Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Разработка технологии получения растворимой формы тромбопластинового реагента

На правах рукописи УДК 616.155.392-036.11-005.1-08-06

Репнякова Евгения Михайловна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ТРОМБОПЛАСТИНОВОГО РЕАГЕНТА

14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург- 2005

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Л.Н. Тарасова

Официальные оппоневты:

доктор медицинских наук, профессор Л.П. Папаян

доктор медицинских наук, профессор В.Л. Эмануэль

Ведущая организация:

Первая военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Защита состоится

униаЗ&РЯ 2005 г. в №

час на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии МЗ РФ по адресу: 193024, г. Санкт-Петербург, 2-ая Советская ул., 16 Автореферат разослан » с-ГЛ- 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Т.В. Глазанова

М6"4

МкО ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нарушения системы гемостаза характерны для многих заболеваний и патологических состояний (Козинец М.И., Макаров В.А., 1997). Чтобы обеспечить их диагностику и правильную коррекцию, необходимы информативные и стандартизованные методы исследований, основанные на применении качественных диагностических реагентов (Бокарев И.Н., 1995; Кондратьева Т.Б. и соавт., 1995; Becker D.et al., 1993; Bophy M. et al., 1993). Одним из наиболее распространенных тестов, применяемых в специализированных и клинико-диагностических лабораториях, является тест Квика (определение протромбинового времени с полным тканевым тромбопластином), выявляющий уровень факторов протромбинового комплекса. На его основе разработаны методы исследования активности отдельных прокоагулянтов. Именно этот тест используется при контроле терапии антикоагулянтами непрямого действия (АНД) и диагностике заболеваний печени (Козлова Т.В., 2001).

Тромбопластиновые реагенты, применяемые в методе, получают из разного биологического сырья и по разным технологиям; поэтому они обладают разной активностью и чувствительностью и результаты определения протромбинового времени трудно сравнимы (Панчеико Е.П., Добровольский А.Б., 1999; Берковский А.Л.,2000; Зубаиров Д.М., 2000; Poller L. et al., 1998). Следовательно, разработка отечественного тромбопластинового реагента из видоспецифичного сырья, обладающего высокой чувствительностью, является актуальной.

Помимо пробирочного воспроизведения метода в последние годы все более широко применяются полу- и автоматические коагулометры, требующие использования в тест-системах коммерческих лиофилизированных диагностикумов высокого качества, имеющих длительный срок годности. Их использование также может оказывать

влияние на конечные результаты и п иДЯйИЙИ^^ЙЙ^^еЬиям между

•а.

сл

09 i з

данными пробирочного и аппаратного воспроизведения (Барроуклиф Т.В., 1995; Бокарев И.Н., Козлова Т.В., 2000; Tabemer D.A. et al. 1990; Kitchen S., 1997). Используемые способы выражения результатов теста Квика в виде протромбинового времени свертывания в секундах, протромбинового отношения (ПО) и % протромбинового теста (%ПТ) имеют ряд недостатков.

На современном этапе необходимо применение тромбопластинов, которые стандартизованы согласно требованиям Всемирной организации здравоохранения (Комитет экспертов ВОЗ 1985; 1999). Они должны обладать чувствительностью к дефициту фактора VII, не содержать гемоглобин и инфекционные агенты, бьггь стабильными и откалиброванными по Международному референтному тромбопластину с определением Международного индекса чувствительности (МИЧ). Использование таких тромбопластиновых реагентов сократит время проведения исследований и повысит их точность, а также обеспечит возможность выражения результатов в единицах Международного нормализованного отношения (MHO), величину которого необходимо определять при контроле терапии АНД (Баркаган З.С. и соавт., 2003; Анохина Т.Ю. и соавт., 2002; Голевцова З.Ш. и соавт. 1999; Lind S.E. et al, 1999; Woodhams B.J. et al, 1999).

Приготовление растворимой формы реагента предусматривает очистку сырья от биологического балласта, проведение которой неизбежно приводит к снижению его активности и чувствительности. В связи с этим, важное значение приобретает оптимизация условий выделения из сырья тромбопластинового экстракта и дальнейшее хранение его до сублимационной сушки и при ее проведении. Основными причинами снижения активности и чувствительности реагента может быть развитие процессов перекисного окисления липидов и активации фосфолипаз, разрушающих фосфолипидную часть тромбопластина (Байкеев Р.Ф., 1994; Бышевский А. Ш. И соавт., 1993).

Предотвратить это возможно путем применения ограждающих веществ. При их оптимальном качественном и количественном составе денатурация и окислительная модификация тканевого фактора и его липидной части могут быть значительно уменьшены (Бойко Н.М. и соавт., 1984; Белоус A.M., Бондаренко В.А., 1982).

Производство отечественного реагента, сопоставимого по качеству с зарубежными аналогами, пригодного для пробирочного и аппаратного выполнения метода определения протромбинового времени будет во многом способствовать решению проблемы его стандартизации, в том числе унификации выражения результатов.

Цель исследования

Разработать технологию получения реагента тромбопластина растворимого, близкого по активности, чувствительности и стабильности к зарубежным аналогам, который можно рекомендовать для использования в клинико-диагностических лабораториях страны при определении протромбинового времени.

Задачи исследования:

1. Исследовать тромбопластическую активность гомогенатов, выделенных из кадаверного мозга и его серого вещества, в зависимости от режимов гомогенизации, сроков, условий хранения и количества используемых единиц (мозг одного кадавера или объединённый пул).

2. Оптимизировать процесс вьщеления из гомогенатов экстрактов, обладающих высокой тромбопластической активностью.

3. Определить взаимосвязь между количественным составом фосфолипидов в супернатантах и их тромбопластической активностью; установить минимальное количество гемоглобина в сырье и супернатантах, не влияющее на активность и последующую стабильность реагента.

