Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Оптимизация оценки внешнего механизма гемокоагуляции и контролируемой терапии антикоагулянтами непрямого действия

На правах рукописи

РГБ ОД

2 7 ДПР 2002

ТАРАНЕНКО Ирина Алексеевна

ОПТИМИЗАЦИЯ ОЦЕНКИ ВНЕШНЕГО МЕХАНИЗМА ГЕМОКОАГУЛЯЦИИ И КОНТРОЛИРУЕМОЙ ТЕРАПИИ АНТИКОАГУЛЯНТАМИ НЕПРЯМОГО ДЕЙСТВИЯ

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Барнаул - 2002

Работа выполнена в Алтайском государственном медицинском университете.

Ведущее учреждение: Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится «/¿_» мая 2002 г. в 10 часов на заседании диссертационнс го совета Д 208.002.01 при Алтайском государственном медицинском униве{ ситете по адресу: 656099, г. Барнаул, пр. Ленина, 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Алтайского государственно! медицинского университета. Адрес библиотеки: 656019, г. Барнаул, ул. Папанинцев, 144.

Научный консультант:

Научный руководитель:

Доктор медицинских Hayi профессор А.П. Момо Член-корреспондент PAMI Заслуженный деятель науки Р<

Официальные оппоненты:

доктор медицинских нау профессор З.С. Баркага Доктор медицинских науз профессор М.И. Неймар!

кандидат медицинских нау Г.И. Костюченю

Автореферат разослан » г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Е.И. Буевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Антикоагулянты непрямого действия (АНД) - кумарины, индандионы - в течение многих лет широко используются в профилактике и терапии многих видов тромбоэмболии (Б.П. Кушелевский, 1958; Н.М. Рзаев, Д.Д. Закирджаев; 1979; Е.И. Чазов, K.M. Лакин, 1977; В.П. Балуда и соавт., 1980; З.С. Баркаган, 1988, 2000; И.Н. Бокарев и соавт., 1999; Е.В. Кабаева, Т.В. Козлова, 1999; Ферст-рате, Фермилен, 1986; Hirsh, 1987; Lewis, 1987; Freedman, 1992; Cook et al, 1992; Van der Meer et al., 1993; Hirsh et al., 1995; Hylek, Singer, 1994; Kearon, 1999; Prins et al., 1999 и др.). Вместе с тем в последние годы существенно пересмотрена методология лабораторного контроля за действием АНД и мониторирования получаемых с их помощью эффектов, что особенно важно, с одной стороны, для снижения риска возникновения геморрагических осложнений, а с другой - для поддержания с их помощью необходимого уровня гипокоагуляции и предотвращения рикошетных тромбозов и некрозов.

Традиционным и общепринятым методом контроля за дозировкой АНД служит определение • протромбинового (тромбопластинового) времени (ПВ) свертывания. Методика этого теста широко известна, приведена во многих известных справочниках и руководствах, повседневно используется в качестве базисного теста в клинических лабораториях. Вместе с тем принятая до недавнего времени методика выполнения и интерпретации результатов протромбинового теста (ПТ) не соответствует международным требованиям и, в связи с этим, недостаточно надежна, воспроизводима и стандартизирована. В качестве основного реагента в этом тесте, как известно, используется тканевой тромбо-пластин. Стандартизация этого реагента проводится по одному из Международных эталонов (RBT/90, ВСТ/253 или др.) и маркируется по международному индексу чувствительности (МИЧ). Использование таких тромбопластинов позволяет свести до минимума разброс результатов определений ПВ при использовании разных реагентов, особенно при контроле за терапией АНД.

При очевидной простоте выполнения ПТ, в настоящее время нет единого подхода к оценке его результатов, в том числе при лечении АНД (И.Н. Бокарев, Т.В. Козлова, 2000; А.П. Момот, И.А. Тараненко, 2000; И.А. Тараненко и со-

авт., 2001; Barrowcliffe, 1982; Van den Besselaar, 1996; Poller at al., 1998 и др.). Современным требованиям отвечает выражение результатов теста в виде международного нормализованного отношения (MHO), рассчитанного с учетом МИЧ тромбопластина. Но нередко используется еще определение результатов ПТ по кривым разведения по Квику в (%). А в России еще широко применяется устаревший расчет протромбинового индекса в %. В литературе почти нет сведений по сравнению результатов этих способов определения ПТ, в связи с чем в настоящей работе предпринято изучение степени их сопоставимости.

В литературе имеется также описание ряда вариантов определения ПТ и контроля за действием АНД на основе исследования «капиллярной» крови. Все эти методы однотипны, но пока не исследована их сопоставимость с результатами, получаемыми при исследовании бедной тромбоцитами плазмы с учетом MHO. Более того, все методы, основанные на исследовании «капиллярной» крови, в том числе и официально утвержденный унифицированный метод не предусматривают оценку действия АНД по MHO. Исключение составляют тест-системы «Hcpato Quick» и «CoaguChek» фирмы «Roche Diagnostics», в которых используются специальные малодоступные реагенты. В нашу задачу входило усовершенствование и стандартизация определения результатов ПТ в «капиллярной» крови с целью создания соответствия получаемых результатов определениям того же показателя на бедной тромбоцитами плазме (БТП).

