Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение иммунохимических реагентов для определения Сl-ингибитора и Clq компонетов системы комплемента человека и некоторые аспекты их клинического применения

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНЭПИДНАДЗОРА РФ МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ии. Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

РГ* ОД

' ^ ,г На правах рукописи

РОЗИНА Марина Николаевна

ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ С1 -ИНГИБИТОРА И С1а КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА И НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ИХ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ.

14.00.36. - Аллергология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой стспснн кандидата медицинских науи.

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории медицинской биотехнологии Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Е Габричевского ГК санэпиднадзора РФ.

Научные руководители - доктор биологических наук.,

профессор Е А. Алегнки; доктор 6иологичес:шх наук, профессор X В. Козлов.

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук,

профессор И В. Пкнепш; кандидат биологических наук 3. П. Еелкин.

Ведущее учреждение - Институт иммунологии РАШ.

Защита диссертации состоится "/Л " . Р. 9.... 1994 г. в .1.9 часов на заседании специализированного . совета (К 084.18.02) Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского ГК санэпидкадзор РФ по адресу: 125212 Москва, уд. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н Габричевского ГК санэяиднадэ-эора РФ.

Автореферат разослан "... РЛ... 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

А. В. Сапронова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Изучение связи состояния системы комплемента (СК) организ-з с патогенезом различных заболеваний является одной из ак-|Мьных проблем современной клинической иммунологии. Один из :пектов этой проблемы состоит в регуляции активации классичес->го пути (КП) комплемента Это относится, в первую очередь, к фокому распространению аутоиммунных заболеваний, характеризуйся формированием аутоагрессивных антител и" иммунных комп-;ксов, зьгзызакиих активацию КП СК.

Одним из важных факторов регуляции СК на ранних стадиях стивации, принадлежащих самой системе, является С1-инг. Это шнственный известный ингибитор сериновых протелназ С1г и С1э :рвого компонента СК. В то же время, принадлежа к классу сер-шов, С1-инг успешно ивакгивирует такие компоненты калликре-[-кининовой, свертывающей и фибриколитической систем крови, к, активированный фактор Хагемана, XI1Г, Х1а, ХаГ факторы ■ертьвания, • плазмин и калликреин- (Аг1аисЗ, 1984; Иитакег,1987). Количественные и функциональные дефициты этого мпонента СК являются патогноионичнымн признаками насяедствен-го ангионевротического отека Квинке (АНО)или приобретенных фицитов аутоиммунного или инфекционного характера при разллч-х заболеваниях. Сходство клинической картины этих заболевний аигионевротическими отеками аллергической природы и повышен-я частота встречаемости дефицитов С1-инг при.системной крас-й волчанке и СКВ-подоСных состояниях требует разработки спо-бов их дифференциальной диагностики.

Помимо' диагностической и прогностической ценности оценки стояния КП СК, мониторинг отдельных компонентов СК позволяет уцествлять подбор дозы некоторых иммунокоррегирутазк препара-в, применяемых при лечении различных заболеваний, в том чнс-, инсулинзависидого сахарного диабета, а тага© способствует эмированкю современных представлений о механизмах развития и збенностях течения аутоиммунных заболеваний. При- этом для ;нки уровня и активности С1-инг и содержания применимы

эстые лабораторные тесты: радиальная иммунодиффувия по Шнчи-и кммуяофермэктный анализ.

Современная отечественная лабораторная практика располага-

ет моноспецифической антисывороткой и стандартом для измерения количества СЗ компонента СК, а также комплектом реагентов для. определения активности С1, С2, СЗ, С4 и С5 компонентов комплемента. Однако, д^я оценки процессов регуляции КП активации комплемента перечисленных реагентов недостаточно. .

Другим аспектом проблемы являетяся и то, что разработка способов получения очищенных компонентов СК невозможна без им-мунохимического контроля качества получаемых препаратов, осуществляемого, в частности, с помощью разнообразных методов, предполагающих использование моноспецифических антисывороток и соответствующих стандартов.