4. Выбрать и оценить эффективность ограждающих веществ и их концентраций для обеспечения стабильности реагента при длительном хранении.

5. Отработать оптимальный для сохранения тромбопластической активности продукта режим сублимационной сушки.

6. Исследовать чувствительность реагента тромбопластина растворимого к дефициту факторов VII и X; установить МИЧ на основании калибровки относительно зарубежных референтов.

7. Исследовать стабильность активности и чувствительности реагента при длительном хранении; оценить его пригодность для контроля терапии антикоагулянтами непрямого действия.

Научная новизна

Впервые разработана и запатентована технология производства отечественного реагента тромбопластина растворимого из серого вещества кадаверного мозга. Оценена тромбопластическая активность гомогенатов мозга, приготовленных из различных участков его, в зависимости от сроков и режимов хранения, количества единиц при изготовлении пула, режимов гомогенизации и центрифугирования. Выявлена прямая зависимость проявления тромбопластической активности реагента от количественного состава трех фосфолипидов в нем (фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина). Впервые предложены ограждающие вещества и их концентрации, сохраняющие активность реагента до и во время проведения сублимационной сушки и при хранении в течение 1 года.

Практическая значимость работы

Создана технология производства тромбопластинового реагента в растворимой форме, проведена его калибровка и определен Международный индекс чувствительности (МИЧ), близкий к единице

при хранении не менее 1 года. Утверждена Фармакопейная статья предприятия: ФСП № 42-0335-5799-04 от 29 сентября 2004 года на «Тромбопластин растворимый, лиофилизат для диагностических целей»; налажено мелкосерийное производство. Это позволило рекомендовать отечественный реагент дня использования в клинико-диагностических лабораториях страны для исследования протромбинового времени и выражения его результатов не только в % протромбинового теста (%ПТ), протромбинового отношения (ПО), но и в виде Международного нормализованного отношения (MHO), что важно при контроле терапии АНД.

Положения, выносимые на защиту

Обоснование зависимости получения активного и чувствительного реагента тромбопластина от условий хранения, гомогенизации, центрифугирования, экстракции сырья, выбора ограждающих веществ и последующей сублимационной сушки.

Технология получения лиофилизированной формы растворимого тромбопластинового реагента со сроком годности не менее 1 года и определение его Международного индекса чувствительности (МИЧ).

Возможность применения тромбопластинового реагента при контроле терапии антикоагулянтами непрямого действия.

Апробация диссертационного материала

Результаты исследования и основные положения работы доложены на научно-практических конференциях «Актуальные проблемы трансфузионной медицины» (Киров,2000), «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Киров, 2002), а также на итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии и переливания крови и Кировской Медицинской академии (1999-2000 гг.). По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 патента и 3 в

рецензируемых журналах.

Объем и структура работы

Диссертация включает следующие разделы и главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы исследований», две главы собственных исследований, «Заключение», «Выводы», «Практические рекомендации и «Список литературы». Работа изложена на 114 страницах компьютерного текста, содержит 2 рисунка и 16 таблиц. Библиография включает 103 источника отечественной и 52 -зарубежной литературы.

Данное исследование проводилось в ФГУ «КНИИГиПК Росздрава» (директор - доктор мед. наук, профессор С.Л. Шарыгин), в лаборатории биохимии крови (руководитель - доктор биол. наук, профессор ЛН. Тарасова) совместно с к.б.н. Е.Ю. Савиных, к.б.н. С.Г. Владимировой, к.м.н. Г.К. Платоновой, ст. лаб. О.В. Веселковой, лаборантами И.Н. Зимиревой, Е.А. Быковой, на станции переливания крови (главный врач Куноф В.К.) совместно с Г.А. Гребеневой, в клинической лаборатории (руководитель Т.А. Коряковцева), научно-производственном отделе совместно с врачом-лаборантом Н.Р. Решетниковой и лаборантом Л.А. Блиновой.

Лично автором выполнено: изготовление тромбопластинового реагента всех экспериментальных серий, исследование рН, активности и чувствительности сырья и реагента в течение срока хранения, определение фосфолипидного состава сырья, анализ полученных данных и их статистическая обработка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал исследования: в настоящей работе представлены результаты использования кадаверного головного мозга в качестве сырья для производства тромбопластина растворимого (ТР). Мозг брали

согласно Инструкции о порядке изъятия органов человека у доноров -трупов (Приложение 4 к Приказу № 189 Минздрава РФ от 10 августа 1993 г). Из него готовили гомогенат (55 экспериментальных серий), который замораживали и оттаивали одно-, двух-, трех- и четырехкратно. Для приготовления супернатантов гомогенат смешивали с очищенной водой (в соотношении 1:1, 1:2, 1:3 и 1:4) и центрифугировали одно-, двух-, трех- и четырехкратно в течение 20 или 30 мин при 600g или 800g и температуре +(5-10)"С. Равные объемы супернатантов смешивали, добавляя в получаемый экстракт ограждающие вещества в различных концешрациях. Из криопротекторов использовали сахарозу, маннит, сорбит, ДМСО, ПВП, из антиоксидантов - метабисульфит натрия, ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол). В качестве буферов применяли MES (2-(1Ч-морфолино)этансульфоновую кислоту), PIPES (пиперазин-N, N'-бис(2-этансульфоновую кислоту)), MOPS (3-(N-

морфолино)пропансульфоновую кислоту), HEPPSO (моногидрат р-гидрокси 4-(2-гидроксиэтил) 1-пиперазинпропансульфоновую кислоту), HEPES (Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-К'-2-этансульфоновую кислоту).