Известно также, что АНД снижают уровень не только витамин К-зави-симых факторов свертывания крови, но и двух важнейших физиологических антикоагулянтов - белков С и S, что может повысить риск развития рикошетных тромбозов и некрозов тканей (А.Х. Исмайлов, O.E. Якимашко, 1966; Е.И. Чазов, K.M. Лакин, 1977; З.С Баркаган, 1988-2000; З.С. Баркаган и соавт., 1995; Ферстрате, Фермилен, 1986; Makris et al., 1996). Поэтому исследование нарушений в системе протеина С необходимо как до, так и в процессе применения АНД (Г.И. Козинец, В.А. Макаров, 1997; А.И. Воробьев и соавт., 2001). Однако в отечественной литературе мы не нашли данных о динамике нарушений в системе протеина С в процессе применения АНД.

Решению всех этих задач и проведению стандартизации одного из отечественных тромбопластин-кальциевых реагентов по МИЧ, в том числе и при исследовании «капиллярной» крови, посвящено настоящее исследование.

Цель работы: Совершенствование методологии контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами на основе стандартизации тромбопластин-кальциевого реагента «Техпластина» и учета динамики активности витамин Независимых как факторов свертывания крови, так и антикоагулянтов.

Задачи исследования:

1. Оценить качество и провести стандартизацию различных серий отечественного нового растворимого тромбопластин-кальциевого регента «Техпластина» в соответствии с требованиями Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов (1985).

2. Сравнить следующие три варианта оценки результатов ПТ: % активности по Квику, MHO, протромбиновый индекс (ПТИ); определить степень их информативности для контроля за лечебным применением АНД.

3. Определить динамику снижения суммарной активности К-витамино-зависимых физиологических антикоагулянтов, относящихся к системе протеина С, в процессе применения АНД, сопоставить ее с динамикой депрессии факторов протрмбинового комплекса.

4. Разработать и апробировать новую методику ПТ на основе исследования «капиллярной» крови для контроля за лечением АНД. __, >

Научная новизна:

1. Определена динамика снижения суммарной активности К-витамино-зависимых физиологических антикоагулянтов, относящихся к системе протеина С в сопоставлении с депрессией факторов протрмбинового комплекса, в разные сроки приема АНД. Установлен период наиболее высокого риска развития тромбонекротических осложнений при лечении АНД.

2. Разработана новая методика стандартизированного по MHO протром-бинового теста, выполняемого на цельной «капиллярной» крови (приоритетная справка на изобретение № 2001121102 от 26.07.2001 г.).

3. Разработан и стандартизирован по MHO отечественный тромбопластин-кальциевый реагент «Техпластин».

Практическое значение работы:

1. Стандартизация по МИЧ нового отечественного тромбопластин-кальциевого реагента позволит оптимизировать выявление нарушений внешне-

го механизма гемокоагуляции с его использованием.

2. На основе анализа разных способов выражения ПТ при контроле за применением АНД определен оптимальный вариант оценки теста на основе расчета MHO, как наиболее информативный и стандартизованный.

3. Разработан способ контроля за лечением АНД на основе исследования «капиллярной» крови, позволяющий получать сходные результаты таковым, определенным при исследовании БТП из венозной крови. Последнее обеспечивает преемственность в контроле за приемом АНД на поликлиническом и госпитальном этапах.

Внедрение результатов работы в практику здравоохранения:

Результаты работы позволяют стандартизировать ПТ на основе применения отечественного тромбопластин-кальциевого реагента и оптимизировать исследование внешнего механизма гемокоагуляции и контролируемой терапии непрямыми антикоагулянтами у больных кардиологического, терапевтического, гематологического профилей.

Результаты исследования внедрены в практику лаборатории гемостаза Алтайского гематологического центра, Алтайского краевого кардиологического диспансера, Тульской областной больницы, Новосибирской муниципальной ЦРБ, Хабаровского окружного военного госпиталя,

Основные положения работы доложены и обсуждены на V Сибирской научно-практической конференции по актуальным вопросам кардиологии (Красноярск, 2000); на региональной научно-практическая конференции «Интегральный подход к формированию здоровья человека» (Новосибирск, 2000); на IV Всероссийской научно-практической конференции «Современные методы диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы» (Новосибирск, 2001); на научно-практической конференции «Острый коронарный синдром: проблемы патогенеза, профилактики, диагностики, классификации, терапии» (Томск, 2001); на II конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); на конференции «Актуальные вопросы лабораторной диагностики и лечения нарушений гемостаза» (Барнаул, 2001); на юбилейной научно-практической врачебной конференции, посвященной 30-летию муниципального медицинско-

го учреждения «Городская больница № 12» (Барнаул, 2001) и других конференциях;

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ в центральной и местной печати. Подана заявка на изобретение.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 135 страницах, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов. Иллюстрирована 22 таблицами, 5 рисунками, 4 протоколами. Список литературы включает 96 отечественных и 163 зарубежных источника.