В связи с вышесказанным, ЦЕЛЬ настоящей работы заключалась в теоретическом и экспериментально-производственном обосновании получения С1-инг, С1ч и набора иммунохшических реагентов для их характеристики в клинике АНО различного генеза и некоторых •других заболеваний, сопровождающихся нарушениями ранних этапов активации КП СК.

При этом в качестве сарья, помимо дефицитной и дорогостоящей нормальной донорской плазмы, использовали бросовые осадки IV-1 и А8, получаемые в процессе производства препаратов гамма-глобулина человека спиртовым методом Кона (СигПпе,1980), и содержащие некоторые белки плазмы крови (ШЬга,198б), в частности, С1-Зи-.а;.-г»:аатор> и С1ч (соответственно). Применение балластных белковых фракций в качестве источника антигеннного материала оправдано для целого ряда гликопротеинов (Втг,1980), особенно» при получении антисывороток, т. к. позволяет, Ео-пер-вых, эконоиггь более ценное сырье: кровь человека; во-Еторых, сами фракции является частично очинённым сырьем, обогащенный или обедненный по отдельным компонентам крови, что упрочат . процесс очистки белков.

Для осуществления поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1) разработать оптимальные способы выделения и очистки С1-инг и Clq из плазмы крови здоровых доноров, а такие из бросовых осадков А8 и 1У-1, получаемых в процессе производства гамма-глобулина спиртовые катодом Кона; 2) осуществить иммунохимический контроль и анализ биологической активности С1-кнг и С1ц, выделенных из различных видов сырья; 3) создать

ор иммунохишческих реагентов для качественного и кали<кст-ного анализа названных гликолротеинов; 4) использовать полу-ные моноспецифические антисыворотки к С1ч и С1-инг дам ха-теристиго! состояния Ш1 активации СК в клинике ангионевроти-кого отека Квинке различного генеза и инсулинзавискьюго са-ного диабета. Научная новизна работы.

Разработаны оригинальные способы выделения и очистки кнг и С1я компонентов СК из нормальной донорской сыворотки ви человека.

Проанализировано содержание названных гликопротеинов в личных видах сырья: балластных осадках А8 и IV-!, получаемых производстве препаратов крови человека спиртовым фракциони-анием по методу Кона

Показана принципиальная возможность использования в качес-дополкителыюго источника антигеннного материала С1-шг и балластных осадков А8 и IV-!.

Получены- новые иммунохимические реагенты для качественной зличественной характеристики С1-инг и С1д в сыворотках крови эвека: полишшальныэ моноспецифические кроличьи азтисыво-

к С1-инг и Clq, а также стандартные сыворотки крови. •Определены уровни С1ц и С1-инг в сыворотках крови нормаль-доноров населения России.

Исследованы шливность и содержание С1-инг', а такгге уро-ь С1ц в сыворотках крови больных врожденным (приобретенным) гионевротическим отеком Квинке и отеками аллергичесгай при-Проведен анализ состояния регуляторного звена ЕП СК по мю и активности С1-инг у больных инсулинаависимым сахарным 5етом I тина (КЗСД). Показана диагностическая и прогности-гая ценность оценки КП активации СК у этих групп Сольных. На гаании проведекпного обследования больных АНО возмоша диф-¡пцкальная диагностика приобретенных, врожденных и алдерги-етх форм отеков.

Практическая значимость работа

На основе предварительно разработанных способов выделения тетки С1-инг и С1д из различных видов сырья' получены и

I - 4 -

внедрены в биотехнологическую практику новые иммунохимические реагенты для определения С1-инг и С1д: 1) "Антисыворотка диагностическая против С1я компонента комплемента человека сухая преципитируиЕэя" (Инструкция по изготовлению и контролю, утверждена 28. Сб. 1988 г., протокол N3, Комитет по аллергенам и биопрепаратам); 2) "Антксыворотка диагностическая против С1-инг человека прецшшпфуюсэя сухая" ( экспериментально-производственный регламент 379-92, временная фармакопейная статья 42-332 ВС-92, утверждено 8.07.92 г., протокол N5, Комитет по ЫИБП ГИСК им. Тарасевича).

Оформлено одно рационализаторское предложение "Способ выделения С1д" (10.03. 88 г., N 185-432).

Подана заявка на авторское свидетельсво и получена приоритетная справка на "Способ получения С1-инг",( 24.07.92 г., N 5043741).

