Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Реагенты оценки коагуляционного гемостаза при пробирочном и аппаратном исполнении методов (лабораторно-экспериментальное исследование)

Па правах рукописи

Владимирова Софья Геннадьевна

РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ КОАГУЛЯЦИОННОГО ГЕМОСТАЗА ПРИ ПРОБИРОЧНОМ И АППАРАТНОМ ИСПОЛНЕНИИ МЕТОДОВ (ЛАБОРАТОРНО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.29 - Гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2002

Работа выполнена в Государственном Учреждении Кировский НИИ гематологии и переливания крови

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Л.Н.Тарасова

доктор медицинских наук, профессор Л.П.Папаян

доктор медицинских наук, профессор В.Л.Эмануэль

Ведущая организация Санкт-Петербургская медицинская

академия последипломного образования

Защита состоится

2002г. в ~/3~°час на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии МЗ РФ по адресу: 193024, г.Санкт-Петербург, 2-ая Советская ул., д.16.

Автореферат разослан " апреля 2002г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук В.С.Быков

Р34Г-ЮЭ о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нарушения системы гемостаза характерны для многих заболеваний и патологических состояний (Козинец М.И., Макаров В.А., 1997). Для диагностики и правильной коррекции этих нарушений необходимы информативные и стандартизованные методы исследований, основанные на применении качественных диагностических реагентов (Бокарев И.НД995; Кондратьева Т.Б. и соавт.,1995; Becker D.et al.,1993; Bophy M. et al., 1993). Реагенты, применяемые в некоторых методах исследования гемостаза, получают из разного биологического сырья и по разным технологиям, что приводит к разночтению результатов (Зубаиров Д.М.,2000).

К наиболее распространенным тестам, составляющим основу современного исследования гемостаза, относятся методы определения протромбинового времени (ПВ) по Квику и активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ). Они отражают состояние внешнего и внутреннего механизмов образования протромбиназы. На этих методах основано определение активности отдельных прокоагулян-тов, а также с их помощью проводится контроль эффективности анти-коагулянтной терапии (Козлова Т.В., 2001). При их выполнении применяют фосфолипидные реагенты: полный тромбопластин - в тесте Квика и частичный — в АПТВ. Результаты, получаемые при использовании различных коммерческих диагностикумов, трудно сравнимы по причине их разной активности и чувствительности к снижению уровня факторов свертывания (Панченко Е.П., Добровольский А.Б., 1999; Берковский А.Л.,2000; Poller L.et al., 1998).

Помимо возросших потребностей контроля антикоагулянтной терапии важной является диагностика коагулопатий, в частности, гемофилии А и В, а также контроль терапии гемостатическими препаратами. При исследовании активности факторов VIII и IX предпочтение отдают одностадийным методам, основанным на тесте АПТВ (Качалова Н.Д. и соавт.,1999; Козлов A.A. и соавт., 2000). Кроме фосфолипидных реагентов и активаторов, тест-системы для определения факторов VIII и IX включают соответствующие субстраты, лишенные указанных прокоагу-лянтов и содержащие избыток других, а также контрольную плазму с

аттестованным значением исследуемого фактора, необходимую для построения калибровочных графиков (Тарасова JI.H. и соавт., 1998; Barrowcliffe T.W.,1990). Из-за большого количества контрольных и субстратных плазм, производимых по разным технологиям, затруднительно сравнивать результаты исследований, полученные не только в различных лабораториях, но нередко - в разное время в одних и тех же (Тарасова JI.H., Платонова Г.К., 1988; Левченко Л.Б. и соавт., 1989; Баркаган З.С.1991).

В клинико-диагностических лабораториях нашей страны в последние годы все более широкое применение находят автоматические коагулометры, требующие использования в тест-системах коммерческих лиофилизированных диагностикумов высокого качества, имеющих длительный срок годности. Однако, они могут оказывать влияние на показатели методов в зависимости от применяемых реагентов и приводить к разночтениям между результатами пробирочного и аппаратного воспроизведения (Барроуклифф Т.В.,1995; Бокарев И.Н., Козлова Т.В., 2000; D'Angelo A. et al, 1989; Taberner D.A. et al. 1990; Kitchen S.,1997).

Основным условием повышения точности и достоверности получаемых результатов является применение качественного оборудования и реагентов. Производство отечественных тест-систем, сопоставимых по качеству с зарубежными, пригодных для пробирочного и аппаратного выполнения методов, позволит ускорить решение проблемы стандартизации исследований коагуляционного гемостаза в нашей стране.

Цель исследования

Оценить соответствие реагентов, разработанных в Кировском НИИ гематологии и переливания крови, современным требованиям качества при пробирочном и аппаратном исполнении методов исследования коагуляционного гемостаза.

Задачи исследования:

1. Оценить воспроизводимость и сопоставимость результатов методов определения протромбинового времени и АПТВ при использовании отечественных и импортных диагностических реагентов и наборов.

2. Изучить возможность использования полного тканевого и частичного тромбопластинов Кировского НИИ гематологии и переливания крови при проведении аппаратных исследований.

3. Изучить влияние различных активаторов, применяемых в методе АПТВ, на его результаты.

