Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуноферментный анализ антител к пептидным биорегуляторам и белкам системы гемостаза в норме и при патологии

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ АНТИТЕЛ К ПЕПТИДНЫМ БИОРЕГУЛЯТОРАМ И БЕЛКАМ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

14.00.36. - аллергология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Научный руководитель Доктор биологических наук М.А. Мягкова

На правах рукописи

САВИЦКАЯ Юлия Анатольевна

МОСКВА- 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ_3

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ_7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ_8

«биорегуляторы системы гемостаза»

1.1. Белковые факторы регуляции системы гемостаза_8

1.1.1. Общая характеристика тромбина и его природных ингибиторов_10

1.1.2. Биологическая функция тромбина и его природных ингибиторов при развитии патологии

14

1.1.3. Методы определения тромбина, его природных ингибиторов и их использование в диагностике заболеваний __19

1.2. Пептиды ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем_20

1.2.1. Структура и физиологическая роль ангиотензина II и брадикинина_21

1.2.2. Значение пептидов ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем в норме и при развитии рада заболеваний_24

1.2.3. Методы определения пептидов: ангиотензина II и брадикинина, и возможность их применения в медицинской диагностике_31

1.3. Взаимосвязь биорегуляторов системы гемостаза_32

1.3.1. Ренин-ангиотензиновая и калликреин-кининовая системы_32

1.3 .2. Факторы системы свёртывания крови и пептидные биорегуляторы_36

1.4. Роль гуморального иммунитета в регуляции системы гомеостаза при патологии_37

1.4.1. Естественные антитела к физиологически активным соединениям и их биологическая функция__38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ_41

2.1. Материалы исследования_41

2.2. Методы исследований_42

2.3. Получение конъюгатов гаптенов на полимерном носителе_43

2.3.1. Получение конъюгата ангиотензина II_43

2.3.2. Получение конъюгата брадикинина_43

2.4. Выделение сывороточных белков из плазмы крови_43

2.4.1. Выделение антитромбина III из плазмы крови_43

2.4.2. Иммунохимический анализ чистоты антитромбина III_44

2.4.3. Выделение а2-макроглобулина из сыворотки крови_45

2.5. Получение иммуноспецифических реагентов для метода латексной агглютинации_46

2.5.1. Получение моноспецифической антисыворотки к антитромбину III_46

2.5.2. Синтез конъюгата на основе СМК-латекса__47

2.5.3. Метод латексной агглютинации_47

2.6. Разработка метода ИФА выявления естественных антител к белкам и гаптенам _._47

2.6.1. Определение рабочего разведения сыворотки и концентрации антигена_47

2.6.2. ИФА белков и пептидов в сыворотке крови человека_48

2.7. Выделение антител к брадикинину и ангиотензину П из сыворотки крови человека _49

2.7.1. Получение сорбента для аффинной хроматографии,_49

2.7.2. Выделение антител к брадикинину и ангиотензину II аффинной хроматографией__49

2.8. Определение специфичности и аффинности выделенных на аффинном сорбенте антител к брадикинину и ангиотензину П_50

2.8.1. Выбор условий проведения ингибиторного ИФА_50

2.8.2. Ингибиторный ИФА для оценки специфичности и аффинности антител к брадикинину и ангиотензину II________50

2.8.3. Определение специфичности антител к брадикинину и ангиотензину II_50

2.8.4. Расчёт константы аффинности антител _51

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ_52

3.1. Получение реагентов для проведения ИФА определения антител к белкам и пептидным биорегуляторам_52

3.1.1. Синтез конъюгированных антигенов пептидов на полимерной матрице_53

3.1.2. Выделение белковых факторов системы гемостаза: антитромбина III и а2-макроглобулина

53

3.1.3. Получение конъюгата для определения антитромбина III методом латексной агглютинации __54

3.2. Разработка ИФА определения антител к пептидным биорегуляторам системы гемостаза_56

3.2.1. Определение уровня антител к ангиотензину II и брадикинину в сыворотке крови доноров и больных__59

