Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка поляризационного флуоро-иммуноанализа фенобарбитала и барбамила в моче

- МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИН. И. Н. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ЕРМАКОВ АНДРЕИ НИКОЛАЕВИЧ

РАЗРАБОТКА ПОЛ5ЭРИЗА1ЛИОННОПО «ЮТУОРО-ИММУНОАНАЛИЗА ФЕНОЕАРЕИГАЛА И ВАРВАМИЛА В МЗЧЕ

1 ■ ( i5.oo.o2 - Фармацевтическая хиния и Фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фарнацевтических наук

носква - 1994 г.

Работа наполнена в Центральной химико-токсикологической лаборатории носковской немшинской Академии ии. и. к. Сеченова.

Научный руководитель:

- кандидат фармацевтических наук, профессор Изотов Б. Н.

- кандидат хинических наук, с. н. с. Еремин с. а.

Официальные оппоненты:

- доктор Фармацевтических наук, профессор Попков в. А.

- доктор фармацевтических наук Солонатин Е. к.

Ведущая организация: Пятигорский фармацевтический институт

.</ /. 1994 г< в у/

Зашита состоится ■ " У 1994 г. в часов, на

заседании специализированного совета л 074.05. Об при носковской Медицинской Академии им. И. Н. Сеченова по адресу: 1211019, г. носква суворовский бульвар, 13.

с диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке К'А им. и. н.Сеченова (Носква. зубовская пл., 1).

чЛл^Л

Автореферат разослан ■ _ 1994 г.

/чеша секретарь специализированного совета

Л. 074. 05. 06 кандидат Фармацевтических

наук, доцент садчикова н. п.

3

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тени. Разработка высокочувствительных иммунохи-чических методов анализа наркотических и одурманивающих веществ является актуальной проблемой современной наркологии и токсико-пс.г;„-. в России эта проблема приобрела особо острое значение, так как ь с"'эи с про::^хс;.::хими социально-политическими и экономически переменами р^зко возросло число случаев потребления наркотических и одурнаплзаклгсх веществ, а для своевременного выявления лип, злоупотреблявших этими веиествами, ■ как известно, необходимы эффективные нетодг экспресс-анализа биологических жидкостей, обычно ночи, как наиболее доступного объекта исследования. Причем, учитывая то, что за немедицинское потребление наркотических и одурманивающих веществ законодательством предусмотрена различная мера ответственности, необходимо точно дифференцировать эти вещества относящиеся порой к одной Фармакологической группе. Так, из рассматриваемых нами в данной работе двух" производных барбитуровой кислоты, получивших наибольшее распространение, одно соединение - барбамил, приравнено к наркотическим веыества, другое - фенобарбитал, относится к одурманивагакм.

в настоящее вреня для обнаружения этих барйитурзтов широко применяются физико-химические нетоды анализа: фотометрия, тонкослойная хроматография, газовая хроматография и др. однако эти методы длительны по времени исполнения, требуют предварительной обработки образцов и зачастую недостаточно чувствительны, поэтому создание быстрых, простых, чувствительных и специфичных иммуно-химических методов определения изучаемых соединений является актуальной задачей, тем более что, тг:яе нетоды количественного определения фенобарбитала и барбамила в ноче практически не разработаны ни у нас в стране ни за рубежом.

цель и задачи исследования- Целью настоящего исследования является разработка специфичных экспресс-методик поляризационного Флуороиммуноанализа (ПФИА) фенобарбитала и барбанила в моче.

для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- осуществить синтез иммунохимических реагентов - инмуногенов и меченных флуоресцеином производных фенобарбитала и барбанила;

- получить шсокоспецифические поликлональные антисыворотки к исследуемым соединениям;

- изучить влиние различных Факторов на-результаты анализа и с учетон полученных данных разработать наиболее оптимальные методики ПФИА, предназначенные для качественного и количественного определения Фенобарбитала и барбанила в моче;

- определить аналитические характеристики разработанных методик и апробировать ах на нодельных смесях и экспертной материале;

- сравнить результаты поляризационного Флуороиммуноанализа фенобарбитала и барбанила с результатами других методов исследования;

- изучить стабильность калибровочных зависимостей и сохранность разработанных тест-систем.

