Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Разработка способа выделения антитромбина-III, получение антисыворотки и некоторые аспекты ее применения

На правах рукописи

РГБ ОД

2 7 ОКТ ШЭ

Волков Сергей Леонидович

/ РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИТРОМБИНА-Ш, ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТКИ И НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ

14.00.17- Нормальная физиология 14.00.16 - Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Чита - 1999

Работа выполнена на базе Московского научно-исследователького института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габрического и на кафедре патологической физиологии Читинской государственной медицинской академии

Научные руководители: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских

наук, профессор В.А.Алешкин; лауреат премии Совета Министров СССР, доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Цыбиков.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Ю.А.Витковский;

доктор медицинских наук А.В.Степанов.

Ведущая организация - Гематологический научный центр РАМН (г.Москва)

Защита диссертации состоится " _10 "_^ Н; /<.?_1999 г.

в / /) часов на заседании диссертационного совета Д 84.74.01 при Читинской государственной медицинской академии (672000, г. Чита, ул. Горького, 39-А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Читинской государственной медицинской академии по адресу: 672000, г. Чита, ул. Горького, 39-А

Автореферат разослан " 2. & "_

1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 84.74.01 кандидат биологических наук, с.н.с.

А.Н.Ложкина

Pz 66.3^0

Р 2Г2. V.<f<f 1 Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкое распространение заболеваний, связанных с нарушением процессов свертывания крови, ставят перед клиницистами проблему выбора наиболее эффективных способов их ранней диагностики и лечения. Решение этой проблемы невозможно без изучения механизмов свертывания крови, факторов, регулирующих этот процесс, их взаимодействия с другими физиологическими системами организма.

В настоящее время показано, что гйперкоагуляция является одним из основных звеньев патогенеза и сопровождает целый ряд патологических состояний. Среди факторов, регулирующих процесс свертывания ¡срови, важное место отводится антитромбину-Ш (АТ-Ш), блокирующему преимущественно активацию контактной фазы свертывающего каскада и тромбин.

Согласно литературным данным при таких заболеваниях, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, сахарный диабет, геморрагический диатез, врожденные пороки сердца, болезни почек и многие другие, уровень и активность АТ-Ш снижены. Причем показано, что такие изменения коррелируют с тяжестью, длительностью заболевания и степенью компенсации состояния больного, а, следовательно, могут служить показателями мониторинга и прогноза течения заболевания.

Помимо диагностической и прогностической значимости оценки количества АТ-Ш в крови больных мониторинг за уровнем АТ-Ш необходим для своевременной компенсации ингибитора, а также для подбора дозы антикоагулянтов при лечении коагулопатий.

Для оценки уровня АТ-Ш применимы следующие лабораторные тесты: радиальная иммунодиффузия по Манчини, иммуноферментный анализ и латекс-агглютинация, требующие наличия соответствующей

моноспецифической антисыворотки. Современная отечественная лабораторная практика не располагает целым рядом иммунохимических реагентов, в том числе моноспецифической антисывороткой, а также стандартом для иммунохимического измерения количества АТ-Ш, поэтому получение отечественных иммунохимических реагентов для этой цели весьма актуально. Для автоматизации и повышения скорости выполнения массовых обследований необходима разработка фотометрических методов измерения уровня АТ-Ш - нефелометрического и турбидиметрического анализа. Развитое фотометрических методов в нашей стране сдерживается отсутствием оборудования и реагентов. В связи с этим создание коммерческих отечественных наборов реагентов для фотометрии также является актуальной задачей.

Другим, более важным аспектом проблемы является отсутствие в отечественном лекарственном арсенале и самого препарата (концентрата) АТ-П1, необходимого как в качестве антикоагулянта, так и кофактора гепарина.

Отсюда становится понятной необходимость разработки отечественных способов выделения очищенного AT-III для получения нового отечественного препарата. Выделение AT-III из крови невозможно без иммунохимического контроля качества получаемых препаратов, предполагающих использование моноспецифических антисывороток и соответствующих стандартов, что предполагает необходимость разработки также и соответствующей иммунохимической тест-системы.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования явилась разработка способа получения очищенного биологически активного AT-III и на его основе - иммунохимических реагентов определения содержания данного антикоагулянта для оценки системы гемостаза в клинической практике.

Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:

1) разработка оптимальных способов выделения и очистки функционально активного AT-III из сыворотки доноров, а также из балластного осадка IV-I, получаемого в процессе производства препаратов крови спиртовым методом Кона;

2) создание набора иммунохимических реагентов (стандарта AT-III, антисыворотки, гамма-фракции антисыворотки и пр.) для качественного и количественного анализа AT-III;

3) апробация способов иммунохимического контроля AT-III с полученными реагентами в сыворотке доноров: радиальной иммунодиффузии, иммуноферментного анализа.

4) разработка методов количественной оценки AT-III - нефелометри-ческого и турбидиметрического анализа, метода латексной агглютинации.

