Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Изменения фенотипа гладкомышечных клеток артерий человека при атеросклерозе

В9 О 3. з

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

БАБАЕВ Владимир Раимович

ИЗМЕНЕНИЯ ФЕНОТИПА ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК АРТЕРИЙ ЧЕЛОВЕКА ПРИ АТЕР0СКЛЕР03ЕЕ

14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора медицинских наук

На правах рукописи

Москва - 1992 г.

Работы выполнена в НИИ морфологии человека РАМН и Институте экспериментальной кардиологии ВКНЦ РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор И. А. КАЗАНЦЕВА

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор К С. Жданов

доктор медицинских наук, профессор В. П. Туманов

доктор медицинских наук Л В. Кактурский

Ведущее учреждение:

Институт сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева РАМН (Москва)

Защита состоится "_"_1992 г.

в _ часов на заседании специализированного совета

(Д 001.04.01) при НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, г Москва, улица Цюруппы , 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института морфологии человека РАЖ

Автореферат разослан "_"_1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

И. К Емельяненко

ens--' зтш

*" * i с.....itsssi

Стдел диссертаций

Актуальность проблемы. Атеросклероз и его осложнения продолжают

ОЬМАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

оставаться наиболее частой причиной смерти и инвалидности трудоспособного населения во всех развитых странах. В связи с этим понятны усилия, направленные на изучение механизмов пато- и морфогенеза этого заболевания. Однако несмотря на значительный прогресс в исследовании атеросклероза и многочисленные гипотезы, объясняющие его возникновение и течение САничков Н Н. Цинзерлинг В Д, 1953; Автаняилов Г Г. 1964; Давыдовский И В. 1967: Анестиади В X. Нагорнев В А.1982: Климов А Н, 1986; Вихерт А И, Жданов В С, 1987: Ross R, 19в6: Bendit Е, 198Б; Steinberg D et al. 19693, ряд ключевых моментов пато- и морфогенеза заболевания остаются дискуссионными и недостаточно изученными. Прежде всего это касается роли гладкомышечных клеток СГМК) в патогенезе атеросклероза. В настоящее время известно, что подавляющая часть клеток сосудистой стенки имеет гладкомышечную природу. По мнению ряда исследователей CRoss R, 1Э8&: Schwartz S М et al., 19061] , пролиферация ГМК и секреция ими компонентов экстрацеллюлярного матрикса является ранним и важным этапом развития атеросклероза. Основываясь на результатах опытов CChanrtley-CaiYiobel 1 J Н et ai., 19793 с культурой клеток сосудистой стенки животных, эти исследователи предположили, что при развитии атеросклероза ГМК артерий человека меняют Фенотип из обычного "сократительного" на "синтетический". На ультраструктурном уровне это проявляется в виде чрезмерного развития эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи, которые вытесняют или полностью замг-i присущие клеткам миофиламенты. Наряду с этим в клетках ме> экспрессия целого комплекса белкой иитоскелета, которые по

причине обозначают как маркеры Фенотипической модуляции.

Казалось бы. многочисленные данные подтверждают присутствие в атеросклеротически пораженных астериях человека Фенотипически измененных ГМК с соответствующей ультраструктурой Cüeer, Haust. 1972}, особенностями экспрессии ряда белков иитоскелетв [Kocher et al, 1985, Thybera et al., 1990] и иммунной активаиии [HensBon et а1..1'ЭВЭ]. Однако эти Факты хотя и многочисленны. но разрозненны, посвящены, как правило, либо особенностям ультраструктуры ГНК. либо экспрессии маркерных белков. До настоящего времени не дана комплексная морфофункииональная характеристика измененных ГИК артерий человека и не доказан Факт участия этих клеток в развитии патологического процесса на ранних стадиях атеросклероза. Кроме того, не выяснено, какие изменения в сосуде предшествуют появлению измененных ГМК и насколько применимы данные. полученные на культуре клеток

экспериментальных животных, к клеткам человека. Все это свидетельствует о необходимости проведения комплексного и многопланового исследования с использованием новых методических подходов к изучению аутопсийного материала.

й исследования. Цель настоящего исследования

изучение морфофункциональных особенностей фенотипически

измененных ГМК артерий человека и выяснение степени их участия в развитии ранних втеросклеротических поражений.

В соответствии с указанной иельп были определены следующие -•чдачи исследования:

1. Изучить структурную характеристику Фенотипически измененных ГМК атеросклеротических бляшек аорты и коронарных артерий

человека.

2. Исследовать вероятность появления и особенности строения Фенотипически измененных ГМК в участках раннего атеросклеротического поражения аорты человека.

3. Определить особенности микроокружения фенотипически измененных ГИК а участках раннего атеросклеротического поражения аорты человека.

Изучить Функциональную характеристику Фенотипически измененных ГМК в первичной культуре интимы аорты человека.

Научная новизна. В результате проведенного исследования в атеросклеротической бляшке аорты человека выявлен фенотип ГИК с измененной экспрессией миозина и альфа-актина. Изучена

ультраструктура каждого фенотипа ГИК бляшки. Установлена вероятность появления и особенности локализации различных фенотипов ГМК.

Сходные фенотипы ГИК найдены в атеросклеротических бляшках коронарных артерий человека, что свидетельствует о стереотипной реакции клеток в артериях мышечно-эластического н эластического типов при атеросклерозе.

Впервые описана возрастная динамика изменения экспрессии десмина в ГМК коронарных артерий человека.

В участках раннего атеросклеротического поражения аорты человека впервые найдены ГМК, экспрессирующие десмин и имеюшйе ультраструктуру синтетического фенотипа. Появление таких клеток на ранних Фазах развития фиброзной бляшки свидетельствует об их участии в атерогенезе.

В участках раннего атеросклеротического поражения обнаружены

ГМК. экспрессируюшне антигены гистосовместимости II класса <HL.fi-БР. Н1_Л-00). что указывает на возможное участие их в аутоиммунном процессе, способном ускорять развитие атеросклероза.

В участках аорты, предрасположенных к поражению атеросклерозом. обнаружены скопления моноцитов-макрофагов (Мн-МФ) и реже Т-лимФоцитов. Морфометрически доказаны локальность и постоянство инфильтрации интимы Мн-МФ, которые потенциально способны инициировать изменения Фенотипа ГМК.

В тех же участках аорт детей выявлено накопление апопротенна В, представляющего преимущественно липопротеиды низкой плотности (ЛНП), окисленные Формы которых способны стимулировать макрофагальную инфильтрацию интимы.

На модели первичной культуры показано, что клетки интимы аорты человека исходно варьируют по Фенотипу, при этом количество Фенотипически измененных ГМК в культуре коррелирует со степенью поражения сосуда атеросклерозом.