Структура и объем диссертации. Работа изложена на страницах машинописи, включает \?.о страниц текста. Л- таблиц и )(з рисунков'и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка литературы, включая 5.3 отечественных и -2.1 V иностранных литературных источника. •

Апробация работы проведена на заседании секции Ученого Совета МНИИЗЫ кх Г., Е Габричевского "Иммунология и медицинская биотехнология" в к^аг 1994 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

иахер:ллы м изтоды Субкомпонент С1д первого компонента комплемента и С1-инг выделяли ив шазмы крови здоровых доноров и балластных фракций (осадков А8 и 1У-1), получаемых при фракционировании крови спиртовым методой Кона в производстве альбумина

Антнсыворотки к С1д и С1-инг получали путем иммунизации кроликов очл^энкьаш антигенами. Уровень С1ч, а также концентрацию и активность С1-инг определяли в сыворотках крови 68 здоровых доноров (25 ¡кнщин, 43 мужчин), 33 - больных различными

формами АЮ, а также 91 образец сывороток больных ИЗСД.

Сыворотки здоровых - доноров использозались в качестве контроля при определении уровня и активности исследуемых компонентов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Сттадента.

Лигандний сорбент IgG-МПС 2000 готовили путем иммобилиза-дии на модифицированном по известной методике (Березин, 1976) макропористом стекле - 2000 В-ГХ (г.Горький, ШШП) иммуногло-5улина G человека, выделенного из комерческого раствора гам-¿а-глобулкна с помощьо ионообменной хроматографии на DEAE-цел-шлозё (Peterson,1956).

Аффинный сорбент анти-1еМ-сефарозу готовили, иммобилизуя [gG-фракцию кроличьей антисьшоротки к IgM человека Peterson,1956) на BrCN-сэфарозе по стандартной методике.

Активность С!-инг определяли методом тшукофериентного шализа, описанннш А.М.Кщенко с соавт. (1991).

Для -характеристики сырья, выделенных белков и полученных отисывороток к Cl-инг и Clq человека, пользовались методами рецшгатации в геле по Оухтерлони, иммувозлеотрсфорезом (ИЭФ) о Грабару и Уильямсу, слитно-ракетного ИЭФ (СИЭФ® (Фримель, 987). В качестве референс-препаратов использовали комерческие оноспецифические антисыворотки к С1-ивг и Clq человека произ-одства фирмы. "Behripg" (Германия).

Концентрации исследуемых компонентов системы комплемента пределяли методом простой радиальной кммунодиффузии (РИДО tencini, 1965) с использованием собственных моноспецифичееких нтисывороток к Cl-инг и Clq, а такие стандартных сывороток роизводства фирмы "Behring" (Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Получение Cl-инг из нормальной сыворотки крови человека

Апробированная нами схема изоляции Cl-инг из нормальной )норской сыворотки крози включает предварительное фракциониро-шие полизтиленгликолем (ПЭГ) с Ш 6000 до конечного насыщения

10Z (вес/объем), ионообменную хроматографию подученного супер-

натанта на DEAE-Toyopearl и лигандную., хроматографию С1-инг -

обогащенной фракции на Heparin-Toyopearl (см. табл. 1).

Табл. 1. Выдеиение Ci-инг из плозии крови человека и бсимхстни; осадков /8 u IV-1 фракционирования крови по методу Кона.

ПУЛ ВЫХОД". фактор очистки

объем мл' ^80 единиц антиген ыкг антиген Z

ДОНОРСКАЯ ПЛАЗМА КРОВИ 500 24500 750 100 1

10% ГОГ супернатант 492 28000 720 96 0,83

элюат с DEAE-Toyopearl 224 1300 485 " 65 12,4

элюат с Heparin-Toyo-pearl 50 185 338 45 61

ОСАДОК А8 500 20000 450 100 1

10% ГОГ супернатант 410 10000 436 97 1,74

элюат с DEAE-Toyopearl 200 500 270 60 21,6

элюат с Heparin-Toyopearl 45 100 170 38 68 "