Методы исследования: количество гемоглобина в исходном сырье и полуфабрикате определяли гемиглобинцианидным методом. Содержание фосфолипидов в исходном сырье и готовом реагенте исследовали методом тонкослойной хроматографии в хроматографической камере на пластинах «Sorbfil», используя полярные растворители: хлороформ, метанол, уксусную кислоту и очищенную воду в соотношении 80:60:7,4:1,2. Идентификацию фосфолипвдов проводили, измеряя хроматографическую подвижность Rf с помощью свидетелей (растворов фосфолипидов): фосфатвдилхолина, фосфатндилсерина и фосфатидилэтаноламина фирмы «Sigma» (США). Эвтектическую температурную зону устанавливали с помощью аппарата УОП 000 001, замораживая реагент в парах жидкого азота и определяя состояние вещества.

Для оценки активности ТР протромбиновое время определяли пробирочным методом и с использованием фотооптического коагулометра "COAG-A-MATE ХМ" фирмы "Organon teknika" (Нидерланды). Результаты исследования выражали в секундах и в виде МНО. Чувствительность к дефициту факторов VII и X оценивали, исследуя протромбиновое время разных разведений пула донорской плазмы (Баркаган З.С., Момот А.П., 2002) с использованием субстратов, дефицитных по указанным факторам («bioMerieux», Франция). Определяли чувствительность к дефициту этих факторов разработанного нами тромбопластина растворимого (ТР), Isimat 1 фирмы «bioMerieux» (Франция) и Техпластина фирмы «Технология-Стандарт» (Россия). Определение МИЧ проводили, используя в качестве референта плацентарный тромбопластин Isimat 1 и Международный референтный тромбопластин rTF/95 (Комитет экспертов ВОЗ, 1999). Исследовали 26 образцов контрольной плазмы и 77 - больных, принимающих антикоагуляты непрямого действия Для статистической обработки полученных данных применяли регрессионный и дисперсионный анализ. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (р) принимался равным 0,05. Для оценки сопоставимости результатов определяли коэффициенты корреляции (г). Воспроизводимость результатов оценивали по коэффициентам вариации повторных измерений одной и той же пробы (CV), согласно рекомендации Международной федерации клинической химии (IFCC). Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ «Microsoft Excel» и «BIOSTAT 4.03.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оптимальные условия изготовления и хранения сырья для получения тромбопластина растворимого

Наиболее важным условием получения активного реагента,

чувствительного к дефициту факторов протромбинового комплекса, является выбор сырья. Использовали кадаверный головной мозг и его серое вещество. Установленные достоверные различия (р<0,05) активности цельного мозга (протромбиновое время в среднем было равно 17,6с до сублимационной сушки и 20,6с - после) и его серого вещества (16,0 и 17,5с соответственно) свидетельствуют о целесообразности использования последнего в качестве сырья при изготовлении реагента.

Изменение качественного и количественного состава фосфолипидов тромбопластина приводит к снижению его тромбопластической активности. Для более полного устранения гемоглобина, который является сильным окислителем и может инициировать процессы разрушения фосфолипидов, проводили десятикратную отмывку сырья и отделенного серого вещества очищенной водой; содержание его после последней отмывки было незначительное (не более 0,02 мг/мл). Сырье гомогенизировали в размельчителе тканей в течение 0,5 - 1 мин, получая однородный гомогенат. Продолжительность его хранения при ~(20±2)°С допустима в течение 2-х, а при -(40±2)°С - 4-х недель (табл. 1). Этого времени достаточно для накопления сырья и изготовления пула для производства реагента одной серии.

Таблица 1.

Изменение активности экстрактов в зависимости

Стат. показатель Исходная активность недели/-(20±2)°С недели/-(40±2)°С

2 4 8 2 4 8

Хер 14,9 15,3 15,85 16,8 15,2 15,4 15,9

0,46 0,75 0,94 1,03 0,86 0,99 0,91

Р - 0,168 0,016 0,001 0,342 0,166 0,006

Примечание: р - сравнение с исходной активностью

Отмечено увеличение тромбопластической активности сырья при

замораживании - оттаивании, что может быть связано с повышением количества фрагментов клеточных мембран. Наибольшей тромбопластической активностью обладал реагент, приготовленный из двукратно замороженного гомогената (16,0с до и 18,5с после сублимационной сушки).

Тромбопластически активные вещества из гомогенатов экстрагировали очищенной водой при тщательном перемешивании в течение 5 мин при +(37±0,5)°С и последующем центрифугировании в течение 20 мин при 600§, затем 30 мин при 800§ и температуре +5°С. Все отбираемые супернатанты проверяли на активность и содержание фосфолипидов. Определяли содержание фосфолипидов 5-ти супернатантов, полученных из 5-ти гомогенатов (табл. 2).

Таблица 2.

Показатели активности и содержания фосфолипидов _супернатантов (Хер ±БР; п=5)_

Центрифугирование ПВ (с) Фосфолипиды (%)

ФЭ ФХ ФС

1-е 17,8±0,9 4,7±1,5 2,6±1,2 1,0±0,8

2-е 14,4±0,7 10,8±1,6 5,0±1,6 2,0+0,8

3-е 13,7±0,6 9,0±2,1 43±1,4 2,3±0,8

4-е 14,7±0,6 9,3 ±2,4 4,0±1,6 1,5±0,01

5-е 17,3±1,5 4,3±1,4 2,3±0,8 0,8+0,5

Второй, третий и четвертый супернатанты имели активность, равную 14,4; 13,7 и 14,7с соответственно; количество ФЭ в них было не менее 9%, ФХ не менее - 4%, а ФС - 1,5%. Поскольку они имели высокую активность, их смесь использовали для приготовления реагента.