4. Оценить качество наборов для определения активности факторов VIII и IX, разработанных в Кировском НИИ гематологии и переливания крови.

5. Изучить возможность использования наборов для определения активности факторов VIII и IX при аппаратном исполнении методов.

Научная новизна

Проведена статистически обоснованная оценка качества результатов наиболее распространенных методов исследования коагуляционного гемостаза, выполненных с использованием реактивов и наборов, разработанных в Кировском НИИ гематологии и переливания крови, а также зарубежных (производства фирмы "Organon Teknika", Нидерланды), в пробирочном и аппаратном исполнении. Доказано, что отечественные реактивы специфичны и чувствительны к измеряемым компонентам и обеспечивают хорошую воспроизводимость методов определения про-тромбинового времени, АПТВ, активности факторов VIII и IX, не уступающую таковой, получаемой при использовании аналогичных импортных реагентов.

При оценке различных активаторов для метода АПТВ выявлено, что реактивы, содержащие оксид кремния (каолины, кремнезем), не влияют на воспроизводимость метода и чувствительность к гепарину. Показано,что активность АПТВ-реагента зависит не только от частичного тромбопластина, используемого при выполнении метода, но также от концентрации и оптической плотности применяемого активатора.

Доказано, что диагностические реагенты и наборы, разработанные в Кировском НИИ гематологии и переливания крови, пригодны для исследования коагуляционного гемостаза с применением фотооптических коагулометров.

Практическое значение работы

Проведенная оценка качества результатов ряда методов исследования коагуляционного гемостаза, выполняемых с использованием реактивов и наборов, разработанных в Кировском НИИ гематологии и переливания крови, позволяет рекомендовать их в дальнейшем к более широкому внедрению в клинико-диагностическую практику, а также к использованию данных реагентов и наборов в исследованиях, проводимых с помощью фотооптических коагулометров. Это будет способствовать стандартизации коагулологических исследований и улучшению качества обследования больных.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Показатели качества диагностикумов для исследования коагуляционного гемостаза, разработанных в Кировском НИИ гематологии и переливания крови, не уступают таковым зарубежных аналогов ("О^апоп Текшка", Нидерланды).

2. Реагенты и наборы, разработанные в Кировском НИИ гематологии и переливания крови, пригодны для определения протромбинового времени, АПТВ, активности факторов VIII и IX при использовании фотооптических коагулометров.

3. Активаторы на основе оксида кремния (каолины, кремнезем) не влияют на воспроизводимость показателей метода АПТВ и чувствительность к гепарину, но от их концентрации и оптической плотности зависит активность АПТВ-набора.

Апробация работы

Материалы работы были доложены на научно-практических конференциях "Национальные дни лабораторной медицины", (Москва, 2001), "Актуальные проблемы трансфузионной медицины" (Киров, 2000), "Современные проблемы гематологии и трансфузиологии" (Киров, 2002), а также итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии и переливания крови и Кировской Государственной Медицинской Академии (1999-2000 гг.).

По теме диссертации опубликовано 14 работ, из которых 8 - в центральной печати.

Объем и структура работы

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 161 источник, в том числе 70 иностранных. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, иллюстрирована 7 рисунками и 16 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Определение протромбинового времени проводили по методу, предложенному A.J. Quick (Баркаган З.С., Момот А.П., 1999), АПТВ и активность факторов VIII и IX - по методам, разработанным Л.П. Папа-ян и П.В. Хроловой (1980 и 1989). В работе использовали реагенты, приведенные в таблице 1.

Таблица 1.

Реагенты, применявшиеся в исследованиях_

Метод Реагенты КНИИГиПК Реагенты "Organon Teknika"

Протромбиновое время (ПВ) Тканевой тромбопластин (нерастворимый - ТН) Симпластины "Excel" и "Excel S"

АПТВ Частичный тромбопластин (ЧТ) "Automated APTT"

Одностадийное определение ф.фДЧИ и IX ЧТ, Субстраты без ф.ф. VIII и IX (из плазмы больных гемофилией А и В) Субстрат без ф.\ТП (химически инактивированный) Субстрат без ф.1Х (имму-ноистощенный)

Для оценки воспроизводимости метода ПВ брали образцы контрольной плазмы фирмы "Organon Teknika" с разными уровнями активности прокоагулянтов: плазму "Verify 1" с оптимальным их содержанием, соответствующим норме, а также "Verify 2" и "Verify 3", из которых в разной степени удалены факторы II, VII, IX и X. Кроме контрольных материалов исследовали протромбиновое время образцов плазмы 21 донора и 34 лиц, принимавших антикоагулянты непрямого действия.

В тесте АПТВ, помимо указанных выше ЧТ-реагентов, применяли следующие активаторы: каолин отечественного производства, фирмы "Oldrich" и кремнезем (Si02) фирмы "Sigma". В качестве контрольного материала брали лиофилизированный пул донорской плазмы (не менее 20 человек), производимый в Кировском НИИ гематологии и переливания крови (КНИИГиПК) - плазму донорскую реактив (ПДР), а также ге-паринизированную in vitro свежую донорскую плазму, в которой значения АПТВ были близки терапевтическим пределам, рекомендуемым при проведении гепаринотерапии. Кроме того, определяли АПТВ плазмы 21 донора.