ОСАДОК IV-I 500 20000 320. 100 1

10% ГОГ-* супернатант 400 -16500 224 70 0,85

злюат с DEAE-Toyopearl 390 330 160 50 30,3

элюат с Heparin-Toyopearl 50 55 96 30 109

Применение фракционирования ГОГ 6000 до 10% насыщения позволяет уже на первой стадии очистки избавиться от большей части контаыинантных белков, фи этом, согласно "литературным и собственным данным, все компоненты лротромбинового комплекса, в том числе фибриноген, шазминоген и XIII фактор свертыванш остаются в осадке, а 1001 С1-инг остается в'растворе, который подвергается дальнейшему хроматографическому разделений

Хроматографию на БЕАЕ-Тоуореаг! проводили в 0,02 Н фосфат-

ом буфере, содержащем 0,1 М НаС1 и 0,Ю5 Ы ЭДТА, рН 7,0 при люировании.. линейным градиентом NaCl от 0,1 до 0,7 И. Пробы, одерзгалще С1-инг, контролировали методом слитно-ракетного им-унозлектрофореза против моноспецифической антисыворотки к 1-инг.

Для получения иммунохимически чистого гликолротеияа, кон-гнтрат, обогащенный С1-инг, подвергали лигандной хроматографии a Heparin-Toyopearl в изотоническом фосфатном буфере (рН 7,2) ж элюкровании связавшейся фракции 1,5 М ИаС1. Элтат- (С1-инг) отцентрировали ультрафильтрацией (Amícon, РМ 10) и хранили при

■43° С. С1-инг Препарат контролировали метода® ИЭФ и PJffl. Дан-je по выделению и очистке С1-инг из нормальной донорской плаз- ' j крови приведении в таблице 2.

2. Выделение С1-инг человека из отходов промышленного получения альбумина спиртовым методом Кона.

Сыворотка кро?и человека (плазма) является традиционнным, ■ дорогостоящим сырьем для выделения многих белков, особенно рментов. Использование сыворотки крови в качестве сырья оп-здано, прелде всего, при получен;® лечебных препаратов крови оиышэнным способом. При этом, в процессе производства альбу-на человека спиртовым методом фракционирования по.Кону, об-зуются так называемые балластные фракции,. содерлгащие практиг ски все белки крови человека, которые не утилизируются в ос-вном цикле." Вопросы рационального использования балластных адков и супернатантов разрабатываются как зарубежными, гак и эчественными исследователями.

В лаборатории медицинской биотехнологии 1ШШЭМ им. Г. Н. Габ-тевского в рачках задания НГС Ш FCCCP были начаты серии раз-5оток по безотходной технологии производства препаратов кро-, которые продолтаются и в настоящее время. Líií предлагаем ис-гьзовать балластные- осадки А8 и IV-1 для выделения С1-инг и ?, т.к. показало, что первый из них, содержит Clq (0,05 -У7 мг/мл) компонент СК (Bing,1980) "и С1-инг (0,1 - 0,07 'мл), а во втором, выявляется С1-инг (0,1 - 0,15 мг/мл).

В условиях спиртового фракционирования функциональная ак-

тивносгь С1-инг, составляла 3,12 от исходной (для осадка IV-!) и ,1,62 ( для осадка А8), что, однако, не исключает, возможное™ использования осадков 1У-1 и А8 в качестве дополнительного источника сырья, так как антигенная структура обоих белков полностью сохраняется.

Экстракцию С1-инг из ^измельченных осадков IV-! и АЭ осуществляли в течение 17 часов в фосфатном буфере* содержащем 0,1 М ЫаС1 (рН 7,0). Супернатаяты, полученные после центрифугирования и диализа против.0,02 М фосфатного буфера, содержащего 0,3 М N301, 0,005 М ЭДГА, рН 7,0 подвергали последовательному фракционированию по схеые, приведенной для сыворотки крови человек (см. табл. 1).

3. Еаделение из нормальной плазмы крови человека

Предложенная наш схема Еыделения С^ из нормальной плазмы крови человека включает предварительную обработку ПЭГ Ш 60СХ до насыщения 4%, лигандную хроматографию' на 1д£3-ЫШ 2000 и белок А-сефарозе, а таке аффинную хроматографию на анти-1дМ-сефа-розе.

