами, индуцирует клеточную гипертрофию, когор&н альтернативна пролиферации.

В целом, полученные результаты унаэыпаот на функциональную гетерогенность популяции гладких мыгец сосудов и предполагают наличие определенных субпопуляций ГМК, ответственных за kjuvi очгтио реакции различного типа, п частности - общее н локальное утолщение стенки сосудов при патологии.

Апробация pggQTM

Основные результаты работы были представлены на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1987), на Советско-Американских симпозиумах по проблемам кардиологии (Ваку, 1984, Томск, 1990, Суздаль, 1991, Гранд Каньон США, 1992), на Советско-Французских симпозиумах по проблемам Кардиологии (Ереван, 1986, Париж, 1988, Ташкент 1989), на Всемирных конгрессах по атеросклерозу (Рим, 1988, Чикаго 1991), на LX Сессии общого собрания /Академии медицинских наук (Ленинград, 1990), на 1-ом Всемирной Конгрессе по Клеточной Биологии (Париж 1991), на XIII и XIV Ежегодных Европейских конференциях по биологии сосудов (Венеция, 1992, Тампере, 1993).

Структура рзботи

Диссертация изложена п настоящей брошюре ц форме научного доклада. Основные результаты получены лично автором. 13 разработке методов, получении и обсуждении результатов принимали участие: А.В.Термин, М.М.Пекло, А.И.Фаерман, Р.В.Лацис, С.Н.Рудченко, С.М.Данилов, В. П. Торчилин, П. Д. Брежестовский, В.Н.Смирнов, а также A.Gown., A.Clowes (Университет Вашингтона, Снэттл, США). Часть работы была выполнена совместно с Е. Т. Колокольчикопой, Д.С. Саркисовым (Институт хирургии им.Вишневского (РАМН).

Всем коллегам автор выражает глубокую признательность. Автор также благодарит О.В.Рохлина и А.В.Ибрагимова за предоставление культур мышиной миеломы и определение подкласса полученных в работе антител. Ю.А.Барышникова (ОИЦ РАМН) и А.В. Филатова (Институт иммунологии Минздрава России) за предоставление антител к типо-специфическим клеточным антигенам. В.Н.Варану (Институт хирургии им.Вишневского РАМН) за предоставление образцов сосудов, полученных при операции больных по поводу неспенифического аорто-артерита. T.Springer (Медицинская школа Гарварда, Бостон, США) за предоставление антител RR1/1.

S

1. ПОВЕРХНОСТНЫЕ АНТИГЕНЫ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ГМК СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Моноклоналыше антитела к ГМК аорты плода человека

Моноклоналыше антитела (МА) получали после иммунизации мышей линии BALB/c культивируемыми ГМК аорты плода человека (аорту выделяли из плодов возраста 10-12 недель, клетки использовали на 8-15 пассажах). Клетки для иммунизации были выбрани исходя из того, что ГМК из развивающихся и патологически измененных сосудов сходны по ряду признаков, включая, как показано о наших работах, тонкие структурные компоксны мембран (2,16,21), и имеют модифицированный фенотип.

Спленоциты иммунных мышей гибридизовали с клетками мышиной мнеломы Р.3 x63.Agl. Методические детали описаны в наших работах (1, 18). Первичное тестирование культуральной жидкости от гибридных клонов проводили на интактном монослое тех se ГМК клеток, что были использованы для иммунизации, методом непрямой иммунофлуо-ресценции, с помощью инвертированного микроскопа (Opton) IСМ-405 с люминисцентной приставкой. Данный подход позволил отбирать антитела, реагирующие с поверхностными антигенами клеток.

Отобранные таким образом клоны тестировал» далее мммунохм-мически ПАП - методом на замороженных срезах нормальной и атеро-склеротической аорт человека.

Нами был выделен клон, обозначенный как 10F3 по следующим интересным особенностям: антитела окрашивали в нормальном сосуде только эндотелий (включая эндотелий vasa vasorum), тогда как ГМК медии и интимы были негативны. В толще же атеросклеротической бляшкн выявлялись многочисленные 10F3-позитивные клетки, часто веретеновидной формы.

Дальнейшее изучение показало, что МА реагируют с культивируемыми ГМК из аорты взрослого человека. В первичной культуре интиген выявлялся уже на вторые сутки культивирования на поверхности большинства (около 80%) клеток (рис.1). Иными словами, хотя in situ ГМК неповержденного сосуда были негативны, активация их при переводе в культуру вызывала быЬтрую экспрессии антигена (АГ). Следует отметить также, что динамика поведения антиген-положительных клеток медии отличалась от таковой из интимы: jig мере достижения конфлузмтного состояния культуры (к 12-14 дню) сродм ннтимальных клеток обнаруживали 11% антиген-положительных.

100

во

g 40

2 го 6«

СИЗ

£23 интима

S

ш

10

14

16

18

дни в культуре

Рисунок 1. 1 ОРЗ-лоложителыше к легки в первичной культуре ГМК аорти человека. Иммунофлуоресиентиое окрашивание. На каждой сроке просчитывали не менее 2000 клеток. Представленные данные среднее из трех независимых культур.

против 0.5% таковых среди медиальных.

Было показано также, что кроме ГМК, активированных при переводе в культуру, антитела 10F3 реагируют in vitro с эндотелием из пупочной вены человека, фибробластами легкого плода человека (12-15. недель развития).

Определение молекулярного веса антигена ЮРЗ

Методом дот-блоттинга было установлено, что МА 1ОРЗ принадлежит к подклассу 1вО|. Определение молекулярной массы произносили методом радиоиммунопреципитации антигена, меченного мстабо-1истически '*С-лейцином, из лиэата ГМК аорти плода человека, а -акже эндотелия пуповины человека.

Анализ преципититов методом электрофореза но Лэмли в олиакриламидном геле с последующей ащ-ораниографией показал п едуиирующих (в присутствии -меркаптотталона) и п нередуни-

ующих условиях, аналогичный результат 7 МА ЮРЛ преципш провали злок с кажушейгя молекулярной массой 90 кД.

Таким образом, оказалось, что антиген 1013 представляет собой рдноцепочечный полипентид либо гликопроченд У0 кД, экспрес-спрующийся на поверхности клеч~ок мезенхимьльного 'происхождения,

Иммуногистохимическое исследование распределения антигена 10РЗ в тканнх человека

Принадлежность АГ ЮРЗ к мезенхиме подтвердили также результаты иммуногистсхимического исследования тканей плода человека, проведенные с помощью непрямого иммунопероксидазного метода (ПАП),

Оказалось, что на ранних сроках развития (7-8 недель) в сосудах плода (включая аорту) позитивными оказываются гладко-мышечные клетки, формирующие будущие медиальный и интимальный слон.

11а 18-20 недело развития характер распределения АГ ЮНЗ не отличается от такового во взрослых нормальных артериях (си.ниже).

В тех органах, в которых в исследуемые сроки, сохранялась малодифференцированная мезенхима, последняя также оказывалась антиген-положительной. Так, в почках 18-20 недельных плодов помимо эндотелия капилляров, окрашивались многочисленные мезенхи-мальные клетки в толще коркового слоя, а также эпителий отдельных канальцев. Изучение кожи, роговицы, желудочка сердца и поперечнополосатой мускулатуры плодов 18 и 20 педель показало, что характер окрашивания АГ 10РЗ в этих органах такой же, как и во взрослом организме.

Распределение АГ ЮрЗ в норме о тканях взрослого человека суммированы в табл.I. Помимо указанных и таблице, било также исследовано 14 аутопсийных образцов сосудов, полученных от доноров в возрасте от 2 месяцев до 65 лет. Следует отметить узкое распределение АГ во взрослом организме о норме. ЮРЗ встречается только на эндотелиальных клетках сосудол различной природы -артерий, вен различного калибра, капилляров, Фибробласты соединительной ткани, равно как и ГМК сосудов и писцеральной мускулатуры, негативны.

Исследование периферической крови1 нормальных доноров показало следующие результаты: на мазках цельной кроми, а также на мазках, приготовленных из суспензии мононуклеаров, антиген-положительные клетки выявлены не были. Анализ же интактных.

Таблица I. Локализация антигена, уэкапаемого МА 1ОГЗ н органах и тканях человека. Антиген пыяпляли мммуногистохимичсски с помощью ПАП-метода

Орган 1ОРЗ-позитивны ЮРЗ-негативнм

Роговица эндотелий мелких сосудов эндотелий роговицы, эпителий роговицы стромз

Кора мозга эндотелий капилляров глиальные клетки, нейроны

Подвздошная кишка / эндотелий капилляров, вен и артерий эпителий ворсинок, ГМК, фибробласты соединительной ткани

Кожа - фибробласты дермы» эпителий потовых и сальных желез, эпидермис

Сердце » кардиомиоциты, ГМК сосудов

Плацента - • . трофобласт

Матка * - ГМК, фибробласты соединительной ткани

Почка петли клубочков, эндотелий капилляров эпителий канальцев

Мочеточник ' эндотелий артерий и вен эпителий, ГМК

прикрепившихся к подложке мононуклеаров показал, что уже на 1-е сутки культивиросания наблюдается экспрессия антигена 10F3 (т.е. кпетки моноцитарного ряда также способны экспрессироват^ антиген in vitro).

Исследование экспрессии антигена на активированных лимфоцитах (культипирование в течение 3-х дней выделенной фракции лимфоцитов в присутствии фитогеммаглютинина, а затем послс отмывки еще 6 дней в присутствии IL-2) показало, что они также способны экспресснрооать 10F3 антиген. Приведенные результаты

руют, что и отношении экспрессии на мононуклеарах крови 10F3 монет рестн себя как актнвационный антиген.

Антиген 10F3 идентифицирован как ICAM 1

Поведение АГ 10F3 как возможного активационного антигена мононуклеаров крови, его молекулярный вес и распределение в тканях человека (прежде всего локализация на поверхности эндотелия), а также экспрессия на поверхности клеток соединительной ткани при активации позволили предположить его идентичность так называемой молекуле межклеточной адгезии (ICAM 1).

ICAM 1 идентифицирован T.Springer с соавторами (198i, 1990) с помощью моноклоналышх антител RR1/1. Было показано, что ICAM I принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов и является контррецептором активационного антигена лейкоцитов LFA-I, функционально молекула ICAM 1 вовлечена р межклеточную адгезии лейкоцитов между собой и лейкоцитов с клетками соединительной ткани. Исследование Т.Springer показали широкую распространенность ICAM 1 на различных активированных клетках. Однако на поверхности ГМК молекула не была идентифицирована.

В нашей работе мы предприняли попытку прямо сравнить антитела RR1/1 с полученными нами антитепами 10F3 с целыа идентификации АГ 10F3 как молекулу адгезии ICAM 1.