Научная новизна. Разработаны оригинальные способы выделения и очистки AT-III из нормальной донорской плазмы крови человека и из балластного осадка IV-I - отхода производства препаратов крови человека спиртовым фракционированием по методу Кона. Проанализировано содержание АТ-1П в различных видах сырья и во фракциях всех этапов очистки белка. Показана принципиальная возможность использования в качестве источника антигенного материала АТ-1П балластного осадка IV-I. Получены новые иммунохимические реагенты для количественной оценки AT-III в плазме крови человека: поликлональная и моноклональная кроличья антисыворотка, очищенная гамма-фракция к AT-III, стандартная сыворотка крови, оттитрованная по имеющемуся аналогу фирмы "Behring" (Германия).

Разработаны и апробированы серологические методы определения уровня AT-III - нефелометрии, турбидиметрии, латексной агглютинации, иммуноферментный анализ. Показана диагностическая и прогностическая ценность оценки уровня AT-III у больных, включенный в группы риска коагулопатий.

Практическая значимость работы. Определены оптимальные режимы получения AT-III, специфических антигенов, антисывороток и гамма-фракции антител для фотометрии. На основе полученных реагентов отработаны

методики проведения нефелометрического, турбидиметрического анализа и латексной агглютинации для определения количества антикоагулянта в сыворотке доноров.

Проведенное обследование больных показало возможность дифференциальной диагностики, прогноза терапевтической коррекции системы гемостаза, возможных осложнений при гепаринотерапии, а также приобретенных и врожденных коагулопатий.

Внедрение в практику. На основе предварительно разработанных способов выделения и очистки АТ-Ш из различных видов сырья получены и внедрены в биотехнологическую практику следующие новые иммунохимические реагенты для определения АТ-Ш :

1) "Антисыворотка диагностическая против АТ-Ш человека сухая преципитирующая" и "Антисыворотка диагностическая против АТ-Ш человека преципитирующая сухая".

2) Латексная тест-система для определения АТ-Ш в плазме крови.(Экспериментально производственный регламент).

Апробация диссертации. Материалы исследований доложены на " международной конференции "Экологическая патология и ее фармакокоррекция" (Чита, 1991), на межвузовской конференции "Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза" (Полтава, 1993), на Всероссийской конференции "Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники" (Чита, 1995), на Всероссийской научной конференции "Экологические интоксикации: биохимия, фармакология, клиника" (Чита, 1996).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 14 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 90 отечественных и 105 зарубежных.

Положения, выносимые на защиту. Разработан оптимальный и простой способ выделения очищенного АТ-Ш из сыворотки крови, основанный на применении аффинной хроматографии на гепарин-сефарозе-4В с предварительной обработкой плазмы полиэтиленгликолем. Данный способ может быть успешно применен в промышленном масштабе. Балластный осадок 1У-1, получаемый при производстве белковых препаратов крови спиртовым методом по Кону, может быть использован для получения АТ-Ш.

Выделенный из сыворотки АТ-Ш сохранет биологическую активность, а препарат АТ-Ш, полученный из бросовой фракции спиртового выделения по Кону, функционально не активен, но сохраняет антигенные свойства, что допускает его применение в качестве иммуногена. Разработаны способы приготовления стандарта антигена и получения антисыворотки к АТ-Ш и

выделения иммуноглобулиновой фракции для проведения серологических реакций.

Латексная тест-система для определения концентрации антитромбина-Ш является эффективной для экспресс-диагностики нарушений системы гемостаза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 100 здоровых людях обоего пола (38 женщин, 62 мужчин) в возрасте 18-40 лет, а также 82 больных с различными заболеваниями (сепсис микс-инфекция, ишемическая болезнь сердца), сопровождающихся изменением антикоагулянтного фона и развитием тромбогеморрагического синдрома (ТГС). Объектами изучения служили цельная кровь, плазма, сыворотка, форменные элементы крови здоровых и больных людей. Плазма и сыворотка здоровых доноров использовались в качестве контроля при определении уровня и активности AT-III. Образцы исследуемых сывороток хранили в 0,01М растворе ЭДТА при -20°С не более недели. В работе также использовано 24 кролика породы шиншилла массой 3 -4 кг.

Выделение антитромбина III и получение антисыворотки к AT-III.

Антиттромбин-Ш выделяли из нескольких образцов плазмы крови здоровых доноров (ЦНИИ гематологии и переливания крови) и из балластной фракции осадка IV-1, получаемой при фракционировании крови спиртовым методом Кона при производстве альбумина на предприятии по производству бактериальных препаратов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Все исходное сырье употреблялось сразу или хранилось не более месяца при температуре -20°С. Антисыворотку к AT-III получали путем иммунизации кроликов очищенным препаратом.

Концентрацию белка определяли методом Лоури с использованием реактива Фолина.