Установлено, что ГМК интимы аорты человека в процессе культивирования меняют свой Фенотип, что проявляется изменениями ультраструктуры, экспрессии миозина и альфа-актина.

Доказано, что изменение Фенотипа ГИК сосудов человека сопровождается активацией их пролиферации, синтеза ими компонентов интерстициального коллагена и экспрессии рецепторов к ЛНП.

Перечисленные новые Факты позволили уточнить последовательность морФогенетических процессов, происходящих в сосуде человека при атеросклерозе, и уточнить роль ГМК в атерогенезе.

Научно-практическая значимость работы. Представленная работа является частью Всесоюзного комплексного исследования по

направлению "Изучение молекулярных и клеточных процессов атеросклеротического поражения сосудов, разработка новых методов профилактики. диагностики и лечения атеросклероза и его осложнений". Диссертация является итоговым обобщением результатов, полученных при выполнении двух грантовых тем: "Изменения Фенотипа гладкомышечных клеток артерий человека при атеросклерозе" <1989-1991ГГ.> и "Исследование морфофункииональных особенностей клеток и межклеточных взаимодействий в интиме аорты человека при раннем атеросклеротическом поражении"С1991-1992гг).

Практическая ценность данной работы состоит в том, что она, являясь Фундоментальным исследованием, дает набор базовых сведений для последующего поиска в этом направлении и открывает новые подходы в изучении пато- и морфогенеза атеросклероза.

Выявленные закономерности изменения Фенотипа ГИК сосудистой стенки при атеросклерозе могут иметь обшебиологическое значение.

Понимание ключевой роли изменения фенотипа ГМК в развитии атеросклероза, знание основных механизмов и условий модуляции ГМК создают основу для целенаправленного воздействия на этот процесс, что открывает перспективу для принципиально новых подходов к профилактике и лечению заболевания.

Предлагаемые способы идентификации клеток и количественного анализа изменения фенотипа ГМК в первичной культуре интимы аорты человека позволяют использовать ее в качестве наиболее приближенной и адекватной модели в изучении важных вопросов патогенеза атеросклероза и других сосудистых заболеваний. Кроме того, модель первичной культуры аорты человека можно использовать

при тестировании новых Фаомакологических поепаоатов. в том числе и антнатерогенного действия.

Положения^ выносимые на эаиит^л

1. В пораженных атеросклерозом артеоиях человека меняется Фенотип ГМК, что проявляется изменениями ультраструктуры, а также экспрессии деспина, миозина и альфа-актина.

2. Фенотипическая модуляция ГМК артерий человека сопровождается изменением их Функций, в том числе активацией пролиферации, синтеза компонентов интерстициального коллагена и экспрессией рецепторов к ЛНП.

3. Изменения Фенотипа ГМК в сосудистой стенке человека является одним из ключевых моментов патогенеза атеросклероза.

Апробация Основные результаты и положения работы

докладывались и обсуждались на Всесоюзном симпозиуме "Актуальные проблемы патогенеза атеросклероза" (Ленинград, 1985), на VIII международном симпозиуме по атеросклерозу (Рим, 1988), на 5 и 6 международных симпозиумах по атеросклерозу (Мюнстер, 1988,1990) на конгрессе по регрессии атеросклероза человека (Стокгольм, 1989), на международном конгрессе по атеросклерозу (Вена, 1989), на 9 международном симпозиуме по атеросклерозу (Чикаго, 1991), на обществе патологоанатомов (Москва, 1991) и на межлабораторном семинаре НИИ морфологии человека РАМН (Москва, 1992).

§й?ЯВёйЦ!= Н523ЙУ* Е®ЭХ£ьтатовл

Полученные в диссертации данные используются в лекционном курсе на кафедре патологической анатомии усовершенствования врачей ММА им.Сеченова.

£1°укт}!ЕЭ 5ЦЯЕ§Е>ХЭНМИ • Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста. состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения результатов собственных исследований с обсуждением в конце каждой из 3-х глав, заключения, выводов, содержит 26 рисунков, 15 таблиц. Библиографический указатель включает 282 отечественных и иностранных источника.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось на аутопсийном материале, который получали во время срочных вскрытий, произведенных в первые 5 часов после наступления смерти. В соответствии с поставленными задачами, аутопсийный материал использовали для изучения особенностей ГМК в нормальной интиме и атеросклеротической бляшке аорты <30 случаев>, в коронарных артериях <38 случаев), в ранних атеросклеротических поражениях (55 случаев) и в первичной культуре интимы аорты <54 случая)•

2§55ботка Выделяли Фрагмент (около 20 см

длиной) грудного отдела аорты, промывали и вскрывали его продольно по задней стороне между двумя рядами межреберных артерий. Выделяли атеросклеротические бляшки и прилежащие к ним визуально неизмененные участки сосудистой стенки. Кроме того, в соответствии с рекомендациями СВИадыа^ »^оьеггвоп- 1973; иг 1380И, различали предрасположенные к поражению (ПП)

атеросклерозом участки, локализованные вдоль ряда устий ¿-8 пар межреберных артерий, и резистентные к поражению <РП> участки, расположенные на том же уровне по передней поверхности аорты. На рис 1. приведена схема выделения кусочков ткани.

TOIC КРОВИ t>

УСТЬЯ МЕЖРЕБЕРНЫХ АРТЕРИЙ

1. Схематическое изображение открытой грудной аорты

человека с обозначением участков. предрасположенных ни и резистентных I I к поражению атеросклерозом.

Часть материала использовали для электронной микроскопии, другую - погружали в OCT comoound (lab-Tek Products. USH), охлаждали в жидком азоте и готовили криостатные срезы. Кроме того, из проксимальных отделов <0.5-1.0 см от устья) левой и правой коронарных артерии вырезали небольшие СЧ.О см) фрагменты сосуда, которые использовали для электронно-микроскопического и иммуноморфологического анализа.

1б!5®ление и культивирование клеток интимы аорты производилось преимущественно сотрудниками НИИ экспериментальной кардиологии BHKU РАМН А.С.Антоновым и Ю.А. Романовым.* При обработке сосуда визульно оценивали степень его поражения атеросклерозом. Согласно критериям Smith L1974-] , наряду с отсутствием видимых поражений (О степень) или наличием только липидных полос (1-ая степень), различали поражения в виде единичных <2-ая степень) или множественных СЗ-ая степень) атеросклеротических бляшек, которые иногда были изъязвлены или имели тромботические наслоения <4--ая степень поражения).

* Автор выражает признательность исследователям за помощь в работе.