Методические подходы и результаты подробно изложены в наших работах (22,2S). Нам удалось показать, что антитела 10F3 (аналогично антителам RR1/1) мнгибнруют аггрегацию лимфобластов периферической крови человека под действием фнтогеммаглютинина (рис.2). Эффективность ингибируоцего эффекта антител была сравнима с описанными для RRI/1 (35% для 10F3 и от 30% до 45%, для RR1/1, соответственно). Тестирование проводили по протоколу, описанному для антител RR 1/1,

Кромо того, в экспериментах по конкурентному связыванию антител было прямо показано, что антитела RR 1/1 и 10РЗ конкурируют за связывание с поверхностным антигеном на клетках линии 11937, а также на культивируемых ГМК (рис.З). Следует отметить, что антитела RR1/1 более эффективно иНгибируют связывание 10F3, чем это делают сами антитела 10F3. По-видимому, это можно объяснить различной величиной констант связывания антител. Во всех экспериментах в качестве контрольного использовалось

§ «

м

=г

2 50

о

е-

о

/

Рисунок 2. Слияние антител ЮРЭ на агрегацию лимфобластоп периферической крови человека. К лимфоцитам, культивируемым и присутствии ФГА, добавляли тестируемые антитела одновременно < ФМА. Процент агрегации вычисляли как

количество свободных клеток

1 ............................ * 100

общее количество клеток

Представлены результат трех независимых эксмпериментов, 1А9 - МА,

-финадл ежащее к подклассу , использовали как отрицательный

сонтроль,

1Нтитело 1А9, принадлежащее к тому ло подклассу, что и 10Р3 I ^) и полученное в той же гибридизации.

Об идентичности АГ IОРЗ с молекулой 1 САМ 1 свидетельствуют акже проведенные нами эксперименты по перекрестной радноиммуио-реципитации антителами 1 0ГЗ и КШ /1 антигена из клеток линии 937. Было обнаружено, что после обработки лизата клеток антнте-ами RRl/l антитела 10РЗ не преципитируот искомый антиген (25).

Таким образом, антиген 1ОИЗ, распознаваемый полученными нами 1тнтелами, оказался молекулой адгезии 1САМ 1.

Следует подчеркнуть, что п данной работе впервые описана жалиэация 1САМ 1 на поверхности ГМК. Более того, как следует из тведенних пище результатов, 1САМ 1 не экспрессируется на ГМК о

- 80

а

Ш во

X

£ 40 и

20

"5

О 1A9+10F3 (111)л) О 1GF3+10F3 <1И1п) A RR1/1 + 10F3 (И,1п)

0.008 0.04 0.2 1 5 25

м к г/мл

.Рисунок 3. Конкурентное связывание антител ЮБЗ и антител против 1САМ-1 КК1/1 с клетками линии 4937. По оси ординат: неличина связывания, выраженная в процентах от значения связывания антитела 10РЗ, меченого 1п111. 1Д9 - МА, принадлежащее к подклассу использовали как отрицательный контроль.

сосудах взрослых, однако обнаруживается в процессе нормального развития, а также при культивировании. Эти наблюдения дают возможность отнести молекулу ICAM I к маркерам ГМК модифицированного (и/или феталыюго) фенотипа.

Как уже было упомянуто выше, при тестировании антител ICAM 1-положительные клетки были обнаружены in vivo п атеросклероти-чоских бляшках сосудов человека. Нами было проведено более детальное изучение этого явления.

Экспрессия ICAM 1 в атеросклеротической бляшке аорты человека

Известно, что клеточный состав атеросклеротической бляшки сосудов человека не ограничивается ГМК. Кроме них в составе бляшки описаны макрофаги, а также некоторое количество активиро-ноиных лимфоцитов (Gown и др. 1986).

С цепью идентифицировать клеточный состав ICAM 1-положительной популяции мы применили метод двойного иммуногистохими-ческого окрашивания срезов бляшки, используя одновременно анш-тела 10F3 и специфические антитела к различным типам клеток (25),

Результаты проведенного нами исследования демонстрируют, чти молекула ICAM t экспрессирооана на поверхности двух основных типов клеток, описанных о бляшке: ГМК и макрофагах. Экспрессии ICAM I наблюдалась как о случае ранних стадий повреждения (липид-ные полосы), так и в продвинутых фиброзных бляшках. ""Причем п большинстве исследуемых образцов (всего было проанализировано 27) макрофаги бляшки представляли собой ICAM 1-позитивную субпопуляцию, тогда как среди альфа-актин-позитивных клеток (т.о. ГМК) только часть оказывалась антиген-позывной.

Кроме того, как показал анализ с использованием двойиог о окрашивания, среди ICAM 1-положительных клеток бляшки достаточно высокий процент (в некоторых случаях-около 50%) составляли клетки, негативные в отношении использованных тино-специфических маркеров (они не окрашивались ни антителами к альфа-актнпу, mi антителами ИАМ56-специфичными для макрофагов).

Использование антител против CD45 показало, что эти клетки не могут быть отнесены к лимфоцитарному ряду.

Следует отметить, что подобные, нендентнфицируемые по типо-специфическим маркерам клетки были выявлены в атеросклеротических бляшках и другими авторами (Wilcox и др. I988), которые идентифицировали их как слабодифференцированные мезенхимальные клетки.

Нельзя также исключить возможность, что данная субпопуляция представлена модифицированными ГМК. Хотя, как показано в нашей работе (3), ГМК при модификации в ходе культиоиронания сохраняют типо-специфические признаки (п частности альфа-изоформу актина). С другой стороны, есть данные (Glukhova и др. 1988), говорящие о том, что клетки интимы человека даже в норме отличает пониженное содержание некоторых дифференцнровочных (о частности, цигоске-летных белков). Не исключено, таким образом, что дальнейшее падение содержания альфа-актина в таких клетках при атеросклерозе не дает возможности идентифицировать его используемым (ПАП) методом.

Как было упомянуто выше, ICAM 1 является контр-рецептором антигена активированных лейкоцитов-молекулы LFA-1. Показано акже, что экспрессия I САМ 1 на поверхности ряда клеток рогули-

руегея некоторыми "медиаторами воспаления", п частности, интер-лейкином I,' интерфероном-гамма, а также фатором некроза опухолей (TNF).

Действие данных медиаторон, как показано, усиливает адгезию моноцитов на поверхности мезеихимальных клеток (Dustin, 1989,

Springer 1990).

Известно, что актииироианныо макрофаги могут быть источником упомянутых активных веществ. То есть, присутствие макрофагов в области бляшки обеспечивает определенное микроокружение для ГМК и индуцирует экспрессию на их поверхности молекулы ICAM I.

Однако, как било установлено (Warner, Libby 1989), ГМК могут сами являться источником лимфокинов, в частности, продуцировать TNF. Это дает возможность предполагать, что ГМК способны регулировать экспрессию ICAM 1 аутокринно. Эксперименты, проведенные нами, говорят в пользу такого предположения; нами было показано, что TNF (но но IL-1) может индуцировать экспрессию I САМ I ГИК in у itro.

Высказанное предположение может быть подтверждено и наблюдением, сделанным нами при иммуногистохимическом анализе атероскле-ротических сосудов: кластеры ICAM 1-положительных клеток часто можно видеть в медии (подлежащей под бляшкой), т.е. а области, где макрофаги, как возможный источник медиаторои экспрессии ICAM 1, отсутствуют.

Принимая во внимание наши результаты о принадлежности ICAM 1 мезенхиме и экспрессии молекулы в ходе морфогенеза сосудов (на ранних стадиях развития) мы также не можем исключить, что реэкспрессия данного мезенчимального антигена при атеросклерозе связана с васкуляризацией бляшки, которая описана уже иа ранних стадиях поражения (Gown, 1986).

Об этом также свидетельствуют результаты наших исследований клеточной композиции очага поражения сосудов при неспецифическом аортоартрите (5,6,15,20). Нами показана высокая степень васкуляризации утолщенной интимы при почти полном разрушении медиального слоя,что происходит по-видимому, в- результате действия цитотоксических лимфоцитов. Электроннр-микросколическая авторадиография выявила активные процессы формирования новых сосудов в утолщенной интиме. Клетки, формирующие их, оказываются ICAM 1«позитивными.

Итак, ICAM 1 - молекула адгезии, идентифицирована нами в

ход© нормального развития в процессе морфогенеза сосудов на поверхности ГИК, а также на поверхности активированных модифицированных ГМК in vitro я в области атеросклеротической бляшки ir» v ivo.

Моноклональные антитела к модифицированным ГМК аорты к рис (4

Исследования, проводимые на клетках человека, имепх естественные ограничения. Как видно из результатов, изложенных выше, ми можем отнести молекулу адгезии ICAM t к маркерам модифицированных ГМК и даже определить локализацию антиген-положительных клеток in vivo, но динамика процесса развития структурных изменений сосуда при патологии не может бить исследована полностью. Таким образом, существенный вопрос о происхождении- антиген-положительных клеток в области поражения остается открытым.

В связи с этим, мы предприняли попытку получить (используя, аналогичный изложенному выше подход) моноклональные антитела к модифицированным ГМК из аорты крыс (Wistar-Kyoto).

Методические подходы и основные результаты представлены п наших работах (1,7,8, II, 26). ГМК выделяли из медин аорты крыс, используя растворы коллагеназы (| мг/мл "Worthnington") и эластазы (0,5 мг/мл "Serva"). Клетки культивировали в среде 199 с 10% фетальной телячей сыворотки ("Oibco") при 37°С п атмосфере 95% воздуха и 5% С02.

Для иммунизации мышей QALB/c непользойали гладкомышечные клетки крысы на Ю-20 пассажах кульгиннропания (10^ клеток на мышь). Силеноциты иммунных мышей гибрицизонали с клетками мышиной миеломы (РЗ.хбЗ.AgJ,4-653).

Тестирование культуральной жидкости от гибридных клонов проводили на монослое живых гладкомышочных клеток, чаходящнхея на 10-20 пассажах, методом непрямой иммунофлуорсснсиции. В качестве вторых антител использовали кроличью синоротку против иммуноглобулинов мыши, меченую флуоресцеинизотиоцианатом.

Клоны, дающие положительный отпет, трижлы реклонироиалн. В результате было отобрано ï I клонов гибридных клеток, продуцирующих ант итела к ак к элементам межк легочного матрнкса, так и к мембранным антигенам клеток-мишеней.

Проверка полученных антител показала, что большинство из них

азаимодействует с поверхность» культивируемых крысиных клеток различного происхождения.

Среди отобранных выделен клон, обозначенный L1, продуцирующий антитела, распознающие антигены, находящиеся только на поверхности культивируемых гладкомышечных клеток и не выявляющиеся на поверхности следующих клеток: эмбриональных крысиных фибробластов (17-18-й день развития); фибробластов костного мозга (и первичной культуре и при пассировании до 5-го пассажа); фибробластов очага асептического воспаления (воспаление вызывали у взрослых крыс введением стерильных покровных стекол в подкожную рыхлу» соединительную ткань, после чего их извлекали н исследовали на 7-8-е сутки с начала воспаления); крысиных тнмоцигон, крысиных гепатоцитов (линия JAR-2) эмбриональной и взрослой поперечно-полосатих мышц крысы, а также клеток крысиных саркомы ХС и глиомы С6 . Описанные антитела относятся к иммуноглобулинам IgOja'

Антиген L1 идентифицирован как молекула адгезии VCAM 1

Моноклональное антитело L1 использовали для преципитации антигена из экстракта меченных ' "*С-лейцином культивируемых ГМК аорты крыс (30-4S пассаж). Контролем служили фибробласты эмбрионов крыс. Детали процедуры описаны в нашей работе (7).

Полученные с помощью антител преципитаты разделяли методом электрофореза по Лэмли в градиентном (7-22%) полиакриламидном геле. По окончании электрофореза гель окрашивали Кумасси, высушивали и экспонировали на рентгеновской пленке в течение 7 дней.

На авторадиограмне материала, осажденного из экстракта клеток моноклональным антителом И, выявляется полоса, соответствующая молекулярной массе 110 кДа и отсутствующая при изучении материала в пробе с неспецифическим белком MPC-11. Эта полоса не выявлялась на авторадиограмиах материала из клеток эмбриона крыс, с которыми не реагирует ни L1, ни MPC-I1, Таким образом, монокло-нальное антитело L1 распознает поверхностный антиген гладкомы-■цёчных клеток крысы, предстаиляющий ейбой полипептид с кажущейся молекулярной массой _ НО кДа.