3.2.2. Определение уровня антител к ангиотензину II в сыворотке крови больных_62

3.2.3. Определение уровня антител к брадикинину в сыворотке крови больных_63

3.2.4. Исследование иммунохимических свойств естественных антител к пептидным биорегуляторам системы гемостаза_63

3.2.5. Практическая значимость выявления антител к пептидным биорегуляторам системы гемостаза_65

3.3. ИФА определения антител к белковым факторам системы гемостаза и его применение в клинике_71

3.3.1. Определение методом ИФА антител к антитромбину III_71

3.3 .2. Практической значимость выявления антител к антитромбину III_72

3.3.3. Определение антител методом ИФА к тромбину и его природным ингибиторам_73

3.3.4. Установление взаимосвязи между уровнем антител к белковым факторам системы гемостаза и биохимическими показателями этой системы_ 75

3.3.5. Влияние терапии на показатели системы гемостаза и гуморального иммунитета у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ_77

ВЫВОДЫ_82

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _ _ __83

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Исследования последних лет направлены на разработку новых методов иммунохимического анализа низкомолекулярных пептидных биорегуляторов и белков, играющих важную роль в патогенезе ряда заболеваний заболеваний.

Хорошо известно, что изменения гемостаза, связанные с функционированием его основных звеньев - белковых факторов системы свёртывания крови человека: тромбина и его ингибиторов (антитромбина III и аг-макроглобулина), а также пептидных биорегуляторов калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем, имеют большое значение в патогенезе атеросклероза, ишемической болезни сердца, гипертонии, нарушении обмена веществ.

В основе сердечно-сосудистых катастроф (острый инфаркт миокарда, инсульт) лежит, как правило, тромбоз, обусловленный активацией тромбоцитов и процессов свёртывания крови.

Вот почему актуальна задача создания надёжных диагностических методов контроля, позволяющих следить за состоянием организма человека, которые можно использовать в норме и при проявлении патологических симптомов.

В нашей стране и за рубежом используются традиционные подходы для создания диагностических тест-систем, которые заключаются в разработке способов количественного определения белковых либо пептидных факторов, участвующих в механизме развития заболевания.

Однако из литературных данных, известно насколько длительно создание надёжного и простого иммунохимического метода анализа перечисленных выше соединений. Это, в первую очередь, связанно с трудоёмкостью разработки специфического анализа и высокой чувствительностью, так как эти вещества в активном состоянии существуют в организме человека в небольших концентрациях и быстро метаболизируются, что затрудняет их выявление в сыворотке крови.

С другой стороны, в настоящее время выполнены исследования, свидетельствующие о наличии в организме здорового человека иммуноглобулинов, взаимодействующих с рядом эндогенных биорегуляторов и называемых естественными антителами.

При патологических состояниях происходит изменение нормального уровня е-ат, которое, как правило, связано с нарушением метаболизма того или иного эндогенного соединения, участвующего в патогенезе заболевания.

Вот почему большой интерес представляет обнаружение и изучение роли е-ат к ряду пептидных и белковых регуляторов системы гемостаза, изменение метаболизма которых имеет место при сердечно-сосудистых заболеваниях и нарушении обмена веществ. К ним относятся, в первую очередь, тромбин и его природные ингибиторы, а также пептиды - брадикинин и ангиотензин II.

Исследования по выявлению и изучению свойств е-ат к этим соединениям позволяют создать новые методы иммунохимического анализа, как для изучения механизма перечисленных выше заболеваний, так и для их диагностики.

Цель и задачи исследования.

Цель данного исследования заключается в разработке различных вариантов твердофазного иммуноферментного анализа естественных антител к пептидным биорегуляторам и белкам системы гемостаза для практического применения в клинике заболеваний сердечно-сосудистой системы и нарушения обмена веществ.