научная аовизна. Впервые синтезированы коныогаты барбанила с бычьин сывороточный альбумином (имнуноген) и флуоресцеинтиокар-банил этиленюамином (трейсер). Способ получения инмуногена и структура трекера барбанила защищены авторскими свидетельствами. Впервые получена высокоспецифическая поликлональная антисыворотка к барбамилу. Кзучено влияние величины разведения антисыворотки, концентрации раствора трейсера, состава и рн буфера на результаты поляризационного Флуороиммуноанализа фенобарбитала и барбанила. Впервые разработаны высокочувствительные и * специфичные методики ПФИА, предназначенные для идентификации и количественного определения изучаемых соединений в моче.

практическая значимость работы, на основе полученных реагентов и проведенных исследований •были созданы высокоэффективные тест-системы для определения фенобарбитала и барбаиила. В настоящее время эти тест-системы успешно прошли испытания и внедрены в практику работы Приморского краевого наркологического диспансера (г.владивостою, Центрального военно-морского госпиталя но РФ (г. Купавна) и Всесоюзного научно-исследовательского центра охраны здоровья натери и ребенка (г. Москва).

материалы диссертационной, работы включены в методические рекомендации "Поляризационный флуороинмуноанализ веществ, вызывающих одурманивание", утвергденные нз СССР. Панине рекомендации предназначены для лабораторий наркологических диспансеров, токсикологических центров и бюро судебно-медицинских экспертиз.

Апробация работы, основные положения диссертации доложены на научно-практической конференции, посвященной 25-летию Фармацевтического Факультета Курского медицинского института (Курск, 1991г.), научных семинарах Центральной химико-токсикологической лаборатории кна им. и. м. Сеченоза (Носква, 1991г.), носковском обществе судебных медиков, секции судебных химиков (Москва, 1991г. ), мехкафедральной конференции фармацевтического Факультета ННА им. и. Н. Сеченова (Носква, 1993г.).

публикации. По теме диссертации опубликовано б работ, получены г авторских свидетельства.

Положения, выдвигаемые на защиту. На зашту выносятся:

- синтез икиунохинических реагентов.. - инмуногенов и меченных Флуоресцеином антигенов;

- разработка методик поляризационного Флуороинмуноанализа Фено-баритала и барбамила в моче;.

- оптимизация условий проведения анализа и определение характеристик предлагаемых тест-систем.

структура и объем диссертации- диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, эксперементальной части (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы паз источника). Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и зо рисунков. _,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

натериалы и негоды исследования, в работе использованы следующие биохимические и химические реагенты: флуоресцеинизотио-цианат ("Signa"), флуореспеинтиокарбамил. атилендиамил, 5-изоамил-5-(5'-карбоксипентил) барбитуровая кислота (МГУ, г.носкза), бычия сывороточный альбумин (БелНИИЭН, г. Нинск), полный адьювант фрейкда ("Sigma"), изобутилхлорформиат (Amersfcan), тартразик, креатинин, триэткламин ("Sigma"), азид натрия ("Serva").

Фенобарбитал, барбамил, апробарбитал, бутабарбктал, секо-барбитал, этанинал-натрия ("Sigma"), барбитал, гексобарбитал, барбитуровая кислота, нетилфенсбарбитал, п-гидроксифенобарбитал, 3-гидроксибарбанил, диФенин, гексанидин, диазепам, хлозепид, -морфин, кодеин, метадон, налорфин, бензсилзкгонин, фенциклидин, н-нор-д'-тпс-сооя, d, 1-эфедрин, d, 1 -амфетамин, d-метамфетимин, d, i-Фенилпропанаданин, аминазин, дипразин, амитриптилин, кофеин, клофелин, нетаквалон, анаприлин, карбомазенин, димедрол, никотин, папаверин, теофиллин, атропин, новокаин предоставлены кафедрой токсикологической химии Носковской медицинской академии им. и. н. Сеченова.

В качестве объектов исследования в работе использованы образцы мочи больных барбитуратовой наркоманией и лиц принимавших фенобарбитал и барбамил по терапевтическим показаниям. Образцы предоставлены 17-ой наркологической больницей г. Носквы, бз-еа

городской больницей г. Москвы, приморским краевым наркологическим диспансером г. Владивостока. В эксперименте также были использованы искусственные модели, приготовленные путем добавления известных количеств Фенобарбитала или барбамила к нормальной человеческой моче.

Определение концентраций исследуеных соединений в образцах проводили методом ПФИА, с использованием автоматизированного прибора - ТЯх-анализатора фирмы "Abbott Laboratories" (США). Анализ фенобарбитала выполняли по модифицированной нами программе N 21, а анализ барбамила по програнне N го.

В качестве нетодов сравнения и подтверждения, при проведении корреляционного исследования, использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию и гомогенный иммунофернентный анализ.