Применение ПЭГ на предварительной стадии выделения белка определяется необходимостью удаления из плазмы 'крови иммунны: комплексов (ИЮ. фи насыщении ГОР от 3,75% до 4% С1д остаетс; в растворе, который после центрифугирования, добавления 0,02 ] ЭДГА и диализа подвергали лигандной хроматограф™ на 1б>3-НПС 2000 в фосфатном солевом буфере (РЕВ), содержащем 0,02 Ы ЭДГА ! 0,15 М КаС1, рН 7,0 (Ко1Ь, 1979). «ракцию, обогащгнную С1сь элшровали линейным градиентом НаС1 до концентрации 1,5 М. Элзо-ат концентрировали ультрафньтрацией (Ашсоп, РМ 30), дкалкзова-ли против исходного буфера и подвергали лигандной хроматографш на белок А-сефарозе в РВЭ, содержащем 0,15 М НаСГ, 0,02 М ЗдТ. при рН 7,0. злшровали 0,1 И гициновыы буфером, рН 2,8, < свободную фракцию подвергали хроматографш! на англ- 1гМ-сефароз! в РВБ, с 0.15 и ИаС1 и 0,02 Ы ЭДГА, рН 7,0. 1еМ злюировали О,: М глициновым буфером, рН 2,8. Очинённый С1ч концентрировал!

ультрафидьтрацией (Атсоп, РМ 30) и хранили при -70° -С.

Препарат С1д контролировали методами ИЭФ и РИД с использо-

ванием антисыворотки против белков плазмы крови человека и мо-носпецифическоцй антисыворотки к С1ч человека. Данные по вьще-. лению и очистке С1ч приведены в таблице 2.

Табл. 2. Выделение С1<? из плозии крови человека и балластного осадка /8 фракционирования, крови по яетязу Кона,

ПУЛ ВЫХОД фактор очистки

объем ^280 антиген антиген >

мл единиц мкг %

ДОНОРСКАЯ ПЛАЗМА КРОВИ 500 25300 500 100 1

4% БЭГ супернатант 494 25000 495 99 0,95

элюат с 1е<1-ШК! 2000 250 450 250 50 27,8

проскок с белок А -сефзрозы 35 300 225 45 37,5

проскок с анги-1^М -сефарозы 45 200 200 40 50

ССАДОК А8 - ' 500 20000 300 100 1

4%. ПЭГ супернаташт 400 1.0950 . ?40 . 80 1,46

элюат с 1е&-Ш1С 2000 180 230 150 50 43,5

проскок с белок А -сефарозы 20 120 90 30 50

проскок с анти-1?М -сефарозы 30 95 75 25 53

4. Выделение Clq из осадка А8.

Экстракцию' Clq из измельченного осадка А8 осуществляли в течение 17 часов в PBS, содержащем 0,3 !i NaCl и 0,02 Ы ЭДТА (рН 7,0). Супернатанг, полученный после центрифугирования и диализа против PBS, содержащего 0,15 il NaCl и 0,02 М ЭДТА, рВ 7,0 подвергали последовательному фракционированию по схеме, приведенной для сыворотки крови человека (см. табх 3).

Препарат Clq контролировали методами ИЭФ и РИД с использованием антисыворотки против белков плазш крови человека и моноспе-

цифическоцй антисыворотки к Clq человека. Данные по выделению и очистке Clq приведены в таблице 3.

5. Получение моноспецифических антисывороток к С1-ингибитору человека и Clq субкомпненту.

Сыворотку крови кроликов, иммунизированных • очинёнными Cl-инг и Clq, исследовали методом ИЭФ с использованием моноспецифических антисывороток производства фирмы "Behring" (Германия) к соответствующим гликопротеинам в качестве референс-пре-паратов. Примеси неспецифических антител удаляли из сывороток крови кроликов с помощью иммунных сорбентов, которые готовит. по стандартной методике (Фримель, 1987) с помощью глутарового альдегида При этом использовали белковые фракции, не содержащие Clq и Cl-инг, подученные на различных стадиях очистки наз-ваннных белков. После сорбции антисыворотки контролировали методом ИЭФ (рис.1). Цри взаимодействии с цельной стандартной сывороткой крови человека каждая из полученных сывороток формировала единственную линию преципитации в характерной для данного белка зоне (альфа-2 для Cl-инг, гамьа-2 для Clq) симметрично рефэренс-ангисыворотке. Антисыворотки специфически взаимздейст-

