Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуноферментный анализ антител к пептидным биорегуляторам и белкам системы гемостаза в норме и при патологии

ДИССЕРТАЦИЯ
Иммуноферментный анализ антител к пептидным биорегуляторам и белкам системы гемостаза в норме и при патологии - диссертация, тема по медицине
Савицкая, Юлия Анатольевна Москва 1998 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
14.00.36
 
 

Текст научной работы по медицине, диссертация 1998 года, Савицкая, Юлия Анатольевна

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ АНТИТЕЛ К ПЕПТИДНЫМ БИОРЕГУЛЯТОРАМ И БЕЛКАМ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

14.00.36. - аллергология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Научный руководитель Доктор биологических наук М.А. Мягкова

На правах рукописи

САВИЦКАЯ Юлия Анатольевна

МОСКВА- 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ_3

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ_7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ_8

«биорегуляторы системы гемостаза»

1.1. Белковые факторы регуляции системы гемостаза_8

1.1.1. Общая характеристика тромбина и его природных ингибиторов_10

1.1.2. Биологическая функция тромбина и его природных ингибиторов при развитии патологии

14

1.1.3. Методы определения тромбина, его природных ингибиторов и их использование в диагностике заболеваний __19

1.2. Пептиды ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем_20

1.2.1. Структура и физиологическая роль ангиотензина II и брадикинина_21

1.2.2. Значение пептидов ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем в норме и при развитии рада заболеваний_24

1.2.3. Методы определения пептидов: ангиотензина II и брадикинина, и возможность их применения в медицинской диагностике_31

1.3. Взаимосвязь биорегуляторов системы гемостаза_32

1.3.1. Ренин-ангиотензиновая и калликреин-кининовая системы_32

1.3 .2. Факторы системы свёртывания крови и пептидные биорегуляторы_36

1.4. Роль гуморального иммунитета в регуляции системы гомеостаза при патологии_37

1.4.1. Естественные антитела к физиологически активным соединениям и их биологическая функция__38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ_41

2.1. Материалы исследования_41

2.2. Методы исследований_42

2.3. Получение конъюгатов гаптенов на полимерном носителе_43

2.3.1. Получение конъюгата ангиотензина II_43

2.3.2. Получение конъюгата брадикинина_43

2.4. Выделение сывороточных белков из плазмы крови_43

2.4.1. Выделение антитромбина III из плазмы крови_43

2.4.2. Иммунохимический анализ чистоты антитромбина III_44

2.4.3. Выделение а2-макроглобулина из сыворотки крови_45

2.5. Получение иммуноспецифических реагентов для метода латексной агглютинации_46

2.5.1. Получение моноспецифической антисыворотки к антитромбину III_46

2.5.2. Синтез конъюгата на основе СМК-латекса__47

2.5.3. Метод латексной агглютинации_47

2.6. Разработка метода ИФА выявления естественных антител к белкам и гаптенам _._47

2.6.1. Определение рабочего разведения сыворотки и концентрации антигена_47

2.6.2. ИФА белков и пептидов в сыворотке крови человека_48

2.7. Выделение антител к брадикинину и ангиотензину П из сыворотки крови человека _49

2.7.1. Получение сорбента для аффинной хроматографии,_49

2.7.2. Выделение антител к брадикинину и ангиотензину II аффинной хроматографией__49

2.8. Определение специфичности и аффинности выделенных на аффинном сорбенте антител к брадикинину и ангиотензину П_50

2.8.1. Выбор условий проведения ингибиторного ИФА_50

2.8.2. Ингибиторный ИФА для оценки специфичности и аффинности антител к брадикинину и ангиотензину II________50

2.8.3. Определение специфичности антител к брадикинину и ангиотензину II_50

2.8.4. Расчёт константы аффинности антител _51

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ_52

3.1. Получение реагентов для проведения ИФА определения антител к белкам и пептидным биорегуляторам_52

3.1.1. Синтез конъюгированных антигенов пептидов на полимерной матрице_53

3.1.2. Выделение белковых факторов системы гемостаза: антитромбина III и а2-макроглобулина

53

3.1.3. Получение конъюгата для определения антитромбина III методом латексной агглютинации __54

3.2. Разработка ИФА определения антител к пептидным биорегуляторам системы гемостаза_56

3.2.1. Определение уровня антител к ангиотензину II и брадикинину в сыворотке крови доноров и больных__59

3.2.2. Определение уровня антител к ангиотензину II в сыворотке крови больных_62

3.2.3. Определение уровня антител к брадикинину в сыворотке крови больных_63

3.2.4. Исследование иммунохимических свойств естественных антител к пептидным биорегуляторам системы гемостаза_63

3.2.5. Практическая значимость выявления антител к пептидным биорегуляторам системы гемостаза_65

3.3. ИФА определения антител к белковым факторам системы гемостаза и его применение в клинике_71

3.3.1. Определение методом ИФА антител к антитромбину III_71

3.3 .2. Практической значимость выявления антител к антитромбину III_72

3.3.3. Определение антител методом ИФА к тромбину и его природным ингибиторам_73

3.3.4. Установление взаимосвязи между уровнем антител к белковым факторам системы гемостаза и биохимическими показателями этой системы_ 75

3.3.5. Влияние терапии на показатели системы гемостаза и гуморального иммунитета у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ_77

ВЫВОДЫ_82

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ _ _ __83

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Исследования последних лет направлены на разработку новых методов иммунохимического анализа низкомолекулярных пептидных биорегуляторов и белков, играющих важную роль в патогенезе ряда заболеваний заболеваний.