Диализ и концентрация белковых фракций. Диализ нормальной плазмы крови при выделении АТ-П1 проводили с использованием диализных трубок против буферного раствора состава: 0,01М мединала, 0,001М эпсилон-аминокапроновой кислоты, 0,001М ЭДТА (рН 8,8) при температуре 4°С. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием при 10000g в течение 20 минут (5°С). Трехкратное промывание осадка осуществляли дистиллированной водой и повторным центрифугированием в тех же условиях. Повторный диализ проводили против 100-кратного объема 0,072М ЭДТА с рН 5,0. Осадок отделяли и промывали, как описано выше. Осажденный AT-III растворяли в минимальном объеме 0,05М трис-HCl с 0,5М NaCl и 0,01М ЭДТА. Белковые растворы на всех этапах очистки концентрировали под давлением 0,1мПа помощью установки "Amicon" (Нидерланды) через пористые фильтры типаРМ-30, пропускающие соединения молекул массой до ЗОкД.

6

Диск-электрофорез. Метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) применяли для анализа молекулярной массы и чистоты хроматографических фракций AT-III.

Аффинная хроматография. Для выделения AT-III использовали аффинную хроматографию на сорбенте гепарин-сефароза-CL 6В. Метод основан на свойстве АТ-Ш достаточно сильно связываться с фиксированным гепарином. Разделение проводили на хроматографической установке фирмы "LKB" (Швеция) при комнатной температуре. Для детекции оптической плотности белковых растворов при проведении хроматографических разделений использовали проточную ячейку типа "Uvicord SU" ("LKB", Швеция) при длине волны 280 нм.

Аффинная хроматография на гепарин-сефарозе. Колонку с гепарин-сефарозой предварительно уравновешивали тремя объемами 0,01М фосфатного буфера (pH 7,4). Антитромбин-Ш-обогащенную фракцию наносили на гепарин-сефарозу со скоростью 20 мл/час. Под конторолем спектрофотометра и самопишущего устройства собирали фракцию несвязавшихся белков и объединяли ее с осажденными компонентами полиэтиленгликолем (см. п. 3.1.) для приготовления иммунного сорбента. Связавшиеся с аффинной матрицей белки элюировали линейным градиентом 0,01-1,5М NaCl и собирали в отдельную емкость. Сорбент регенерировали промывкой колонки тремя объемами исходного буфера и хранили при 4 5° С с 0,02% азида натрия (NaN3). Присутствие гепарина проверялось измерением содержания мочевой кислоты.

Ионообменная хроматография. Для проведения ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе фракцию с АТ-Ш пропускали в буферном растворе (0,02 М натрий-фосфатный буфер с 0,1М NaCl, 0,005М ЭДТА, pH 7,0) через колонку со скоростью 20 мл/час., сорбент промывали буферным раствором. Элюцию сорбированных белков проводили при помощи линейного солевого градиента (от 0,1 до 0,7М NaCl) в пробирки по 5 мл. Каждую фракцию проверяли на присутствие АТ-Ш методом двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. АТ-Ш-обогащенные фракции объединяли. Оставшиеся фракции суммировали и использовали для приготовления иммунного сорбента.

Радиальная иммунодиффузия (РИД) по Оухтерлони и Манчини.

Для реакции иммунопреципитации использовали 1% агарозу ("Reanal", Венгрия). Расплавленную агарозу предварительно выдерживали в термостате при температуре 51-54°С. Фиксированная толщина геля (2 мм) достигалась заливкой охлажденной до указанной температуры агарозы между двумя пластинами размером 2 х 12см, зафиксированными с помощью зажимов и П-образной прокладки. После застывания геля одну из пластинок и прокладку убирали и в слое агарозы вырезали лунки диаметром 1,5-2 мм, в которые вносили по 5 мкл образца антигена в разных концентрациях. Параллельно ставились 4 пробы со стандартной сывороткой фирмы "Behring" (ФРГ) в

разведениях 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. После нанесения проб стекло помещали во влажную камеру и оставляли на 24 часа для реакции преципитации при температуре 4°С.

Реакцию преципитации по Оухтерлони проводили, помещая раствор AT-III и антисыворотку в лунки на расстоянии 3-4мм друг от друга. Референс-препаратами служили моноспецифические антисыворотки к АТ-Ш и стандартная плазма крови человека с известным содержанием AT-III производства фирмы "Behring" (Германия).

При постановке РИД по Манчини первоначально готовили гель, содержащий моноспецифическую антисыворотку к AT-III ("Sevac", Чехословакия). Рабочее разведение антисыворотки к АТ-Ш (1:16) подбиралось предварительно: 0,5 мл антисыворотки добавляли к 3 мл 0,03М веронал-мединалового буфера (pH 8,6) и смешивали с 4мл 2% раствора агарозы при температуре 5°С.