вовали с препаратами Cl-инг и Clq-__г

+ —"ч i . ~ '

г ъ

4

5

-"N I

^ в I

I

I

»s^ J

Рис. 1. Анализ антиснвороток к С1-югг и Clq методом КЗФ (схема). I - стандартная плазма крови человека; 1 - сыворотка ирецшштиру-хщая белки крови человека; 2-3 - моноспецифические антисыворотки к Cl-икг (собственная и фирмы "Behring", соответственно); 4-5 -моноспецифические антисыворотки к Clq (собственная и фирмы "Behring", соответственно).

- и -

Титр антисьшороток, определенный методом РЯД по Мэнчини .составил 1:8 (для С1-инг) .и 1:5 (для Clq).

6. Оценка уровней С1-инг и Clq в популяции нормальных доно-• ров России.

До настоящего времени в современной отечественной и зару-безжой научной литературе отсутствуют однозначные данные по распределению уровней многих белков сыворотки крови человека, в том числе, Clq и С1-инг. В связи с этим, а тага® учитывая то, что европейские нормы, в силу целого ряда генетических, геогра-' фических, экологических и социально-экономических факторов, отличаются от таковых для российского региона, были измерены уровни С1-янг и Clq в сыворотках 68 здоровых доноров с помощью РВД

Определенный наш разброс значений С1-инг в популяции здоровых доноров при возрастных рамках от 22 до 54 лет составил / 145,2+48,2 мкг/мл у 'женщин и 183,9+44,2 мкг/мл у мужчин (р < 0.002)', а средний уровень в общей группе составил ■ 164,6 + 52,4 мкГ/мл.

. Значение, уровней Clq в той же популяции здоровых доноров составили 93,2+17,3 мкг/мл для женщин и 110,6+20,2 мкг/мл для мужчин (р < 0,002) при среднем уровне 104,4 + 37,4 мкг/мл.

Таким образом, как для Cl-инг, так и для Clq, характерны несколько более высокие значения концентраций в сыворотках мук-чин, по сравнению с женщинами (р < 0,002), что модно объяснить половыми особенностями нейрозндокринной системы.

, Учитывая вышесказанное, а также то, что возрастная структура 5 групп больных соответствовала таковой нормальных доноров, определенные нами средние-значения Cl-инг - 164,6 + 52,4 мкг/мл и Clq - 104,4 + 37,4 да/мл были приняты за нормальные.

7. Определение уровней и активности И-¡яг в сыворотках • , больных ИЗСД,

Уровень и активность Cl-инг измеряли в сыворотках больных ИЗСД ( 91 образец ). фи этом 33 образцов сыворотки были поду-

чены от больных ИЗСД на фоне традиционного лечения инсулином, и 58 образцов от больных с иммуносупрессорной терапией азатиопри-ном.

Полученные данные приведены в таблице а

Таблица 3. Сравнительная характеристика уровня, и активности С1-инг в группе нормальных доноров и больных ИЗСД.

группа С1-ИНГ ( ПОКАЗАТЕЛИ)

количество, активность, удельная

мкх/мл % нормы активность

Доноры . 165 + 52 100+20 100 ± 20

И 3 С Д (терапия инсул.) 222 + 57 (р < 0,001) 85 + 16 (р <~0,001) 66 + 22 (р < 0,001)

ИЗСД (терапия азатиоприном) 224 + 51 (р < 0.001) 83+21 (р-< "0,001) 66 + 31 • (р < 0,001)

Сравнение активности и содержания С1-инг в группе больных ВЗСД при лечении инсулином и азатиопривом, а таюке нормальных доноров показало, что в обеих группах содержание С1-инг достоверно повышено (р < 0,001) по сравнении с нормой, в то . время как функциональная активность и удельная активность ингибитора достоверно снижалась (р < 0,001). Средние данные по обеим группам больных не выявляют различий показателей уровня и активности С1-инг. Однако, при построении гистограмм изменения уровня-и активности гликопротеина внутри групп было выявлено, что на фоне лечения инсулином 66% больных имеют нормальную активность 01-инг, а 22% - пониженную; на фоне лечения азатиоприном, напротив, у 62% больных активность была пониженной, а у 28% соответствовала нормальным значениям (рис. Z).