Активность получаемых супернатантов зависит также от соотношения гомогената и воды при проведении экстракции. Согласно

полученным результатам, соотношения, равные 1:1 и 1:2, являются оптимальными, так как обеспечивают наибольшую активность экстрактов - 14,7 и 15,2 с (р>0,05). При исследовании зависимости между активностью экстрактов и количеством единиц сырья выявили, что наибольшую активность имеет пул из восьми единиц (14,6 с). Результаты использования его в тесте Квика показали минимальный коэффициент вариации (СУ=1,4%), поэтому для производства тромбопластинового реагента следует рекомендовать смесь не менее 8 единиц сырья (табл.3).

Таблица 3.

Активность экстрактов, полученных из разных

Стат. показатель Единицы мозга

1 5 8

Хер 16,1 15,3 14,6

1,69 1,15 0,21

СУ(%) 10,5 7,6 1,4

Чтобы сохранить активность фосфолипидного сырья до и во время сублимационной сушки и получить реагент с высокой стабильностью, мы использовали различные ограждающие вещества, предотвращающие его разрушение. Из буферных систем были отобраны 0,05М растворы НЕРРБО или НЕРЕБа, обеспечивающие необходимые, близкие к нейтральным, значения рН среды продукта при хранении его до и после сублимационной сушки. Из антиоксидантов следует использовать 0,005 М метабисульфита натрия, из криопротекторов - 2% раствор сахарозы (конечная концентрация).

Для оценки результативности применения ограждающих веществ при проведении сублимационной сушки и при последующем хранении лиофилизированного реагента исследовали активность и рН. Проверку проводили до и после сублимационной сушки, далее - в течение 15-ти

месяцев хранения (табл. 4).

Таблица 4.

Активность тромбопластина растворимого (ПВ,с) до, после сублимационной сушки и при хранении (п=10)

Стат показатель Сроки исследований (месяцы)

полуфабрикат реагент 3 15

Хер 14,7 15,8 15,5 15,8

БЭ 0,68 0,82 1,17 0,83

Р1 - 0,003 - -

Р2 - - 0,461 0,852

Примечание:

р,- сравнение активности полуфабриката и реагента после сушки; р2- сравнение активности реагента после сушки и при хранении

Полученные данные показали, что добавление ограждающих веществ в реагент обеспечивает сохранение активности его в течение 15 месяцев (р>0,05). Поскольку значения рН также соответствовали установленным нами требованиям (были близки к нейтральным: рН 6,5 -7,7), мы считаем эффективным действие выбранных ограждающих веществ.

Отработка режимов замораживания и сублимационного высушивания тромбопластина растворимого

Для выбора параметров замораживания и режима сублимационной сушки тромбопластина растворимого определили эвтектическую температурную зону реагента (Тд); она составила (-42 )°С. Продолжительность стадии сублимации при отрицательных значениях температуры продукта равнялась 11±1 часов; по истечении этого времени температура повышалась до положительных значений и начиналась стадия десорбции (досушивания). Определение ее продолжительности необходимо для получения значений и минимальных колебаний уровня остаточной (связанной) влаги (ОВ). Стадия досушивания составила в среднем 12 ± 1 часов (рис. 1).

20 0 -20 -40 -60 -80

! 1

■-1* : 1 ■ > — — UT ri 21 31 41 51 81 71

!

1

4-

Время сушки,ч

Рисунок 1. График сушки тромбогшастина растворимого.

Остаточную влажность ТР определяли сразу после сублимационной сушки и в процессе хранения. После сушки она составила в среднем 1,43%, при хранении в течение года обнаружено ее повышение (в среднем 1,82%), однако, этот показатель не выходил за пределы допустимой величины (был не более 2%). Такой разброс значений ОВ получен при создании мелкозернистой плотной структуры сухой таблетки, что было достигнуто добавлением сахарозы в реагент для получения раствора 2% конечной концентрации. Остаточная влажность ТР всех серий отвечала требованиям на протяжении всего срока хранения, что подтверждает эффективность применяемых ограждающих веществ и правильность проведения процесса досушивания. Лиофилизированный реагент был хорошо растворим в течение 2-х минут; растворенный водой до исходного состояния, имел вид слегка мутного раствора, без хлопьев.

Исследование чувствительности к дефициту факторов VII и X

Чтобы определить соответствие тромбопластина растворимого современным требованиям ВОЗ к тромбопластиновым реагентам, оценивали его чувствительность к дефициту факторов VII и X. Определяли чувствительность ТР, ЬтШ 1 и Техпластина к дефициту

этих факторов. Ее оценивали по удлинению протромбинового времени при исследовании различных разведений нормальной плазмы после добавления к ним субстратной плазмы, дефицитной по указанным прокоагуляитам (табл. 5).

Таблица 5.

Сравнение чувствительности тромбопластинов к VII и X факторам

Активность Протромбиновое время, с

фактора в плазме, % Isimat 1 Техпластин ТР

100 30,2 30,5 28,5

VII 50 35,5 35,2 33,0

10 62,5 53,2 57,2

1 72,0 64,5 87,0

100 32,2 41,5 31,2

50 49,5 50,2 39,0

10 87,0 64,2 71,5

1 97,0 81,5 80,0

При снижении активности фактора VII в 2 раза протромбиновое время, измеренное с использованием Isimat 1, увеличилось в 1,17, с Техпластином - в 1,15, и ТР - в 1,15 раз. При уменьшении активности фактора VII в 10 раз этот показатель увеличивался соответственно в 2,00; 1,17 и 2,00 раза. При снижении активности фактора X в 2 раза протромбиновое время, измеренное с Isimat 1, удлинилось в 1,50, с Техпластином - в 1,20, и ТР - в 1,25 раз. При разведении плазмы в 10 раз показатели увеличились в 2,70; 1,50 и 2,29 раз соответственно. Согласно проведенным исследованиям, разработанный нами тромбопластиновый реагент превосходит по чувствительности к факторам VII и X отечественный аналог (Техпластин) и приближается к зарубежному (Isimat 1). Исследование чувствительности к фактору VII можно использовать в качестве скринингового теста, определяющего качество сырья, полуфабриката, а также готового реагента при его производстве.