Пластинку с образовавшимися дугами преципитации, заливали физиологическим раствором на 2 суток для удаления непрореагированных белков сыворотки. Физиологический раствор меняли два раза в сутки. По окончании промывки поверхность геля на пластинке плотно прикрывали влажной фильтровальной бумагой для равномерного высушивания. Стекло с подсушенным гелем помещали в кювету с раствором краски (1% амидо черного в 7% уксусной кислоте) на 15 минут. Затем пластинку промывали в растворе 7% уксусной кислоты, которую меняли 3 раза через каждые 10-15 мин.

Иммуноэлектрофорез. Стеклянную пластинку размером 9 х 12 см, помещенную на горизонтальную площадку, заливали 20 мл расплавленного 1% агара, приготовленного в 0,03М веронал-мединаловом буфере с pH 8,6. Затем по трафарету в геле вырезали лунки диаметром 1,5-2 мм и каналы (на данном этапе агар из каналов не извлекается). На стекле подобного размера обычно вырезают 10 каналов (60 х 2 мм) на расстоянии 10 мм. В лунки вносили исследуемые фракции по 5-7 мкл, для контроля - стандартную плазму.

Электрофорез проводили с принудительным охлаждением при напряжении 200 В и силе тока 15-40 мА в течение 1,5 часов. По окончании разделения белков вынимали агар из ранее вырезанных каналов и заполняли соответствующими антисыворотками. Стекло помещали во влажную камеру и оставляли на сутки для проведения реакции преципитации. Дальнейшую обработку проводили аналогично диск-электрофорезу.

Определение белков нефелометрическим и турбнднметрнческнм методами анализа. Нефелометрию проводили на отечественном лазерном нефелометре JIH-1 фирмы "Квант", турбидиметрию - на отечественном спектрофотометре.

Метод латексной агглютинации. В работе была использована полимерная суспензия, представляющая собой сополимер стирола и глицидилметакр плата (ПСГМ) с размером микрочастиц 1,8 мкм. На поверхности частиц данной суспензии содержатся эпоксидные группы.

Для проведения латексной агглютинации в лунку микропланшета с U-образным дном помещали по 15 мкл сыворотки крови, содержащей AT-III в диапазоне концентраций от 50 до 400 мкг/мл. Затем туда же приливали по 15 мкл латексного конъюгата ПСГМ-АТ. Микропланшет инкубировали 2 часа при комнатной температуре. В качестве контроля использовали конъюгат ПСГМ-АТ в фосфатном буфере. Примерно через 40 минут наблюдается агглютинация латексного конъюгата с AT-III, выраженная в образовании небольшой точки на дне U-образной лунки.

Методы забора и хранения крови. Донорскую кровь забирали у человека из локтевой вены широкой иглой в центрифужные пробирки (для получения плазмы - с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9). Для отделения сыворотки кровь оставляли в термостате для свертывания и ретракции на 40 минут, затем центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 15 мин., сыворотку отсасывали в кюветы и для хранения замораживали при -20°С.

Кровь кроликов собирали в центрифужные пробирки из краевой вены уха, сыворотку отделяли центрифугированием.

Методы исследования системы гемостаза. Для диагностики тромбогеморрагического синдрома в кровотоке больных записывали тромбоэластограмму цельной крови (Hartert H.,1948). В тромбоэластограмме расшифровывали следующие показатели: период R, характеризующий образование протромбиназы и тромбина; период К, отвечающий началу формирования сгустка фибрина; MA - максимальная амплитуда, соответствует наибольшей вязкости свернувшейся крови; Т - общая константа свертывания крови; угол тромбоэластограммы. Для исследования свертывания крови и фибринолиза использовали реактивы фирмы Behring (Германия). Коагуляционный гемостаз оценивали по следующим тестам: время, свертывания крови (Lee R.J., White P.,1913), время рекальцификации плазмы (Bergerhof H.D., Roka L., 1954), АЧТВ (Larrien M.J., Weillard С., 1957), протромбиновое (Quick A.J., 1943), тромбиновое время (Syrmai Е., 1957), этаноловый тест (Godai H., Helle J., 1963) и протаминсульфатный тест (Lipinski A. et al.,1968). Концентрацию фибриногена определяли общепринятым способом.

Оценка содержания и активности препарата AT-III. Концентрацию АТ-П1 в исследуемых препаратах определяли методом простой радиальной иммунодиффузии (РИД) с использованием собственных моноспецифических антисывороток к АТ-П1 и стандартных сывороток производства фирм "Behring" (Германия), "Sevac" (Чехословакия), а также с помощью разработанной латексной тест-системы. Для сравнения проведено количественное измерение уровня АТ-1П нефелометрическим методом и турбидиметрией.

Оценку активности полученного антитромбина-Ш (прогрессивная антитромбиновая проба) определяли двумя методами - V.Abildgaard и соавт.

(1970) с небольшой модификацией и в коагулологическом тесте по методу Е.П.Иванова,Л.А.Бизюка (1989).

Антитромбиновую активность (ед/мл) определяли по формуле:

А=(Д0- Дк )F, где Д к - оптическая плотность пробы без AT-III; До - оптическая плотность в исследуемом образце;

F - коэффициент, зависящий от температуры, при которой осуществлялось определение активности.