Хорошо известно, что изменения гемостаза, связанные с функционированием его основных звеньев - белковых факторов системы свёртывания крови человека: тромбина и его ингибиторов (антитромбина III и аг-макроглобулина), а также пептидных биорегуляторов калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем, имеют большое значение в патогенезе атеросклероза, ишемической болезни сердца, гипертонии, нарушении обмена веществ.

В основе сердечно-сосудистых катастроф (острый инфаркт миокарда, инсульт) лежит, как правило, тромбоз, обусловленный активацией тромбоцитов и процессов свёртывания крови.

Вот почему актуальна задача создания надёжных диагностических методов контроля, позволяющих следить за состоянием организма человека, которые можно использовать в норме и при проявлении патологических симптомов.

В нашей стране и за рубежом используются традиционные подходы для создания диагностических тест-систем, которые заключаются в разработке способов количественного определения белковых либо пептидных факторов, участвующих в механизме развития заболевания.

Однако из литературных данных, известно насколько длительно создание надёжного и простого иммунохимического метода анализа перечисленных выше соединений. Это, в первую очередь, связанно с трудоёмкостью разработки специфического анализа и высокой чувствительностью, так как эти вещества в активном состоянии существуют в организме человека в небольших концентрациях и быстро метаболизируются, что затрудняет их выявление в сыворотке крови.

С другой стороны, в настоящее время выполнены исследования, свидетельствующие о наличии в организме здорового человека иммуноглобулинов, взаимодействующих с рядом эндогенных биорегуляторов и называемых естественными антителами.

При патологических состояниях происходит изменение нормального уровня е-ат, которое, как правило, связано с нарушением метаболизма того или иного эндогенного соединения, участвующего в патогенезе заболевания.

Вот почему большой интерес представляет обнаружение и изучение роли е-ат к ряду пептидных и белковых регуляторов системы гемостаза, изменение метаболизма которых имеет место при сердечно-сосудистых заболеваниях и нарушении обмена веществ. К ним относятся, в первую очередь, тромбин и его природные ингибиторы, а также пептиды - брадикинин и ангиотензин II.

Исследования по выявлению и изучению свойств е-ат к этим соединениям позволяют создать новые методы иммунохимического анализа, как для изучения механизма перечисленных выше заболеваний, так и для их диагностики.

Цель и задачи исследования.

Цель данного исследования заключается в разработке различных вариантов твердофазного иммуноферментного анализа естественных антител к пептидным биорегуляторам и белкам системы гемостаза для практического применения в клинике заболеваний сердечно-сосудистой системы и нарушения обмена веществ.

В СООТВЕТСТВИИ С ПОСТАВЛЕННОЙ ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНЫ СЛЕДУЮЩИЕ ЗАДА ЧИ: ^ осуществить получение иммунохимических реагентов для разработки иммуноферментного анализа: синтезировать антигены пептидов (брадикинина и ангиотензина II) на полимерной матрице, разработать хроматографические способы выделения белков (аг-макроглобулина и антитромбина III); разработать иммуноферментные методы определения антител к брадикинину и ангиотензину II, оценить возможность использования иммуноферментного анализа антител для данных биорегуляторов в клинике сердечно-сосудистых заболеваний и нарушения обмена веществ;

выделить с помощью аффинной хроматографии антитела к брадикинину и ангиотензину II из сыворотки крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, и исследовать их иммунохимические свойства; оптимизировать условия выявления твердофазным иммуноферментным анализом антител к тромбину и его природным ингибиторам (а2-макроглобулину и антитромбину III) в сыворотке крови людей; "Ф провести сравнительный анализ содержания специфических антител к белкам и пептидным биорегуляторам системы гемостаза в сыворотке крови доноров и

больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ для выявления взаимосвязи с биохимическими показателями этой системы и установления практической значимости разработанных вариантов иммуноферментного анализа.

Научная новизна работы. => Разработаны новые способы получения конъюгатов пептидных биорегуляторов на полимерной матрице. Синтезированы искусственные антигены брадикинина и ангиотензина П с использованием 4-полинитрофенилакрилата. => В сыворотке крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ обнаружено наличие антител к эндогенным пептидным биорегуляторам. Причём, у больных по сравнению с донорами установлено изменение уровня антител к брадикинину и ангиотензину II. => На основе проведённых исследований разработаны оригинальные методы твёрдофазного иммуноферментного анализа антител к пептидным биорегуляторам в сыворотке крови людей. Показана возможность их использования в практической медицине. => Приготовлен новым способом иммуносорбент для аффинной хроматографии; впервые из сыворотки крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями выделены антитела к брадикинину и ангиотензину II и исследованы их иммунохимические свойства.