Фрагмент или измельченную интиму аорты инкубировали в 0.2 растворе коллагеназы (Sigma, tyae I) в течение 2 ч гюи 37°С. Клетки высевали с плотностью 2.5-3.0 х 10^ клеток /см- и культивировали в среде 199. содержащей Ю- фетальной сыворотки теленка. 2мМ глутамина, 25мМ НЕР£3,1мМ пирувата натрия, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все GiЬсо,США). АЦТЫё^Эл В работе использовали набор различных антител. в том числе моноклональные антитела к виментину iOstiorn et a.i. , l'J04 j , десмину [DEbub et al-, 190.3J . альфа-актину CSkalJi cl л I . . I'Jnijj. к поверхностному антигену iGlnkhova et al. . 1Э053 и актину ГМК n'Eji.iuada et al. . 10073 , к Мн-Мф ГОомп et al. . Ю0С: l\c?llv fit jl.,1988: Zwjd 1 о et al. , 19B5, 1Э0С,3 . к В- и Т-лимфоцитам ГТЧшсг.а et al.,19073 и т.д.. поликлональные антитела к миозину ГМК СБ.В.Ыехонин и соавт, 1985; Коспсг, Gabbiavu. Ю0СЗ , к

апопротеинам A-I. В. C-III и Е СВ.Р.Бабаев и соавт., 1987.19903. к десмину и актину CSiojrta3 и т.д. Антитела получали аффиной хроматографией на колонке лиганд-сефароза 4В. Специфичность антител определяли в тестах иммунодиффузии, иммуноэлектрофореза, иммуноблотинга и иммуноморфологически. Козьи и бараньи антитела к IuG кролика и мыши метили Флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) или тетраметилродаминизотиоцианатом (ТРИТЦ) по протоколу frjjirn, 19763. Кроличий комплекс пероксидаза-антипероксидаза (ПАП) готовили по прописи CSteiriDm uer, Г3793 .

Использовали непрямой и двойной иммунофлуоресцентные методы исследования. Криостатные срезы и/или клетки культуры инкубировали последовательно с моно- и поликлональными антителами. Затем срезы и/или клетки обрабатывали

смесью козьих м бараньих антител к lab мыши и кролика. меченных различными Флуорохромами. В ряде случаев использовали ТРИТЦ-меченный Фаллоидин (Stoma, FRB) , выявляющий F-актин CWi.il Г. 197ЭЗ .

метод. Криостатные срезы и/или клетки культуры предобрабатывали с целью блокирования эндогенной пероксидазы и неспецифической сорбции, затем инкубировали с поликлональнымм антителами. После этого срезы или клетки обрабатывали антителами барана к IçCi кролика и кроличьим ПАП комплексом. Пероксидазу выявляли раствором диаминобензидина.

Морфометрический анализ препаратов. При морфометрическом анализе гистопрепаратов использовали рекомендации Г.Г.Автандилова С1990]. Подсчет клеток в стенке сосуда человека производился в соответствии с рекомендациями CUeHo ff 1987.1 как для оринтированных структур, имеющих варьирующие размеры составных частиц. Подсчитывали количество ГМК и Мн-Мф интимы в стандартной площади гистопрепарата (11,5 мкм^). Все данные обрабатывали методами вариационной статистики.

?лектЕднно;микроскопическое исследование материала производилось совместно с сотрудником Центра мозга АН СССР (г.Санкт-Петербург) Ю.В.Бобрышевым, а также сотрудниками НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР Г.К.Суховой и А.В.Крушинским.* Кусочки ткани и клетки интимы, атероматозных бляшек аорты и коронарных артерий фиксировали в 2.5"/. глутаровом альдегиде, обрабатывали в 1'/- раствор четырехосмия и заключали в аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца и уранилацетатом, затем просматривали в микроскопе JEM—100В или JEM 100.СХ.

» Автор благодарит всех, принявших участие в работе.

методов использовали при анализе популяции пролиферируюших клеток. На 4-й и 6-й день пребывания клеток в культуре в культуральную среду добавляли 1 mCí [Зц]-тимидина (5Г-'i/ммоль, (Imersham, U.K.) и инкубировали в течение 18 часов. Затем клетки отмывали, фиксировали,- высушивали и иммуноцитохимически выявляли экспрессию миозина ГМК, используя поликлональные антитела к миозину и кроличий ПАП комплекс. После выявления пероксидазы диаминобензидином клетки покрывали Фотоэмульсией типа "М" и экспонировали в течение 7 дней. Затем препараты проявляли, подкрашивали гематоксилином и заключали в бальзам. При увеличении хЮО подсчитывали число меченых ядер, содержащих 4 и более гранул восстановленного серебра.

Анализ связывания ЛНП с клетками культуры проводился по схеме Cflnüersen et al-, 19SCO, Клетки помешали в среду, в которой фетальная сыворотка теленка была заменена на делипидированную сыворотку <д>1,25 г/мл) человека. Спустя сутки клетки инкубировали 3 часа с 15 мкг/мл ЛНП человека (д=1.019-1.050 г/мл). После Фиксации параформальдегидом выявляли связавшиеся с клетками липопротеиды, используя непрямой иммунофлуоресцентный метод.и кроличьи антитела к ano В.

П2Е£ошение липопротеидов изучали с помощью нативных или модифицированных малоновым диальдегидом (МДА) по прописи [Mabt?rlcmd et al., 13023 ЛНП, которые метили флуоресцентным красителем , 3' --di ос t аОссу 11 ndocarbocyamne (Дил) (Molncular Г'1-oDe'j, I ne junction city, Ore) по прописи CPitaii et al. , 198511 . Клетки инкубировали в течение 3-4 часов в среде с делипидированной сывороткой, содержащей 20 мкг/мл Днл-ЛНП или

Дил-МДЛ-ЛНП. Затем клетки Анкетировали и использовали в иммуноморфологических исследованиях•

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ?ообенности ГМК нормальной интимы и атеросклеротической

бляшки аорты человека. Иммуноморфологический анализ криостатных срезов визуально неизмененной части аорты показал. что за исключением эндотелия все клетки интимы и медии реагируют с антителами к виментину, миозину, альфа-актину и актину. При этом ГИК аорты не содержали десмина» хотя этот белок характерен для гладкомышечной ткани CLazaг idos 19323 • Очевидно* синтез десмина в ГМК аорты человека блокируется еще на ранних сроках эмбриогенеза С N i k к а г i et al, 1908:1.

При анализе 28 атеросклеротических бляшек аорты в 7 из них были обнаружены клетки» которые содержали десмин. Десминпозитив-ные клетки локализовались в "покрышке" бляшки» имели вытянутую Форму, содержали миозин» виментин, филамин, альфа-актин и окрашивались на Р-актин фаллоидином.