Дальнейшая характеристика антигена L1 была проведена после ого выделения из лизата ГИК методом аффинной хроматографии, с Использованием колонки с иммуносорбентом (очищенные из асцита

антитела LI, соединенные с BrCN-сефароэой 4В (Farmacia).

После 'з люирования антигена, качество очистки проверяли методом электрофореза (SDS-PAGE). Полипептид затем переносили на мембран/ Immobilon-P (Millipore) и анализировали аминокислотную последовательность Я^-концевой части молекулы, используя сикви-натор (Applied Biosyste»s; Данная часть работы выполнена п Университете Вашингтона, Сиэттл, CUJA, совместно с Dr, A. Gown).

Было установлено, что НН^-концевая часть молекулы имеет следующую последовательность аминокислот:.. .FKIE1SPEYKTLA0GIPS-MLT. . . 1 .

Сравнение выявленной последовательности с банком данных (geri BANK) показало, что последняя демонстрирует гомологию (59.1%) л N-концевой последовательностью молекулы, описанной (Osboru и лр. 1989, Polte 1990) как. VCAM 1 (молекула адгезии сосудов) или INCAM 110 (Rice, 1989 - индуцированная молекула адгезии). Молекула VCAM 1 была открыта как поверхностная для активированного эндотелия пуповины человека. Индукции молекулы вызывали лимфокины (IL-1 или TNF-альфа), и как было показано, она может быть ответственна за адгезию трансформированных клеток некоторых линий лейкимий человека (HL-60, ТНР1 и т.д.), а также меланомы к эндотЪлию человека о культуре. Контр-рецептором для VCAM 1 служит интегрин VLA-4 (описанный на поверхности мононуклеаров крови). VCAM 1 (так жо как и ICAM 1) принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов, и п настоящее время известны две формы VCAM I (6-tí» и 7-ми-доменные полипептиды), представляющие собой продукты альтернативного сплайсинга гена (Hession, 1991).

Обсуждается возможная роль молекулы адгезии VCAM I н воспалении (привлечение мононуклеаров крови), а также при метастазировании опухолей.

Таким образом, нам впервые удалось описать молекулу, известную как "эндотелиальную", на сгоаерхиосги модифицированных ГМК при длительном культивировании.

I Используемые сокращения названий аминокислотных остатков: F, Phe; К, Lys; I, lie; Е, Glu; S, Ser; P, Pro; Y, Tyr; T, Thr; L, Leu; A, Ala; 0, Gin; G, Gly; D, Asp: M, Met.

Имиупогисгохимическое исследование распределения УСАМ 1 и ходе нормального развития крыс

Как уже подчеркивалось выше, модифицированные ГИК по ряду признаков (в гон числе, по способности к пролиферации и миграции) сходны с клетками из развивающихся сосудов. Предпринятое нами исследование показало, что УСАМ 1 экспрессируегся ГМК не только при активации их в ходе культивирования, но и в процессе нормального развития крыс.

Данные иммуногистохимического исследования суммированы в табл.2. УСАМ 1 выявляется в процессе нормального развития довольно рано (14-15 день внутриутробного развития) и экспрессирует тралзиторно преимущественно на поверхности клеток гладких мышц различных органов (активная реакция наблюдается также в гепатоцитах, но следует отметить, что антитела Ы перекрестно реагируют с ганглиоэидом 0И1, который в больших количествах присутствует в клетках печени). Данный вопрос требует специального контроля, так как вероятно, перекрестная реакция антитела 1Л определяется эпитопом, расположенным на углеводной части молекулы - общей между йМЗ и УСАМ 1.

К 7 дню постнатального развития антиген сохраняется лишь на поверхности отдельных клеток иедии артерий (как правило, прилежащих к адаентиции, в сонной артерии их количество не превышает 0,255), а также начинает (после М дня прстиатального развития) выявляться на клетках мелких виутриорганних сосудов (преимущественно на эндотелии, но нельзя исключить также, что антиген-позитивны могут быть окружающие капилляры Лерициты).

Таким образом, результаты данного исследования показали, что молекула УСАМ 1 может быть, также как 1САМ ), определена как антиген мезенхимы (преимущественно гладкомышечного ростка), играющий определенную роль в процессе нормального развития и морфогенеза сосудов.

Экспрессия УСАМ 1 в первичной культуре ГМК аорты крыс

Итак, во взрослых нормальных артериях крыс сохраняется лишь незначительное количество УСАМ 1-положительных клеток. Однако, как отмечалось выше, длительно-культивируемые ГМК (с 1-го по 60-Й пассаж) окрашивались антителами 1*1 при нммуногистохимическом исследовании. Следовательно, экспрессия антигена, по-видимому.

Таблица 2, Раслрвделеннв и аитигеня я прои развития ирысы Нмчуьргнстохиничрсксю 0*ра»»в»»И®

се нормального ПАП-м^тоо)

срок (уровень { сро}а

•орт» ) тия«еоп 1и кштач-{ и»* | трубки

П(1яос1т1 миищы

11 {группой дней I 0/у (хвосто-р»Эви-1 вой тип |

НЛЛТОИ I)

вентраль -ной част*

15 |грулноп

пива 1 в/У I раэеи~(уровень тип | пеней«

I

I I

I */-

( пкпевоо (и тра*вя

16 |голоса вмей | -вея в/у | развН'| тия {

(

1в (грудной дней I В/у I разам- '

| желудка | •ки»еч-) ьнка

(уровень ( сарлиа

I ♦/1 ПУПОВод (и трахея |(гя»пко-)мншечныЛ ( слоА)

I 1

| кымеч*<ий (спой »е-( луцк« 1 (

((гладио-{мдоечм^Й | спой

НЛрИЙ ребра

брписи, крупные сосупв

КГЗЯ'ХИИЯ

конечностей,

( 10 1 вея ] ( яне(\ ( 1 1 в/у (оерхуи-1 |рязвн' | ка сер- ) ) тия | дна 1 1 1 1 -<<

1 1 I «еяуяо- 1 »

Iсерлцз 1

|уровень( (легких-! |-иеч«ни| *

ипворо! I ♦

пери*о ярив

ребер

дерма

евряие, перикард

( ♦ отяель-|нищевел, мые кле-[ киа'ка

-тки со ) стороны ) адвент«- 1 1№И |

I

ТО *<> |

I I

герлпе, !«• РИ* вря

то

\ */-( кишка / (глвяно-)нмшечныЛ 1 слой)

»» )

1

печень

аерма

-

уровень

дерма

кпетии

уровень

дерма

перм«

серпив, )<*ри««рп

у «оо

происходит при переводе клеток в культуру и первичном г у льтприронатш.

Оказалось, что VCAM 1 - положительные клетки впервые наннлнются ка 2-3 дню культивирования и затем, по мере роста культуры, число их возрастает.

Как полагают, в первичной культуре на 3-5 день происходит модификация фенотипа ГМК и вступление их о активную пролиферацию (Campbell, 197У, 1981). Постепенное накопление VCAM 1-положительных плеток о такой культуре может указывать на связь экспрессии VCAM 1 С одним из указанных процессов.

В связи с этим мы проследили судьбу АГ-лоложителышх клеток н первичных культурах, при выращивании в различных условиях, с'бесиевающнх, прежде всего, различный уровень пролиферации : ГМК ьысеиали и среду DMTM (Flow), содержащую 10% фатальной сыворотки (ICS), «ибо и среду с 5% сыворотки крови крыс (гомологичная сыворотка HS), либо ц среду с 5% сыворотки, полученной из плазмы (PUS), т.е. лишенной сывороточных митогенов.

Рисунок 4. Кривые роста первичных культур ГМК аорты крысы. Клетки выделяли из медии аорты крысы (I мг/мл коллагеназы Worthington, США, и 0.5 мг/мл зластазы Serva, ФРГ). Начальная плотность посадки - 4,104/'см2 о среде ЕМЕИ с соответствующей сывороткой: FCS - фетальная сиворотка теленка; НЗ - гомологичная сыворотка (крысы); PDS - сыворотка, полученная из плазмы (Plasma-Derived Scrum).

Сравнение кривых роста (рис.4) таких культур показывает, чк> увеличения числа клоток в среде с 5% PDS практически но пропс' ходит, тогда как о среде с 5% HS или 10% FCS клетки вступали н логарифмические фазы роста на 4-й день культипиропанин. Крипт' роста соответствовали данным по включении меченного тимидина. При импульсном введении ^Н-тимидина на 4-й день культивирования количество меченных клеток в среда с 5% PDS составляло Я-1056, л па последующих сроках не превышало 5%.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток антителом Ы показало существенное отличие динамики накопления АГ-положителькцх клеток в таких культурах (рис.5). Так, при обычных условиях культивирования (10ÍS FCS), АГ-положительные клетки появлялись на 2-3 сутки, а затем число их возрастало к 7 дню до 40% (от обоцого числа клеток). В среде с 5% KS также происходит постепенное возрастание числа VCAM 1-положительных клеток, хотя на всех исследуемых сроках их содержание было ниже, чем при культивировании в присутствии 10% FCS, и к 7-ому дню не превышало 25%. В культуре, выращиваемой в среде с 54 PDS, АГ-поэитивные клетки на 7 день cocían

40

30

М го

и ю

\о

ON

Hh

2 4 . 3

enmv шьштшшя

p-IO%FCS Ц — 3%PDS

ÉL

Рисунок 5. Накопление LI-положительны* клеток при первичном ультивировании ГМК из медии аорт крыс при различных условиях оста. FCS - фетальная сыворотка теленка; ÍÍS - гомологичная ыэоратка (крысы); PDS - сыворотка, полученная из ппэзмм (Plasroa-er1ved Scrum).

ляли лишь 5%. Полученные результаты указывают на корреляции двух процессов, происходящих в клеточных культурах - пролиферацию и экспрессии клетками VCAM 1 1.

Следует подчеркнуть, что, как уже упоминалось выше, согласно точке зрения некоторых авторов, пролиферации предшествует модификации фенотипа, которая, как полагают (Campbell, 1981, Thybcrg, 1983) происходит и первичной культуре в одни и те ао сроки, независимо от присутствия в среде ростовых факторов сыворотки. Иными словами, и в среде с 536 PDS, и в среде с 10% FCS клетки на 3-5 день имеют модифицированная фенотип. То есть, согласно нашим данным экспрессия VCAM 1 строго не сопряяеиа с морфологической модификацией, а дополнительно регулируется иными факторами. .

Нельзя исключить, что для экспрессии VCAM 1 необходимы медиаторы, содержащиеся в сыаороткс. Возг-юясно также, что корреляция экспрессии VCAM 1 с пролиферацией отражает зависимость экспрессии молекулы адгезии VCAM 1 от плотности культуры. Косвенно это подтверждается нашими наблюдениями (иеопу5ликованниа данныо) об ускорении экспрессии VCAM 1 в культурах, высаяенлмх с высокой плотностью (экспрессия VCAM 1 отмечалась уже на 1-ыр сутки после посадки). Специальное исследование показало, что экспрессия VCAM 1 не связана с фазами клеточного цикла.

Экспрессия VCAM 1 при деэндотелиализации сонной артерии крыс

Как следует из вышеизложенного, VCAM 1 - молекула адгезии, которая транзиторно экспрессирована в ходе нормального развития на гладкомишечных клетках сосудов, но сохраняется лишь на небольшом их числе во взрослых артериях. При культивировании, однако, VCAM 1 реэкспрессируется ГМК, причем представлена на их поверхности íí процессе длительного культивирования.