Положения, выносимые на защиту:

1. Стандартизированный по МИЧ отечественный тромбопластин-кальцие-вый реагент может быть использован при лабораторном контроле за приемом АНД при исследовании как бедной тромбоцитами плазмы, так и «капиллярной» крови по разработанной нами методике.

2. Динамика снижения активности К-витаминозависимых физиологических антикоагулянтов не совпадает с динамикой депрессии факторов протром-бинового комплекса. Наиболее выражена она на начальном этапе применения АНД, с чем связан период высокого риска тромбонекротических осложнений при приеме АНД.

3. Оценка результатов ПТ существенно более точна по MHO с учетом МИЧ тромбопластина, чем методика определения по кривым разведения в % (по Квику) и часто практикуемому определению протромбинового индекса в %. При контроле за действием АНД в случае использования разных тромбо-пластинов следует пользоваться расчетом MHO.

Работа выполнена в лаборатории патологии гемостаза Алтайского академического центра по диагностике и лечению нарушений гемостаза и кафедре пропедевтики внутренних болезней Алтайского государственного медицинского университета.

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю профессору А.П. Момоту, научному консультанту профессору З.С. Баркагану за предложенную тему, ценные советы и замечания. Выражаю признательность за

консультативную помощь в работе заведующему кафедрой профессору Е.И. Буевичу, кандидатам мед. наук А.Н. Мамаеву, Е.Ф. Котовщиковой, Г.В. Сердюк, лаборантам кафедры.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методы исследования и характеристика обследованных групп здоровых и больных

В работе исследовалась БТП и «капиллярная» кровь здоровых людей и больных с нарушением синтеза витамин-К зависимых факторов вследствие приема АНД. Контроль за депрессией факторов свертывания и антикоагулянтов системы протеина С основывался на использовании стандартизированного ОТ и глобального скринингового теста определения активности системы протеина С.

В исследование системы гемостаза были включены следующие тесты:

1. Протромбиновый тест в БТП и «капиллярной» крови с использованием нового растворимого тромбопластин-калыщевый реагента (ТКР), стандартизированного по МИЧ. Показания теста оценивали по времени свертывания в секундах и по международному нормализованному отношению (MHO) в сравнении с определениями по Квику и ПТИ в %.

2. Активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ).

3. Скрининг нарушений в системе протеина С с определением нормализованного отношения (НО).

4. Тромбиновое время по Biggs, Macfarlane.

5. Концентрация фибриногена в плазме по Clauss.

Исследования проводились на коагулометре «Trombostat 2» фирмы «Behnk Elektronik» с механическим принципом регистрации результатов и мануально по описаниям, изложенным в руководстве З.С. Баркагана и А.П. Момота (2001).

В специальных исследованиях нами проводилась стандартизация по международному стандарту ВСТ/253 одного из отечественных тромбопластин-кальциевых реагентов - «Техпластина» (ТУ 9398-289-42349142-00, регистрационное удостоверение МЗ РФ № 29/25050500/2750-01), Исследование производилось по процедуре, включающей определение МИЧ согласно рекомендациям

Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов (1985).

Работа основана на исследовании в динамике 87 больных, принимающих АНД (см. таблицу 1) и 120 здоровых людей контрольной группы. Больные исследовались на разных этапах применения АНД. Всего проведено 1497 комплексных исследований (> 4 тысяч анализов) системы гемостаза, в том числе при начальном подборе доз АНД - 493 исследования, в стабильной фазе терапии АНД (свыше 6 недель от начала приема) - 884 исследования.

Таблица 1.

Распределение обследованных больных по видам патологии, полу и среднему возрасту

Группы больных Обследовано Средний воз-

мужчин женщин всего раст больных, (Х±т)

Обшее число больных 44 43 87 47,4±1,4

1. С протезированием клапанов сердца: 31 30 61 45,8±1,3

1.1. Протезом митрального клапана 1.2. Протезом аортального клапана 1.3. Протезом аортального и митрального клапанов 14 9 8 20 7 3 34 16 11 45,0±1,7 48,9±3,2 43,5±2,3

2. Профиластика трмбоэмбо-лий у больных с: 12 14 26 51,1±3,3

2.1. Имплантированным кава-фильтром 2.2. Тромбозом глубоких вен конечностей 2.3. Первичным АФС 2.4. Мерцательной аритмией 2.5. Тромбозом левого желудочка 2 3 2 2 2 1 5 3 3 8 2 5 2 53,3+17,2 46,5±5,2 32,5±2,5 62,0+6,1 58,5±6,5

2.6. Синдромом вязких тромбоцитов 1 - 1 31

2.7. Вторичная профилактика ТЭЛА - 5 5 54,8±6,3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Определение индекса чувствительности тромбопластина отечественного производства

До последнего времени в Российской Федерации в клинических лабораториях при выполнении ПТ применялись, в основном, нерастворимые тромбопластины из мозга человека, требующие экстракции. При этом изготовителями таких реагентов не проводилась стандартизация тромбопластина по МИЧ. В настоящей работе проводилась стандартизация тромбопластин-кальциевого реагента «Техпластина» в соответствии с рекомендациями ВОЗ по одному из международных эталонных стандартов.