Кроме того» в 13 бляшках аорты обнаружили клетки» которые не реагируют с антителами к миозину» Ниозиннегативные клетки располагались вблизи атероматозных масс по краю бляшки» в зоне ее. перехода в нормальную интиму сосуда. Они имели вытянутую форму, не экспрессировали десмин и альфа-актин» но содержали виментин и Г-актин. выявляемый фаллоидином.

Десминпозитивные и миозиннегативные клетки связывались с моно-клональными антителами к ГИК С11G10), не реагировали с тремя клонами к Нн-МФ (HAM--5G, EDM/11, 25ГЭ) » с антисыворотками к Фактору VIII и лизоииму - известными маркерами эндотелиальных

клеток и Мн-МФ. Вместе с тем. миозиннегативные клетки в отличие от десминпозитивных не реагировали с моноклональными антителами к ГМК (ННР-ЗЗ), которые связываются преимущественно с альфа-актином С'Гзикаиа с^ а1. . 19873 . Сравнительная

иммуноморфологическая характеристика типичных и измененных ГМК атеросклеротических бляшек аорты приведена в таблице. Таблица

ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕНОТИПОВ ГМК АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК АОРТЫ И КОРОНАРНЫХ АРТЕРИИ ЧЕЛОВЕКА

Маркеры ГМК ГМК ГМК

Фенотипической типичные десмин- миозин-

модуляции позитивные негативные

виментин +

десмин

миозин ♦

альфа-актин ♦

Р-актин ♦

11010:

ИНГ--35: +

(|ПМ-5б:ЕБМ/'11:25Р,Э Лизоиим Фактор У 7 Т1 ОКТ 3

Локализация измененных клеток в виде скоплений и в определенных участках бляшки позволила прицельно изучать их ультраструктуру. По сравнению с ГМК нормальной интимы и большинством клеток бляшки, цитоплазма которых была заполнена миофиламентами, а эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольдхн были не развиты и локализовались перинуклеарно, десминпозитивные клетки характеризовались относительно крупными размерами, они имели просветленный иатрнкс цитоплазмы, содержащей значительное количество везикул, развитый эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольдхн. а обильные пучки ниофилпнентоп распределялись

неравномерно и преимущественно у наружной иитолеммы. Как правило, эти клетки имели резко утолщенную слоистую базальную мембрану, спаянную с прилежащими соединительнотканными волокнами.

Изучение бляшек, содержащих скопления миозиннегативные клеток, показало, что цитоплазма этих клеток частично или целиком была заполнена шероховатым эндоплазматическим ретикулумом и хорошо выраженным аппаратом Гольджи. Лишь в части клеток отмечали отдельные пучки миофиламентов. слабо выраженную прерывистую базальную мембрану и обилие пиноиитозных пузырьков - все те признаки, которые указывают на гладкомышечную природу клеток ГП|ч?г. ||,nr.it,, 1 "Э7СЗ .

Полученные результаты свидетельствуют, что в

атеросклеротической бляшке аорты человека присутствуют, по крайней мере, три субпопуляции ГМК. которые отличаются друг от друга ультраструктурой. экспрессией десмина. миозина и альфа-актина. Появление подобных клеток можно рассматривать как результат изменения Фенотипа ГМК с "сократительного" на "синтетический". подобно тому, как это происходит в условиях культуры у клеток артерий животных ЕСатпЬе11 а1. 19803. Особенности ^УЗХУП® Ы бляики

У?ловека^ Исследование коронарных артерий показало, что толщина интимы сосудов непрерывно повышается с возрастом. У детей, подростков и взрослых интима коронарных артерий состояла соответственно из 2-4, 5-8, и 6-15 слоев ГИК. Все эти клетки содержали виментин, миозин, альфа-актин и Р-актин, тогда как экспрессия десмина менялась с возрастом. У детей десмин выявлялся во всех клетках артерии, у подростков - лишь в части

клетках интимы» у взрослых десмин никогда не находили в клетках интимы, а только в части ГМК медии. Следовательно, с возрастом по мере роста коронарных артерий число ГМК интимы возрастает, и они теряют способность экспрессировать десмин.

В 7 из 17 атеросклеротических бляшек коронарных артерий находили клетки, содержащие десмин. Эти клетки были единичными» они имели крупные размеры и локализовались в покрышке бляшки. В более глубоких слоях бляшек находили скопления клеток, которые не реагировали с антителами к миозину и альфа-актину. По реакции с различными антителами, определяющими тип и фенотип клеток, десминпозитивные и миозиннегативные клетки коронарных артерий были идентичны фенотипически измененным ГМК аорты человека (таблица>. Электронно-микроскопически в тех же атеросклеротических бляшках коронарных артерий находили клетки, цитоплазма которых содержала развитые шероховатый эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи, свободные рибосомы и многочисленные везикулы•

Полученные результаты свидетельствуют, что в пораженных атеросклерозом артериях человека Фенотип ГМК меняется по единой схеме. Между тем, ранее было установлено, что клетки артерий эластического и мышечного типов различаются по экспрессии ряда белков цитоскелета ШьЬогп 10053.

Изменения фенотипа ГМК в участках раннего атеросклеротического П9В§*_?ни5 интимы. Последующий поиск Фенотипически измененных ГМК в аорте детей и лиц молодого возраста (1-40 лет) показал, что в 13 из 19 тестируемых сосудов встречаются клетки, содержащие десмин. Эти клетки локализовались в глубоких слоях интимы ПП-участков аорты. Гладкомышечная природа данных клеток

подтверждалась оеакцией их с моноклональными антителами к ГПК СННГ35.t]G3О). Электронно-микроскопический анализ этих участков сосуда выявил клетки, цитоплазма которых была заполнена развитым шероховатым эндоплазматическим ретикулумом и комплексом Гольджи. Часть из этих клеток содержала пучки миофиламентов, локализованных по периферии цитоплазмы. Некоторые из клеток располагались в непосредственной близости или контактировали с Мн-Мф. Очевидно, появление клеток с измененной ультраструктурой и экспрессией десмина является следствием модуляции Фенотипа ГМК процесса, который сопровождается активизацией пролиферации клеток и синтеза компонентов соединительнотканного матрикса, что может вести к образованию фиброзной бляшки. Поэтому Факт выявления десминпозитивных ГМК в визуально неизмененной интиме аорты у лиц молодого возраста может быть расценен как начало формирования фиброзной бляшки.

Кроме того, в ПП-участках 4 аорт лиц старше 20 лет экспрессию антигенов гистосовместимости II класса (HLO-DR, HLfl-DD) находили не только в Мн-МФ и Т-лимфоиитах, но и в части ГМК интимы. Подобная аберрантная экспрессия антигенов активации в ГМК сосудистой стенки может свидетельствовать об участии этих клеток в аутоиммунном процессе, который способен ускорять развитие атеросклероза [Клипов, 1990И.