Для оценки метода определения ф.УШ в пробирочном и аппаратном исполнении было исследовано 38 образцов плазмы больных гемофилией А, 38 - доноров и проанализировано 30 калибровочных графиков для расчета активности этого фактора. Чтобы оценить метод определения ф.1Х, было исследовано 40 образцов плазмы больных гемофилией В и 40 - доноров, а также проанализировано 23 калибровочных графика. Общее количество исследований приведено в табл. 2.

При выполнении методов использовали фотооптические коагуло-метры: "Clot" - 2-х канальный полуавтоматический ("Hospitex", Италия), одноканальный полуавтомат CGL 2110 ("Solar", Беларусь), Coag-A-Mate ХМ (ХМ) - 4-х канальный полуавтоматический и Coag-A-Mate RA-4 (RA-4) - 12-ти канальный автоматический ("Organon Teknika", Нидерланды).

Для статистической обработки результатов применяли дисперсионный анализ. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (р) принимался равным 0,05. Для оценки сопоставимости результатов использовали коэффициенты корреляции (г). Коэффициент корреляции, равный 0,3, выражал слабую степень тесноты связи между показателями, от 0,31 до 0,5 - умеренную, от 0,51 до 0,7 - заметную и от 0,71 и выше - высокую (Каминский Л.С., 1964). Чтобы определить, зависит ли расхождение результатов от величины признака, применяли описательный метод оценки согласованности измерений Блэнда - Алт-мана (Гланц С.,1999). Воспроизводимость исследуемых методов оценивали по коэффициентам вариации (CV) результатов повторных измерений одной и той же пробы (Гаранина E.H., 1997).

t

Таблица 2.

Количество исследований, проведенных для оценки методов исследова-_ния коагуляционного гемостаза_

Метод Исследуемые образцы (п)

ПВ "Verify Г "Verify 2" "Verify 3" Плазма доноров Плазма лиц, приним. антикоагулянты

Реагенты ТН 76 77 80 63 132

"Excel" 42 42 45 63 36

"Excel S" 42 42 45 63 36

АПТВ ПДР Плазма с гепарином Плазма доноров

Реагенты АПТВ-набор (ЧТ+каолин отеч.) ИЗ 45 53

ЧТ+каолин ("Oldrich") 66 42

4T+Si02 ("Sigma") 70 42

"Automated APTT" 43 53

Метод опред.акт-ти ф.УШ Калибровочные графики Плазма доноров Плазма б-ных гемофилией А

Реагенты Субстрат КНИИГиПК 19 78 78

Субстрат "Ог&Тек." 11

Метод опред. акт-ти ф.1Х Калибровочные графики Плазма доноров Плазма б-ных гемофилией В

Реагенты Субстрат КНИИГиПК 18 80 80

Субстрат "Ощ.Тек." 5

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оценка качества реактивов, применяемых для определения про-тромбинового времени (ПВ)

Разные технологии получения коммерческих тромбопластиновых реагентов по-разному влияют на их чувствительность к факторам про-тромбинового комплекса. Чтобы выяснить, как чувствительность исследуемых тромбопластинов соотносится между собой, протромбиновое время определяли в разных разведениях пула нормальной донорской

плазмы. По результатам были построены графики, на которых видно, что "Excel S" при снижении уровня прокоагулянтов дает более выраженное удлинение времени образования сгустка, значит, является наиболее чувствительным (рис.1). Графики, построенные по результатам использования отечественного тромбопластина и симпластина "Excel", практически параллельны.

На рис. 2 приведена гистограмма, на которой чувствительность выражена в относительных единицах, представляющих собой тангенс угла наклона графиков. Между чувствительностью отечественного тромбопластина и симпластина "Excel" значимых различий нет (р>0,05).

-Д- Excel S

о -,-1-,-гО 0.02 0.04 0.06 0.08

11% протромбина по Квику Рис. 1. Графики зависимости ПВ от активности факторов протромбинового комплекса

0.1

7

6.54

б -

5-

4-

3.59

3.37

з -

2 -

1 -

о

тн

Excel

Excels

Рис.2. Чувствительность тромбопластиновых реагентов (отн.ед.)

Наиболее важной характеристикой качества результатов метода является воспроизводимость. Она отражает близость друг к другу результатов измерений, выполняемых в различных условиях, и выражается в виде CV. Тканевой тромбопластин, производимый в КНИИГиПК, является нерастворимым реагентом, в отличие от симпластинов. Вероятность вариабельности результатов, получаемых при его использовании, выше, поскольку процедура приготовления его рабочего раствора включает взвешивание, растирание в ступке и центрифугирование. Несмотря на это, ТН обеспечивает воспроизводимость, сопоставимую с таковой симпластина "Excel", как в пробирочных исследованиях, так и аппаратных (табл.3).

Таблица 3.