Таким образом, изменения уровня к активности 01-кнг у больных вновь выявленным ИЗСД позволяет сделать .вывод о нарушении процессов регуляции КП активации комплемента, что согласуется с имеющимися данными о напряженном состоянии СК у таких больных в целом.

□ Ниже нормы Н Норма Е5 Выше нормы

Инсулин ¿¡гтиопоин

Рис. 2. Гистограммы распределения активности С1-инг в группах больных ИЗСД на фоне лечения инсулином и азатиоприном.

7. Использование методов иммунохимического анализа для определения состояния КП активации СК у больных различными формами отеков.

Актуальность проблемы своевременной диагностики АЮ объясняется. сходством клинической картины заболевания с отеками аллергической природы и случаями сочетанной патологии- иммунной системы (Ьаиге11,1985).'Осуществление дифференциальной диагностики в этой группе определяет выбор и успех терапевтических мероприятий, способствусг уменьшению смертности при А1Ю от асфиксии вследствие отека гортани. Ресение этой проблемы заключается в применении целого ряда простых иммунохимических тестов, требующих набора специальных реагентов и недорогого оборудования в клинико-лабораторной практике. ■

Диагностические процедуры в лабораторных условиях включают анализ уровней С1-инг, С1, С4 и СЗ компонентов СК методами 15ан-чзти и электроиммуоанажза, определения функциональной активности С1-инг с помощью зстеролитических тестов и анализа способности сыворотки угнетать С1б-опосредованную инактивацию С2' и 04.

Созданный нами набор иммунохимических реагентов - моноспе-

цифической ангисыворогки к С1-инг и С1ц человека, а также соответствующие стандарты и ИФА тест-сиртеш, разработанная во ВНИИ ОЧБ (С. -П., А. и. Ищанко), позволили наы провести обследование группы больных (33 человек) различными формами отеков; Исследуемая группа по возрастным характеристикам соответствовала контрольной группе нормальных доноров.

Полученные данные представлены в табквде 4.

Табл. 4. Сравнительная, характеристика показателей классического пути активации СК при различных форхах. отеков Кпилкс.

ГРУППА ПОКАЗАТЕЛИ

(человек) . С1-ИНГ ' С1-ИНГ С1-ИНГ С1д й-инг/йя

(мкг/мл) (акгивн. %) (удельная акгивн.) (мкг/мл)

Доноры (I) 165+52 100+20 100+20 104+37 1, 6ё0,3

Аллергические отеки (И) 217+125 73+18 75+47 56+19 4,0+2,3

Баследствеянк? 113+86 стеки (III) 22+6 44+23 63+21 1,9+1,5

р (II - III) < 0,01 < 0,001 < 0,02 Н. Д. < 0,003

Согласно полученный результатам, для дифференциальной диагностики АНО и отеков аллергической-природы целесообразно учитывать общую функциональную активность С1-инг, так как различия этих двух групп больных, при атом наиболее достоверны р < 0,001. Вторым по достоверности критерием (р < 0,003) является сравнение содерйанкя С1-инг по отнойевка к С1ч. Определение общего количества Й-кнг (как антигена) не позволяет однозначно установить диагноз аллергических отеков (р < .0,01).

Функциональная активность С1-инт при аллергических отеках составила 73+18 X для 12 больных (диапазон от 30 до 331). Щ>и 'ДЮ 22+6% для 21 больного (диапазон от 10 до 331). Следовательно, проведение дифференциальной диагностики по уровню функциональной активности возмогло с надежностью 100%. Однако, в связи с дороговизной и недоступностью для юкнико-лабораторной прак-

тики этого вида анализа, допустимо использование второго критерия (отношение уровня С1-инг к С1ч). Надешэсть его применения составила 85%. Из 12 больных с аллергическими отеками 10 имели значение С1-инг/С1ч от 8,6 до 2,08, а при АНО 21 больной из 29 - от 0,66 до 1,8.