Выявление фенотипически измененных ГМК в участках раннего атеросклеротического поражения аорты побудило нас к более детальному анализу микроокружения этих клеток.

Клеточный состав интимы в участках ряннего атеросклеротического й°ЕТЬ!а ИммуноморФологический анализ клеточного состава

интимы• содержащей Фенотипически измененные ГМК. показал. что начиная с 16-17-летнего возраста в ПП-участках аорты постоянно отмечаются скопления Мн-Мф и реже (в 1/4 случаев) Т- лимфоцитов• Такую картину никогда не наблюдали в интиме РП-участков те* же сосудов. Из других клеточных элементов интимы в ПП-участках аорты иногда встречали единичные клетки, реагирующие с антителами к моноцитам крови и В-лимфоцитам•

Морфометрический анализ гистопрепаратов, окрашенных двойным иммунофлуоресцентным методом» показал, что во всех 10 тестированных аортах доля Мн-МФ и их число в стандартной единице обьема ткани интимы были значительно выше в ПП-участках, чем в РП-участках сосуда. Так, процентный показатель Мн-Мф в ПП-участках возрастал в 2-6 раз по сравнению с РП-участками сосуда. Скопления Мн-Мф отмечали и при отсутствии видимых атеросклеротических поражений сосуда. Очевидно, инфильтрация Мн-Мф интимы в ПП-участках аорты у лиц молодого возраста является одним из наиболее ранних проявлений атеросклеротического поражения.

5 раннего атеросклеротического

поражения интины. Поиски наиболее ранних изменений в интиме аорт лиц молодого возраста оказались успешными лишь при иммуноморфо-логическом анализе распределения различных апопротеннов (ano), в том числе ano Л-1 , ano В, ano C-III и ano Е. Уже у детей 5-7 лет в субэндотелиальной части интимы ПП-участков аорты отмечали скопления ano В, содержание которых в более позднем возрасте увеличивалось, распространяясь на всю интиму. При этом содержание ano В в ПП-участках аорты всегда было более значительным, чем в РП-участках аорты. Реакция сосудистой стенки с антителами к ano

А-1 и ano С- X1 л была едва заметной независимо от возраста. Напротив• у лиц старше 20 лет в субэндотелиальной части интимы находили скопления ano Е содержащих липопротеидов, которые у лиц среднего возраста распределялись на всю толщу интимы. Следовательно» наиболее ранние изменения интимы аорты человека появляются уже в детском возрасте в виде накопления ano В содержащих липопротеидов. преимущественно ЛНП. Отсутствие скоплений ano A-I и ano С-III в стенке сосуда человека подтверждает это положение. поскольку данные апобелки считают основными маркерами липопротеидов высокой и очень низкой плотности СМ«*! i J е »»1 с* 1. 1305 j „

клеток интимы аорты человека в первичной культуре. Анализ первичной культуры интимы аорты человека показал, что она содержит несколько типов клеток. Наряду с ГМК, составляющими подавляющее большинство клеток культуры» в ней всегда встречались Мн-Мф, эндотелиальные и пенистые клетки. Поиски оптимального способа идентификации типов и возможных фенотипов клеток культуры завершился применением пробы на поглощение модифицированных ЛНП, меченных флуоресцентным красителем. Благодаря наличию у Мн-Мф, пенистых и эндотелиальных клеток сосуда специфических скевенджер рецепторов lDpqwij, Golabitíin, iSJOCÜi , эти клетки поглощали модифицированные ЛНП, приобретая яркое свечение, отличаясь тем самым от ГМК, которые не имеют таких рецепторов♦ Сочетание этой пробы с окрашиванием на миозин позволило выявить в культуре ГМК с измененной экспрессией миозина. Количество таких ГМК варьировало в каждом случае в пределах 10-25'- от общего числа клеток культуры» и доля их повышалась по мере роста степени поражения сосуда атеросклерозом (рис 2У .

^ 20 -И

0-1 1-1 1-3

Степень поражены атеросклерозам

Рис 2. Соотношение эндотелмальных клеток ШШ . Мн-МФ С 3 и измененных ГМК БФЯ в первичной! культуре интимы. выделенной из аорт с различной степенью поражения атеросклерозом.

Кроме того. сопоставление культур клеток. выделенных из фиброзных бляшек и прилежащих к ним визуально неизменных участков интимы трех различных аорт, показало, что количество миозиннегативных ГМК всегда было статистически достоверно (в 1.4-2.1 раз) выше среди клеток фиброзной бляшки» чем в культуре интимы нормальных участков сосуда. Это еще одно доказательство что число фенотипически измененных ГМК в культуре интимы коррелирует со степенью поражения сосуда атеросклерозом. Изменение фенотипа ГМК в первичной интимы 52В1У

меловекУспешная идентификация клеток культуры, исключающая из анализа примесь Мн-Мф, пенистых и эндотелиальных клеток, позволила прицельно изучать фенотипы ГМК• Так, по характеру реакции с антителами к миозину различали клетки с гомогенным распределением миозина, клетки с непрерывными фибриллами миозина и миозиннегативные клетки. Соотношение этих клеток в культуре в первые 5 суток опыта составляло 82:1:17%, соответственно. С 6-7-х суток пребывания о культуре это соотношение менялось и на 14-е

сутки эксперимента составило соответственно 10:30:80%. Сходным образом менялась и экспрессия в клетках альфа-актина. Содержание виментина и актина не менялось» а десмина в ГПК культуры мы не обнаружили. Электронно-микроскопически первые 4-5 суток опыта клетки культуры не отличались от ГМК сосудистой стенки, т.е. они были заполнены преимущественно миофиламентами. С 5-7-х суток эксперимента в культуре р'езко возрастало число клеток, цитоплазма которых была заполнена развитым эндоплазматическим ретикулумом, комплексом Гольдхи и многочисленными везикулами.

Все эти результаты свидетельствуют, что в процессе роста в первичной культуре на 5-7-е сутки опыта ГМК спонтанно меняют свой фенотип, что проявляется изменением ультраструктуры, экспрессии миозина и альфа-актина.

Мод^офункциональные особенности ¿^нотипически измененных ГМК интимы ао£Ты человека в первичной культуре^ Знание динамики изменения фенотипа ГМК в культуре позволило приступить к анализу свойств модулированных клеток. Исследование кривой роста клеток первичной культуры интимы показало, что первые 5 суток число клеток не менялось, на 6-7-й день пребывания в культуре количество их резко возрастало и через 2-3 суток удваивалось.