Известно, что и нррме io vivo ГМК не вступает и активную пролиферацию. Однако при экспериментальном повреждении сосудов (в частности, деэндотели^лизации луминальной поверхности артерии), репарация сосудистой стенки связана с пролиферацией и миграцией ГМК, формирующих локальное утолщение интимы (или неоинтиму) (Кауфман, 1979, Fishman и др. 197Í; Clones и др.' 1983).

I Аналогичное з&кввчениа позволяет сделать и иные эксперименты, связанные с изменением уровня пролиферации и экспрессии LI «нгнгеиа, проведенные нами и изложенные в нашей работе (11).

В нашей работе мы предприняли попытку исследовать экспрессам VCAM 1 при формировании неомнтимы. Были использованы две различные модели деэндотелиализацин сосудоо - повреждение с помощь»; баллоного катетера (носящее более ограниченный характер) (Cloners и др. 1983), а также модель высушивания эндотелия с помощью потока воздуха, который прокачивали через изолированный сегмоиг сосуда со скоростью 30 мл/мим (согласно методике, описанной Feit-Verguil и др. 1983). В последнем случае степень повреждения сосудов более значительна.

В обоих случаях воздействию подвергалась левая сонмам артерия крыс. Правая от тех же животных служила контролем. Эксперименты проводили на крысах-самцах линий Wistar-Kyoto и Spragnc-Dawley. Методические детали описаны в нашей работе (26). Сосуды исследовали с 0 часоо до 30 дней после повреждения.

Для оценки связи между процессами пролиферации ГМК п сгонке; поврежденного сосуда и возможной экспрессии VCAM I, било проведено авторадиографическо«з исследование с использованием ^Н-ттшдина в сочетании с иммуиогистохимическим окрашиванием срезов аПтителим Li на разных сроках после повреждения (модель высушивании эндотелия: со 2-го «о 30 день).

Были получены следующие результаты: подсчот числа моченых клеток на срезах правой (интактной) сонной артерии (от 5 оперированных крыс) показал, что при импульсном меченый (тимидии вводили за 2 часа до забоя животного) лишь 1 клетка на 2-3 тысячи включает эН-тимидин, и количество VCAM 1-положительны* клеток не превышало 0. 2%.

Иммуногистохимическое исследование показало, что при обоих вариантах повреждения VCAM 1 начинает экспрессироватьсл на сохранившихся клетках медии достаточно рано - через 15 часов посяо операции. Количество АГ-положительных клеток о сохраняющейся медии при этом достигает 50-60%.

Одновременное использование авторадиографии и иммуногнето-химии при повреждении методом высушивания эндотелия выявило следующее: через 2 дня после повреждения количество АГ-положит^льны*< клеток также, как и через 15 часов, насчитывало SO-f>0% от медиальных, клеток включало меченный тнмидин, причем

•а

оказалось, что включается как в аитиген-положнтельнио, так и

ц антиген-отрицательные клетки.

Таким образом, ГМК оперированных артерий можно было ртзде-

Таблица Относительное содержание (%) меченых ^Н-Т н оьрлшепних МКЛТ 1Л клеток а медиальном слое сонной артерии на различных сроках, поело деэндотелиэации.

N пни классы клотск

,,.нио г • после меченые 1Л-поло*и-

иого операции 1.1 ~7 1Л~Т + 11* Т" т+ 3И- т тельные

1 ■■> 2 41 . Ч 5. 9 47 . 0 5 . 1 11 . 0 52. 1

>0 2 35. 5 5. 8 53 . 7 5 . 1 10 . 9 58. 8

2 7 4 37. I 7. 7 50 . г 5 . 1 12 . 8 55. 3

2» 4 34. 6 Ь. 5 55 . 3 3 . 6 10 . 1 58. 9

30 7 79. 6 2.8 1 6 . 1 1 . 5 4 . 3 17. 6

3 3 • 1 35. 8 4 . 9 54 , 3 5 . 1 10 .0 59, 4

34 ' 14 90. 6 0. 4 а . 8 0 . 2 0 . б 9. 0

и «!. 0 0. 5 18, 3 0 . 2 0. 7 18. 5

3 1 4 91 . 1 0. 1 8. <5 0 . 2 0 . 3 '8. 8

2 1 .10 95. 8 0. 3 3. 9 0. 1 0 . 4 4.0

2 1 зо 87. 5 о: 2 12 . 3 0 . 1 0. 3 Ц. 4

/шп. на 4 класса клеток: АГ-отрицатолыше, не включившие ^Н-Т (1.1~Т~), ат пген-о! ркцательные, включившие ''Н-Т (1Л~Т+), антигении 1ю*ительнио, па меченные (11*Т~), и антиген-положительные и м^чепнио одновременно Клетки веек 4-х классов вылаля-У'Т^н и на более поздних сроках (табл.3).

Иосгеиешю, к 7 дню после операции, начинает формироваться ш'оштма аа счет миграции подлежащих медиальных клеток через внутреннюю эластическую мечбрану, а к 14 дню, в случае модели имсушивамии, неоинтималькос: утолщение оказывается почти ■ & |рииро1Ш1|1им, а в модели баллоной катетеризации - неоинтима .-формирован.» полностью. Уровень включения ^Н-тимияина в неоинтиме и иориом случае неписок, меченными оказываются от 0.7% до 3.8% кпигон. Количество УСАМ 1-положительных клеток составляет: в щи ими чг 4.24% до 11%, в медии - 9-18Я.

Следует отметить, что при повреждении с помощью баллоного |с;*т<л ера к 14 ;;и» антиген не выявляется практически ни и медин, ¡щ ч нсоин 1 икк: (за исключением клеток, прилежацнх к просвету гпада). 1) случаи повреждения с помощью потока воздуха, уменьш-£ мно ьолмчис | н<* как УСАМ 1-положительных, так и включающих ЛН-Т

клеток происходщит к J0 дню (3Н-тимидии включает О . 7 Ч'í.- I . 1 "Í клеток мнтимы, а 9%-11% окраииваптсп антителами LI).

Приведенные результаты покаэгшают, что молекула уцгезии VíMff 1 экспрессируется в клетках медик сонных артерий крыс в orner на повреждение эндотелия. Экспрессия при этом происходит в эначи* тельном числе клеток и в достаточно короткие сроки.

Следует отметить, что in. vivo (как и in vitro) наблюдается корреляция двух процессов - пролиферации ГМК и экспрессии VCAH I в процессе формирования интималыюго утолщения. Это потттпержд.ю г высокий и достоверный коэффициент корреляции между относительным содержанием в медии поврежденных сосудов меченых клеток и относительным содержанием VC АН I-положительных клегок (г =0. '<[.■>, р<0,001).

Однако, как установлено, в пролиферацию в отгют на повреждение ' эндотелия вовлекаются, по крайней мере, дно субиоиулинии ГМК (относительно их способности зкепресеирояать VCAM 1). Волео того, как следует из данных, припелепных в таблице 4, число

Таблица 4. Относителыюе содержание меченых ^ií-T клеток it субпопуляции L1-положительных и L1-отрицательных клеток п медиальном слое сонной артерии на различных сроках mocííí* деэндотелизации. Достоверность различий определяли с г/омощьп -критерия Фишера; н.д. - ралнчия недостоверны.

N дни % печеных клеток % меченых клеток доетонпр-

живот- после среди LI-положи- среди Ll-отрица- IfOCTt,

ного операции тельных 7 елышх pa ijnruú't

19 2 9 . RI 12. 30 н. д.

20 2 8 . 70 13. 95 p<0, 01

27 ■4 9 ■ '"i 17. 09 p<0.00 1

28 4 fi . 16 15. 73 ¡1С0. 001

30 7 f! . 68 3. 37 p<0.00 í

33 7 8 . 5 J 12. 05 p<0.05

34 14 2 . 38 0. 47 p<0. 05

35 1 4 1 . 06 0. 60 H. Д.

36 ) 4 2 . 20 0. 0 5 p < и. ma

2 1 30 1 . 85 0. 3 1 h. л.

22 )0 0 . 3 9 0. 22 H. Д.

меченных тимпанном клеток (т.е. уровень пролиферации) сиза среди niiTurcii-иигатншш, чем среди антиген-позитивных клеток.

Эти данные косвенным образом указывают на возможную разницу лролифоратииного поведения VCAM 1-позитивной и VCAM 1-негативной tубноиупяций. О существовании среди ГМК сосуда субпопуляций с различимы характером пролиферации свидетельствуют данныа некото-рих авторов (llaudenshild, 198S), а таксе наши собственные. Так, нами било показано существование по крайней мере двух с:убпопулнций ГШ! среди клеток аорты крысы, отличающихся по уровню пролиферации (9).

Как било упомянуто sms, экспрессии VCAM 1 в клетках эндо-1слпя может быть индуцирована 11-1 или TNF-альфа. Источником данных факторов могут бить активированные мононуклеары крови. Если ирииы ь ио внимание, что VCAM 1 экспрессируется избирательно только одной из субиопуляций ГМК, участвующих в репарации сосуда, то можно предполагать, что либо регуляция экспрессии VCAM 1 в ГМК определяется иными медиаторами, либо среди ГМК существуют субпопу лнцмн различные чо характеру днфференцироаки и одна из них не способна экснрессиронать VCAM 1. В пользу последнего предположения свидетельствуют некоторые данные, полученные в последние годи (см. обзоры Schwartz и др. ¡990, Majesky, Schwartz 1900).

Авторам удалось выделить из аоргы новорожденных крыс две различны* еублопулнции ГМК. Клетки различались in vitro по форме, по зависимости их пролиферации от присутствия в среде ростовых факторов, по способности продуцировать ростовой фактор типа тромбоцитарного, Эти два типа клеток сохраняли разницу по упомянутым признакам в течение многих поколений в культуре. Оба типа имели синтетический (модифицированный) фенотип. Клетки отличные но форме и способности пролифорировать в бессывороточной среде, получили название "pup SMC", тогда как другая популяция была пазиана "взрослыми" ("adult SMC").

"pup SMC по некоторым признакам, как было показано (Reidy и др. 1986), сходни с клетками из неоинтимц дезндотолнзооаниых сосудои (клетки выделяли через 14 дней после повреждении и перепилили в культуру). Это дало возможность авторам полагать, что за репарации сосудов, а также структурные изменения при патологии может ешь ответственна особая субпопуллция ГМК, имеющая "pup" фенотип.

Исследования "pup SMC" и неоинтимальных клеток было прове-

депо нами методом инмуноблогтинга с использованием антителя LI. (Клеточныо культуры били люйоэио продостаплаии доктором Schwartz. Сизттл СЭа).

Оказалось, что антитела LI нэ гшлвляот VCAM 1 молекулу ни в тех, ни в ииих клотках, тогда как "uapocjiue" ГМК демонстрировали полохнтельнуо реакцка (оииплялся полипептид м.а. ПО кД). Даннин результат спидзгельстауот п пользу гетерогенности ГМК сосуда по характеру дигХ^реччирозки отдельных субпопуляциД и согласуется с шднеиэложоиными данники о различии моаду "pup" н 'озрослимн' ГМК.

Однако, согласно результатам наших экспериментов, о pj/ia-

16* tOsia

кхя&тртзх U

ясяц&гг\яацят> li

Рисунок б. Сравнаниэ цитотоксичаского дойстяия нмыукогокенна (ИТ) на ГМК (заштрихоолнные столбики), и на клетки «ккии 1>К-2 [незаполненные столбики). А - ИТ-1.1; В - НТ-МОРС (меспэцифическив штитела); В - МА-1Л; Г - рицин.