Методы статистической обработки. Полученные данные обработаны методом вариационной статистики для связанных и несвязанных между собой наблюдений и вычислен показатель достоверности различий (Венчиков А.И., Венчиков В.А., 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка способов получения AT-IIIиз крови и осадков, получаемых при фракционировании сыворотки методом Кона Нами применен метод выделения концентрата AT-III из плазмы и фракции Кона IV-I (Matra G., 1986; William С.,1987).

Выход целевого продукта представлен в таблице 1.

Таблица 1. Соде ржание антитромбина-Ш в плазме крови и осадке IV-I

Источник сырья Объем, мл Концентрация АТ-Ш мг/мл Содержание AT-III, %

Плазма крови 150 79 0,29

Осадок IV-I 100 20 1,4

Для характеристики сырья, выделенных белков и полученных антисывороток к AT-III человека, пользовались методами преципитации в геле по Оухтерлони, иммуноэлектрофорезом (ИЭФ) по методу Грабара и Уильямса, диск-электрофорезом. В качестве референс-препаратов использовали коммерческие моноспецифические антисыворотки к AT-III производства фирмы "Behring" (Германия) и "Sevac" (Чехословакия).

Выделение АТ-Ш из плазмы человека.

Апробированная нами схема выделения АТ-П1 из плазмы крови включает предварительное фракционирование плазмы полиэтиленгликолем (ПЭГ) с относительной молекулярной массой 6000 Д до конечного насыщения 20% (вес/объем) и аффинную хроматографию на гепарин-сефарозе-бВ.

Первый этап очистки АТ-Ш проводили следующим образом: к 150 мл плазмы крови человека добавляли сухой ПЭГ-6000 до конечного насыщения 20% (ЗОг) и инкубировали при постоянном помешивании на магнитной мешалке при температуре +45° С в течение 2 часов. Сформировавшийся осадок, содержащий фракцию высокомолекулярных белков, отделяли центрифугированием (6000 об./мин., мин., 5°С) и оставляли для приготовления

10

иммунного сорбента. Полученный супернатант хранили в присутствии 0,02% раствора азида натрия (ЫаЫ3).

Вторая стадия - аффинная хроматография на гепарин-сефарозе-СЬ 6В. Разделение проводили на хроматографической установке фирмы "ЬКВ" (Швеция). Супернатант наносили на колонку объемом 25 см3, уравновешенную 0,01М фосфатным буфером (рН 7,4). Скорость элюции составляла 20 мл/час. Элюцию неадсорбировавшейся фракции белков, не содержащей АТ-1П, проводили стартовым буфером. Белки фракционировали линейным градиентом (от 0,01 до 1,5М) №С1 (рН 7,4). Регенерацию гепарин-сефарозы проводили промывкой колонки ЗМ ИаС1 и затем тремя объемами 0,01М фосфатного буфера (рН 7,4). Результаты фракционирования на гепарин-сефарозе представлены в таблице 2.

Таблица 2. Характеристика фракций в процессе очистки АТ-Ш из плазмы

крови

Фракция Объем, мл Концентрация белка, мг/мл Концентрация АТ-Ш, мг/мл Содержание АТ-Ш во фракциях, %%

Исходная плазма 150 79 0,229 0,29

Осаждение ПЭГ: супернатант

160 65 0,150 0,23

Хроматография на гепарин-сефарозе 6В

- фракция 1 - фракция 2 - фракция 3 200 2,5 0,018 0,75

190 1,6 0,026 1,65

210 2,0 0,004 0,23

Из данных, представленных в таблице, видно, что при элюции белков плазмы крови человека с применением линейного градиента концентраций ИаС1 выявляются три основных белковых фракции.

Иммунохимическая чистота фракций оценивалась методами диск-электрофореза (рис. 1) и иммунопреципитации по Оухтерлони (рис. 2).

Выделение АТ-Ш человека из отходов промышленного получения препаратов крови спиртовым методом Кона. В процессе производства альбумина человека спиртовым методом фракционирования Кона образуются так называемые балластные фракции, содержащие практически все белки крови человека, которые не утилизируются в основном цикле. В лаборатории медицинской биотехнологии МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского в рамках задания НТС МЗ РФ были начаты серии разработок по безотходной технологии производства препаратов крови.

Наибольшее содержание AT-III обнаружено в балластном осадке IV-I (28 мг/мл на 1 г сырого осадка или 1 г общего белка). Фракция IV-1 в 40% этиловом спирте содержит около 20 белков. Отделение AT-III проводили следующим образом. 100 г полувлажного осадка растворяли в 500 мл 0,01М фосфатного буфера (pH 7,4; соотношение 1:5), перемешивали мешалкой при температуре +4°С в течении 40 мин.

f

■WäafcSÄ. »

t:

r^m

i i * -

ХУ

--Sis

t

J f

i f i

I

-V i:

-'S t-

«

t i

•'¡■J&iltM^XitrA.