Сочетэнное применение имуноцитохимического и авторадиографического методов исследования позволило установить, что на 5-й день культивирования клетки интимы визуально неизмененных участков аорты не включали ^Н-тимидин. На 7-й день опыта метки Зн-тимидина находили в окрашивающихся и неокрашивающихся на миозин ГМК культуры. При этом ДНК-синтезирующих ГМК было в 1.54.5 раза больше среди миозиннегативных клеток по сравнению

с клетками, которые реагировали с антителами к миозину.

ИммуноФлуоресцентный анализ культур (11 = 6 > интимы с помощью моноклональных антител к обшему эпитопу I и III типов коллагена показал. что в первые 3 суток опыта антитела не связывались с клетками. На 4-й день культивирования в цитоплазме части клеток появлялось специфическое свечение, локализующееся вокруг ядер. Число таких клеток на 4-й. 6-й. 8-й и 12-й дни культивирования составляло 14-20*'-. 18-24%. 44-5A?: н 76-89"'., соответственно. При этом окрашивание на коллаген наблюдали у миозиннегативных и миозинпозитивных клеток, и первых среди них было в 2.0-4.6 раза больше, чем вторых.

Визуальный анализ связывания ЛНП показал. что часть ГМК культуры имела специфическое свечение в виде небольших гранул, дисперсно распределенных по всей поверхности клеток. В процессе культивирования доля ГМК со специфическим свечением, как и число гранул на их поверхности. заметно повышались, и после 10-14 суток пребывания в культуре почти все клетки имели места связывания ЛНП. Сходные результаты были получены и при анализе поглощения Лил-меченных ЛНП. В первые 5 суток пребывания в культуре лишь часть ГМК интимы поглотала Дил-ЛНП. приобретая яркое свечение, локализованное вокруг ядра. В процессе роста культуры число таких клеток неуклонно повышалось и на 8-14-е сутки опыта их было более 90"- от общего числа клеток культуры. При этом активность поглощения модифицированных ЛНП определялась не характером распределения миозина, а наличием внутриклеточных липидных включений. Полученные данные свидетельствуют, что изменение Фенотипа ГМК интимы аорты человека в первичной культуре сопровождается активизацией пролиферации и синтеза коллагена.

Это. очевидно. ведет к повышению обмена вешеств в клетках. что и активизирует экспрессию рецепторов к ЛНП. Вместе с тем. мы не обнаружили предполагавшейся ранее ССЬак»1еу-Сый1рЬе11 еЬ »1.19013 последовательности между отдельными проявлениями Фенотипической модуляции, которые, по-видимому, протекают параллельно и независимо друг от друга•

Приведенный перечень основных Фактов, полученных в исследовании, позволяет представить возможную последовательность процессов, происходящих в артериальной стенке человека при• атеросклерозе. Схематично эта последовательность изменений в стенке аорты человека представлена на рисунке 3.

Нлкопдааае ЛНП в ннгвке (окисленная форма)

ажРАПттхльныа «акта] гик ашптнчкына «нтш гык

Г1ро/шфвр«цм Сит мпшг«па Эхсврессжя рецвигоре» я ЛШ1 Нлмене им цштасмпвп Ишвнои Атпшо» опридеш

Рис 3, Схема изменения Фенотипа ГМК в стенке артерий человека при атеросклерозе.

Как можно видеть из схемы, наиболее ранние изменения в интиме артерий человека проявляются накоплением ЛНП. Очевидно, частицы ЛНП проникают в стенку сосуда из кровотока и связываются с протеогликанами соединительнотканного матрикса интимы [Слпи ш сН ¿Л., 19063. В результате длительного пребывания ЛНП в стенке сосуда они меняют свою конфигурацию и окисляются СГ'а1ц|',к1 иЬ

:i i. „ ¡'.'М'м . Патогенней э^'Лект окисленного холестерина на сосудистую стенку ранее показан о оаботах А.М.Вихеота и соавт. C1?87j. Сравнительно недавно стал понятен механизм его действия, а окисленные ЛНП обнаружены в пораженных атеросклерозом артериях человека и животных ГГ> t <.м1 м.кч п гЧ- 1.98П . Экспериментально

доказано. что окисленные ЛНП или их дериваты меняют взаимодействие клеток сосуда с матриксом, что инициирует у эндотелиальных клеток, ГМК синтез и секрецию хемоаттрактивного Фактора, который стимулирует пролиферацию и приток к интиме Мн-МФ и Т-лимЛоцитов С С и 'з: 1 i ну • et al., 1ЭЭ0] . Сравнительно недавно описана группа адгезивных молекул, экспрессируюиихся на поверхности эндотелия и способствующих прикреплению к ним моноцитов и лимфоцитов крови СП^Ьогп f3t, al., 19ВЭ; Rice et al., rat". Показаны и способы проникновения моноцитов в толщу интимы ГГСечт iI у, 13013. В пользу такой последовательности изменений, происходящих в сосудистой стенке человека, свидетельствует корреляция между уровнем ЛНП в крови и степенью поражения артерий атеросклерозом * ГInknlоь ' ot al., 19G13. Сходную динамику инфильтрации сосуда ЛНП. а затем Мн-КФ отмечали и в экспериментах с кормлением животных холестерином С Rosenfeld ot al.. 1307Э.

Скопления Мн-МФ постоянно встречаются в ннтиме аорты лиц молодого возраста. они локализуются в непосредственной близости от измененных ГМК, зачастую контактируя с ними. Мн-МФ известны как активные продуценты многочисленных Факторов роста CSchwartz et al.,17W], которые ускоряют изменение фенотипа ГМК при совместном культивировании клеток CRennick et al., 19883. Сходную роль Нн-МФ проявляют и в очаге повреждения кожи TWalsli et al..

19903. Поэтому их можно рассматривать как наиболее веролтный инициатор изменения фенотипа ГМК • в участках раннего атеросклеротического поражения артерий человека.

Факт • присутствия фенотипически измененных ГМК в стенке атеросклеротическн пораженных артерий человека подтверждался многократно, в том числе выявлением ГМК с измененной ультраструктурой СИоьи 19643, особой экспрессией десмина , СсьЬЫат, 190С; ОгЬогп et а1. , 19073 и других маркеров модуляции СОгекЬоу еЬ а1. , 1906; Ьатаггеге аЪ а1. , 1968: Рппгеуа и* а1.т19093. В нашем исследовании такие клетки встречались в атеросклеротичеких бляшках аорты и коронарных артерий, в свежевыделенной суспензии и первичной культуре клеток интимы аорты. Особенно важен Факт обнаружения фенотипически измененных ГМК в участках аорты, предрасположенных к атеросклеротическому поражению. Он указывает на возможное участие этих клеток в патогенезе атеросклероза, в частности в Формировании Фиброзной бляшки. Очевидно, фенотипически измененные ГМК, с их высокой активностью пролиферации и синтеза компонентов соединительноткан-

Г"

ного натрикса, ответственны за Формирование клеточной массы и Фиброзного остова бляшек.