В СООТВЕТСТВИИ С ПОСТАВЛЕННОЙ ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНЫ СЛЕДУЮЩИЕ ЗАДА ЧИ: ^ осуществить получение иммунохимических реагентов для разработки иммуноферментного анализа: синтезировать антигены пептидов (брадикинина и ангиотензина II) на полимерной матрице, разработать хроматографические способы выделения белков (аг-макроглобулина и антитромбина III); разработать иммуноферментные методы определения антител к брадикинину и ангиотензину II, оценить возможность использования иммуноферментного анализа антител для данных биорегуляторов в клинике сердечно-сосудистых заболеваний и нарушения обмена веществ;

выделить с помощью аффинной хроматографии антитела к брадикинину и ангиотензину II из сыворотки крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, и исследовать их иммунохимические свойства; оптимизировать условия выявления твердофазным иммуноферментным анализом антител к тромбину и его природным ингибиторам (а2-макроглобулину и антитромбину III) в сыворотке крови людей; "Ф провести сравнительный анализ содержания специфических антител к белкам и пептидным биорегуляторам системы гемостаза в сыворотке крови доноров и

больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ для выявления взаимосвязи с биохимическими показателями этой системы и установления практической значимости разработанных вариантов иммуноферментного анализа.

Научная новизна работы. => Разработаны новые способы получения конъюгатов пептидных биорегуляторов на полимерной матрице. Синтезированы искусственные антигены брадикинина и ангиотензина П с использованием 4-полинитрофенилакрилата. => В сыворотке крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ обнаружено наличие антител к эндогенным пептидным биорегуляторам. Причём, у больных по сравнению с донорами установлено изменение уровня антител к брадикинину и ангиотензину II. => На основе проведённых исследований разработаны оригинальные методы твёрдофазного иммуноферментного анализа антител к пептидным биорегуляторам в сыворотке крови людей. Показана возможность их использования в практической медицине. => Приготовлен новым способом иммуносорбент для аффинной хроматографии; впервые из сыворотки крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями выделены антитела к брадикинину и ангиотензину II и исследованы их иммунохимические свойства.

Практическая ценность работы.

Полученные в работе результаты по созданию новых методов ИФА для выявления е-ат к белкам и пептидным биорегуляторам имеют большое значение для практического использования в медицине.

Так, проведён сравнительный анализ содержания антител к тромбину и его ингибиторам, а также к брадикинину и ангиотензину II в сыворотке крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ, в результате которого установлена взаимосвязь с биохимическими показателями, используемыми в качестве оценки состояния больного и течения этих заболеваний. Показана практическая ценность разработанныдх методов иммуноферментного анализа.

Совместно с сотрудниками Клиники лечебного питания Института питания РАМН подготовлен проект методических рекомендаций по практическому применению данных методов иммуноферментного анализа в клинике.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммуноферментный способ анализа, основанный на выявлении антител к белкам системы гемостаза (тромбину и его ингибиторам) в сыворотке крови, можно использовать в качестве контроля за состоянием организма человека в норме и при появлении патологических изменений.

2. Обнаружено наличие в сыворотке крови человека антител к пептидным биорегуляторам гемостаза (брадикинину и ангиотензину II). Выявлено изменение, по сравнению с нормой, уровня антител к этим соединениям у людей, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ. Разработаны методы анализа антител к данным эндогенным веществам.

3. Установлена взаимосвязь между содержанием антител к тромбину, антитромбину III и аг-макроглобулину в сыворотке крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ и биохимическими показателями, используемыми для характеристики течения и прогноза этих патологий в клинике. Показана практическая значимость разработанных методов иммуноферментного анализа.

Апробация работы.

Основные материалы и положения диссертационной работы доложены и утверждены:

иг- на межлабораторной конференции Института физиологически активных веществ РАН (протокол №1 от 24 апреля 1997 года);

»*- на межлабораторной конференции Московского научно-исследовательского института им. Г.Н. Габричевского (протокол №1 от 25 апреля 1998 года).