рации сосуда и формировании нвоинтмми участвуют, по крайней мере, пио субпоиуляцин ГМК. Если предположить, что VCAM I-негативная с убпо it уллиип представляет собой клетки "pup" фенотипа (что требуот дополнительного изучения), то нельзя согласиться с мнением о ик исключительной роли в формировании локального улолщення сосудов.

Известно, что клотки медии яеэндотслизовашшх сосудов подвергнется модификации фенотип (Gabbiani, 1991). В частности, в них значительно уменьшается содержание цитоскелетных белков, в кш числе - маркеров сократительного фенотипа ГМК. Экспрессия у т и и и клетками м опекуны VCAM 1 через 15 часов после поорежд&ни'Я. сосу/зол, а также наличие молекулы VCAM I на длительно-культивируемых ГМК, позволяет отнести молекулу VCAKi 1 к маркерам модифицированного фоиотина. Причем, учитывая приведенные выше данные, к маркерам модифицированных "взрослых" ГМК.

Взаимоотношения 'pup" и 'взрослых * ГМК представляют особый интерес и требуют внимательного исследования.

Следует отметить, что антитела к антигену одной из субпопу-яяиии могут служить для этого очень удобным инструментам. Данное исследование выходит за рамки настоящей работы, однако следует оговориться, чго проведенные нами эксперименты позволяют оценить перспективность полученных антител. Моноклональные антитела L1 были использованы и качестве вектора в молекуле иммунотоксина (с качестве второй части о гибридной молекуле использовали А-цепь рицина). In vitro была .показана избирательная элиминация антиген-положительных «леток (рис.6). Более подробно результаты изложены га нзшлх работах (4,13,17).

II. ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ'ГЛАДКИХ МЫШЦ КРУПНЫХ АРТЕРИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА ПРИ ГИПЕРТОНИИ

Анализ содержания гиперплридных ГМК в аорте человека и крыс

Как у*е было отмечено, структурные изменения крупных артерий при гипертонии иыражеиы » общем утолщении стенки сосуда (и отличие от локального, описанного нише). Предполагают, что в основе таких изменений лежит гипертрофия ГМК, связанная, в частности, с ио/кЦ!лоидиэацмей ИНК и усилением вследствие этого синтетических способностей клеток (Schwartz и др. 19 8 6, Uwens D82).

фзрмоптатиано изолированные» ШК из недин аорты 5-1 и наспчнич крыс линий Wistar-Xyoto и SHR били проанализированы нами iu» содержание ДНК (рис.7). Очевидно, что сосуды гипсртемзипиыч аи-потных характеризуйте?! значительным, по сравнены» с нормотензи-вными, содержанием тотраплоидных клеток ("24S и I l'i, еоотпотстпсн-но). Следует отметить, что не удалось зарегистрировать догм) верны» количеств клеток с содержанием ДНК 8С, а тамжо клотик, находящихся о S фазо клеточного числа (с содержанием ДНК промежуточным кожйу 2С и 4С).

Приведенные результаты лоятверядайг, что накопление» rimep-плоидных клеток в стониэ крупных артерий - реакции специфичная для гипертония. О специфичности выявленной реакции дли гипортоини говорит тот факт, что аналогичный изменами» отмечены дли различных моделей гипертонии, а но только для спонтанной ((.Urns,, Schwartz, 1932, Owens 1985). При этом показано, что н»яил:1>'.ь.и« тетраплоиднно клетки - истинно полиплоидны, а на находится >s О, фазе клеточного цикла (Goldberg и др. 1 984, Hoscn, I •> s 3 ) . Отсутствия в исследуемых нами образцах клоток с нроможуючнкм

Рисунок 7. Анализ содержания тетранлондпых клеток в малин рты нормотонзивных м спонтанно гипертенэивиых крыс. *•" -стиверно больна, чем в случае нормотонзивных крыс (р<0.001). 11 авоИ части рисунка - профили содержания ДНК в ферментагинно эпироианных ГМК из аорты нормотеиэишшх (А) и спонтанно пни-р-13ивных крыс (Б).

значением содержания ДНК (2С-4С, т.о. о 5 фазе цикла) также свидетельствует » пользу данного положения.

Анализ содержания ДНК в ГМК аорты человека проводили в суспензии клеток, омдепенных отдельно из медии или из интимы (Методические детали описаны в нашей работе (2 3)). Было проанализировано 44 образца аорт от доноров в возраста 25-69 лет. П большинстве образцов не удалось зарегистрировать достоверных количеств клеток с содержанием ДИК 8С.

На рисунке 8 суммирована данные по процентному содержанию то1раплоидных (4С) клеток в нормальной аорте, в аорте с птеросклоротнчоским поражением и в аорте при гипертонической Оопьэнк. Очевидно отсутствие достоверных отличий в содержании тетраилоидныч клеток в слоях нормального и зтероскяеротического сосудов как о интиме (12% и 11%, соответственно), таи и в медии (13г и 14®, соответственна). По количеству тетраплоиднмх клеток резко выделяется популяция ГМК из сосудов доноров, в анамнезе которых значится гипертоническая болезнь: и в медии и в интиме тпних аорт обнаруно около 20% 4С клеток, что достоверно выше, чем в нормальном или атеросклеротическом сосудах (р<0.05).

Рисунок 8. Анализ содержания тетраллоидных клеток в медии и китиме аорты человека в норме и при сосудистой патологии. ' -достоверно больше, чем в нормальном или атеросклеротическом сосуде (р<0.05).

Рисунех 9. Анапчз содержания тетраплоидннх кяотсн а модни и интимо различных ysacTKOs горти человекв. * и ** - лостокорио Меныгэ, чем в других участках (¡>¿0.05 и pcO.Ol cdotbotctucikiu) .

3 нормальных сосудах Сити отдельно исследованы участки, uti-далонпио по длине г.орти, согласно схема, предлоаенноЯ Корнхияяом (Cornhill, 1974), и соответствующие зона«, так называемо "повышенной" и "пониженной" вероятности атеросклероза (Cornhill и яр. 1985). Сущвстоешмх различий по содержания 4С клеток в исследуемых зонах на обнаружено (рис.9). Последнее, подтверждает "гипертоническую" специфичность выяапешшх изменений.

Гипертоничзские и возрастные изменения сосудов человека миевт однонапрявпетшй характер

Исследоаанча содержания тотраплондных клеток ц аорте чело-¡ек» в зависимости от возраста (рис.10) показало следующее: колн-ество тотраплондных клеток в медкн аорты увеличивается от 1 Iii » J-летнаы аозраоте до JS'S - а 70-летиом (данные аппроксимированы рлмоП линией. Коэффициент корреляции - 71%). В случае интимы ортм человека апрокснмируоцал линия имеет тог же характер коэффициент корреляции - 65%), количество' теграплоидных клеток

Рисунок 10. Анализ содержания тетраллоидных клеток в аорте человека. Зависимость от возраста. Данные апроксимированы прямой линией (г - коэффициент корреляции).

изменяется с возрастом от 10% до 17®. Следует подчеркнуть, что достоверных количеств клеток в Б-фаэе клсточного цикла в анализируемых образцах обнаружено не было.

Нам впервые удалось зарегистрировать процесс накопления тетраллоидных клеток а аорте человека при гипертонии. Следует особо подчеркнуть, что гипертонические и возрастные изменении в аорте человека имеют однонаправленный характер (аналогичные данные о накоплении тетраплоидных клеток с возрастом у человека получены Barrett, 1983).

Этот факт позволяет предположить, что в норме постепенное (в зависимости от возраста) накопление тетраплоидных клеток - способ ограниченного обновления популяции ГМК. В случае гипертонии тот *с процесс происходит в короткие сроки. Если данное предположение верно, то среди ГМК сосуда, по-видимому, должна существовать субпопуляция, ответственная за обновление ткани в норме и за гипертоническую реакцию при действии определенных стимулов.

Как уже било описано выше, г» нормальных взрослых сосудах присутствует значительное количество ГМК, способных включать меченый тимидин (т.е. нзхолящихсл в S $азе клеточного цикла). Мы

предприняли попытку исспедопать особенности пролифератионого поседения данной субпопуляцни.

Пролифюратипноа поведение субпопуляцни ГМК, способных аклвчать меченный тймияин in vivo

Зкспериианти проводит« по 2 разним схемам: 1. клетки фврмчц-тативнэ иэолироэалн и полученную взвесь инкубировал» с мочении» тимидином; 2. полоски медик инкубировали в изотопом, а затем феркаитатиено изолировали клетки.

В экспериментах, проведенных по двум различным схемам, результаты сказались аналогичны. Для балов полного и быстрого прикрепления клеток, видоленну» суспензию наносили на. стекла, покрытые поли-L-лизином. Оказалось, что популяция свежевыпэпвннмх ГМК мз аорты нормотензнпиих (Wiatar-Kyoto) крыс содержит 0.3« меченых тимидином клеток. Эти результата совпадаат с результатами других авторов (С1о»еч н др. 1983, Tacha, ¡Uidy 1987), а так»е <; кгдшми собственными (изложениями su::a).

П случпи аорта человека, данная субпопулпцня составила 0,07®, а в аорто гипортенэивных крмс (SÜS) о»а оказалась крзПно МЗЛОЧИСЛеНИЗ - ИЭЧЧКиЯН Cu/tH ЛИШЬ ОТДОЛЬНЬ'З клетки.

На проследили поведение вклгзчияших предшественник синтеза ДНК субпопуяяциП в порвичноП культура. Результат эксперимента!« лрадстеадоки о таблицах S и 6.

Было установлено, что в случае культнвнровпния клеток аорты нормальных крыс фактическое количества меченых клеток при культивировании в течение 6 суток возрастало лишь в 2 раза, в то время как об'-чзе количество клеток увеличилось за это время и 11 раз. Одновременно с этим, количество меченых двуядерных клеток н культуре возрастало 9-кратно, так что к 9-ому дню культивирования более S0% кечзннх клеток становились двуядерными. В случае культивирования ГМК, выделенных иэ аорты челсоока, результаты также подтвердили существование иодлонно обновляющейся субпопуляцни клеток; фактическое количество меченых клеток в этом случае уво-личилось в 2,$ раза в течение И дней культивирования, тбгдя как общее количество клоток За этот жо период возросло a 9 реэ.

Полученные результаты павт возможность прэдпояагать, что, по крайней море, часть клеток данной субпопуляции 'комитирована" и сторону полиплсиднэоцин . Это подтверждает наше предполо*ениа о гом, что попиплоидизацил может быть способом обновления популяции

Таблица'5. Первичная культура ГМК из нориотенэноных крыс. Мочение соезкевыдоленных клеток ^Н-тимкдином (104 Ки/мМ, 6 мкКи/мл н чеченце 3 часов). Изменение процента и абсолютного количества меченых клеток при культинировании, • - достоверно больше, чем на 3 сутки культииироаакич (р<0.05); - достоверно больше, чем на 3 сутки культивирования (р<0.01).

Дни культивирования

................з........ 6....... "ч......