Коэффициенты вариации (%) метода ПВ, полученные при использова-

нии разных тромбопластиновых реагентов

Контрольный образец Пробирочный метод коагулометр

ХМ RA-4 "Clot" CGL 2110

ТН Ex. Ex.S ТН Ex. Ex.S ТН Ex. Ex.S ТН ТН

'Verify 1" 4,6 4,8 4,2 1,6 5,0 6,0 5,6 6,1 7,8 4,7 6,0

п 14 14 14 15 15 14 14 14 14 18 15

"Verify 2" 6,5 7,4 13,0 4,1 10,3 11,8 5,2 8,3 15,9 7,3 5,8

п 14 14 14 14 14 14 14 14 14 19 16

'Verify 3" 7,7 6,8 12,2 4,3 4,3 8,0 8,1 7,7 15,2 5,9 8,5

п 15 15 15 15 15 15 15 15 15 19 16

Наибольшая вариация выявлена для симпластина "Excel S" при тестировании им плазмы со сниженными уровнями прокоагулянтов. Это согласуется с данными Y. De Geldre и соавт. (1994), которые выявили обратную зависимость между чувствительностью и воспроизводимостью.

При применении ТН в аппаратных исследованиях CV результатов соответствовали таковым пробирочных. Во всех случаях вариация была ниже 9%, но наилучшую воспроизводимость обеспечивал полуавтоматический коагулометр ХМ фирмы "Organon Telmika".

Одним из направлений применения метода ПВ является контроль терапии антикоагулянтами непрямого действия. Однако ввиду различной чувствительности тромбопластинов между результатами, полученными при использовании разных реагентов, могут возникать разночтения. Оценивали сопоставимость результатов, выраженных в виде про-тромбинового индекса (%ПИ), а также международного нормализованного отношения (MHO) (табл.4).

Таблица 4.

Оценка сопоставимости результатов метода ПВ, получаемых при ис-

пользовании разных тромбопластинов

Сравниваемые реагенты Статистический критерий Проби-рочн. метод Коагулометры

ХМ RA-4

ТН - "Excel" (%ПИ) Коэффициент корреляции (г) Блэнда-Алтмана (г между разностью и средней величиной каждой пары измерений) 0,94 0,36 0,98 -0,46 0,97 -0,10

TH-"Excel S" (%ПИ) Коэффициент корреляции (г) Блэнда-Алтмана 0,97 -0,68 0,95 -0,70 0,98 -0,79

"Excel"-"Excel S" (%ПИ) Коэффициент корреляции (г) Блэнда-Алтмана 0,96 -0,84 0,96 -0,67 0,98 -0,76

"Excel"-"Excel S" (MHO) Коэффициент корреляции (г) Блэнда-Алтмана 0,90 0,41 0,96 0,93 0,93 0,78

Исследовали плазму 12 лиц, принимавших антикоагулянты непрямого действия. MHO вычисляли для результатов, полученных с сим-пластинами, пользуясь международными индексами чувствительности (МИЧ), указанными на упаковке (МИЧ "Excel" - 2,07, МИЧ "Excel S" -1,13). Высокие коэффициенты корреляции между полученными результатами свидетельствуют о тесной линейной связи между ними. Однако для оценки согласованности результатов этого недостаточно. Нами был применен метод Блэнда-Алтмана, который позволяет определить, зависит ли расхождение результатов от величины признака. Для каждой пары измерений вычисляли их разность и среднюю величину и определяли коэффициенты корреляции (г) между ними. При сравнении %ПИ, полу-

ченных при использовании ТН и "Excel" с "Excel S", была выявлена обратная зависимость. То есть, чем ниже %ПИ пробы, тем больше результаты измерений, полученные с "Excel S", отличались от результатов ТН и "Excel". Это связано с тем, что чувствительность ТН близка симпла-стину "Excel", как было показано выше, a "Excel S" значительно чувствительнее их.

При сопоставлении результатов, выраженных в виде MHO, г между разностью и средней величиной каждой пары измерений свидетельствует о слабой прямой зависимости между данными пробирочного определения и высокой - аппаратного. То есть, чем выше MHO пробы (что соответствует большему снижению активности факторов протромбино-вого комплекса), тем сильнее различаются показатели теста Квика, полученные при использовании реагентов с разными МИЧ. Эти данные согласуются со сведениями L. Poller и соавт. (1998), S.E. Lind и соавт. (1999) и G. Introcaso и соавт. (2000). Они свидетельствуют о том, что разночтения в показателях метода ПВ, связанные с применением тром-бопластинов разной чувствительности, возникают как при выражении результатов в виде %ПИ, так и MHO; эти разночтения увеличиваются по мере снижения активности прокоагулянтов. Таким образом, можно заключить, что результаты метода, полученные с разными реагентами, сопоставимы лишь при условии сходной чувствительности тромбопласти-нов к факторам протромбинового комплекса как при выражении их в виде %ПИ, так и MHO.

На чувствительность тромбопластина могут оказывать влияние коагулометры, применяемые для определения ПВ. Согласно распоряжению Международного гематологического консультативного комитета показатели теста Квика, полученные с помощью коагулометров, могут быть использованы только в том случае, если они сравнимы с данными пробирочных тестов (Giddings J.C.,1989).