Определение Международного индекса чувствительности ТР

Объективная интерпретация результатов определения протромбинового времени возможна лишь при использовании тромбопластинов, в наименьшей степени изменяющих чувствительность при хранении. Стабильные реагенты дают наименьшие межфлаконные вариации при выполнении исследований. Исследовали чувствительность тромбопластина изготовленных нами 3-х экспериментальных серий (011102, 051102, 030303), используя в качестве референта Мто1 1 фирмы «ЫоМепеих» (Франция); его МИЧ равен 1,01. Поскольку этот реагент откалиброван по Международному эталону, мы сочли возможным применить его в качестве референта. Было определено протромбиновое время 18-ти образцов плазмы доноров и 55 - больных, принимающих антикоагулянты (варфарин) через 1, 6 и 12 месяцев хранения (табл.6).

Таблица 6.

Изменение чувствительности (МИЧ) тромбопластина растворимого

экспериментальных серий в процессе хранения

МИЧ

№ серии 1 месяц 6 Изменение по сравнению с первоначаль ным, % 12 Изменение по сравнению с первоначаль ным, %

ТР 011102 1,007 1,030 +2,23 1,040 +3,28

ТР 051102 1,062 1,060 -0,19 1,086 +2,26

ТР 030303 1,049 1,020 -2,76 1,071 +2,54

На основании проведенных исследований был установлен МИЧ ТР 3-х экспериментальных серий; он составил 1,007; 1,062 и 1,049. В процессе хранения реагента МИЧ был равен 1,030; 1,060; 1,020 и 1,040; 1,086; 1,071 соответственно; он изменялся в среднем не более, чем на

2 - 3 %. Это свидетельствует о стабильности тромбопластина в отношении сохранения высокой чувствительности в течение установленного по активности срока годности.

Помимо Ыта1 1 в качестве референта для определения МИЧ тромбопластина растворимого был использован также Международный референтный тромбогшастин - Человеческий рекомбинангный гТТУ95, утвержденный экспертами ВОЗ в 1996 году; МИЧ - 1,00. Поскольку проводили предварительное определение МИЧ по [эта! 1, показавшее высокую чувствительность реагента, калибровку по гТТ/95 выполняли на меньшем, чем рекомендуемое ВОЗ, но допустимом количестве исследуемых образцов: 8 -нормальной плазмы (доноров) и 22 - больных, длительно принимающих антикоагулянты непрямого действия (рис. 2).

1лПВТР(с020204)

Рисунок 2. Определение МИЧ тромбопластина растворимого серий 010504 и 020204.

МИЧ вычисляли по уравнению линейной регрессии графиков, построенных на основании натуральных логарифмов протромбинового времени, с анализируемым тромбопластином и Международным референтным rTF/95. Уравнение линейной регрессии, полученное по результатам исследования тромбопластина растворимого серии 010504, было: у=1,0154х - 0,0827. Тогда МИЧ этой серии TP равняется 1,00*1,0154=1,02. А уравнение линейной регрессии, полученное по результатам исследования TP серии 020204, было: у=1,0783х - 0,2578, следовательно, МИЧ=1,00*1,0783=1,08. То есть МИЧ тромбопластина растворимого двух серий был определен равным 1,02 и 1,08. Такой близкий к 1,00 показатель подтверждает высокую чувствительность полученного реагента при сравнении с Международным референтным тромбопластином rTF/95 и возможность его использования в качестве рабочего референта при производстве последующих производственных серий тромбопластина растворимого.

Оценка сопоставимости результатов исследований при применении различных тромбопластинов

Для оценки сопоставимости результатов протромбинового времени, полученных при применении тромбопластинов с различной чувствительностью, произведенных разными фирмами- изготовителями, определяли коэффициент корреляции (г). Данные, полученные при воспроизведении метода определения протромбинового времени пробирочным способом, представлены в таблице 7. При этом были использованы следующие тромбопластины: TP (серия 010504), Техпластин и Neoplastin Plus. При сравнении значений MHO, полученных при использовании TP и Техпласгина, выявлена более тесная связь (i=0,96), чем при использовании TP и Neoplastin Plus (г=0,91) и Техпласгина и Neoplastin Plus (г=0,94). Это можно объяснить

тем, что Международные индексы чувствительности ТР и Техпластина близки друг другу и не превышают значения 1,02 и 1,1 соответственно.

Таблица 7.

Корреляция значений MHO плазмы больных, принимающих АНД, при использовании разных тромбопластинов (п=20)

Сравниваемые реагенты Коэффициент корреляции, г

ТР/Техпластин 0,96

TP/Neoplastin Plus 0,91

Техпластин/ Neoplastin Plus 0,94

Примечание: TP (010504) МИЧ 1,02 Техпластин МИЧ 1,10 Neoplastin Plus МИЧ 1,27

Таким образом, чем ближе чувствительность тромбопластиновых реагентов Международному стандарту, тем выше сопоставимость результатов исследования, выраженных в виде Международного нормализованного отношения (МНО) и объективнее контроль терапии антикоагулянтами непрямого действия.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения растворимого тромбопластинового реагента из серого вещества кадаверного мозга, обладающего высокой чувствительностью к дефициту факторов VII и X.

2. Международный индекс чувствительности (МИЧ) тромбопластина растворимого, установленный на основании калибровки относительно Международного референтного тромбопластина гТТ/95, близок к 1,00 (1,02 - 1,08), что подтверждает его высокую чувствительность и возможность использования при контроле терапии ангикоагулянтами непрямого действия.