Плотность культуры 3600 ± 400 30000 +. 6900 62500 ¿ 6100

/2 ~ (клеток на см

ростовой площади)

Процент моченых клеток

1. 34 ¿ 0. 2 6 0.35 i О.Ю 0. 20 + 0. 03

Количество меченых клеток на см* ростовой площади

48 i 13

105 i 39

124 ± 23

Процент меченых двуядерных клеток

0.21 + 0.09 0.08 + 0.08 0.12 ¿0.07

Количество меченых /шуядерных клеток на см ростовой площади

8 + 4

24 i 24

75 ' 44

ГМК в норме, а выявленная субпопуляция ответственна также за структурные изменения сосудов при гипертонии. В пользу такого эаклочеиия косвенно говорит и тот факт, что подобная субнопуляцня (способная включить ^Н-тимипин in vivo) крайне малочисленна в сосудах спонтаниа-гипартензивных крыс. То есть, в том случае, когда количество тетраплоидных клеток в сосуде.»елико, данная субпопуляция, возможно, уже исчерпана и коде предшествующих гипертонических изменений.

Согласно гипотезе о модификации фенотипа ГМК (Campbell и др. 1979), последняя исегда предшествует пролиферации. Полагают, что клетки, вступающие в клеточный цикл, должны иметь синтетический (модифицированный) фенотип. Как было показано выше, ГМК аор)ы крысы модифицированного фенотипа экспрессируют VCAM 1. Следует

Таблица 6. Первичная культура ГМК нз мсдии аорты человека. Мочение спезерыделенных клеток ^Н-тнммликоч (22 Ки/мМ, Э икКи/мл а течение 48 часов). Изменение процента и абсопатиого количества меченых клеток при культивирований. * - достоверно больше, чем на 2 сутки культивирования (р<0.05). ч

Дни культивирования

2

7

14

Плотность культуры 2300 i 450 9S00 £ 1060 13600 +. НО (клеток на см^ ростовой плетцади)

Процент меченых 0.070 + 0.012 0.033 + 0.016 0.025 X 0.013 клеток

Количество маченых клеток на 10 см' ростовой пно*чади

16 £ 4

31 ± 16

» ±. 18*

подчеркнуть, что мы не обнаружили корреляции между способность» ГИК вкяочать •'н-тнмидии in vivo и экспрвссиропать VCAII 1. В первичной культуре пролиферации меченой in vivo субполулчцнн также на сопроаоадалось экспрессией VCAM 1.

Это еие раз указывает на нозмояну» функциональную гетеро--аннасть ГМК н разноиапрааланность реакций отдельных субпопуляций глоток при различны* структурных изменениях стенки сосуда (в 1астности, при локальном и об:цеи утолщении).

III. МЕДИАТОРЫ ГИПЕРТОНИЧЕСКОГО ОТВЕТА ГМК: Н0Р\ДРЕ1Ш1ИН И А.НГИ0ТЕНЗИН II

В настоящее Время обсуждается несколько кандидатов в медиа-оры гипертонического отоета ГМК, среди ноторых катохоламиии известно, что мч уровень существенно повншен при гипертонии), а »Кае ангиотензнн II.

С цель» изучения этого вопроса, нами были проведаны экспоненты по влиянию данных агентов (а также ряда агонистов и анта->нистов адренорецептороп) на изменение содержания 4С клеток о пер-1ЧИОЙ культуре и субкультуре ГМК медии аорты нормотенэипных крыс.

3S

Норадреналин индуцирует полиплоидизацко ГМК через синергизм даух систем вторичных посредников

Результаты экспериментов ло культивированы» ГМК в присутствии НА суммирован:! в таблица 7.

Оказалось, что НЛ, действительно, может оказывать влияние на пролиферацию ГМК, причем вызывать гипертонический ответ, а именно - полиплоидизвцнв части ГМК in vitro. При культивировании ГМК в присутствии 1С ккМ НА достоверно (приблизительно в 2 раза) возрастало количество тетраплоидных клеток.

Дли того, чтобы доказать, что накапливающиеся в культуре тетраллоидные клетки являются истинно полиплоидными, субггапуляцио клеток с содержанием 4С выделяли, и исслодовалн ее проли-фсративное поведении in vitro. Для выделения 4С субпопуляции ГМК использовали последовательно: обогащение в градиенте сахарозы и сортировку с использованием проточного цитофлуориметра FACS II (подробно методическая часть представлена в нашей работе (19). Отсортированную субпопуляцию культивировали в нормальных условиях и через 14"часов (время достаточное для вступления клеток в новый клеточный цикл и прохождения S фазы) анализировали содержание о клетках ДНК.

Сравнивая профили ДНК, полученные непосредственно после сортировки и после культивирования, вычислили долю клеток 4С субпо-пуляцни, вступниших в митоз за время культивирования (рис.11).

Анализ показал, что количество истинно полиплоидных клеток при этом составляет 80% от всех тетраплоидов; В контрольных культурах нх количество не превышало 35%. То есть, в пересчете на общее количество клеток в культуре, содержание полиплоидных клеток о 5 раз увеличивалось под действие« НА. Следует отметить, что истинно полиплоидными, в данном случае, мы считаем клетки, либо задерживающиеся в G2 фазе цикла, либо вышедшие из него.

Известно, что катсхоламины оказывают воздействие на ГМК через 2 типа адренорецепторое: альфа и бета (Hirata и др. I9SS). Использование в наших экспериментах антагонистов альфа- и бета-адренорецепторов (фентоламин, пропранолол) показало рецептор-опосредованный эффект НА на полиплоидизацию ГМК, причем он иоги-бнроэался полностью только при соцместном действии ат.фа- ч бота-пнтагонистов.

Связывание агогшста с бета-рецептором ведет к активации аде-ннлатциклазы и последующему повышению уровня внутриклеточного

Таблица 7. Культивируемые ГМК из кодии аорты норыотоиэианич крыс. Иэманешкз процента 4С клеток при длительном действии <5 суток) различных агентоо. Таблица суммирует результаты нескольких однотипных экспериментов,(первичная культура и субкультура); и каждом' эксперимент вычисляли разннцу а проценте 4С клеток между культурой, подзергавиейся воздействию" агента, и контрольной культурой; по нескольким таким величинам оычислнли сродное энпчемнв и стандартное отклонение. 4С клэтки в контрольной кулътур,э составляли 5-10'8. * иди •• - достоверно больше, чем в контрольной культура (р<0.05 или р<0.01 соответственно).

Qffii'iOCTBa среднее разброс

ÜA 100 нМ 0. 9 1.0

НА 1 ичП 1.8 0. 5

НА 10 мкМ 8. 7 3. 4 » «

НА 1 мк!4 пролранелол 10 мкМ 1. 9 0. 5 •

НА 10 мкМ пропранолол 5 0 мкМ / 5. 1 0. 8 * •

НА 1 кхИ фэнтолзмиц 10 мкИ 2. I 2.0

НА 10 мкИ фзитолзмнн 10 ккН 3. 2 1.3 *

НА 1 кк)| нропрзко.чоя 10 мкМ фентоламии 10 мкМ 0. 5 0.4

ИА 10 нкИ прспранолсл 10 ккМ фентоламин 10 ккМ -0. 5 0. 2

изопротгрзнол 1 ыкИ 2. 1 0. 5 •

нэопротсфонол 10 мкН S. 8 2. 9 ч

нзопроторенол 1 икМ пропранолол 10 мкМ Э. 8 0. 9 *

нзопратеряцол 10 мкМ пропранапоя 10 мкИ 6. 2 1. 3 * •

адреналин 1 ккМ 1.6 0. 6

адреналин 10 м.чМ 5. 1 1. 9 • •

5>энилэфрин 1 кк(1 -0. 4 0. б

^внипэ>|рмн 10 икИ 0. 7 0. 3

<ланнди>1 10 мкМ 0. 1 0. 5

'СрСКОПИН 10 н!1 -0. 5 0. 0

>орсколиц 100 нМ 0. J 2.0

юрскопнн 1 ик.М 0. 7 1. 8

•МА 0. 1 нМ 0. 5 0.0

МА I нМ 0. 0 1. 2

МА 10 кМ 0. б 2. 3

орскодйн 10 нМ <!>!.!А 0.1 НМ 1.3 0. 6

орскояин 10 n!J ФМА 1 н!1 0. J 0. 0

орсколии 10 ll!,i ФМА 10 иМ 2. 4 0. 2 • *

эрсколкн 100 нМ С.ЧА 0. 1 нМ 0.5 1. 8

зреколин 1Q0 líM 4МА 1 нМ 2.4 1. 3 *

эрскопнн 100 иМ ФМА 10 нМ 3. 1 1. 8 •

зреколин 1 мкМ ФМА 0. 1 нМ 0. 4 0. S

>рсколин 1 мкЫ ФИА 1 нМ 0. 9 0. 5

>рсколии 1 икМ ФМА 10 нМ 0. 4 0. 3

Норадреяагош

Контроль

>, 49.4% —1 1 55Лх /и

1 ЗаВ* А- « 14.0%

79.7*

М&г.

Рисунок II. Гладкомышечные клетки из медич аорты нормотензи-вных крыс, 3-й пассаж. Профили содержания ДНК в отсортированных популяциях. ((Л (10 мкМ) добавляли ежедневно в течение 5 суток. Числа в верхних прагэых углах соотпетствуют доли тетраплоидних клотак. Числа внизу - доля полиплоидных клеток среди тотраплоицов, вычисленная по формуле

I

К''

отсортированной популяции и в той хе популяции после 14-часового культивирования.

где Д„ и Дк - доля тетраплоидних клеток соответственно в

цаМФ, который блокирует пролиферацию клоток (Вегг11^е, 1975).

В выбранной нами системе функциональные бста-адрекорецелторы выявляются при действии иэопротерепола или НА а сочетании с альфа-антагонистом а тесте на включение '^С-тнмндина: включение падает (табл.8). При этом дополнительный апторадиографический анализ показал о культуре меньший процент меченых клеток, то есть под действием НА происходит уменьшение пролиферативного пула ГМК.

Эти данные подтверждаются кривыми роста культуры - к 7-м суткам культивирования плотность опытной культуры составляла лкии 60% от контрольной. Интенсивность мочения (количество эере! серебра на меченое ядро) в опыте и контроле практически н< различалась.

Таблица 8. Культура ГМК из медик аорты нормотеизивных крыс (первичная культура и субкультура). Влияние различных агентов на включение '^С-тимиднна (50 мкКи/мМ, 0.5 мкКи/мл). Культуры выдерживали 2 суток,в бессывороточной сродо, а затем даяалн ростовую сроду с '^С-тимидином, 5% ЭТС и .тестируемыми пещсстпэми. Результаты нормализованы к включению в контрольную культуру 1 (100«; соответсвугаций счет составлял 7000-9000 распадоп/мипуту). *, ** или •** - достоверное отличие; от контрольной культуры (р<0.05, р<0.01 или р<0.001 соответственно).

вещества % оключения разброс

НА 100 ИМ 112 3 6. 6

НА 1 мкЯ 91 9 3. 3

НА 10 мкМ «1 0 2.7

адреналин 100 нМ 85. 8 7.6

адреналин 1 мкМ 65 3 12.2 •*

адреналин 10 мкМ 33 0 3. 8 •**

изопротервиол 100 нМ 68. 0 7.7 •*•

нзопротереиол 1 ккМ 61 г 18. 8 •

язопротеренол 10 мкМ 53 8 3.1 •••

фенилэфрим 1 мкМ 103. 7 5. 6

феннлзфрнн 10 мкМ 75 5 2.9

клонидин 1 мкМ юг. 1 .4. 6

клонидин 10 икМ 97 3 2. 7

НА 1 мкМ пропранолол 1 мкМ 101. 6 9. 0

НА 10 мкМ пропранолол 1 мкМ 108. 3 5. 6

изопротеренол 1 мкМ клонидин 10 мкМ 72 9 10.6 *

изолротеренол 10 мкМ клонидин 10 мкМ 81 1 3. 6 •

форсколин 10 мкМ клонидин 10 мкМ 112. 3 9. 3

форсколин 1 мкМ клонидин 10 икМ 99. 4 15. 1

форсколин 10 кМ 1 12. 3 V. 3

форсколин 100 нМ 86. 0 16 3

форсколин 1 мкМ 52. а 1 6 •

ФМА 0. 1 нМ 97. 7 1 1 Ч

ФМА 1 иМ 118. 1 1 9 '

ФМА 10 нМ 96 5 И 1

ФМА 0 1 нМ форсколин 100 нМ 87 'I 12 )

ФМА 1 нМ форскоимн 1 00 иМ 1 04 I) 1 ! (1 .