вывода

1. Предлозкены оригинальнш схемы выделения и очистки С1-инг сёри-новых- протеиназ и Clq субкомпонента С1 компонента системы комплемента человека из плазмы крови человека.

2. В развитие принципов безотходной технологии производства препаратов крови по методу Кона показана возможность утилизации балластных осадков А8 и IV-I для получения С1-инг и Clq компонентов системы комплемента человека в виде шдлунохимически чистых антигенов.

3. Впервые в РФ получены и внедрены в практику моноспецифические антисыворотки к С1-инг и Clq человека.

..4. Определены уровни СЬинг и Clq в популяции 'нормальных доноров РФ.

5. По данным оценки уровней С1-инг я Clq, а также активности Cl-инг ■ в сыворотках больных ИЗСД показано нарушение процессов регуляции КП активации комплемента Екявленные особенности комплементарного статуса в этой группе больных на фоне инсулиноте-рапии и лечения азатиоприном являются чувствительным критерием активности аутоиммунного процесса.

6. Шкззана диагностическая ценность использованной схемы обследования больных различными формами отеков, вклвчающей определение уровней Cl-инг и Clq, а такж активности Cl-инг, на основании которой-возможна дифференциальная диагностика вроэденного АПО Квинке я аллергических отеков.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Розина М. Н. , Феофанова Е Е Еыдедение Clq-субкомпонента системы комплемента человека и использование его в МФА для опреде- . ления ДИК в сыворотках некоторых больных // Деп. Медицинский реф. вдэнал. - 1988, - раздел III, - N8, - публ.3026.

2. Пономарева А. М., Алешкин В. А., Розина IL Н. Определение гали-чества агрегированного иммуноглобулина G в препаратах гаммагло-булина для внутривенного и внутримышечного введения, по связыванию Clq компонента системы комплемента // Иммунобиологические препараты: Сб. тр. ШШЭЫ им.. Г. Е Габричевского. - М. 1989. -с. 15-19.

3. Смолина Е К , Ишмухаме-тов 0. А., Розина М. Е Значение отдельных показателей иммунного статуса в краткосрочном прогнозе инфаркта миокарда // Молекулярные аспекты клинической иммунологии: Республиканский Сб. тр.. 2-го ШЛГШ им. Е И.Бирогова. - Ы. 1989."- с. 153-155.

4. Алешин Е А., Розина М. Е Выделение Clq субкомпонента системы комплемента человека из бросового осадка А8, получемого при фракционировании крови по методу Кона // Актуальные вопросы би-технологии производства препаратов крови: Сб. тез. конф. - Новосибирск, 1989. - с. 81-85.

5. Юмалев Г. С., Петрова К В., Елисеев А. Т. •, Алешкин fe. А., Розина М. Е Цммункьн комплексы крови и ликвора у больных с травмой спинного мозга // Клиническая медицина. - 1,991. - N3. -с. 56-58.

6. Use of ion exchange and affinity chromatography for purification of isolated human 01-inhibitor // Int. Conf. Kted. Biotechnology. -.Leningrad, 1991. -. P7-2.

7.. Еамхалова К.Е,- Дедов И. iL, Шишко Ell, Абугова H.A., Козлов TLU., Алешкин В. А., Розина ü Е , Влияние азатиоприна на иммунологические показатели у.больных с вновь выявленным сахарным диабетом // Цхэбл. эндокринологии. - 19S3. - N6. 8. Rozina КН., Alyoshkin V. А., Use of ion exchange and ligand chromatography for isolating of human Cl-lnhibltor // Bio-Chromatogr. Bio-En^in., Vth Symposium of the Europen Society for Bi ^Chromatography, France - Мзу 17-19 - 1994 - P 41.

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых ЮШЭИ им. Г. Е Габричевского "Клинико-лабораторные аспекты исследований в инфекционной, патологии" (1968 г.); республиканской конвенции "Актуальные вопросы биотехнологии иммунобиологических и гемотрансфузионных препаратов" (Новосибирск, 1988 г.).