получение реагентов для поляризационного Флуороимнуноанализа Фенобарбитала и барбамила. Ключевым моментом при создании чувствительной иммунологической тест-системы любого типа является получение высокоспецифических антител, однако, получение таких антител к низконолекулярным соединениям возможно лиаь при использовании для иммунизации животных коньюга та гаптена с высокомолекулярным носителем.

В качестве такого носителя в нашей работе был использован широко распространенный и относительно дешевый бычий сывороточный альбумин (БСА). Синтез коныогата этого белка с фенобарбиталом осуиествляли по известной нетодике (А.м.sidKi et al., 1982). Данная методика включает нитрование и последующее восстановление Фенобарбитала до аминопроизводного, получение из него диазо-производного и коныогирование последнего с бычьим сывороточным альбумином в 1 м растворе бикарбоната натрия, схема синтеза этого коныогата представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема синтеза трейсера (III) и имнуногена (IV) фенобарбитала.

В отличие от коныогата Фенобарбитал-БСА иммуноген барбанила получали по методу смешанных ангидридов, используя в качестве исходного соединения карбоксипроизводное барбанила - 5-изоамил-5-(5'-карбоксипентил) барбитуровую кислоту, схема синтеза данного коныогата представлена на рис. г.

Кроне вышеописанных коныогатов гаптена с белокон для разработки пфиа. необходино было получить меченные флуоресцентными метками производные Фенобарбитала и барбанила. синтез этих произ-

о усн

нп—\ сн-сн-сн^ „=< V 2 ! СИ.

нм-ч (

2 2

1 )~С

2 5

—Л (СН )-СООН ^ 2 5 О

ЫН— (СН >—N4 2 2 2 2

НЫ—\ <

КX

(СН )-с—к—БСА

2 5 II I О О Н

IX

сн-сн-сн

2 2

СН—О—С / \

СИ

нн-^ (СН2)-С-И-(СН2)-Ш

о н

Г8

ин

соон

Рис. 2. Схема синтеза

трейсера (1) барбанила.

и инмуногена (II)

водных осуществляли тени хе нетолани. что и синтез иннуногенов. так, трейсер фенобарбитала получали путем взаинодейсвия п-анино-производного с флуоресиеинизотиоиионатом. а трейсер барбанила -путей связывания 5-изоамил-5-(5'-карбоксипентил) барбитуровой кислоты с флуоресцеинтиокарбамил этилендиамином. Схемы синтеза трейсеров представлены на рис. 1 и г.

следующим шагом в разработке поляризационного флуороиммуно-анализа фенобарбитала и барбанила было получение специфических антисывороток к исследуемым соединениям, данные антисыворотки получали классическим методом - иммунизацией кроликов синтезированными имнуногенами. иммунизацию проводили в несколько этапов, кахдый из которых заканчивали забором крови и тестированием полученных антисывороток, всего было оттестировано 33 антисыворотки к фенобарбиталу и 16 антисывороток к барбаниду. Для лучшей антисыворотки к фенобарбиталу н п (4-ый несяц иммунизации), имеющей титр 1:300 и лучшей антисыворотки к барбамилу н 9 (4-ый месяц иммунизации), имеющей титр 1:3000, на рисунке 3 приведены кривые титрования, на этих хе рисунках, для сравнения, приведены кривые титрования неинмунной сыворотки кролика, показывающие отсутствие специфического связывания меченных гаптенов нормальными белками сыворотки при соответствующих ее разведениях.

оптимизация условий проведения анализа, в процессе оптимизации условий проведения поляризационного флуороиммуноанализа фенобарбитала и барбанила в моче, нами было изучено влияние следующих факторов на результаты ПФИА: 1) величины разведения антисыворотки; 2) концентрации раствора трейсера; 3) состава и рн буфера.

С целью установления влияния первой из вышеназванных величин, были исследованы следующие исходные разведения антисыворотки к фенобарбиталу ни: 1:1, 1:2, 1:3 и 1:4. такие невысокие значе-

ля разведений антисыворотки связаны прежде всего с налой вели-янои ее титра (1:зоо>. однако, несмотря не невысокий титр, нам аалось получить для некоторых разведений этой антасыворотки эрошие калибровочные зависимости.