ФМА 10 нМ форсколин 100 нМ на. 5 9 Н

Возможно, что уменьшение пролиферативного пула при действии НА происходит за счет полиплоидизации и выхода в покой части пролиферирующих клеток.

Таким образом, эффект НА на ГМК реализуется через бета-адре-норецепторы. Однако, как упомянуто выше, действие НА блокируется только при совместной действии альфа- и бета-антагонистов.

Исследования альфа-рецепторов ГИК сосудов показали, что на их поверхности локализованы преимущественно альфа-I-рецепторы (liirata и др. 1985). Связывание агониста с альфа-1-рецептором приводит к активации фосфолипазм С, стимулирующей обмен фосфо-ннозитндов и последующее повышенно внутриклеточной концентрации Са^*, и активации протеинкиназы С. Активация последней - важный шаг в регуляции пролиферации (Anderson и др. 1985). В тесте на включение **С-тийидина не удалось.выявить увеличения включения при действии как альфа-агонметов (фенилэфрин, НА в сочетании с нропранололом), гак и прямого активатора протскнкиназы С-ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат).

Ранее нами было показано (неопубликованные данныо), что действие 10 мкМ НА приводит к незначительному увеличению концентрации внутриклеточного Са^* (на 25-ЭО нМ, в то же время действие ингиотенэина II повышает его концентрацию на 150-250 нМ).

Все приведенные данные свидетельствуют в пользу низкой активности альфа-1-рецепторов о рассматриваемой системе. Однако, так как НА реализует свой гипертонический эффект при участии альфа1-рецепторов, то можно предполагать, что данный тип рецепторов представлен только на части ГМК, которая и подвергается полиплоидизации под действием НА. Мы же оценивали эффекты агонистон адренорецепторов в общей (т.е. гетерогенной) популяции ГМК.

Лолиплоидизация ГМК под действием НА не блокировалась полностью бота-антагонистом пропроналолом. Использование активатора ьденилатциклйзы форсколина не вызывало полиплоидизацию ГМК. Однако, эффект совместного действия форсколина и ФМА был сравним с эффектом НА. Это свидетельствует о необходимости синергизма двух систем вторичных посредников для реализации гипертонического действия НА.

Из полученных нам» данных следует, что бета-агонист изопро-теренол вызывает эффект, близкий к эффекту НА. 'Это, казалось бы, противоречит »«сказанному предположению о необходимости

синергизма. Однако в литорэ-гуро имоэтся данные о тон, что илеточннй отает на иэопротереиол частично реализуется черед систему, специфичнуо для альфа-1-рецепторов (Shcrline и «р. 1984). Кроме того, обнаружена гетерогенность альфа-I - рецептором ГМК (Goldberg и др. 1984). Некоторые авторы вообще высказывают мнение о возможности действия ÍIA на ГМК через рецептор, отличный как от альфа-, так и бета-эдреморецепторог» (Bond и др. 1986). Таким образом, выявленная активность нзопротеренола не противоречат обклей схеме рассуждений.

Последнео, что следует откатить: используемая а наших экспериментах концентрация НА (10 икМ) существенно превышает физиологический уровень. Однако, имеются данные о гиперфункции симпатической нервной системе при гипертонии, и о возможной при этом локальной концентрации KA п синапсах около I мМ (Nara и др. 1985). Mu не молем искяячнть возможность воздействия in vivo на ГМК локально высоких концентраций НА.

Итак, НА действительно мояе-r бить одни» из медиаторов гипертонического отпета П<!К. Эффект НА реализуется через синергизм дзух снстеп оторичмих посредннкоз и блокируется только при одновременном воздействии альфа-1 - и бота-пнтпгоннстоп, то ость клетки, способном к гипертоническому ответу, по-видимому, вонзим отличаться определенном набором альфа-1- и бета-рецепторов.

При действии НА только часть клеток отвечает лолнплоилиза-цивй, что указывает из ограниченность субпопуяяцин ГМК, способних к подобной ¡«лоточной реакции. Это соответствует приведенным выше результатам о наличии в сосуде определенной субпоиуляции, возможно, ответственной за реализации гипертонических изменений зосудистой стенки. Представляется перспективным использовать <етод аоторздиографии с двойной меткой: для визуализации ювэрхиостных, рецэпторов и анализа содержания ДНК. Это позволило >ы локализовать данную субпопуляцнп в общем пуло ГМК.

Ангиотензин II не изменяет содержания ДНК а гладкомишечнык клетках

Известно, что помимо катехонаминоо, гипертрофии ГИК могут ¿зысшть и некоторые другие вещества, п частности, так наливаемы» агонисты сокращения" (contractail aponists), сря/иi которых шболее известен ангиотензин II (АН).

В проведенных нами экспериментах мы исследопани дейстние All

4 I

на ГМК в первичных культурах, полученных из аорт мормотензивных крыс (Wistar-Kyoto) ГМК культивировали либо в обычных условиях (среда роста DMEM с добавлением 10% FSC), либо в бессмвороточной среда Monome«J (CSL, Австралия), которая способна поддерживать клетки и стационарной фазе роста о течение длительного времени.

Результаты, полученные нами, были аналогичны в используемых условиях культивирования, к показали следующее: All в концентрациях от I nil да I мкИ (добавляли ежедневно в течение 4-х дней) вызывал гипертрофию ГМК, а именно: диаметр ГМК увеличивался в среднем на U'l. (Для измерения диаметра клеток в суспензии использовали Coulter Counter ZM, с последующей компьютерной обработкой данных). Причем, в отличие от НА, действие All не

сопровождалось изменением содержания в клетках ДНК,

i

Изучение связывания меченого лиганда - [ Н|-ангиотензина II с ГМК выявило присутствие одного класса высокоаффинных учэстковсвязывания (kd _ 5.6 пМ). Количество мест связывания лиганда Втах составлял 7200¿I500 участков/клетку. (Результаты были получены при изучении 3-х независимо выделенных культур).

Приподенные результаты демонстрируют наличие "медиатор-специфичности" в реакции гипертонического типа ГМК. Если в случае НА гипертрофия ГМК в основе своей имела полиплоидизацию, то при действии АН мы имеем дело лишь с гипертрофией, затрагивающей; по-видимому, только цитоплазму.

Механизм гипертрофии ГМК под действием All был частично исследован другими авторами, которые в недавних работах (Owens 1990) продемонстрировали общее усиление синтетических проиессов в ГМК в присутствии НА. В частности, обращает на себя внимание значительное накопление в клетках актина, в том числе его альфа-изоформы. Альфа-изоформа актина, как известно, является маркерным белком ГМК вообще (Cown, 1986), а также ГМК сократительного фенотипа, в частности (Gabbiani, 1986). По мненио Cloves (1987), синтез альфа-актина можно рассматривать, как часть программы выведония ГМК из пролиферации". Подобное соображение полностью подтверждается следующими полученными нами данными. .

Инкубация культивируемых ГМК в течение 4-х дней с All (ежедневное добавление по 1 шсМ)" ведет к торможению пролиферации ГМК таким образом, что к 5-ому дню эксперимента плотность опытной культуры была на 25% ниже контрольной. Результаты авторадиографии с использованием импульсного введения тимидина соответствовали

кривым роста и показали пониженную способность ГМК вступать о клеточный цикл а условиях эксперимента. При этом количество матки (плотность зерен серебра в ядре не изменялось в опытных культурах. Результату указывают «а уменьшение пролиферативнога пупа ГИК при действии Alt. При этом All не наменял пропиферативного поведения (скорость размножения, продолжительность клеточного цикла) ГИК, вступивших в пролиферацию до начала воздействия АН.

Таким образом, приведенные результаты аналогичны полученным нами для НА и указываот на то, что гипертрофия ГМК н их пролиферация - альтернативны.

В пользу данного соображения спидетельствуют также следующие результаты: используя модель первичных культур ГМК, посаженных с различной начальной платность!), ми изучили возможное влипнио фенотипа ГМ?С на способность их к гипертрофии под действием All. Данная модель предложена Carapbelt (1981) и предполагает поддержание в культурах клетом: сократительного фенотипа (начальная плотность посадки 1.2x10^ клеток), необратимо модифицн-юванного фенотипа (начальная плотность посадки 1.3x10* клеток) н >брат:.мо модифицированного фенотипа (начальная плотность посадки клеток).

Независимо от (фенотипа исследуемых ГМК, действие At! оказа-ась аналогичным и, как и при стандартных условиях купьтивнро-ания, размер клеток увеличивался по всех исследуемых культурах а 15%. Не изменялись также и параметры связывания ГМК с J 1 — чгиотензином II.

Приведенные данные позволяют предполагать, что гипертрофия Ж и фенотипичсская модификация - по-разному регулируемые юцессы, и, так же как в случае НА, клетки-мишени для АН, ловимому, определяются набором специфических рецепторов на их верхности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изменения, происходящие на клеточном уровне и приводящие к юненио общей формы и структуры органа или организма - процесс, горый принято называть морфогенезом. Роль молекул адгезии в >фогенезо обсуждал Edelman (1982, 19 8 3), который выдвинул отезу об их возможной регуляторной роли, п частности, в раннем

эмбриогенезе.

В денной работе нам впервые удалось показать экспрессию молекул аагезни ICAM I и VCAM I на поверхности гдадкомышечных клеток в морфогенезе сосудов в хода нормального развития человека и животных, е также при патологии, связанной с локальным утотцонием интимы, га есть в тех случаях, когда ГМК вовлекается в гиперплазии и миграцию. Упомянутые молекулы такие экспрессируотся при активации ГМК сосудов в ходе культивирования их in vitro, то есть при модификации фенотипа ГМК,

Данные результаты позволяют говорить о возможности модификации фенотипа ГМК in vivo и об участии модифицированных ГМК в патологии. Однако, как показало наше исследование, популяция ГМК, участвующая в образовании неоинтимы после деэндо-телизацин артерий у животных, неоднородна и состоит по крайней мере из 2-х субпопуляций (относительно их способности экспресси-ропать VCAM 1). В наших экспериментах нам не удалось идентифицировать молекулу VCAM 1 в ГМК, так называвшего "pup" фенотипа, а также в клетках из сформированной неоинтимы, даже при их длительном культивировании.

ГМК "pup' фенотипа отличаются по ряду признаков от "взрослых" ГМК, в частности, по способности к продукции фактора, аналогичного тромбоцнтарному фактору роста (PDGF-like activity), и, как полагают, аутоиринно регулируют пролиферацию. При этот и "pup" и "взрослые" ГМК имеют модифицированный фенотип.