На образцах БТП здоровых людей и больных, получающих АНД, сопоставлялись результаты протромбинового времени, полученные с использованием международного референтного тромбопластина (MPT) ВСТ/253 из мозга человека и одной из опытных серий тромбопластина (ОСТ) «Техпластина» (серия № Б0125), определенной в дальнейшем, как калиброванный по МИЧ рабочий отечественный референтный тромбопластин (ОРТ). На втором этапе была выполнена калибровка нескольких рабочих серий «Техпластина» относительно ОРТ.

Международный индекс чувствительности опытной серии тромбопластина (ОСТ) «Техпластина» определяли путем составления графиков по результатам протромбинового времени, определенным с МРТ и ОСТ в двойном логарифмическом масштабе (рис. 1).

Анализ полученных данных по всем протоколам включал в себя определение наклона прямой и стандартной ошибки этого наклона, для чего использовался метод ортогональной регрессии (ВОЗ, 1983).

В результате расчетов при сравнении МРТ с ОСТ получены следующие данные:

Международный индекс чувствительности ОСТ составил 1.06;

Коэффициент вариации (%) - 3.88% (допустимое значение согласно рекомендациям ВОЗ - не более 5%).

и

сек

10 20 30 40 50 60 сек

Прогромбиновое время опытной серии тромбопластина (ОСТ)

Рис. 1. Протромбиновое время на образцах контрольной нормальной плазмы и плазмы больных, получавших АНД при определении МИЧв ОСТ.

Определено, что растворимый тромбопластин-кальциевьгй реагент из мозга человека «Техпластин» серии № Б0125 в результате проведенной стандартизации относительно международного референтного тромбопластина из мозга человека ВСТ/253 имеет МИЧ 1.06, удовлетворяет требованиям ВОЗ и в дальнейшем рассматривался, как отечественный референтный тромбопластин (ОРТ).

Для процедуры вторичной стандартизации были выбраны партии «Тех-пластина» следующих серий: № Б0135, № Б0136 и № Б0142.

Результаты сравнения их свойств со свойствами ОРТ проводились аналогично, в результате чего определено, что выбранный в качестве рабочего отечественного референтного образца «Техпластин» серии № Б0125 имеет МИЧ 1,06, а серийные образцы этого реагента - диапазон МИЧ от 1,11 до 1,18.

При изучении аналитических характеристик «Техпластина» установлено, что коэффициент внутрииндивидуальной вариации в контрольной плазме с ат-

тестованным значением ПВ на нормальном уровне при работе с реагентом «Техпластин» составил 0,7%; а в БТП больного, получающего АНД - 0,9% (при коагулометрических определениях). Эти показатели являются удовлетворительными по критериям МЗ РФ (приказ № 45 от 07.02.2000), в котором предельно допустимым значением коэффициента внутриндивидуальной биологической вариации является 1,7%. Вместе с тем, при мануальном определении ПВ этот коэффициент увеличивается в нормальной плазме до 2,8% и в БТП больного, получающего АНД - до 2,7%.

Коэффициент межиндивидуальной вариации в контрольной нормальной плазме согласно тому же приказу МЗ РФ не должен превышать 6,8%. Этот показатель соблюдался в наших исследованиях при использовании как коагуло-метрического, так и мануального способов определения и составлял 2,3% и 4,8% соответственно.

Все изложенное позволило нам в дальнейшем использовать стандартизованный по МИЧ реагент «Техпластин» для контроля за лечением больных непрямыми антикоагулянтами.

Сравнительная характеристика разных методов оценки результатов ПТ при контроле за лечебным применением АНД

В настоящее время используются следующие варианты оценки результатов протромбинового теста:

- расчет протромбинового индекса в % (111 И);

- определение показателя по Квику на основе стандартной кривой разведения, в %;

- на основе расчета международного нормализованного отношения (MHO).

При оценке результатов разных способов выражения показаний ПТ мы рассчитывали коэффициенты вариации по каждому показателю, полученному при использовании семи примененных тромбопластинов, имеющих МИЧ в диапазоне от 1,0 до 1,8. Три из этих тромбопластинов были импортного производства, четыре - отечественного. Средние результаты коэффициента вариации разных способов выражения показаний ПТ по этим 10 больным, получавшим АНД, приведены в таблице 2.

Сравнительный анализ различных способов оценки результатов протромбинового теста у 10 больных, получавших АНД

Варианты выражения результатов ПТ

MHO (INR) Протромбиновый индекс, % Показатель по Квику, %

1 2 3

Коэффициент Вариации (CV), Х±ш 7,09 ± 1,18 12,68 + 2,17 33,92 +4,02

Достоверность Различий Р i-2< 0,05 Р2-з< 0,001 Р !-з< 0,001

Из таблицы видно, что по степени увеличения коэффициента вариации (CV) методы оценки ПТ можно расставить в следующем порядке: MHO (INR), протромбиновый индекс в %, показатель по Квику. Следовательно, оптимальным по точности вариантом является расчет по MHO, что соответствует и международным данным.