Наиболее оптинальная зависимость была получена с раэведе-ием 1:г. Применение же более концентрированных растворов анти-аворотки приводит, во-первых, к увеличению значений поляризации пуоресцешши (П. Ф. ) для всех стандартов Фенобарбитала, а во-торых, к увеличению перепада значений п. Ф. между нулевын и накси-альным стандартами, что, очевидно, увеличит точность определения енобарбитала. однако при больших концентрациях антител возрас-ает уровень неспецифического сзязывания, а значит увеличивается огрешность измерения, кроме того, использование высогажонцентри-ованных растворов антисыворотки приводит к незкономнону расходо-ангао реагента, а, следовательно, к увеличению стоимости анализа.

р к?

,0 2(0

А

Б

1/200 I /£09 \пг<я 1/12509 1/51200 СУ» Разеягаэ езптзоая

1/м 1/120 х/12до 1/пго 1/20*20 ву»

резваЕяв етяхгти

Рис. з. Кркскэ титрования антисыворооки к барбанилу н 9 (А! и фенобарбиталу ни (Б), о - антисыворотка; о - неикиунная сыворотка.

Применение более разбавленных растворов антисыворотки к фенобарбиталу (1:3, 1:4), хотя и позволяет несколько увеличить чувствительность анализа и уменьшить расход реагента, однако ограничивается минимальным значением П. ф. для нулевого стандарта (нередактируеный параметр програнмы 21. 16), ниже которого калибровочная кривая не обрабатывается прибором.

Аналогичное исследование было проведено с актисывороткой к 9 содержащей антитела специфичные к барбамилу. так как титр данной антисыворотки 6ijm очень высок (1: зооо), то исследовались следующие ее начальные разведения: 1:20, 1:30, 1:40 и 1:50.

Наиболее оптимальным из исследуемых разведений оказалось разведение 1:40. Применение же более концентрированных растворов антисыворотки (1:го, 1:зо), приводит к уменьшению перепада значений п. Ф. между нулевым и максимальным стандартами, при этом особенно значительно уменьшается угол наклона калибровочных зависимостей в области малых концентраций барбамила (0,5-5 мкг/нл), а это, как известно, приводит к снижению чувствительности и точности анализа.

при использовании еще более разбавленных растворов антисыворотки (1:50), существенных изменений в параметрах калибровочных зависимостей не происходит. Однако, происходит значительная потеря специфической антигенсвязывающей активности антител в течение небольшого срока^хранения (около одного месяца). По этой и другим вышеуказанным причинам, в качестве оптимального значения для дальнейшей работы, было выбрано разведение антисыворотки к барбанилу 1:40.

для выбора оптимальной концентрации второго компонента разрабатываемых тест-систем - трейсера Фенобарбитала-и барбамила-исследовали диапазоны концентраций от 50 до во нмоль/л и от юо до iso нмоль/л соответственно.

Наиболее подходящими из исследуемых концентрация трейсера в данном случае оказались следующие концентрации: 60 нмоль/л для Фенобарбитала и 130 нмоль/л для барбамила. применение же в-анализе изучаемых соединений более концентрированных растворов трейсера приводит к уменьшению значений поляризации Флуоресценции для всех стандартов фенобарбитала и барбамила, в то время как при использовании более разбавленных растворов трейсера, значения П. Ф., наоборот, увеличиваются, а расход реагента уменьшается, однако, применение в анализе фенобарбитала и барбанила более экономичных растворов трейсера ограничивается нинииальным значением конечной интенсивности флуоресценции раствора (параметр программы 21.21), которое необходимо для осуществления автоматической обработки калибровочной зависимости, данный параметр программы в большой степени зависит от концентрации раствора трейсера в аналитической смеси и не подлежит корректировке.

Для завершения комплексного исследования, связанного с оптимизацией условий проведения пфиа фенобарбитала и барбамила, нам необходимо было изучить влияние природы реакционного буфера на результаты анализа, с этой целью мы исследовали 0.1 Н фосфатные (рН 7.4), о. 1 к боратные (рн 9.0) и о. 1 н трис (рН 7. 3) буферы различного состава.

Наилучшие результаты в пфиа фенобарбитала были получены с применением боратного буфера. При использовании фосфатного буфера характеристики анализа изненяются незначительно, хотя общий уровень сигналов поляризации флуоресценции уменьшается. При использовании ке трис-буфера наблидается не только значительное снижение величин п. ф., но и уменьшение угла наклона калибровочной зависимости, а, следовательно, снижение чувствительности и точности анализа.