Как показано о нашей работе, при формировании нооинтимы е ответ на повреждение артерий и VCAM 1-позитивная, и VCAM 1-негативкая субпопуляцни ГМК демонстрирует способности ь пролиферации, хотя уроаень ее различен- Заманчиво предположить, что одна из субпопулвциЯ (в данном случае VCAM 1-негативная] представлена линией дифференцировки, описываемой как 'pup* ГМК. 1 этом случае, учитывая ее способности к аутокринной регуляции, mi нз можем исключить возможность ео регуляторной роли в морфог енетическом процессе формиропания локального утолщения сосудов VCAM I в таком случае может выступать как регуляторная молекул паракринно регулируемой контр-субпопуляции. Возможная рол молекул адгезии как сигнальных систем, причем передающих сигна внутрь клетки ("outside-in" signalling), сейчас широк обсуждается в литературе, однако фактов в пользу таког предположения пока недостаточно. Полученные нами МА, а так»

модифицированные П4К в культуре - как нам представляется, могут служить перспективным инструментом для исследования данная проблемы.

Несомненна одно, что молекулы адгезии I САМ 1 и УСАМ I, характерные для недифференцированной мезенхимы, играют существенную роль а морфогенетических процессах, связанных с репарацией сосудов и развитии патологии, а закономерность их экспрессии при патологии отражает гетерогенность ГМК сосудов по характеру двфферепцировки.

Результаты, полученные нами, свидетельствуют не только о гетерогенности популяции ГМК, но и о связанной с этой гетерогенность» разнонапрааленностью клеточных реакций лежащих в основе »структурно-функциональных изменений сосудистой стенки при различных сосудистых заболеваниях.

В отличив от корфогенетическнх событий при развитии локальных утолщений, в случае общего утолщения стенки сосуда, характерного для гипертонии, ГМК подвергаются гипертрофии, н основе которой могут лежать различные механизмы: полиплоидиээция и/или гипертрофия цитоплазмы. Фенотип ГМК при этом не имеет значения, а клетки реализуют программу "гипертрофии" под действием определенных факторов, и в зависимости от характера распределения на их поверхности специфических к санным факторам рецепторов. Следует особо отметить существование о популяции ГМК сосудов животных н человека особой группы клеток, медлеииообиовляющёйся и частично "комитированой" о сторону полиплоидизации. Данная субпопуляция, по нашему мнению, отяетстоенна за обновление гладкомыщечной ткани сосудов и норме и за одну из форм гипертрофии ГМК при гипертонии. Гипертонический тип реакций ГМК, таким образом, может отражать процесс нормального старения ткани сосуда.

выводы

1. Получены моноклоналышо антитела к ГИК модифицированного фенотипа животных и человека. Показано, что распознаваемые ими антигены представляют собой молекулы адгезии VCAM 1 и I САМ 1, ранее но описанные для ГМК.

2. Выявлено, что в ходе нормального развития VCAM 1 и ICAM 1 зкслрессированы транзиторно на меэвнхймальных клетках (преимущественно на гладких мышцах) крыс и человека. Во взрослых нормальных сосудах антигены представлены только на клетках эндотелия.

3. Гладкомышечные клетки способны роэкспрессировать мезенхималь-ные антигены VCAM' 1 и ICAM 1 в ходе структурных изменений сосудов, связанных с локальным утолщением интимы, в частности при атеросклерозе и репарации сосудистой стенки.

4. Установлено, что в основе общего утолщения сосудистой стенки при гипертонии лежит гипертрофия ГМК. Гипертонические и возрастные изменения крупных сосудов человека и животных имеют однонаправленный характер. Экспрессия молекул адгезии VCAM 1 и ICAM 1 при этом не изменяется, по сравнению с нормой.

J. В модии аорты человека и крыс выявлены субпопуляции ГМК с различным пролиферативмым поведением. Обнаружено существование особой субпопуляции ГМК, имеющей тенденцию к полиплпиди-эации in vitro.

6. Показано, что медиаторами "гипертонической" клеточной реакции гладких мышц могут Сыть морадреналин и ангиотенэин II, реализующие свой эффект по-разному: морадреналин вызывает полипло-иднэацип ГИК через синергизм двух систем вторичных посредников, ангиотензин индуцирует гипертрофию ГМК без изменения содержания в клетке ДНК.

Основные результаты работ« отражены о следующих публикациях:

1. Принцспа О. Ю., фаерман А. И., Тюрмин A. D. , Ильинский ОБ. "Моноклоналыше антитела к поиерхностным антигенам длительно культивируемых глалкомышечны* сосудистых клеток".

Доклады АН СССР, 273: 1268-1270, 1983.

2. Бреаестовский П. Д. ,. Замойский В. Л., Ильинский О.Б., Пршшена

0. Ю. , Тюрмин А. В.

"Одиночные канал» глалкомышачных клеток аорты человека". Доклады АН СССР, 273: 1262-1264, 1983.

3. Ильинский О.Б., Кяоева Т. С., Красникоза Т.Л., Принивиа О.Ю. , Соловьева А.И., Теркин А. В.

"Длительное культиоировганно копии аорты крис с сохранением характерных своПсто дифференцированных гладкоытаочныч сосудистик клеток".

Еюлл, Эксп. Бнол. Мчд. , 97: 183-185, 1984.

4. Printseva О. Vu. , Faerjaan A.I,, Maksiraenko A. V. , Toncvitsky

1. G. . Ilyinsky 0. 3., Torchilin V. P.

Selective killing of sraooth musclo cells in culture by the rlcin i-chain conjugated with monoclonal antibodies to a cell surface ntigen via a dextrsn bridge*, xperientia, 41: 1342-1344, 1983.

5. Сарнисов Д.С., Колоиольчикова Е.Г., Варага Б.Н. , Принцев» . О. , Тюрмин А. В.

< вопросу о морфогенезе утончений интимы, наблюдаемых при

»специфическом вортоартериитв*.

1лл. Зксп.Биол.Мод. , 102: 233-2И, 1986.

. Варааа Б.Н. , Примцеаа О.Ю. , Тормин А.В., Колоколичикоаа Е.Г., дикова А. К.

экоторые вопросы морфогенеза ««специфического «ортоартериита'. хиа Патологии, 41: 4 3-48, 1986.

, Фаерман А,И., Принцооа О, Г.

1рвделонне молекулярной массы специфического поверхностного гигено глодкомышвчиых клеток*. »л.Мембр, , 3; 1037-1039, 1986.

8. Printseva 0.Yu., Foerman A. I., Tjurmin A. V,"

"The expression of specific surface antigen of smooth muscle celts is related to proliferation". Exp.Cell Kes., 1«9: 85-94, 1987,

9. Tjurmin A. V., Lacis R. V. , Printseva O. Yu. "Proliferation kinetics of aortic snooth muscle cell populations: comparison of noraotensive and spontaneously hypertensive rats." Cell Ties.Kinet., 20: 15-27, 1987.

10. Danllov S.M., Faernan A.I., Printseva 0.Yu., Martynov A.V. , Sakharov l.Yu. , Trakht I.N.

' Inununohietochceical etudy of angiotensin-converting enzyme in human tissues using monoclonal antibodies". Histocheaistry, 87: 487-490, 1987.

11. PecloM.M., Printseva O. Yu.

"Retinoic acid enhances proliferation of smooth muscle cells." Experientia, «3: 194-198, 1987.

12. Chernousov М.Л. , Faerman A. 1., Frid M.C. , Printseva 0. Yu.," Hotelionsky V. E.

'Monoclonal antibody to fibronectin which inhibits extrecellulai

matrix assembly".

FEBSLett., 211: 124-128, 1987.

13. Принцеаа О.С.

"Глапкоиышочные клетки как мишени для направленного транспорта лекарств".

Журнал ВХО им.Д.И.Менделеева. $:551-5S8, 1987

14. Пекло М.М., Любимов А.В., Прмнцева O.D.

"Гетерогенность базальных мембран в тканях человека, выявляема? моноклоиальними антителами к лаыинину и энтактину". Бюлл.Эксп. Биол, Men. , 105: 611-613, 1988.

15. Пекло И.М. , Лриицева О.Ю. , Варава Б. П., Колокольчиков^ Е.Г "Т-8 позитивные лимфоциты преобладают в воспалительных инфильтратах стенки сосудов яри нвспецнфическом аортоартериите Бюлл.Эксп.Биол.Мед., 105: 718-720, 1988.

16. Bregestovski P.D., Printseva 0.Yu., Serebryakov V. , Stinnnkre J., Tjurmln A. V. , Zaooyski V.

"Comparison of Ca2+-dependent K+ channels in the membrane of smooth muscle cells Isolated iron adult and foetal hucjan aorta". Pflugers Arch., -»13: 8-13, 1988.

17. Muzikantov V. R. , Peclo U.U., Printseva O, Yu.

"Local tissue injury induced by glucose oxidase conjugated with anti-collagen antibody."

Immunol.Meth., 11»: 6S-73, 1989.

18. Printseva O.Yu. , Peclo M.M. , Faermon A.I., Tjurmin A.V., Danilov S.M. . Repin V. S. , Srairnov V.N.

■A 90-kD surface antigen of a subpepulation of seooth muscle cells froa human atherosclerotic lesion". Am. J. Pathol. , 134: 305-313, 1939.

19. Printseva O. Yu., Tjurmin A.V., Rudchenko S.A., Repin V.S. "Noradrenaline induces the polyploidization of smooth muscle cells. The synergism of second messenpers*.

Exp. Cell lies. , 18«: 342-350, 1989.

20. Sarkisov D,S. , Ко locoIchikova E.G., Varava B.N. , Tjurain к. V., Peclo M. M. , Printseva 0. Yu.

Morphogenesis of intinal thickening in nonspecific aorto-irteritis*.

uman Pathology, 20: 1048-10S6, 1989.

(

1. Serebryakov V.N., Zamoiskii V.L., Printseva 0.Yu., Stinnakre ., Tjurrain A. V, , Bregestovski P. D.

iffect of low-denaity lipoproteins on Ca2t-dependent K* channels l the raeabrane оt sctooth muscle cells isolated from human fetal irta".

oned.Science, 1: «9-94, 1990.

. Printseva 0. Yu., Pcclo M. M., Tjurmin V., Gown A. 14. 90 kD surface antigen of immature smooth muscle cells fa Ш-1'.

J.Physiol., 1991; 261(Suppl.): 21-22.

Принцева О. Ю. , Термин Л. В. юлиферация гладкомышочных клеток при гипертонии*. Аналогия, 31: 44^48, 1991.

24. Printseva O, Yu. , Tjurmin A.V.

"Proliferative response of smooth muscle cells in hypertension*. Am.J.Hypcrtens., 5(6 Pt.2): tIgS-lZ3S, 1992.

25. Printseva O.Yu., Pcclo M.M., Gown A.M.

"Vnrious cell types in human atherosclerotic lesions express ICAM-1: further imnunocytocheoical and immunochemical studies ¿«ploying monoclonal antibody 10F3". Am 1,Pathol., 140: 889-896, 1992.

26. Frid M.A., Printseva 0.Y., Faggin E., Chiavegato A , Scatena M., Kotcliansky V.E., Pauletto P., Glukhova M.A., Sartore S. 'Myosin heavy-chain isoform composition and distritiition in developing and adult human aortic smooth muscle'..

J. Vase. Res. , in press, 1993.

27. Printseva O.Yu., Paernan A. I. , Peclo M.M. , Tjurrain A.V. , Ananieva N.M. , Clowes M.M. , Clowes A.M.

'At least two fsubpopulations of smooth muscle cells relating to VCAM-1 expression are involved in the response to injury of vessels*.

Circ.Res., in press, 1993.