В то же время мы столкнулись с тем, что часто встречаемый в современной литературе показатель по Квику оказался наиболее изменчивым и нестабильным при использовании разных тромбопластинов. По результатам проведенных исследований определено, что углы наклонов кривых неодинаковы и не зависят от МИЧ реагентов (Р>0,05). Следовательно, при использовании разных тромбопластинов на основе теста Квика в процессе применения АНД у одних и тех же больных могут быть получены совершенно различные результаты.

Таким образом, сравнительный анализ различных методов оценки результатов ПТ показал, что определение данного показателя по Квику дает наибольший коэффициент вариации, в связи с чем он может давать ошибочные результаты при контроле за лечением АНД. Наиболее же оптимальным способом оценки результатов ПТ у таких больных является расчет MHO с учетом МИЧ используемого тромбопластина, что соответствует рекомендациям Международных комитетов по стандартизации биологических препаратов, а также по тромбозам и гемостазу.

Нарушения в системе протеина С в процессе лечения больных непрямыми антикоагулянтами

Дефицит синтезируемых в гепатоцитах витамин К-зависимых факторов свертывания, а также протеинов С и S, при приеме АНД связан, как известно, с нарушением у-карбоксилирования этих факторов под влиянием К-витаминозависимой карбоксилазы (В.П. Балуда и др, 1992; З.С. Баркаган, А.П. Момот, 1999; Choonara et al., 1988; и др.). В отечественных работах, посвященных применению АНД, до наших исследований не были прослежены изменения активности этих важнейших антикоагулянтов в процессе лечения. Для того чтобы восполнить этот пробел, мы обследовали в разные сроки применения АНД 67 больных, причем одновременно с динамикой показаний ПТ по MHO, анализировали сдвиг в системе протеина С по нормализованному отношению (НО). Изучая эту взаимосвязь мы смогли отметить, как это видно из рис. 2 и

7 т

TW

6 --

о

е >i S о ш о

X S

ю S о а. t-о о. с о с

4 -

3 --

2 --

1 --

норма

терапевтический диапазон

MHO по протром-биновому тесту

- НО по скринингу нарушений в системе протеина С

Рис. 2. Соотношение глубины нарушений в прокоагулянтном и антикоагулянтном звеньях гемостаза при приеме АНД.

5

таблицы 3, что существенная депрессия суммарной активности упомянутых физиологических антикоагулянтов совпадает с начальной гипокоагуляцией в протромбиновом тесте (MHO в пределах от 1,5 до 2,5). Так, в частности, при MHO в среднем равном 1,52 НО, характеризующее нарушения в системе протеина С находилось на достоверно сниженном уровне (Рк<0,001). При этом даже при увеличении MHO в 3,9 раза, НО уменьшилось лишь в 1,2 раза. В целом же, из графика на рис. 2 отчетливо видно, что по мере углубления антикоаху-лянтного эффекта депрессия в системе протеина С не прогрессирует, а стабилизируется примерно на одном и том же умеренно сниженном уровне.

Таблица 3.

Динамика активности в системе протеина С при разных степенях гипокоагуляции, обусловленной приемом АНД

Диапазон Число иссле- Средние величины (Х±т)

MHO дований MHO НО

1. 1,0-2,0 59 1,52±0,03 0,84±0,04

Рк<0,001 Рк<0,001

2,42±0,07 Рк<0,001 0,70±0,04

2. 2,0-3,0 23 Рк<0,001

Pl-2<0,01

3. 3,0-4,0 16 3,47i0,07 Рк<0,001 0,72±0,07 Рк<0,001 Р2-з<0,5

4. 4,0-8,5 9 5,86±0,68 Рк<0,001 0,71±0,11 Рк<1),001 Р2-4>0,5 Р}.4>0,5

контроль (без приема АНД) 120 1,07±0,02 1,02±0,02

При анализе средних данных, приведенных нами в таблице 4 и на рисунке 3, было определено, что наибольшее снижение активности системы протеина С происходит в течение первой недели от начала приема АНД, тогда как в последующем этот показатель стабилизируется одновременно со стабилизацией MHO. В частности, при терапии АНД в течение 2-6 недель, средний показатель MHO составил 2,75, а НО 0,69. При дальнейшем приеме АНД (свыше 6 недель) показатели MHO и НО были равными 2,35 и 0,78 соответственно.

Динамика снижения активности системы протеина С в разные сроки применения АНД

Срок приема АНД Число Наблюдений Средние величины (Х±т)

МНО НО

1. Первая неделя 16 2,46±0,28 Рк<0,001 0,72±0,12 Рк<0,05

2. 2-6 недели 18 2,75±0,40 Рк<0,001 0,69±0,03 Рш>0,5 Рк<0,001

3. Более 6 недель 79 2,35±0,1б Рк<0,001 0,78±0,03 Рц-ш<0,05 Рк<0,001

Контроль (без приема АНД) 40 1,07±0,02 1,02±0,02

Рис.3. Динамика нарушений в прокоагулянтном и антикоагулянтном звеньях гемостаза в процессе приема АНД

Из приведенных данных следует, что при приеме АНД снижение активности витамин K-зависимых антикоагулянтов наиболее велико в начальной фазе применения этих препаратов, в период, когда MHO повышается до уровня 2,5, тогда как по мере дальнейшего прогрессирования гипокоагуляции активность в системе протеина С стабилизируется на одном и том же сниженном уровне.