Аналогичное исследование, с использованием тех же самых буферных растворов, было проведено с тест-системой барбанила. Б результате этого исследования было установлено, что при использовании слабоиелочных буферов - трисового (2) и особенно фосфатного (3) - наблюдается повышение общего уровня сигналов поляризации флуоресвеняии и увеличение угла наклона калибровочной зависимости, тогда как при использовании более щелочного боратного буфера (1). наоборот, происходит снижение величин поляризации Флуоресценции и уненьшение угла наклона калибровочной зависимости, что в свою очередь, обязательно сказывается на ухудшгнии аналитических характеристик,анализа.

Исходя из вышеизложенного, ны рекомендовали бы использовать в анализе барбанила слабощелочной фосфатный буфер, а в анализе Фенобарбитала, отличающегося от барбанила по ионогенным свойствам, более основной боратный буфер, однако, с практической точки зрения применение различных буферных систем в анализе таких близких по фарнакологическону действию веществ, как Фенобарбитал и барбамил, нецелесообразно. Поэгону, с целью унификации методик ПФИА, ны использовали в дальнейшей работе о. 1 м фосфатный буфер (рн т.4), являющийся по результатам проведенного нами исследования более универсальным.

помимо вышеуказанных Факторов большое влияние на вид калибровочной зависимости оказывают также различные белковые и полипептидные добавки, вводимые в состав реакционного буфера. Такие добавки, как известно, не только увеличивают вязкость раствора, а, следовательно, и п. Ф., но и изменяют уровень неспецифического связывания, по этой причине мы исследовали .влияние, оказываемое следующими, наиболее часто применяшимися добавками: БСА (0.оп), желатином (0,12), бычьим гамна-глобулином (0,01Х).

Как показали проведенные нани исследования, введение любой из изучаемых добавок в реакционный буфер приводит к увеличению обшего уровня сигналов поляризации Флуоресценции. при этом наиболее сильное влияние на значения п. Ф. оказывают добавки бса. однако, сила этого влияния в большей степени обусловлена высокин уровнем неспецифического связывания, характерным для данного белка, кроме того, следует отнетить, что при использовании добавок БСА, а-такхе желатина угол наклона калибровочных зависимостей Фенобарбитала и барбамила почти не увеличивается, этот эффект, как свидетельствуют результаты проведенного исследования, достигается только в случае использования добавок бычьего гамма-глобулина, введение которого в реакционный буфер не только увеличивает угол наклона калибровочных зависимостей, но и максимально снижает уровень неспецифического связывания в обеих тест-системах. Именно по этим причинан ны использовали в дальнейшей работе о,1 н фосфатный буфер рН 7.1, содержащий 0.01Х бычьего гамма-глобулина и о, IX азида натрия.

Определение характеристик пфиа Фенобарбитала и барбамила. Используя вышеописанные реагенты, а также растворы Фенобарбитала и барбамила известной концентрации, ны построили соответствующие (удовлетворяющие всем критериям автоматической обработки кривой) калибровочные зависимости (см. рис. 4), по которым определили все основные аналитические характеристики разработанных методик: чувствительность, пороговую концентрацию, точность, специфичность, достоверность.

определение чувствительности (минимально определяемой концентрации) методик проводили по методу Родбарда. Для этого, используя обычную процедуру анализа, произвели в каждой тест-системе по го повторных измерений нулевого стандарта, после чего

с 95г доверительной вероятностью рассчитали нининально определяемые концентрации фенобарбитала и барбамила. они составили 90 и 50 нг/нл соответственно.

Для расчета величин так называемой пороговой концентрации (cut-off) использовали методику СниФа. согласно этой методике вышеназванная величина (позволяющая свести к ниниуну вероятность получения лохноподожитедышх результатов при скрининге) была расчитана из 30 определений образцов нормальной (не содержащей анализируеного вещества) человеческой мочи, и составила, по нашин данным, о, 5 нкг/мл для тест-сисгены фенобарбитала и о, з икг/;ш для тест-систеки барбамила.

Для оценки следующего аналитического параметра - точности изменений -использовали две характеристики: сходимость и воспроизводимость. Каждую из этих характеристик определяли в отдельности при трех различных концентрациях исследуемого вещества: низкой, средней и высокой, полученные результаты исследования пр

к? ISO

tto

140 IZO 100 «О

о oí в £в го too га.киущ о о. е г s го so га.кт/ха

Рис. 1. Калибровочные зависимости для определения барбамила (а) и Фенобарбитала (б) в моче методом пфиа.

таблица 1

сходимость результатов поляризационного Флуоро-иммуноанализа фенобарбитала и барбамила

Определяемое соединение

Расчетная концентрация, мкг/нл

Найденная* концентрация, мкг/мл

Нетрологические характеристики

Б

Б-*

К, '/.