Для оценки сопоставимости результатов, получаемых при использовании ТН в пробирочных и аппаратных определениях ПВ, исследовали плазму лиц, принимающих антикоагулянты непрямого действия (табл.5). Сравнение результатов, полученных при использовании коагулометров ХМ и CGL 2110, с таковыми пробирочных исследований показало, что коэффициенты корреляции между разностью и средней ве-

личиной каждой пары измерений близки к нулю. Это указывает на отсутствие зависимости величины расхождений в показателях от активности прокоагулянтов в образце. При сравнении результатов коагуломет-рии на "Clot" и RA-4 с пробирочными была выявлена слабая отрицательная зависимость. Это значит, что при снижении уровня протромби-нового комплекса под воздействием антикоагулянтов между результатами пробирочных и аппаратных исследований могут возникнуть незначительные расхождения.

Таблица 5.

Сопоставимость результатов пробирочного и аппаратного определения _протромбинового времени при использовании ТН

Статистический критерий Пробир./ ХМ п=34 Пробир./ RA-4 п=34 Пробир./ "Clot" п=8 Пробир./ CGL2110 п=22

Коэффициент корреляции (г) 0,93 0,93 0,84 0,83

Критерий Блэнда-Алтмана (г между разностью и средней величиной каждой пары измерений) -0,01 -0,36 -0,47 -0,07

Таким образом, использование тромбопластина нерастворимого, производимого КНИИГиПК, в аппаратных исследованиях протромбинового времени обеспечивает хорошо воспроизводимые и хорошо сопоставимые результаты как в нормальном, так и патологическом диапазонах значений %ПИ.

Оценка качества реактивов, применяемых для определения активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ)

Метод АПТВ представляет собой модификацию метода времени рекальцификации плазмы, стандартизованного по контактной и фосфо-липидной фазам. Однако частичные тромбопластины (ЧТ), являясь биологическими фосфолипидными реагентами, различаются между собой по чувствительности к прокоагулянтам внутреннего пути свертывания, а также к содержанию в плазме гепарина. Для запуска свертывания крови в методе АПТВ помимо ЧТ-реагентов применяют активаторы. Наиболее часто с этой целью используют различные формы оксида кремния: каолин, кремнезем, силикагель. Активатором, применяемым в тесте АПТВ,

является также эллаговая кислота - растворимый реагент, наиболее приемлемый для проведения исследований с помощью оптических коагу-лометров. Однако, было выявлено ее значительное влияние на чувствительность АПТВ к факторам свертывания и содержанию гепарина в зависимости от природы металла, применяемого для активации самой эл-лаговой кислоты (Берковский А.Л., 2000). Аналогичных данных о влиянии активаторов, содержащих кремнезем, на результаты метода АПТВ и чувствительность его к гепарину в доступной литературе мы не встретили.

Оценивали воспроизводимость и сопоставимость результатов метода АПТВ, полученных при выполнении его пробирочным и аппаратным способами с применением наборов реагентов КНИИГиПК и фирмы "О^апоп Текшка". Коэффициенты вариации результатов, полученных при использовании этих наборов, не превышали 10% (табл.6). При использовании отечественного набора в сочетании с коагулометрами фирмы "О^апоп Текшка" СУ составили около 3%.

Таблица 6.

Коэффициенты вариации (%) метода АПТВ, полученные с разными

ЧТ-реагентами в пробирочном и аппаратном исполнении

ЧТ-реагент Пробироч- Коагулометры

ный метод ХМ RA-4 "Clot" CGL2110

"АПТВ-набор" (КНИИГиПК) 9,9 2,9 3,3 8,7 8,5

"Automated АРТТ" 7,7 9,8 6,0 8,2

(Org. Тек.)

Чтобы выяснить влияние различных активаторов, применяемых в тесте АПТВ, на его результаты, исследовали каолин отечественного производства, фирмы "Oldrich" и кремнезем фирмы "Sigma"; источником фосфолипидов был частичный тромбопластин, разработанный в КНИИГиПК институте. Суспензии активаторов, приготовленные из расчета 5 мг на 1 мл 0,9% раствора NaCl, имели высокую оптическую плотность, которая не позволяла использовать такой "мутный" реагент в фотооптических коагулометрах. В связи с этим суспензии активаторов отстаивали и отбирали "легкую" фракцию, добиваясь, чтобы оптическая плотность была такой же, как у реагента "Automated АРТТ". Получен-

ную таким образом "легкую" суспензию каолина использовали в дальнейших исследованиях.

На рис.3 видны разночтения между результатами пробирочных и аппаратных тестов. Если в пробирочном исполнении метода АПТВ самое короткое время образования сгустка наблюдалось при включении в тест-систему кремнезема, а наибольшее - отечественного каолина, то в аппаратном - при применении отечественного каолина сгусток образовывался быстрее. Между результатами, полученными с применением этих активаторов, выявлены значимые различия (р<0,001). Следовательно, для исключения подобных разночтений необходимо использовать не сочетание отдельных реагентов, а наборы для теста АПТВ, откалибро-ванные для комбинации ЧТ/активатор.