Полученные данные представляются нам важными еще и потому, что при исходном дефиците протеина С назначение непрямых антикоагулянтов, как известно, может на ранних этапах привести к множественному тромбированию мелких сосудов и развитию гангренозных пигментных некрозов кожи и подкожной клетчатки (Г.И. Козинец, В.А. Макаров, 1997; З.С. Баркаган, 2000; А.И. Воробьев и соавт., 2001; Ферстрате, Фермилен, 1986 и др.). Особенно часто такая аномальная реакция наблюдается при ДВС синдроме, в том числе при злокачественной пурпуре новорожденных, а также при тромбофилии, связанной с дефицитом протеинов С и S.

Наши данные показывают, что такая опасность имеется, особенно на начальных этапах применения АНД, в связи с чем именно в этом периоде лечения, по-видимому, необходимо диагностировать и компенсировать значительную депрессию протеина С внутривенными введениями этого антикоагулянта или грансфузиями криосупернатанта донорской плазмы (В.А. Елыкомов, 1998). В частности, для этого может быть рекомендован препарат «Ceprotin» (рекомби-нантный протеин С человека) фирмы «Baxter Dade», США (Moritz et al., 2000).

Разработка нового метода контроля за приемом антикоагулянтов

непрямого действия на основе исследования «капиллярной» крови

В современной практике используются несколько методов исследования ПТ з капиллярной крови. Все они имеют незначительные различия в технике выполнения анализа, которая близка к известной при исследовании плазмы, полугенной из венозной крови (БТП), однако общим их недостатком является низкая сопоставимость с результатами, получаемыми по ПТ в БТП. Кроме того, извест-гые методы на основе исследования капиллярной крови не предусматривают щенку по MHO в тех случаях, когда проводится контроль за приемом АНД (за тсключением используемых за рубежом тест-системы с комбинированным ■ромбопластином «Hepato Quick» и тест-системы «CoaguChek» с использовани-

ем цельной капиллярной нестабилизированной крови производства фирмы «Roche Diagnostics»).

В настоящей работе проведен анализ наиболее распространенного в отечественной лабораторной практике унифицированного способа определения про-тромбинового времени в «капиллярной» крови (Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований, Приказ МЗ СССР № 960 от 15.10.74, под ред. В.В. Меньшикова, М., 1977, С. 27-29). В соответствии с его описанием результаты метода определяются вычислением протромбинового индекса или протромбиновой активности крови (ПАК).

В нашей работе мы исходили из того, что условием качественной лабораторной диагностики является совпадение результатов протромбинового теста в БТП и в «капиллярной» крови, взятых у одного и того же пациента. Нас интересовал вопрос, насколько унифицированный метод соответствует этому условию.

С этой целью был проведен анализ БТП и капиллярной крови по унифицированному методу у 10 больных, получающих АНД на протяжении от 1,5 месяцев до 4 лет. Данные представлены в таблице 5, из которой видна достоверно выраженная разница получаемых результатов (Р<0,05) в зависимости от объекта исследования. В частности, протромбиновая активность «капиллярной» крови оказалось ниже (в среднем на 8,2%), чем аналогичный показатель в БТП. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что данный подход к контролю за приемом АНД при исследовании БТП с одной стороны и капиллярной крови с другой - малосопоставимы. Представляется важным и то, что унифицированный вариант методики не предусматривает рекомендованный ВОЗ (1983) современный вариант оценки ПТ в единицах международного нормализованного отношения (MHO).

Для преодоления этой разницы в оценке результатов ПТ в нашем центре разработан вариант контроля за приемом АНД на основе исследования стабилизированной цитратом капиллярной крови.

Результаты протромбипового теста, полученные унифицированным методом в БТП и капиллярной крови у больных, принимающих АНД

№ Больные Протромбиновая активность капиллярной крови*, в% Протромбиновая активность БТП *, в %

1 Н.К. 47,2 42

2 П.П. 51,2 63,5

3 A.JI. 46,5 55,5

4 P.O. 46,9 42,6

5 А.Г. 52,7 64,6

6 В.Е. 27,9 44,5

7 И.В. 42,4 52,4

8 Н.С. 35,3 43,9

9 А.Т. 48,5 56,5

10 Е.А. 44,5 59,2

Х±т 44,31±2,38 52,47+2,76

* - протромбиновая активность плазмы и капиллярной крови определена с помощью унифицированой методики (Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований, Кг 960 от 15.10.74, под ред. В.В. Меньшикова, М., 1977, С. 27-29).

При разработке этого метода нами было принято во внимание используемое в унифицированном методе соотношение концентраций цитрата натрия (трехза-мещенного) и хлористого кальция. Последнее имеет важное значение для этого метода, поскольку принцип измерения прогромбинового времени свертывания основан, как известно, на рекальцификации предварительно стабилизированной цитратом натрия крови (Quick, 1935). Смещение же равновесия между концентрациями этих реагентов в крови может приводить к удлинению (в случае передозировки цитрата натрия) или укорочению (при недостатке стабилизатора) времени свертывания в одном и том же образце крови.