Фенобарбитал

1, оо Ю, оо 50, 00

1, 00 10, 44 50, аз

0, 13

1. 49 7, 05

О, 04 0,47

г, гз

4, О 4, 5 4,4

Барбанил 1, 00 1, 02 0, 09 0, 03 2.9

10, 00 10, 11 0, 62 0, 26 2,6

30, 00 ' 28, 71 3, 32 1, 05 3,7

* - среднее значение 5 определений.

таблица г

воспроизводимость результатов поляризационного Флуороиммуноанализа фенобарбитала и барбамила

Определяемое Расчетная Найденная" нетрологические соединение концентра- концентра- характеристики ция. мкг/мл ция, мкг/мл э : Бу : к, г

Фенобарбитал 1, 00 1,02 0,09 0,04 3,9

10, 00 9,66 1,03 0, 46 4,8

50, 00 49,74 5, 11 2,28 4,6

Барбанил 1,00 1, 00 0, 09 0, 04 4,0

10, 00 10, 20 0, 63 0, 28 2,7

30, 00 29, 38 1, 86 0, 83 2,8

* - среднее значение ю определений.

как видно из' таблиц, значения коэффициента вариации б тест-системах Фенобарбитала и барбамила не превышают ч, 5г при определении сходиности и 4, ьг при определении воспроизводимости, что ниже максимально допустимых в подобных исследованиях значений в г, г и з, 1 раза соответственно.

Не менее высокие показатели качества разработанных тест-систем были получены нами и при определении параметра достоверности. так, например, процент аналитического открытия фенобарбитала в образцах мочи варьировал в^ пределах от 90,1 до 109,ьг, а процент открытия барбамила находился в диапазоне от 91, 9 до Ю4, гг.

Для изучения специфичности предлагаемых методик ПФИА исследовали уровень перекрестного реагирования с близкими по химической структуре веществани и некоторыми соединениями, для которых вознохно совместное применение с определяемым барбитуратом, полученные результаты исследования представлены в таблице 3.

как видно из таблицы, процент перекрестных реакций, рассчитанный при 50/С вытеснении трейсера, даже с близкими по структуре веществани, не превышает 7,гх в тест-системе фенобарбитала и б,ох в тест-системе барбамила. что же касается соединений из других Фармакологических групп (не похожих по структуре на фенобарбитал и барбамил), таких как: норфин, кодеин, >яалорфин, бензоилзкгонин, Фекциклидин, и-нор- Д9-тгк-соон, с, 1-эфедрин, й-метаноетанин, <1,1-амфетакин, а, 1 -фенштропаноламин, аминазин, дипразин, карба-мазепин, амитрилтилин, хлозепад, диазелам, нетадон, нетаквалон, кофеин, клофелин, анаприлин, димедрол, никотин, теофиллин, папаверин, атропин, новокаин, то для них уровень перекрестного реагирования в обеих тест-системах был менее' о; г/., таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о высокой

таблипа з

перекрестные реакпии и.) с различными барбитуратани и структурно-подобными соединениями в поляризационном Флуороинмуноанализе фенобарбитала и барбамила

исследуемое Перекрестные реакции, г

соединение тест-система тест-систена

фенобарбитала барбамила

Фенобарбитал юо.о . 1,4

Барбанил 7,2 юо,о

Апробарбитал 1, г о, 7

Барбитал о, 9 о, 2

Барбитуровая кислота <0,1 • <о;1

1)

Еутобарбитал 3,5 1,5

гексобарбитал <о, 1 <о,1

гексаниди <о, 1 <о, 1

ЛиФенин <о, 1 <о, 1

п-гидроксифенобарбитал 2, з <о. 1

3-гидроксибарбамил <о, 1 2,8

нетилфенобарбитал <0,1 <0,1

секобарбитал з, г 8, о

Этаминал-натрии 3,4 4,7

специфичности разработанных нетодик анализа, что позволяет определять фенобарбитал и барбанил в присутствии мнохества других соединений или их метаболитов.

в заключение данного раздела следует также отметить, что разработанные нами тест-системы обладают высокой стабильностью калибровочных зависимостей (перекалибровку нохно проводить не

чаше 1 раза в месяц) и сохраняют свои свойства б течение 1 года и более 1срок годности тест-системы фенобарбитала - 1б-1е месяцев, а тест-системы - барбамила го-гг месяца), при условии их хранения б холодильнике при температурой +г-4°с.