, 5 4»,

-i /

t i

Рис. 1. Диск-элекгрофорез фракций, содержащих антитромбин III.

Где А, Б, В -белки-маркеры с известной молекулярной массой;

1 - первый компонент, выделенный из плазмы;

2 - второй компонент выделенный из плазмы;

3 - первый компонент, выделенный из осадка IV-I;

4 - второй компонент выделенный из осадка IV-I;

5 - второй компонент выделенный из плазмы крови.

Основной задачей при подготовке сырья к выделению AT-III является освобождение осадка от спирта. В зависимости от количества сырья для отделения этилового спирта можно использовать диализ против рабочего буфера или испарение. В описываемом нами способе метод удаления спирта выветриванием оказался наиболее эффективным, так как диализ очень длителен, а ультрафильтрацию без значительного разбавления нельзя применить из-за высокой концентрации спирта в растворе (40%), который

выводит мембрану из рабочего состояния. В процессе испарения в мешочек после концентрирования раствора приблизительно в два раза приливали новую порцию 0,01 М фосфатного буфера (рН 6,8). Эту процедуру проделывали несколько раз, после чего объем раствора доводили тем же буфером до первоначального.

1- IV-пик с ГС (осадок IV-I);

2 - Ш-пик с ГС (осадок IV-I);

3 - Ii-пик с ГС (осадок IV-I);

4 - 1-пик с ГС (осадок IV-I);

5 - осадок IV-I;

6 - 1П пик с ГС (плазма);

7 - III пик с ГС (плазма);

8 - Ш пик с ГС (плазма);

9 - нормальная цельная донорская плазма.

А - сыворотка преципитирующая ко всем белкам плазмы крови человека; В - моноспецифическая антисыворотка к антитромбину- III.

Рис. 2. Иммуноэлектрофорез фракций антитромбина Ш из донорской плазмы и осадка IV-I.

Разделение фракций проводили хроматографически (рис. 3). Для этого 600 мл супернатанта наносили на колонку с гепарин-сефарозой (объем колонки 25 см3) и элюировали 20 мл/час.

Первая фракция белков составила 255мл. Наличие антитромбина в этой фракции проверяли методом иммунопреципитации по Оухтерлони. Концентрация белка в этом растворе составила 3,5 мг/мл; содержание AT-III, определенное методом РИД, 0,032 мг/мл.

Вторая фракция белков элюировалась последующими порциями линейного градиента (0,5-1,5М) солевого фосфатного буфера. Объем фракции составил 210мл. В реакции иммунопреципитации по Оухтерлони данной фракции с антисывороткой к AT-III видна интенсивная линия преципитации. Концентрация белка в растворе - 2,4 мг/мл; содержание AT-III - 0,035 мг/мл.

04

ОД

0,2

ОД

Д А 280 нм

Фракция 1

Фракция 3

I 1,0

0,75

-0,5

•0,25

%

ё 3,0

2.7

2.4 2Д

1.8

1.5 1,2 -0,9 -0,6 0,3 0

100

200

300

400

Экстинция при А-280нм Активность антитромбина III, Ед /мл Концентрация NaCI, М

Рис. 3. Выделение антитромбина-П1 из плазмы крови доноров афинной хроматографией на гепарин-сефарозе.

Таблица 3. Характеристика фракций в процессе очистки АТ-Ш

Фракция Объем, мл Концентра- Концентра- Содержание

ция белка, ция АТ-Ш, АТ-Ш во

мг/мл мг/мл фракциях,

%%

Исходная фракция 600 20 0,280 1,40

IV-!

Осаждение ПЭГ:

супернатант 610 16 0,190 1,20

Хроматография на

гепарин-сефарозе 6В

- фракция 1 225 3,5 0,032 0,90

- фракция 2 210 2,4 0,035 1,45

- фракция 3 190 1,7 0,005 0,29

0

о

Электрофоретическим анализом в ПААГ обнаружено шесть основных белков с молекулярной массой 96, 86, 77, 68, 65, 46 кД, а также несколько минорных белковых компонентов. В составе белков данной фракции 50% приходилось на АТ-Ш. Молекулярная масса выделенного белка по результатам диск-электрофореза составила 63 кД.

Проверкой на иммунохимическую чистоту методом ммунопреципитации по Оухтерлони выявили, что третий пик, эюированный 0,01 М солевым фосфатным буфером с ЗМ ШО, АТ-Ш не содержит.

Проверкой на иммунохимическую чистоту методом ммунопреципитации по Оухтерлони выявили, что третий пик, эюированный 0,01 М солевым фосфатным буфером с ЗМ ЫаС1, АТ-Ш не содержит.

Иммунохимическая чистота фракций оценивалась методами иммунопреципитации по Оухтерлони (рис. 4), электрофореза по Уильяме и Габару.