Перечисленная последовательность изменений в интиме аорты человека, от момента инфильтрации ее ЛНП в детском возрасте до последующих скоплений Мн-Мф в юношеском и молодом возрасте, от изменения фенотипа ГМК до Формирования фиброзной бляшки у лиц среднего и пожилого возраста - все это указывает на длительное развитие процесса, который, очевидно, начинается еще у детей и проявляется в молодом и зрелом возрасте.

Кроме того. в развитии атеооскл^Ъотического процесса можно выделить две стадии. Первая из них характеризуется инФнльтраикей интимы Мн-МФ и накоплением в ней липндов, включая внутриклеточных, а вторая - увеличением клеточной массы и соединительнотканных волокон с образованием Фиброзных бляшек. Переход из одной стадии в другую осуществляется при непосредственном участии Фенотипически измененных ГМК. В связи с этим понятна важность этапа Ленотипической модуляции ГМК в развитии атеросклероза. Изменение Фенотипа ГМК несомненно занимает ключевое. центральное место в цепи процессов, заканчивающихся формированием фиброзной бляшки - наиболее типичного проявления атеросклеротического процесса.

Изменения в участках атеросклеротического поражения сосуда человека можно рассматривать как стереотипный процесс защитно приспособительного характера, направленный либо против накопления ЛНП в интиме сосуда, либо на создание дополнительного барьера при возросшей проницаемости эндотелия.

Для понимания причин, по которым эволюционно закрепился такой способ ответа, следует указать, что сосудистая стенка состоит преимущественно из ГМК, а остальная часть клеток (от 2 до С'Л Мн-МФ и Т-лимфоцитов) имеет гематогенное происхождение. В ряде руководств указано, что в интиме »г медии артерий человека встречаются Фибробласть». Мы таких клеток не находили, об этом же свидетельствуют данные электронно-микроскопических С Сое? г, НаизЪ, 1Э723 и иммуноцитохимических СБоип c?t <з1, , 190С0 исследований. Поэтому, очевидно, что в условиях повреждения эндотелия или возросшей функциональной нагрузки на сосудистую стенку морФо-Функииональная перестройка ГМК будет наиболее быстрым и

эффективным ответом. по сравнению с предполагаемым ранее прорастанием сосудов в стенку артерий и последующей реакцией перицитов СД.С.Саркисов и соавт..19863.

В определенном смысле механизмы регуляции Фенотипа ГИК сосудов остаются до конца не изученными. хотя и существует обилие Фактов» обьясняющих основные принципиальные положения. Сложность изучения указанных механизмов, как оказалось, связана с отсутствием выраженных корреляций между различными признаками модуляции. Это стало понятно после серии наших опытов по выяснению особенностей Фенотипически измененных ГМК в первичной культуре интимы аорты человека, в частности при непосредственном сопоставлении характера экспрессии миозина в ГМК с активацией пролиферации и синтеза коллагена. Полученные данные частично обьясняют истоки неудач наших ранних и более поздних попыток исследователей воздействовать на процесс модуляции Т!(у т (Ч

,ЮЭОЭ. Поэтому, не отрицая наличие общих связей между различными проявлениями Фенотипической модуляции ГМК, мы подчеркиваем их специфичность и относительную независимость друг от друга.

С другой стороны, сравнительно недавно появились сообщения об удачных попытках инициации ССол иЬ п1. , 1Т)<">1 и блокирования процесса ГБЬин е»I а1.,19Э*"0 модуляции ГМК в сосудах экспериментальных животных. Это имеет важное значение для определения перспективы дальнейших исследований. Приведенные Факты указывают на реальную возможность целенаправленной регуляции ключевого этапа патогенеза атеросклероза - модуляцию фенотипа ГМК.

Таким образом, открывается перспектива длч принциципиально нового

подхода к пооЛилактике н лечению этого заболевания.

Кюоме того. разработанные способы идентификации клеток и количественной оценки изменения Фенотипа ГМК в первичной культуре интимы аорты человека позволяют рекомендовать ее в качестве наиболее приближенной и адекватной модели при изучении морфофункииональных свойств клеток сосуда и при тестировании ряда Фармакологических препаратов, в том числе и антиатерогенного действия.

выводы:

1. С помошью современных методов исследования с использованием комплекса моно- и поликлональных антител, на материале срочных вскрытий и клетках первичной культуры интимы аорты человека получен ряд новых Фактов, проясняющих роль гладкомышечных клеток (ГМК) в патогенезе атеросклероза и доказывающих их Фенотипическуго модуляцию в процессе атерогенеза.

2. В атеросклеротической бляшке аорты человека, наряду с типичными "сократительными" ГМК, присутствуют две субпопуляции клеток, для одной из них характерна экспрессия десмина, а для другой - понижение содержания миозина и альфа-актина. Последние две субпопуляции клеток отличаются тем, что в них исчезают миоФиламенты и чрезмерно развиваются эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи. Появление этих клеток свидетельствует о том, что ГМК бляшки способны менять свой Фенотип с "сократительного" на "синтетический".

3. В атеросклеротических бляшках коронарных артерий человека обнаруживаются сходные варианты Фенотипов ГМК с измененной

ультраструктурой. экспрессией десмина. миозина и ¡зльФа-актима. Это свидетельствует об универсальном механизме развития фенотипической модуляции ГМК в артериях мышечно-эластического и эластического типов.

А. По мере увеличения возраста в коронарных артериях детей утолщается интима и в ней увеличивается число ГМК: при этом последние теряют способность экспрессировать десмин.

5. У лиц молодого возраста в участках интимы аорты, предрасположенных к поражению атеросклерозом• встречают ся ГМК, экспрессируюыие десмин и содержащие хорошо развитый эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи. Появление таких признаков у ГМК является следствием изменения их Фенотипа, начальным этапом Формирования фиброзной бляшки.

6. У части <20"/.) лиц молодого возраста в участках, предрасположенных к поражению атеросклерозом, единичные ГМК интимы экспрессируют не свойственные им антигены гистосовместимости 11 класса (. Н1_Л~БП!) , что можно расценивать как участие иммунного компонента в развитии атеросклероза.

7. Появление Фенотипически измененных ГМК в аорте лиц молодого возраста всегда сочетается с инфильтрацией интимы моноцитов-макрофагов <Мн-Мф> и, значительно реже Т-лимфоцитами. Учитывая способность Мн-Мф продуцировать многочисленные факторы роста, эти клетки можно расценивать как наиболее вероятный инициатор изменения фенотипа ГМК интимы в участках раннего атеросклеротического поражения.