Сравнение результатов пфиа фенобарбитала и барбанила с результатами взкх и Ен1т-анализа. с целью подтверхдения клинической значимости разработанных методик проводили сопоставление результатов пфиа с результатами других методов исследования, для этого анализировали образцы ночи больных барбитуратовой наркоманией и лиц, принимавших фенобарбитал и барбамил по терапевтическим показаниям. Некоторые результаты такого исследования представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы, результаты разработанного ПФИА и ЕМ1Т-анализа довольно хорошо коррелируют, однако, в 6-ти случаях анализа на фенобарбитал (из 92) ив 6-ми случаях анализа на барбамил (из 63) все хе наблюдаются расхохдения в результатах (в дальнейшем результаты ПФИА были полностью подтверждены методом ВЭЮ. Эти расхождения между данными ПФИА и ИФА объясняются тем, что значения пороговой концентрации в имнуноферментном методе (2,0 нкг/мл для барбанила и з,о мкг/кл для фенобарбитала) выше, чем в ПФИА (из-за чего наблюдаются ложноотрипателыше результаты в ИФА), а сам метод является ненее селективным, т. к. предназначен для группового анализа барбитуратов (из-за чего наблюдаются "ложнополохительные" результаты в ИФА).

Кроме вышеописанного исследования, методами ПФИА и ВЭХХ были проанализированы еше 47 образцов ночи. при. этом, в 25 образцах методом ПФИА обнаружили фенобарбитал, а в 22 - барбамил. хронато-графическин же методой Фенобарбитал обнаружила в гз-х образцах, а барбамил - в 21. В двух образцах мочи вместо фенобарбитала нашли

высокие концентрации барбамила и этанинала-'натрия, а в одном образце внесто барбамила обнаружили значительную концентрацию Фенобарбитала, при дальнейшем сопоставлении результатов пфиа (у) и вэхх (х) было установлено, что уравнения регрессии для анализов обеих веществ инеют линейный вид (у = о, 99х ♦ о, 54 - для фенобарбитала и у = 1,озх + о, зо - для барбамила), а коэффициент корреляции нехду переменными х и у составляет о, 98.

Таким образом, констатируя высокую степень корреляции результатов ПФИА с результатами других нетодов анализа, следует отметить, что разработанные ПФИА фенобарбитала и барбамила по своей чувствительности превышают EMT-st анализ и сопоставимы по ней с методон вэжх, но уступают последнему в селективности. По этой причине,

Таблица 4

Результаты обнаружения Фенобарбитала и барбанила в моче методами ПФИА и EHIT-анализа

определяемое количество проанализи- Результаты Результаты соединение рованных образцов пфиа EHiT-анализа

Фенобарбитал 49

37 5 1

Барбанил 40

35 5 2

- обнаруженная концентрация больше или равна величине cut-off.

положительные результаты, получаеные с использованием предлагаемых методик пфиа, кзк, впрочем, и с использованием всех других инмунохимических методик, требуют подтверждения альтернативными физико-химическими методами анализа, такими, как: ПЕХ, вэхх, хромато-масс-спектрометрия и др.

Изучение выведения исследуеных соединений с ночой. с целью, изучения некоторых аспектов выведения фенобарбитала и барбамила с мочой, мы, с помощью разработанных методик исследовали образцы ночи трех добровольцев, собранные через определенные промежутки вренени после однократного приена высшей разовой.дозы препарата. Полученные результаты исследования представлены на рис. 5.

Как видно из представленных на рисунке усредненных зависимостей выведения, с помощью разработанных нетодик ПФИА, можно контролировать уровни барбанила в коче (в концентрациях превышающих величину cut-off) в -течение 2-2, 5 дней, а фенобарбитала - в течение 21-22 дней. При этом, максимальная концентрация барбамила в моче (2,6-3,5 нкг/нл) по нашим данным наблюдается через 3-5 часов после приема высшей разовой дозы препарата, а максимальная концентрация фенобарбитала (16-17 нкг/нл) - через ю-13 часов.

Такин образом, результаты проведенного исследования показали, что разработанные нани методики ПФИА могут быть использованы для определения концентрации изучавши соединений в моче в течение длительного промежутка вреяени после приема препарата, это дает нан, основания рекомендовать"данные методики не только для химико-токсикологического анализа Фенобарбитала и барбамила, но и для терапевтической практики, в частности'для изучения фарнакокинетики и оптимизации Фармакотерапии.-

Рис. 5. кинетические зависимости выведения фенобарбитала (А) и барбамила (Б) с ночой, полученные после приена высшей разовой дозы препарата.