3. Наиболее высокой тромбо пластической активностью (14,6с±0,21; СУ=1,4%) обладает пул из серого вещества восьми единиц

мозга, подвергнутый двукратной заморозке и последующему оттаиванию. Гомогенизацию сырья необходимо проводить в течение 0,5-1 минуты, полученные гомогенаты допустимо хранить в течение 2-х недель при -(20±2)°С и 4-х - при -(40±2)°С.

4. Наибольшую активность экстрактов обеспечивают соотношения гомогената и воды 1:1 и 1:2, центрифугирование 20 минут

при 600g с последующим трехкратным центрифугированием по 30 *

минут при 800g и температуре +(5±2)°С.

5. Супернатанты с высокой активностью получаются после второго, третьего и четвертого центрифугирования (14,42,13,67 и 14,67с соответственно); количество ФЭ в них не ниже 9%, ФХ - не менее 4%, а ФС - 1,5%.

6. Стабильность реагента при хранении обеспечивает применение следующих защитных веществ: 0,05М растворов буферов HEPPSO или HEPESa, антиоксиданта 0,005 М раствора метабисульфита натрия, криопротектора - 2% раствора сахарозы (конечной концентрации).

7. Определены оптимальные параметры проведения сублимационной сушки для сохранения тромбопластической активности и допустимой остаточной влажности реагента: температура материала при сублимации в пределах -(25-40)°С, конденсатора в камере не выше -(60)°С, давление в камере сублиматора на уровне от 7-16 Па, на этапе досушивания - не выше 14 Па. Продолжительность стадии сублимации при отрицательных значениях температуры продукта -11+1 час, при положительных -12 ± 1 час.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Тромбопластиновый реагент, разработанный в ФГУ «КНИИГиПК Росздрава», может быть рекомендован для широкого использования в клинико-диагностических лабораториях страны при исследовании

протромбинового времени и выражении его результатов в виде MHO, необходимого при контроле терапии антикоагулянтами непрямого действия.

2. Для получения качественного реагента, применение которого в методе Квика позволит снизить вариации метода, необходимо соблюдать требования по: срокам хранения, условиям отмывки, режимам гомогенизации и центрифугирования сырья. При изготовлении пула сырья следует соблюдать требования по использованию оптимального количества единиц.

3. При определении качества сырья и полуфабриката на промежуточных этапах производства тромбопластинов, как скрининговый тест можно рекомендовать исследование чувствительности к фактору VII.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Репнякова Е.М. Патент Способ сохранения активности сырья для изготовления тромбопластина полного растворимого до и во время лиофилизации/Е.М. Репнякова, JI.H. Тарасова, Е.Ю. Савиных, Л.Н. Гонин, Н.Р. Решетникова//ФГУ «КНИИГиПК Росздрава» № 2161975 от 05.01.2000г.

2. Репнякова Е.М. Патент Способ повышения качества сохранения активности сырья для изготовления реактива тромбопластина полного растворимого до и во время сублимации/Е.М. Репнякова, Л.Н. Тарасова, С.Г. Владимирова//ФГУ «КНИИГиПК Росздрава» № 2245154 от 16.06.03г.

3. Репнякова Е.М. Антиоксиданты в сохранении активности сырья для изготовления тромбопластиновых реагентов /Е.М. Репнякова//Материалы VI итоговой открытой научно-практ. конф. Молодежь и медицинская наука на пороге XXI века, - Киров, 18-20 апреля 2000.- Киров, 2000. - Ч.2.-С.13.

4. Репнякова Е.М. Использование буферных систем для поддержания рН среды фосфолипопротеидных комплексов /Е.М. Репнякова, Е.Ю. Савиных, Л.Н. Тарасова, Н.Р. Решетникова// Материалы VI итоговой открытой научно-практ. конф. Молодежь и медицинская наука на пороге XXI века, - Киров, 18-20 апреля 2000.- Киров, 2000. - Ч.2.-С.43.

5. Репнякова Е.М. Белково-липидные источники получения тромбопластиновых реагенгов/Е.М. Репнякова, Н.Р. Решетникова, Е.Ю. Савиных, Л.Н. Тарасова//Материалы VI научной конф. молодых ученых Вопросы трансфузионной и клинической медицины, - Киров, 29-30 марта 1999.- Киров,1999.-С. 42

6. Тарасова Л.Н. Чувствительность тромбопластина растворимого/Л.Н. Тарасова, Е.М. Репнякова, С.Г. Владимирова//Х1 национальный конгресс Человек и лекарство, Москва, 19-23 апреля 2004. -М., 2004. -С.

7. Тарасова Л.Н. Способ получения высокоактивного сырья для изготовления тромбопластина полного растворимого / Л.Н. Тарасова, Е.М. Репнякова, Е.Ю. Савиных// Патент ФГУ «КНИИГиПК Росздрава» №2260111 от 07.10.99 г

8. Тарасова Л.Н. Исследование чувствительности тромбопластина растворимого в процессе хранения/ Л.Н. Тарасова, Е.М. Репнякова, С.Г. Владимирова//Материалы Российской научно-практ. конф. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург, 8-10 июня 2004. - СПб. - 2004. - С.103 -104.

9 Тарасова Л.Н. Получение активных экстрактов для приготовления тромбопластина растворимого/ Л.Н. Тарасова, Е.М. Репнякова, С.Г. Владимирова, Е.Ю. Савиных // Клинич. лаб. диагностика.- 2004.-№7. -С. 21-24.

10. Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н., Репнякова Е.М. Активность и чувствительность отечественного тромбопластина растворимого // Здравоохранение и медтехника. - 2005. - №4. - С.29.