45 -) 39 7

34 5 36 635.4 □ Каолин

i 35 - 32-3 32.3—29 г—4Н отечеств,

1 I № — I г—^ • Н ОКаолин

g. 25 - ■ ■ H "Oldrich"

g Hj HI H ШКремнез!

I 15- ■ M "Sigma"

Пробирочн. ХМ RA-4 Рис.3. Влияние различных активаторов на АПТВ

Коэффициенты вариации результатов в пробирочном исполнении метода АПТВ во всех вариантах не превышали 10%, а в аппаратном -находились в пределах от 2,6 до 6,2% при исследовании образцов плазмы с нормальными значениями АПТВ и от 4,0 до 8,3% - при исследовании гепаринизированных образцов (табл.7). На основании этих данных можно утверждать, что воспроизводимость метода АПТВ не зависит от типа применяемого активатора.

Для оценки чувствительности ЧТ, разработанного в КНИИГиПК, к гепарину, и влияния на нее разных активаторов использовали плазму, в которую in vitro добавляли гепарин в концентрациях 1,0; 0,5; 0,25; 0,13 и 0,06 ед/мл. АПТВ плазмы, определяемое с применением данных реагентов, линейно зависит от концентрации в ней гепарина (рис.4).

Таблица 7.

Коэффициенты вариации (%) метода АПТВ при выполнении его с раз__ными активаторами_

Объект исследования Пробирочный метод Коагулометры

ХМ RA-4

К 1 К2 КЗ К 1 К 2 КЗ К 1 К 2 КЗ

Контрольная плазма п 9,9 20 9,8 20 9,8 24 2,9 22 ' 2,6 22 4,0 22 3,3 ' 24 2,7 24 6,2 24

Плазма с гепарином п 9,5 ю...... 6,6 "То" 9,9 • 0 5,8 8,3" 16 7,7 16 6Д 16 4,4 16 4,0 16

Примечание: К 1 - каолин отечественный; К 2 - каолин "Oldrich"; К 3 -кремнезем "Sigma".

О 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Концентрация гепарина, ед'мл РисАВлияние разныхакпшагоровна чувствительность АПТВ-реагектов к гепарину

Статистически достоверных различий между графиками зависимости времени свертывания от концентрации гепарина в образце при использовании разных активаторов не выявлено (р>0,05). Это является подтверждением того, что активаторы на основе кремния не влияют на чувствительность АПТВ к гепарину.

Оценка качества реактивов, применяемых для определения активности факторов VIII и IX

Наиболее распространенными методами определения активности факторов VIII и IX являются одностадийные, основанные на тесте АПТВ. При этом в тест-системах используют субстратную плазму с достаточным уровнем всех прокоагулянтов и отсутствием исследуемого. Качество таких субстратов оказывает значительное влияние на чувствительность методов. Это может быть связано с наличием "остаточной активности" или ингибиторов к исследуемому фактору, либо инактивацией других прокоагулянтов, происходящей в процессе приготовления субстрата.

Оценивали воспроизводимость методов определения факторов VIII и IX, используя субстраты, разработанные в КНИИГиПК, и субстраты фирмы "Organon Teknika". Методы выполняли пробирочным способом и на коагулометре ХМ. Расчитывали коэффициенты вариации повторных измерений образцов плазмы с нормальным уровнем этих факторов (плазмы доноров) и со сниженным (плазмы больных гемофилией А или В). Поскольку пробы, предназначенные для определения указанных прокоагулянтов, хранить не рекомендуется, исследования проводили в один день. CV, вычисленные по полученным результатам, характеризовали воспроизводимость в одной серии исследований - сходимость. Вариация пробирочного определения факторов VIII и IX достигала 12 - 13%. Применение коагулометра уменьшало ее до 5 и 7% (табл.8).

Таблица 8.

Воспроизводимость методов определения активности ф.ф.УШ и IX

Определение ф.УШ Определение ф.1Х

Проби рочное Аппаратное Проби рочное Аппаратное

Акт-ть ф.УШ CV (%) Акт-ть ф.УШ CV (%) Акт-ть ф.1Х CV (%) Акт-ть ф.1Х CV (%)

11% 14% 134% 136% 10,5 10.5 12,2 13.6 7% 8% 166% 155% 3,8 2,2 4,5 5Д 4% 2% 89% 91% 12,9 11,0 11,1 9,3 8% 148% 125% 6,8 7,2 3,9

Примечание: каждый образец тестировали 20 раз (п=20).

Получение объективных результатов во многом зависит от калибровочных графиков, по которым производится расчет. СУ калибровочных графиков для расчета активности ф.УШ, полученных с использованием субстрата, разработанного в КНИИГиПК, находились в пределах 10,5 - 13,7% в пробирочном исполнении метода и 6,4 - 13,8% - при использовании полуавтоматического коагулометра (табл.9). Применение импортного субстрата показало те же пределы колебаний.

Вариация калибровочных графиков для расчета активности ф.1Х, полученных с использованием отечественного субстрата, была в пределах 10,5 - 13,7% в пробирочном исполнении метода и 6,4 - 13,8% - аппаратном. Коэффициенты вариации при использовании импортного субстрата в аппаратном исполнении метода достигали 15%.