3. Наиболее ранние изменения интимы аорты наблюдаются уже у детей и проявляются они в виде накопления апопротеина В (ano В), преимущественно в составе липопротеидов низкой плотности. В участках аорты. предрасположенных к поражению атеросклерозом, скопления ano В появляются раньше и развиваются интенсивнее, чем в других участках того же сосуда.

9. У лиц старше 20 лет в интиме аорты накапливается апопротеин Е, который локализуется внеклеточно. Топография распределения этого апобелка индивидуально варьирует.

10. Первичная культура нормальной интимы аорты человека характеризуется выраженной гетерогенностью клеточного состава и полиморфизмом ГМК. Доля фенотипически измененных ГМК и Мн-М6 в культуре варьирует в каждом случае, и коррелирует со степенью поражения сосуда атеросклерозом.

11. В процессе роста первичной культуры интимы аорты человека ГМК спонтанно меняют Фенотип с "сократительного" на "синтетический", что сопровождается изменением их ультраструктуры, переключением экспрессии миозина и альфа-актина.

12. Модуляция фенотипа ГМК в первичной культуре сопровождается активацией пролиферации, синтеза компонентов интерстициального коллагена и повышением активности рецепторов к ЛНП.

13. Анализ морфо-Функциональных свойств ГМК в нормальных и пораженных атеросклерозом артериях человека, а также в первичной культуре аорты свидетельствует, что изменение фенотипа ГМК является одним из ключевых моментов патогенеза атеросклероза.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Babaev V.R., Romanov Y. fi. Distribution of myosin in primary culture of human aortic intimal cells. // J Cell Biology 1383, vol 97, abstr 11a

2. Бабаев В.P., Антонов А.С., Романов Ю.А., Рукосуев B.C., Репин B.C. Распределение миозина в первичной культуре клеток интимы аорты человека. // Билл Экспер Биол и Мед 1984, в 3, стр 350353.

3. Бабаев В.Р., Антонов А.С., Николаева М.А. Визуальный анализ мест связывания липопротеидов низкой плотности с клетками стенки аорты человека в первичной культуре. // Тезисы докл. "Актуальные проблемы патогенеза атеросклероза", Л. 1985, стр 32.

4. Бабаев В.Р., Антонов А.С. Полиморфизм клеток интимы аорты человека по распределении миозина в первичной культуре. // Тезисы докл."Актуальные проблемы патоген, атеросклероза" Л.1985,стр 76.

5. Бабаев В.Р., Хлюстов В.П., Трусов О.А.. Мишарин А.Ю. Распределение липопротеидов в стенке аорты человека. // Архив п^.ологии 1987. в 5, стр 35-39.

6. Бабаев В.Р., Тарарак Э.М. Полиморфизм гладкомышечных клеток атероматозной бляшки аорты человека. // Билл Эксп Биол Мед 1988, в 7, стр 118-120.

7. Babaev V. R. , flntonov О. S. , Zacharova О. В. , Romanov Yu. П. , KrushinsUy ft.V., Tsibulsky V.P., Shirinsky V.P., Repin V. S. , Smirnov V.N. Identification of intimal subendothelia1 cells from human aorta in primary culture. // Atherosclerosis 1988, v 71, pp 45-56.

8. Babaev V. R. , ТагагаЦ E. M., Dedyueva E. Yu. Heterooeneity of smooth muscle cells in atheromatous olacjue of human aorta. // 5th Munster international arteriosclerosis symposium, 1Э8В, abstr 24a.

9. Babaev V. R. , flntonov П. S. , Domogatsky S. P. Heterogeneity of human aortic subendothelial cells in primary culture. Myosin distribution. // 8th Intern. Symposium on Atherosclerosis, Rome 1ЭВ8, abst r 40a

10. Sukhova G. K. , Babaev V. R. , Tararak E. M. U11 rast ruct ure and expression of cytoskeletal proteins in coronary artery of children and adults. // Internarional atherosclerosis congres, Vienna 1989, abst r 23.

11. Babaev V. R. , Dergunov 0. D. , Sirotkin V. N. , Tararak E. M. , Yanushevskaya E.V. , Trakht I.N. Distribution of apol i poprotein E in normal and atherosclerotic human aorta. // The congress "Regression of human atherosclerosis", Stockgolm, 1ЭВЭ, abstr 41.

12. Бабаев B.P, Бобрышев Ю.В., Стенина О.В. и др. Фенотипические варианты гладкомымечных клеток в атеросклеротической бляшке аорты человека. // Архив патологии 1990, в 5, стр 36-41.

13. Бабаев В.Р., Дергунов А.Д., Сироткин В.Н., Янушевская Е В и др. Локализация апопротеина Е в стенке аорты человека в норме и при атеросклерозе. // Архив патологии 1990, в 7, стр 52-57.

14. Babaev V. R. , Bobrishev Yu. V. , Stenina О. V. , Tararak E. M. , Gabbiani Б. Heterogeneity of smooth-muscle cells in an atheromatous plaque of human aorta. // Rmer J Pathol. 1990, vol 13S, pp 1031-1042.

15. Babaev V. R. , Dergunov 0. D. , Chenchik О. Я. , Tararak E. M. , Yanushevskaya E.V. , Trakht I.N. , Sora C. , Smirnov V.N. Localization of apo1ipoprotein E in normal and atherosclerotic human aorta. // Atherosclerosis 19Э0, vol 85, pp 23Э-247.

16. Babaev V. R. , Bobryshev Yu. V. , Sukhova G. К. , Tararak E. M. The monocytesVmacrophages and smooth muscle cells ratio in early atherosclerotic lesion of human aorta. // J. Histochem and Cytochem 1990, vol 38, abst r 124a.

17. Сухова Г.К., Бабаев В.Р., Сироткин В.Н., Тарарак Э.М. Изменение фенотипа гладкомышечных клеток коронарных артерий человека с возрастом и при развитии атеросклероза. // Кардиология 1991, в 8, стр 15-19.

18. Бабаев В.Р., Сухова Г.К., Бобрыыев С.В. и др. Инфильтрация моноцит-макрофагов в ранних атеросклеротическнх поражениях аорты человека. // Арх патологии 1991, в 10, стр 48-53.

19. Бобрышев С.В., Сухова Г.К., Бабаев В.Р., Казанцева И.А. Межклеточные контакты в участках раннего атеросклеротического поражения аорты человека. // Арх патол 1991, в 11, стр 38-42.

20. Bobryshev Yu. V., Sukhova G. К., Babaev V. R. Ult rast ruct ure of cell-to-cell contacts in early atherosclerotic lesions of human aorta. // 9th International symposium on atherosclerosis, Chicago 19Э1, abstr

Соискатель