•150 12

РНБ Русский фонд

2006-4 12140

Подписано в печать 15.08.05 г. Тираж 100. Заказ № 407/05 Усл. п. л. 1,35

Отпечатано в типографии «Старая Вятка» 610004, г. Киров, ул. Р. Люксембург, 30, т. 65-36-77

Актуальность

Нарушения системы гемостаза сопутствуют многим заболеваниям и патологическим состояниям. Для их диагностики и коррекции необходимы информативные и стандартизованные методы исследований, основанные на применении качественных диагностических реагентов. Одним из наиболее широко распространенных тестов, обязательных для выполнения в клинико-диагностических лабораториях, является определение протромбинового времени (принцип Квика). Метод широко используется для скринингового исследования свертывающей системы крови, контроля терапии антикоагулянтами непрямого действия (АНД) и диагностики заболеваний печени.

Для его воспроизведения применяется целый спектр тромбопластиновых реагентов, выпускаемых в основном многочисленными зарубежными фирмами. Результаты исследований, полученные при их применении, бывают трудно сравнимы из-за различий в активности и чувствительности реагентов, особенно к низкому уровню факторов свертывания, в том числе тех, которые снижаются под воздействием антикоагулянтов - антагонистов витамина К. Для обеспечения объективности результатов исследований протромбинового времени и современных способов его выражения необходимо применение тромбопластинов, которые стандартизованы согласно требованиям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Они должны обладать чувствительностью к дефициту фактора VII, белкам PIVKA, не содержать гемоглобин и инфекционные агенты, быть стабильными и откалиброванными по Международному референтному тромбопластину с определением Международного индекса чувствительности (МИЧ).

На качество исследований протромбинового времени влияет также то, что во многих лабораториях определение проводится пробирочными способами и аппаратными, с использованием полуавтоматических и автоматических коагулометров. Воспроизведение метода с помощью приборов облегчает проведение исследований и снижает вариацию результатов; однако, их применение предусматривает использование в тест-системах коммерческих реагентов особо высокого качества, имеющих длительный срок годности (140, 141, 152, 153).

Наиболее широко используются реагенты тромбопластина, приготовленные из тканей организма млекопитающих; в последние годы применяются также рекомбинантные тромбопластины. В настоящее время один из существующих Международных референтных тромбопластинов (rTF/95) также является человеческим рекомбинантным; он рекомендован экспертами ВОЗ в качестве референта производителям тромбопластинов.

При определении протромбинового времени многие отечественные КДЛ используют нерастворимые тромбопластины, которые нестандартны, так как для приготовления рабочего раствора они требуют проведения дополнительных манипуляций, снижающих качество конечных результатов. Растворимые формы реагентов сокращают время проведения исследований и повышают их точность, а также обеспечивают возможность калибровки и выражения результатов не только в %ПИ, но и в единицах Международного нормализованного отношения (MHO), величину которого необходимо определять при контроле терапии АНД.

Поскольку технология приготовления растворимой формы тромбопластинового реагента имеет определенные сложности, до настоящего времени предложены и используются всего два отечественных растворимых реагента: Ренампластин фирмы «Ренам» (Москва) и Техпластин фирмы «Технология-Стандарт» (Барнаул).

Приготовление растворимой формы реагента предусматривает очистку от биологического балласта, проведение которой может привести к снижению активности и чувствительности сырья. В связи с этим важное значение приобретает оптимизация условий выделения из него тромбопластинового экстракта и дальнейшее его хранение до сублимационной сушки и при проведении ее. Основными причинами снижения активности и чувствительности реагента может быть развитие процессов перекисного окисления липидов и активации фосфолипаз, разрушающих фосфолипидную часть тромбопластина. Предотвратить их возможно путем применения ограждающих веществ. При их оптимальном качественном и количественном составе денатурация и окислительная модификация тканевого фактора и его липидной части могут быть значительно уменьшены.

Использование качественного растворимого тромбопластина, МИЧ которого определен и находится в пределах требований ВОЗ, позволит выражать результаты теста Квика в виде MHO. Это особенно важно для обеспечения контроля терапии антикоагулянтами непрямого действия. Создание такого отечественного реагента, сопоставимого по качеству с зарубежными аналогами, пригодного для пробирочного и аппаратного выполнения метода определения протромбинового времени будет во многом способствовать решению проблемы его стандартизации, в том числе выражения результатов.

Цель исследования

Разработать технологию получения реагента тромбопластина растворимого, близкого по активности, чувствительности и стабильности к лучшим зарубежным аналогам, который можно рекомендовать для использования в клинико-диагностических лабораториях страны при определении протромбинового времени.

Задачи исследования:

1. Изучить тромбопластическую активность гомогенатов, выделенных из кадаверного мозга и его серого вещества, в зависимости от режимов гомогенизации, сроков, условий хранения и количества используемых единиц (мозг одного кадавера или объединённый пул).

2. Оптимизировать процесс выделения из гомогенатов экстрактов, обладающих высокой тромбопластической активностью.

3. Определить взаимосвязь между количественным составом фосфолипидов в супернатантах и их тромбопластической активностью; установить минимальное количество гемоглобина в сырье и супернатантах, не влияющее на активность и последующую стабильность реагента.

4. Выбрать и оценить эффективность ограждающих веществ и их концентраций для обеспечения стабильности реагента при длительном хранении.

5. Отработать оптимальный для сохранения тромбопластической активности продукта режим сублимационной сушки.

6. Исследовать чувствительность реагента тромбопластина растворимого к дефициту факторов VII и X; установить МИЧ на основании калибровки относительно зарубежных референтов.

7. Исследовать стабильность активности и чувствительности реагента при длительном хранении; оценить его пригодность для контроля терапии анти коагулянтам и непрямого действия.

Научная новизна

Впервые разработана и запатентована технология производства отечественного реагента тромбопластина растворимого, сырьем для которого является серое вещество кадаверного мозга. Оценена тромбопластическая активность гомогенатов мозга, приготовленных из различных участков его, в зависимости от сроков и режимов хранения, количества единиц при изготовлении пула, режимов гомогенизации и центрифугирования. Выявлена прямая зависимость проявления тромбопластической активности реагента от количественного состава трех фосфолипидов в нем (фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина). Впервые предложены ограждающие вещества и их концентрации, сохраняющие активность реагента до и во время проведения сублимационной сушки и при хранении в течение 1 года.