Таблица 9.

Коэффициенты вариации (%) калибровочных графиков методов опреде-

ления активности ф.ф.УШ и IX

Определение ф.УШ Определение ф.1Х

Субстр. Субстр. "Oтg. Субстр.

Разведе- КНИИ [ГиПК Те к." КНИГ [ГиПК "/~Ь-гт ТпЪ- "

ния Проби- Аппа- Проби- Аппа- Проби- Аппа- и^. хек. Аппаратн.

рочное (п=9) ратное (п=10) рочное (п=6) ратное (п=5) рочное (п=9) рата (п=9) (п=5)

100% 12,5 13,8 12,5 13,8 12,5 13,8 15,2

50% 10,6 11,7 10,6 11,7 10,6 11,7 7,4

25% 11,9 9,8 11,9 9,8 11,9 9,8 0,8

12,5% 10,5 10,3 10,5 10,3 10,5 10,3 0,9

6,25% 13,7 6,4 13,7 6,4 13,7 6,4 2,3

На рисунках 5 и 6 представлены калибровочные графики для вычисления активности ф.ф.УШ и IX, построенные с применением исследуемых субстратов в пробирочном и аппаратном исполнении метода.

Графики, построенные по результатам аппаратного выполнения методов более линейны, чем построенные по результатам пробирочного. Это подтверждают коэффициенты детерминации (КД), характеризующие разброс точек относительно графика: если все точки лежат строго на одной линии, КД=1; чем более точки отходят от графика, тем ниже коэффициент. КД калибровочных графиков аппаратного исполнения ме-

тодов несколько выше, результаты калибровки более линейны (табл.10).

2.1

2.0 -

1.9

1.8

1.7

0.6

Д.

□ Пробир. КНИИГПК

Д Пробир. "Org. Тек."

О Аппарат. КНИИГПК

Д Аппарат. "Org. Тек."

0.9

1.2 1.5

lg %акгивности ф.УШ

1.8

2.1

Рис.5.Калибровочные графики для вычисления активности ф.УШ

2.1 т

2.0

1.9

□ Пробир. КНИИГПК О Аппарат. КНИИГПК А Аппарат. "Org. Тек."

■-Д.

-Д

1.7

0.6 0.9 1.2 1.5

активности ф.1Х

Рис.б.Калибровочные графики для вычисления активности ф.1Х

2.1

Г

Таблица 10.

Коэффициенты детерминации (КД) калибровочных графиков для вы_ числения активности ф.ф.УШ и IX _

Исполнение метода Субстрат КД(ф.УШ) КД(ф.1Х)

Пробирочное КНИИГиПК 0,975 0,976

"Organon Teknika" 0,982 -

Аппаратное КНИИГиПК 0,984 0,984

"Organon Teknika" 0,988 0,988

Таким образом, несмотря на то, что применение коагулометра ХМ не повышает воспроизводимость калибровочных графиков, оно обеспечивает более линейные результаты при их построении, следовательно, улучшает качество исследований.

Чувствительность калибровочных графиков методов определения активности ф.ф.УШ и IX была выражена в виде относительных единиц (рис.7).

0.167

0.14

III

1ный И Аппаратный Д

■ ,1 им

фактор VIII фактор IX ф.УШ, ф.1Х,

"О^апоп "О^алоп

(екшка" 1екшка" Рис.7. Чувствительность методов определения

активности ф.ф.УШ и IX

Данные, представленные на гистограмме, показывают, что применяемые субстраты обеспечивали сходную чувствительность методов определения активности ф.ф.УШ и IX. Между значениями чувствительности, полученными при использовании субстратов, разработанных в КНИИГиПК, и производимых фирмой "О^апоп Текшка", значимых различий не выявлено (р>0,05). При сравнении чувствительности пробирочных и аппаратных способов выполнения этих методов статистически достоверные различия также отсутствовали (р>0,05).

выводы

1. Полный тканевой тромбопластин для определения протромбинового времени и частичный - для АПТВ, разработанные в Кировском НИИ гематологии и переливания крови, обеспечивают хорошую воспроизводимость результатов этих методов, не уступающую таковой, получаемой при использовании зарубежных аналогов ("Organon Teknika", Нидерланды), как в пробирочных, так и аппаратных исследованиях.

2. Реагенты для выполнения методов протромбинового времени и АПТВ, разработанные в Кировском НИИ гематологии и переливания крови, при использовании в аппаратных исследованиях обеспечивают результаты, сопоставимые с таковыми пробирочных. Их допустимо применять в сочетании с фотооптическими коагулометрами: Coag-A-Mate ХМ, Coag-A-Mate RA-4 ("Organon Teknika", Нидерланды), "Clot" ("Hospitex", Италия) и CGL 2110 ("Solar", Беларусь).

3. Активаторы на основе оксида кремния (каолины, кремнезем), наряду с частичным тромбоаластином, оказывают влияние на активность АПТВ-набора в зависимости от их концентрации и оптической плотности. В то же время, они не влияют на воспроизводимость показателей метода АПТВ и чувствительность к гепарину.