Для поиска оптимально необходимых концентраций цитрата натрия и клорида кальция в тестируемой смеси при выполнении ПТ в капиллярной кро-зи мы, на первом этапе, рассчитали молярное содержание этих компонентов, тспользованных в унифицированном методе. Оказалось, что конечная концен-грация цитрата натрия (безводного) в тестируемой смеси по данному методу завна 2,1х10"6 М, а хлорида кальция (безводного) - 4,5х10"6 М, т.е. соотноше-

ние молярных концентраций данных компонентов оказалось равным 1:2,1. Аналогичные концентрации этих реагентов в тестируемой смеси при выполнении ПТ в бедной тромбоцитами плазме, как показали наши расчеты, составляют для цитрата натрия 2,1x10"® М, хлорида кальция - 2,5x10"6 М. При этом молярное соотношение равно 1:1,2. То есть имеется несоответствие пропорций концентраций данных реагентов.

В дальнейшем мы выполнили эксперименты, в которых изучалось влияние различных молярных соотношений цитрата натрия и хлорида кальция на показатель MHO в капиллярной крови у больных, получающих лечение АНД. При этом проводилось сравнение полученных результатов с аналогичными при исследовании БТП (таблица 6). Исследовались молярные соотношения концентраций цитрата натрия и хлорида кальция в тестируемой смеси в диапазоне от 1:1,2 до 1:2,2.

Таблица 6.

Поиск оптимального соотношения концентраций цитрата натрия и хлорида кальция при выполнении ПТ по MHO в «капиллярной» крови

Больные, получающие АНД Молярные соотношения концентраций в тестируемой смеси цитрата натрия и хлорида кальция МНО в БТП больных, ПОЛЗ чающих АНД**

1:1,2 1:1,3 1:1,5 1:1,7 1:1,9 1:2,1* 1:2,2

1 2,12 2,06 1,85 1,86 1,85 1,18 1,41 1,78

2 2,58 3,12 1,78 1,67 1,31 1,66 1,42 1,65

3 4,74 1,59 1,38 1,26 1,19 0,99 1,0 1,27

4 3,96 1,12 2,86 3,06 3,20 0,98 1,76 3,03

5 2,30 1,37 1,50 1,64 1,54 1,37 2,48 1,62

6 2,54 3,95 1,56 1,79 1,79 1,56 1,43 1,77

7 1,98 2,51 1,25 1,13 1,28 1,01 2,54 1,24

8 3,19 5,34 3,90 3,75 3,70 2,93 5,02 3,83

9 1,68 3,51 3,41 3,59 3,87 2,40 1,54 3,13

10 2,40 3,57 1,39 1,30 1,22 2,17 3,01 1,26

И 5,68 3,98 3,85 3,42 3,21 1,67 2,2 3,58

г** 0,38 0,48 0,99 0,99 0,96 0,54 0,41

* - молярное соотношение концентраций, применяемое в унифицированном способе; ** - коэффициент корреляции результатов ПТ, выраженный в МНО при исследовании капиллярной крови и БТП в случаях применения различных концентраций цитрата натрия и хлорида кальция. *** - молярное соотношение 1:1,2

По результатам выполненных исследований (таблица 6) видно, что оптимальным диапазоном молярного соотношения конечных концентраций цитрата натрия и хлорида кальция в тестируемой смеси являются соотношения от 1:1,5 до 1:1,9. В этих случаях наблюдался очень высокий коэффициент корреляции между результатами ПТ, полученными в капиллярной крови и БТП (г= 0,96 -1,00; р <0,005).

На основе этих исследований была предложена новая методика контроля ПТ за лечением АНД (заявка на патент «Способ контроля лечения непрямыми антикоагулянтами», авторы - А.П. Момот, И.А. Тараненко, А.Н. Мамаев, приоритетная справка № 2001121102 от 26.07.2001 г.) и создан диагностический набор реагентов «Техпластин-тест (К)» для исследования ПВ в «капиллярной крови».

Это позволяет повысить точность контроля за приемом АНД на поликлиническом (чаще анализ капиллярной крови с целью меньшей травматизации вен больного) и госпитальном этапе (преимущественно исследование БТП).

Клиническая апробация нового метода контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами

Апробацию заявляемого способа провели при обследовании 45 практически здоровых людей и 43 больных из числа описаных ранее. Срок приема антикоагулянтов непрямого действия у них составлял от 4 дней до 5,5 лет. Большая часть этих пациентов (38 человек) получали АНД в связи с протезами клапанов сердца, 3 - для предотвращения вторичных тромбоэмболии легочной артерии, 2-е тромбозами глубоких вен нижних конечностей.

Установлено, что у здоровых людей, вне приема АНД, показатель MHO в капиллярной крови в среднем (Х±т) равен 1,01±0,003, с пределами нормальных колебаний (±2ст) от 0,97 до 1,05. Воспроизводимость способа определена по коэффициенту вариации. Коэффициент вариации разработанного метода составил 4,5%, что является приемлемым для большинства способов лабораторной диагностики.

На рис. 4 приведены данные обследования больных, получающих АНД, откуда видно, что значения MHO в БТП и капиллярной крови хорошо согласуются между собой. Коэффициент корреляции результатов при этом составил

+0,98 (р<0,001).