Практическое значение

Создана технология производства тромбопластинового реагента в растворимой форме, проведена его калибровка и определен Международный индекс чувствительности, близкий к единице в течение всего срока хранения. Утверждена Фармакопейная статья предприятия: ФСП № 42-0335-5799-04 от 29 сентября 2004 года на «Тромбопластин рстворимый, лиофилизат для диагностических целей»; налажено его мелкосерийное производство. Это позволило рекомендовать отечественный реагент для использования в клинико-диагностических лабораториях страны для исследования протромбинового времени и выражения его результатов в виде Международного нормализованного отношения (MHO), что важно при контроле терапии антикоагулянтами непрямого действия.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Обоснование зависимости получения активного и чувствительного реагента тромбопластина от условий хранения, гомогенизации, центрифугирования, экстракции сырья, выбора ограждающих веществ и последующей сублимационной сушки.

2. Технология получения лиофилизированной формы растворимого тромбопластинового реагента со сроком годности не менее 1 года для

О исследования протромбинового времени и определение его

Международного индекса чувствительности (МИЧ). 3. Возможность применения реагента при контроле терапии антикоагулянтами непрямого действия.

Апробация работы

Материалы работы были доложены на научно-практических конференциях «Актуальные проблемы трансфузионной медицины» (Киров,2000), «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Киров, 2002), а также на итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии и переливания крови и Кировской Медицинской академии (1999-2000 гг.). По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 патента и 3 - в центральной печати.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, содержащего

У 155 источников. Диссертация изложена на 115 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 2 рисунками и 16 таблицами.

Работа выполнена в лаборатории биохимии крови (руководитель -доктор биол. наук, профессор Тарасова Л.Н.), станции переливания крови (главный врач Куноф В.К.) и научно-производственном отделе ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росздрава» (директор - доктор мед. наук, профессор Шарыгин СЛ.)

Выражаю благодарность дирекции института и ученой части за предоставленную возможность выполнения данной работы.

Выражаю большую благодарность руководителю Людмиле Николаевне Тарасовой за предложенную тему, постоянную помощь, ценные советы и замечания.

Выражаю также благодарность сотрудникам лаборатории биохимии крови: Софье Геннадьевне Владимировой, Наталье Николаевне Переваловой, Галине Карповне Платоновой, Ирине Николаевне Зимиревой, Ольге Викторовне Веселковой, Елене Андреевне Быковой за совместное творческое участие при выполнении работы. Благодарю Екатерину Юрьевну Савиных и сотрудников научно-производственного отдела: Решетникову Надежду Рудольфовну, Блинову Лидию Александровну, Воронову Любовь Николаевну за помощь в проведении исследований, также сотрудников клинической лаборатории и отдела контроля качества.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения растворимого тромбопластинового реагента из серого вещества кадаверного мозга, обладающего высокой чувствительностью к дефициту факторов VII и X.

2. Международный индекс чувствительности (МИЧ) тромбопластина растворимого, установленный на основании калибровки, относительно Международного референтного тромбопластина rTF/95, близок к 1,00 (1,02 и 1,08), что подтверждает его высокую чувствительность и возможность использования при контроле терапии антикоагулянтами непрямого действия.

3. Наиболее высокой тромбопластической активностью (14,6с±0,21; CV=1,4%) обладает пул из серого вещества восьми единиц мозга, подвергнутый двукратной заморозке и последующему оттаиванию. Гомогенизацию сырья необходимо проводить в течение 0,5-1 минуты, полученные гомогенаты допустимо хранить в течение 2-х недель при -(20±2)°С и 4-х - при -(40±2)°С.

4. Наибольшую активность экстрактов обеспечивают соотношения гомогената и воды 1:1 и 1:2, центрифугирование 20 мин при 600 g с последующим трехкратным центрифугированием по 30 мин при 800 g и температуре +(5±2)°С.

5. Супернатанты с высокой активностью получаются после второго, третьего и четвертого центрифугирования (14,4, 13,7 и 14,7с соответственно); количество ФЭ в них не ниже 9%, ФХ не менее 4%, а ФС- 1,5%.

6. Стабильность реагента при хранении обеспечивает применение следующих защитных веществ: 0,05М растворов буферов HEPPSO или HEPESa, антиоксиданта 0,005 М раствора метабисульфита натрия, криопротектора - 2% раствора сахарозы (конечной концентрации).

7. Оптимальными для сохранения тромбопластической активности и допустимой остаточной влажности реагента определены параметры проведения сублимационной сушки: температура материала при сублимации в пределах -(25-40)°С, конденсатора в камере не выше -(60)°С, давление в камере сублиматора на уровне от 7-16 Па, на этапе досушивания - не выше 14 Па. Продолжительность стадии сублимации при отрицательных значениях температуры продукта - 11±1 час, при положительных -12+1 час.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Тромбопластиновый реагент, разработанный в ФГУ «КНИИГиПК Росздрава», в дальнейшем может быть рекомендован для использования в клинико-диагностических лабораториях страны для исследования протромбинового времени и выражения его результатов в виде MHO, необходимого при контроле терапии антикоагулянтами непрямого действия.

2. Для исключения вариаций результатов метода при использовании тромбопластиновых реагентов при их производстве необходимо соблюдать требования по срокам хранения, гомогенизации, отмывки и центрифугированию сырья. При изготовлении пула сырья соблюдать требования по использованию оптимального количества единиц.

3. Определять качество сырья, полуфабриката на промежуточных этапах производства тромбопластинов, исследуя чувствительность к фактору VII в качестве скринингового теста.