4. Реагенты для одностадийных методов определения активности факторов VIII и IX, разработанные в Кировском НИИ гематологии и переливания крови (АПТВ-набор и субстраты без факторов VIII и IX), высоко чувствительны к снижению уровня этих прокоагулянтов. Они обеспечивают воспроизводимость, не уступающую таковой зарубежных аналогов (субстраты "Organon Teknika", Нидерланды).

5. Применение коагулометра Coag-A-Mate ХМ ("Organon Teknika", Нидерланды) при определении активности факторов VIII и IX с использованием реагентов Кировского НИИ гематологии и переливания крови позволяет получать результаты, сопоставимые с таковыми пробирочных определений, и значительно повышает воспроизводимость методов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

. Реагенты для определения протромбинового времени и АПТВ, разработанные в Кировском НИИ гематологии и переливания крови, в дальнейшем могут быть рекомендованы не только для пробирочного исполнения методов, но и аппаратного - при использовании коагуломет-ров Coag-A-Mate ХМ и Coag-A-Mate RA-4 ("Organon Teknika", Нидерланды), "Clot" ("Hospitex", Италия) и CGL 2110 ("Solar", Беларусь).

!. Для исключения вариаций результатов метода АПТВ, вызываемых применением различных активаторов, следует использовать не сочетание отдельных реагентов, а наборы для теста АПТВ, откалиброванные для комбинации ЧТ/активатор.

'. С целью уменьшения вариации чувствительности АПТВ к гепарину предпочтительно использовать активаторы на основе кремнезема.

:ПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

. Тарасова Л.Н., Владимирова С.Г., Савиных Е.Ю., Платонова Г.К. Тромбопластиновые реагенты и результаты метода Квика в пробирочном и аппаратном воспроизведении // Трансфузиология и служба крови: Тез. докл. конференции,- М.,1998.- С.213.

:. Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю., Владимирова С.Г., Платонова Г.К. Оценка показателей качества методов Квика и АПТВ в ручном и аппаратном исполнении // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998,- С.230-231.

. Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н. Стабильность прокоагулянтов пула нативной плазмы при разных режимах хранения // Вопросы трансфузи-онной и клинической медицины: Тез. докл. Шестой научной конференции молодых ученых. - Киров, 1999,- С.37-38.

4. Тарасова Л.Н., Платонова Г.К., Савиных Е.Ю., Владимирова С.Г.

Донорская плазма (реактив) для расчета протромбинового комплекса h Проблемы стандартизации в здравоохранении,- 1999, №2.- С.41.

5. Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю., Платонова Г.К. Вос-

производимость аппаратных методов исследования коагуляционого гемостаза

при использовании отечественных тест-систем // Проблемы стандартизации в здравоохранении,- 2000, №1,- С.117.

6. Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю., Платонова Г.К. Активность частичного тромбопластина, входящего в набор для теста АЧТВ, при хранении в растворенном виде // Проблемы стандартизации в здравоохранении,- 2000, №1.- С.117.

7. Владимирова С.Г. Воспроизводимость метода АПТВ в пробирочном и аппаратном воспроизведении // Молодежь и медицинская наука на пороге XXI века: Материалы VI итоговой открытой научно-практической конференции. -Ч.2.- Киров, 2000.- С. 12.

8. Владимирова С.Г. Воспроизводимость метода протромбинового времени в ручном и аппаратном исполнении // Молодежь и медицинская наука на пороге XXI века: Материалы VI итоговой открытой научно-практической конференции. -Ч.2.- Киров, 2000,- С. 13.

9. Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю., Платонова Г.К. Влияние различных активаторов на результаты метода АЧТВ // Актуальные проблемы трансфузионной медицины: Тез.докл. научно-практической конференции,- Киров, 2000.- С.44-45.

10. Тарасова Л.Н., Владимирова С.Г., Савиных Е.Ю., Платонова Г.К., Речкин О.И. Показатели качества метода Квика при использовании тромбопластиновых реагентов в ручном и аппаратном исполнении // Клинич. лаб. диагностика.- 2000, ЖЗ.-С.24, 41-42.

11. Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н., Платонова Г.К., Савиных Е.Ю., Халтурина Т.И. Оценка сопоставимости результатов одно- и двухста-дийного методов определения активности фактора VIII // Клинич. лаб. диагностика,- 2001,№9.-С. 17-18.

12. Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н., Платонова Г.К., Савиных Е.Ю. Сравнение воспоизводимости калибровочных графиков метода определения активности фактора VIII // Клинич. лаб. диагностика.- 2001,№10.-С. 11.

Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю., Платонова Г.К. Чувствительность методов определения активности факторов VIII и IX при использовании отечественных и импортных субстратов в пробирочных и аппаратных исследованиях // Современные проблемы гематологии и трансфузиологии: Тездокл. научно-практической конференции.- Киров, 2002.-С.55-56.

Владимирова С.Г., Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю., Платонова Г.К. Влияние активаторов, применяемых в тесте АЧТВ, на его результаты в пробирочном и аппаратном исполнении // Клинич. лаб. диагностика.-2002,№2. -С.38-40.