- 22 -ВЫВОШ

1. получены иммунохимические реагенты (трейсеры, имиуногены и антисиворотки), необходимые для разработки гомогенного поляризационного флуороиммуноанализа фенобарбитала и барбамила в моче. Коньюгированные производные барбамила с бычьим сывороточным альбумином и флуореспеином ■ синтезированы впервые и защишены авторскими свидетельствами.

г. проведены исследования различных комбинаций синтезированных трейсеров с антисывороткани к фенобарбиталу и барбамилу, имеющини разные сроки иммунизации. В результате этих исследований установлены наиболее оптимальные варианты для проведения ПФИА.

3. Изучено влияние величины разведения антисыворотки, концентрации раствора трейсера, состава и рН буфера на результаты количественного определения Фенобарбитала и барбамила в ноче. с учетом полученных данных выбраны наиболее подходящие условия для проведения анализа.

4. разработаны высокочувствительные специфичные экспресс-методики ПФИА (время анализа 20-ти образцов - 15-16 мик), предназначенные для идентификации и количественного определения Фенобарбитала и барбамила в моче. Нижний предел обнаружения Фенобарбитала по данной методике составляет 90 нг/мл, а барбамила - 50 нг/мл. •, ••

5. Определены все основные аналитические характеристики разработанных методик: чувствительность, пороговая концентрация специфичность, точность (сходимость и -воспроизводимость), достоверность.

6. Установлена высокая степень корреляции результатов разработанных ПФИА с результатами гомогенного иммуноферментного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографией (г - 0. 98).

7. исследовано выведение фенобарбитала и барбамила с ночей после однократного приема высшей разовой дозы соответствующего препарата, найдены максимальные концентрации изучаемых веществ в моче и установлено время через которое эти концентрации достигаются. определены периоды времени, в течение которых исследуемые - соединения могут быть обнаружены в моче пациентов с поношыо разработанных нетодик.

э. Изучена стабильность калибровочных зависимостей и установлены сроки годности разработанных тест-систем, при условии их хранения в холодильнике при температуре +4°с.

9. Предложенные методики апробированы на практике при проведении' наркологических и химико-токсикологических исследований и утверждены нз СССР.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ

^^jj^Polarization- fluoroimmunoassays for drugs of abuse / S.A. Eremin, A.A. Chegolev, A.M. Egorov, A.H. ErmaKov et al // Changchun international symposium on analytical chemistry. -Changchun, 1990. - P. 151.

2. Ернаков A. H., Изотов Б. H. поляризационный флуороиммуно-анализ барбамила с использованием тдх-анализатора // Актуальные вопросы фармацевтической науки и практики: Тез. докл. науч. -практ. конф. кгни. - Курск, 1991. - ч. г. - с. гог-гоз.

3. Смирнов А. в., Ермаков А. н., Изотов Б. Н. Поляризационный флуороимнуноанализ веществ, вызывающих одурманивание: метод, рекомендации. - Н., 1991.- 4 с.

4. ЕреминС. А., Ернаков А. н., Изотове. Й. Определение Фенобарбитала поляризационнын Флуороинмуноанализом п Вопр. наркологии. - 1992. - N 2. - С. 25-27.

5. применение метода поляризации Флуоресценции для экспресс-тестирования антисывороток к галтенам / с. а. Еремин. а. К. Ермёхов, а. в. Смирнов к др. // Современные методы кммунохинической и моле-кулярнобиологическоя диагностики в медицине: Сб. тр. - к., 1992. -С. 27-32.

6. Поляризационный Флуороинмуноанализ Фенобарбитала к б^рба-мила с использованием тдх-анализатора фирмы "Abbott" /А.Н.Ермаков, Д. Э. Бодрина, Б. Н. Изотов, А. н. Егоров я др. // вопр. мед. химии. -1993. - Н 4. - С 59-63.

7. способ получения коньюгированных производных барбитуровой кислоты для инмунохинического анализа барбамила: A.c. 1632122 СССР, НКИ с 07 л 239/62 / с.А. Еремин, A.A. Щеголев, А.к. Егоров, А. К. ЕРМакОЕ и ДР // БЮЛ. - 1993. - Н 29.

6. ^-ощуоресцентиокарбамилэтиламид 5-изоамил-5-(5'-карбокск-пентил) барбитуровой кислоты в качестве реагента для поляризационного флуороимнуноанализа барбанила: A.c. 1625793 СССР, НКИ С 07 д 239/62 / А. Н. Ермаков, Б. н. Изотов, с. А. Еремин. А. А. Шего-лев и др. // БШ. - 1993. - Н 25.