Рис.4. Сравнение результатов ПТ, выраженных в MHO при исследовании БТП и капиллярной крови у больных, получающих АНД

Таким образом, нами показано, что контроль при лечении АНД с помощью исследования капиллярной крови по разработанному нами методу может проводиться в соответствии с рекомендациями ВОЗ по MHO, отличается высокой степенью точности, практически совпадает с данными исследования БТП, но должен выполняться, как правило, с применением коагулометров, имеющих механический принцип регистрации результатов.

Выводы:

1. Проведена стандартизация отечественного нового растворимого ТКР по МИЧ в соответствии с требованиями Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов (1985), показаны высокая воспроизводимость и точность выполняемого с его помощью протромбинового (тромбопластиново-

го) теста как у здоровых людей, так и у больных с нарушениями внешнего механизма свертывания крови.

2. Установлены преимущество и стандартизация оценки результатов про-тромбинового теста в ходе применения АНД с использованием метода с расчетом MHO по сравнению с методикой определения по Квику, основанной на использовании кривых разведения контрольной нормальной плазмы.

3. Установлено, что на начальном этапе применения АНД происходит значительное снижение как активности факторов протромбинового комплекса, так и антикоагулянтов системы протеина С, тогда как по мере дальнейшего углубления действия АНД депрессия системы протеина С не продолжается, и происходит стабилизация этого параметра на одном и том же сниженном уровне.

4. Риск развития осложнений, связанных с депрессией системы протеина С, наиболее значительны на начальном этапе применения АНД.

5. Разработанная новая методика контроля за лечением АНД по исследованию «капиллярной» крови показывает сходные результаты с методикой исследования бедной тромбоцитами плазмы, полученной из венозной крови.

Рекомендации

Официально рекомендованный унифицированный метод при определении ПТ на капиллярной крови нестандартизирован по MHO и дает при контроле за лечением АНД результаты, не совпадающие с определением ПТ на БТП. В связи с этим дальнейшее использование унифицированного метода не может быть рекомендовано. Предложенный нами протромбиновый тест на основе исследования капиллярной крови позволяет оценивать действие АНД по современным критериям с помощью MHO и дает результаты, совпадающие с аналогичными определениями в БТП. Данный метод может быть рекомендован к использованию для контроля за АНД вместо ранее предложенного - унифицированного.

При начальном этапе приема АНД глубина депрессии витамин К-зависимых физиологических антикоагулянтов опережает глубину нарушений факторов протромбинового комплекса, что иногда приводит к тромбонекроти-ческим осложнениям. В связи с этим рекомендуется до начала терапии АНД и на начальном этапе приема АНД проводить скрининговые исследования на предмет выявления нарушений в системе протеина С.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние фенилина и кумаринов на динамику депрессии витамин К-зависимых факторов свертывания и антикоагулянтов. //В сб.: V Сибирская научно-практическая конференция по актуальным вопросам кардиологии. -Красноярск, 2000. - С.408-411. (Соавт. А.Н. Мамаев, А.П. Момот).

2. Современный контроль за лечением непрямыми антикоагулянтами (антагонистами витамина К). // В журнале: Консилиум, 2000. - № 6 (16). - С.11-17. (Соавт. А.П. Момог, А.Н. Мамаев).

3. Сравнительный анализ угнетения выработки витамин К-зависимых факторов свертывания и нарушений в системе протеина С при лечении оральными антикоагулянтами кардиологических больных. // В сб.: Острый коронарный синдром: проблемы патогенеза, профилактики, диагностики, классификации, терапии. - Томск, 2001. - С.211-213. (Соавт. А.П. Момот, А.Н. Мамаев, З.С. Баркаган).

4. Опыт современного лабораторного контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами. //В сб.: «Интегральный подход к формированию здоровья человека». - Новосибирск, 2000. - С.46-49.

5. Принципы проведения контролируемой терапии непрямыми антикоагулянтами. И В журнале: Фармацевтический вестник Алтая, 2000. - № 18 (49). -С. 11-13. (Соавт. А.П. Момот).

6. Лабораторный контроль за терапией антикоахулянтами непрямого действия. // В сб.: «Актуальные вопросы лабораторной диагностики и лечения нарушений гемостаза». - Барнаул, 2001. - С.70-73. (Соавт. А.П. Момот, Е.И. Буе-вич).

7. Динамика витамин К-зависимых факторов свертывания и протеинов С+Б в процессе лечебного применения антикоагулянтов непрямого действия. // В сб.: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва, 2001. - Том 1. - С.116-117. (Соавт. А.Н. Мамаев, А.П. Момот).

8. Лабораторный контроль за терапией антикоагулянтами непрямого действия при исследовании капиллярной крови. // В сб.: «Современные методы диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы». - Новосибирск, 2001. - С. 164-165. (Соавт. А.П. Момот).

9. Современная оценка результатов протромбинового теста. // В сб: «Актуальные вопросы практической медицины». - Барнаул. - 2001. - С. 14-16. (Соавт. А.П. Момот, Е.И. Буевич)