Рис. 4. Проверка фракций на содержание антитромбина-III, где

1- моноспецифическая антисыворотка против АТ-П1 (Behring, Германия)

2- 1-й пик с ГС (плазма);

3- "проскок " с ГС (плазма);

4- Ш-й пик (плазма);

5- нормальная донорская плазма;

6- 1-й пик с ГС (осадок IV-I);

7- П-й пик с ГС (плазма);

8- осадок IV-I (исходный)

9- Ш-й пик с ГС (осадок IV-I);

10- IV-й пик с ГС (осадок IV-I).

Очищенный AT-III концентрировали на установке "Amicon" с использованием пористой мембраны типа РМ 10.

Белок после концентрирования до уровня не менее 1 мг/мл хранили при -70°С в течение нескольких месяцев.

2. Получение моноспецифической антисыворотки к антитромбину-Ш

Антисыворотку к AT-III получали путем иммунизации кроликов комплексом антиген-антитело и очищенным белком. В первом случае для иммунизации использовали отмытые преципитаты иммунных комплексов в агарозе моноспецифической антисыворотки к AT-I1I фирмы "Boehring" (Германия) и антикоагулянта. Для иммунизации очищенным AT-III использовали белок, полученный из сыворотки человека аффинной хроматографией после спиртового фракционирования по Кону. Выделенный препарат AT-III дополнительно разделялся на ДЕАЕ-сефадексе.

Иммунизацию кроликов осуществляли внутримышечно циклически с 10-дневным интервалом. Минимальное количество инъекций равнялось трем. Антиген очищенного AT-III в концентрации 2 мг/мл вводили животным в четыре точки в количестве 1 мг. При первичной иммунизации растворы антигена смешивали с полным адьювантом Фрейнда ("Hoechst",Германия) в соотношении 1:1. Последующие иммунизации проводили с использованием неполного адьюванта Фрейнда производства той же фирмы.

Полученную антисыворотку исследовали методом ИЭФ с

использованием моноспецифических антисывороток ("Behring".Германия) качестве референс-препаратов. Следует отметить, что пропорционально нарастанию титра антител к AT-III обнаруживались примеси неспецифических антител.

Примеси неспецифических антител удаляли из сывороток крови кроликов с помощью иммунных сорбентов, которые готовили по методике S.Avrameas, T.Ternyck (1969) с помощью глутарового диальдегида.

Специфичность антисыворотки контролировали методом ИЭФ. Титр очищенной антисыворотки к АТ-Ш, определенный методом РИД по Манчини, составил 1:8.

Антисыворотку хранили в ампулах при 4° С в присутствии 0,1% азида натрия.

3. Определение содержания и активности антитромбина-Ш

Для оценки активности AT-III применяли коагулологический тест Е.П.Иванова,Л.А.Бизюка (1989) и метод V.Abildgaard и соавт. (1970) с небольшой модификацией. Нами установлено, что активность препарата, выделенного из плазмы крови доноров, выше, чем у препарата, выделенного из осадка IV-1 и достигает 0,31ЕД/мл. Низкая активность выделенного из осадка IV-1 препарата АТ-П1 (0,19 ЕД/мл) объясняется тем, что осадок получен осаждением спиртом, в результате чего могла произойти денатурация и инактивация биологически активных белков, в том числе и АТ-1П. Это

ограничивает применение AT-III, выделенного из осадка IV-1, как лекарственного препарата, но дает возможность использовать его в качестве антигена в иммунохимической практике (например, для получения иммуноспецифической антисыворотки или в качестве стандартного антигена).

Концентрацию AT-III в исследуемых препаратах определяли методом простой радиальной иммунодиффузии (РИД) с использованием собственных моноспецифических антисывороток к AT-III и стандартных сывороток производства фирм "Behring" (Германия), а также с использованием разработанной нами латексной тест-системы. Для сравнения проведено количественное измерение уровня AT-III иммуноферментным анализом, нефелометрическим методом и турбидиметрией.

Оценка уровня AT-III в крови нормальных доноров. Нами методом латексной агглютинации определен разброс значений AT-III в популяции здоровых доноров при возрастных рамках от 22 до 54 лет, который составил 145 ± 28 мкг/мл у женщин и 184 ± 24 мкг/мл у мужчин (Р<0, 002); средний уровень . в общей группе составил 165 ±32 мкг/мл. Таким образом, для AT-III характерны несколько более высокие значения концентраций в сыворотках мужчин, по сравнению с женщинами, что можно объяснить особенностями нейроэндокринной системы.

Так как возрастная структура групп больных соответствовала таковой нормальных доноров, определенные нами средние значения АТ-Ш - 165 ±32 мкг/мл были приняты за нормальные.

Измерение уровня АТ-П1 разработанным нами методом латексной агглютинации, а также в реакциях преципитации по Манчини, нефелометрией и турбидиметрией показало соразмерные результаты.