Результаты исследования также были доложены на:

иг- Международном конгрессе по аналитической химии (г. Москва, 1997 год);

иг Ш-ем Международном симпозиуме «Питание и здоровье. Б АД в профилактике и лечении наиболее распространённых заболеваний» (г. Тюмень, 1997 год).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

А1 - ангиотензин I;

АП - ангиотензин II;

АД - артериальное давление;

осг-МГ - а2-макроглобулин,

АПС - аминопропилированное стекло;

АПФ - ангиотензин-превращающий фермент;

АТ - антитела;

АТШ - антитромбин III;

БК - брадикинин;

ВМК - высокомолекулярный кининоген; ГБ - гипертоническая болезнь; ГЛП - гиперлипопротеидемия;

ДВС-синдром - синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания,

ДМФА - диметилформамид,

Е-ат - естественные антитела;

ЗФР - забуференный раствор,

ИБС - ишемическая болезнь сердца,

ИБХ РАН - Институт биоорганической химии Российской академии наук;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ИЭФ - иммуноэлектрофорез по Грабару и Уильямсу;

Ка - константа аффинности;

КА - конъюгированные антигены;

КДИ - мета-толуол-сульфанат-1 -циклогексил-2(морфолин-этил)карбодиимид; ККС - калликреин-кининовая система; КНЦ - кардиологический научный центр; ЛА - латексная агглютинация;

МГУ им. М.В. Ломоносова - Московский Государственный университет им. М.В. Ломоносова;

МИТХТ им. М.В. Ломоносова - Московский институт тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова;

МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского - Московский научно-исследовательский институт

им. Г.Н. Габричевского;

ОИМ - острый инфаркт миокарда,

ПК - прекалликреин;

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты;

РАМН - Российская академия медицинских наук;

РАН - Российская академия наук;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РАС - ренин-ангиотензиновая система;

РИД - радиальная иммунодиффузия по Мапсш;

СГК - спонтанно-гипертензивные крысы;

СМК - сополимер стирола с метакриловой кислотой;

ТР - тромбин;

ЧСА - человеческий сывороточный альбумин; РВБ - 0.01 М солевой фосфатный буфер;

- иммуноглобулин класса в; ^М - иммуноглобулин класса М.

ГЛАВА 1.

ЛИТРАТУРНЫЙ ОБЗОР

«биорегуляторы системы гемостаза»

Изучение биологической функции факторов свёртывающей системы крови, и низкомолекулярных пептидов ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем, является важной задачей в решении проблем, связанных с познанием механизма развития ряда патологий. Особое внимание в этом вопросе учёными уделяется исследованию взаимосвязи двух регуляторных систем организма: гемостаза и иммунитета.

Антитела - являются гуморальными факторами иммунной системы и обладают способностью специфически взаимодействовать с широким кругом как эндогенных, так и экзогенных соединений; по этой причине они могут выполнять функцию связующего звена между указанными регуляторными структурами.

В настоящем литературном обзоре будет рассмотрено значение ключевых белков системы свёртывания крови: тромбина и его физиологических ингибиторов (антитромбина III и а2-макроглобулина), а также пептидов ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем (ангиотензина II и брадикинина) в развитии патологии, и их взаимосвязь с гуморальными факторами иммунитета. 1.1. Белковые Факторы регуляции системы гемостаза.

Свёртывающая система крови (система гемостаза) - ферментативная система, сохраняющая циркулирующую кровь в жидком состоянии, поддерживающая целостность кровеносных сосудов и обеспечивающая остановку кровотечения путём образования фибриновых тромбов [22].

В процесс гемостаза вовлечено несколько компонентов: стенки кровеносных сосудов, форменные элементы крови, плазменная система свёртывания крови, клеточные и белковые факторы тканей организма. В настоящее время охарактеризованы практически все составляющие свёртывающей системы крови. Определена их биологическая роль в ферментативном каскаде [16].

На рисунке 1 представлена схема каскадно-комплексного механизма действия свёртывания крови.

В таблице 1 приведены основные факторы свёртывания и их некоторые свойства

Рисунок 1. Схема каскадно-комплексного механизма свёр