Так как метод латексной агпотинации оказался наиболее простым, быстрым и воспроизводимым в лабораторных условиях больниц, нами в дальнейшем был исследован уровень АТ-Ш при некоторых патологических состояниях именно данным тестом.

Использование латексной тест-системы для оценки гемостаза при некоторой патологии в клинике. Нарушения в системе свертывания крови могут служить основой патологических процессов, клинически проявляющихся тромбозами кровеносных сосудов, геморрагическими диатезами, а также изменением регуляции агрегатного состояния крови, например, тромбогеморрагическим синдромом (ТГС).

Для апробации латексной тест-системы в клинике нами был исследован уровень AT-III у нескольких групп больных при следующих патологических состояниях: острый инфаркт миокарда, разлитые перитониты различного происхождения, ожоговая болезнь, нефротическнй синдром.

Таблица 2. Содержание АТ-Ш (мг/мл) у больных при некоторых патологических состояниях

Здоровые Острый Разлитые Ожоговая Нефротический

люди инфаркт перитониты болезнь синдром

миокарда

п= 100 п = 26 п = 31 п= 15 п= 14

165 ±32 116 ±28 89 ± 18 75 ±21 124 + 27

Р>0,05 Р < 0,05 Р < 0,05 Р>0,05

Р - достоверность различий по сравнению со здоровыми людьми.

Обнаружено, что уровень АТ-Ш значительно (на 50%) снижается при разлитых перитонитах, ожоговой болезни, сопровождаемых ТГС. Тенденция к снижению обнаружена при остром инфаркте миокарда, также сопровождаемой ТГС. При остром инфаркте миокарда и нефротическом синдроме изменения оказались недостоверными из-за большого разброса данных. При снижении уровня АТ-Ш ниже 70% нормы показана антикоагулянтная терапия.

Таким образом, разработанный метод определения АТ-Ш в сыворотке крови больных на основе латексной агглютинации является простым и доступным для клинической практики способом анализа и позволяет в течение короткого времени (порядка 10 минут) визуально без приборного оснащения проводить учет результатов анализа.

ВЫВОДЫ

1. Разработан оптимальный и простой способ выделения очищенного АТ-Ш из сыворотки крови, основанный на применении аффинной хроматографии на гепарин-сефарозе-4В с предварительной обработкой плазмы полиэтиленгликолем. Данный способ может быть успешно применен в промышленном масштабе.

2. Показана возможность использования балластного осадка IV-1, получаемого при производстве белковых препаратов крови спиртовым методом по Кону для получения АТ-Ш.

3. Выделенный из сыворотки АТ-Ш сохранет биологическую активность, а препарат АТ-Ш, полученный из бросовой фракции спиртового выделения по Кону, функционально не активен, но сохраняет антигенные свойства, что допускает его применение в качестве иммуногена.

4. Разработаны способы приготовления стандарта антигена, получения антисыворотки к АТ-Ш и выделения иммуноглобулиновой фракции для проведения серологических реакций.

5. Получена латексная тест-система для определения концентрации антитромбина-Ш и апробирована для экспресс-диагностики нарушений системы гемостаза.

18

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Для получения антитромбина-III в промышленных масштабах рекомендуется следующая технологическая схема: осаждение фракций, обогащенных AT-III, ПЭГ 6000; применение гепарин-сефарозы для получения высокоактивного, неиммуногенного препарата;

2. Фракция-IV Кона может быть использована для получения антигена АТ-Ш для дальнейшей иммунизации;

3. Полученная моноспецифическая . поликлональная антисыворотка к антитромбину-III рекомендуется для лабораторного использования в методах иммунопреципитации, электрофорезе, турбидиметрии, нефелометрии как наиболее чистый, более дешевый и стабильный реактив.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волков С.Л. Влияние антитромбина-III на фибринолитические свойства • лимфоцитов. // Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии,

клиники. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции. Чита. - 1995. -с. 90.

2. Волков СЛ., Алешкин В.А. Получение моноспецифической антисыворотки к антитромбину-III // Экологические интоксикации: биохимия, фармакология, клиника. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции. Чита.-1996.-с. 120.

3. Волков СЛ., Мягкова М.А., Абраменко Т.В. Алешкин В.А. Определение антитромбина-III на основе латексной агглютинации // Новое в трансфу-зиологии. Информационный бюллетень. Выпуск 15. Москва. - 1996 . - С. 19-23.

4. Волков СЛ.,Алешкин В.А. Способ выделения антитромбина III из плазмы человека и осадка IV-I спиртового фракционирования по Кону. //Экологические интоксикации: биохимия, фармакология, клиника.// Тезисы докладов Всероссийской научной конференции.Чита. - 1996. - с.231-232.

5. Волков СЛ., Мягкова М.А.^Абраменко Т.В. Алешкин В.А. Разработка метода определения антитромбина-III на основе латексной агглютинации // Экологические интоксикации: биохимия, фармакология, клиника. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции. Чита. - 1996. часть 2. - с.232-233