Практическая ценность работы.

Полученные в работе результаты по созданию новых методов ИФА для выявления е-ат к белкам и пептидным биорегуляторам имеют большое значение для практического использования в медицине.

Так, проведён сравнительный анализ содержания антител к тромбину и его ингибиторам, а также к брадикинину и ангиотензину II в сыворотке крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ, в результате которого установлена взаимосвязь с биохимическими показателями, используемыми в качестве оценки состояния больного и течения этих заболеваний. Показана практическая ценность разработанныдх методов иммуноферментного анализа.

Совместно с сотрудниками Клиники лечебного питания Института питания РАМН подготовлен проект методических рекомендаций по практическому применению данных методов иммуноферментного анализа в клинике.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммуноферментный способ анализа, основанный на выявлении антител к белкам системы гемостаза (тромбину и его ингибиторам) в сыворотке крови, можно использовать в качестве контроля за состоянием организма человека в норме и при появлении патологических изменений.

2. Обнаружено наличие в сыворотке крови человека антител к пептидным биорегуляторам гемостаза (брадикинину и ангиотензину II). Выявлено изменение, по сравнению с нормой, уровня антител к этим соединениям у людей, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ. Разработаны методы анализа антител к данным эндогенным веществам.

3. Установлена взаимосвязь между содержанием антител к тромбину, антитромбину III и аг-макроглобулину в сыворотке крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ и биохимическими показателями, используемыми для характеристики течения и прогноза этих патологий в клинике. Показана практическая значимость разработанных методов иммуноферментного анализа.

Апробация работы.

Основные материалы и положения диссертационной работы доложены и утверждены:

иг- на межлабораторной конференции Института физиологически активных веществ РАН (протокол №1 от 24 апреля 1997 года);

»*- на межлабораторной конференции Московского научно-исследовательского института им. Г.Н. Габричевского (протокол №1 от 25 апреля 1998 года).

Результаты исследования также были доложены на:

иг- Международном конгрессе по аналитической химии (г. Москва, 1997 год);

иг Ш-ем Международном симпозиуме «Питание и здоровье. Б АД в профилактике и лечении наиболее распространённых заболеваний» (г. Тюмень, 1997 год).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

А1 - ангиотензин I;

АП - ангиотензин II;

АД - артериальное давление;

осг-МГ - а2-макроглобулин,

АПС - аминопропилированное стекло;

АПФ - ангиотензин-превращающий фермент;

АТ - антитела;

АТШ - антитромбин III;

БК - брадикинин;

ВМК - высокомолекулярный кининоген; ГБ - гипертоническая болезнь; ГЛП - гиперлипопротеидемия;

ДВС-синдром - синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания,

ДМФА - диметилформамид,

Е-ат - естественные антитела;

ЗФР - забуференный раствор,

ИБС - ишемическая болезнь сердца,

ИБХ РАН - Институт биоорганической химии Российской академии наук;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ИЭФ - иммуноэлектрофорез по Грабару и Уильямсу;

Ка - константа аффинности;

КА - конъюгированные антигены;

КДИ - мета-толуол-сульфанат-1 -циклогексил-2(морфолин-этил)карбодиимид; ККС - калликреин-кининовая система; КНЦ - кардиологический научный центр; ЛА - латексная агглютинация;

МГУ им. М.В. Ломоносова - Московский Государственный университет им. М.В. Ломоносова;

МИТХТ им. М.В. Ломоносова - Московский институт тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова;

МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского - Московский научно-исследовательский институт

им. Г.Н. Габричевского;

ОИМ - острый инфаркт миокарда,

ПК - прекалликреин;

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты;

РАМН - Российская академия медицинских наук;

РАН - Российская академия наук;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РАС - ренин-ангиотензиновая система;

РИД - радиальная иммунодиффузия по Мапсш;

СГК - спонтанно-гипертензивные крысы;

СМК - сополимер стирола с метакриловой кислотой;

ТР - тромбин;

ЧСА - человеческий сывороточный альбумин; РВБ - 0.01 М солевой фосфатный буфер;

- иммуноглобулин класса в; ^М - иммуноглобулин класса М.

ГЛАВА 1.

ЛИТРАТУРНЫЙ ОБЗОР

«биорегуляторы системы гемостаза»

Изучение биологической функции факторов свёртывающей системы крови, и низкомолекулярных пептидов ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем, является важной задачей в решении проблем, связанных с познанием механизма развития ряда патологий. Особое внимание в этом вопросе учёными уделяется исследованию взаимосвязи двух регуляторных систем организма: гемостаза и иммунитета.

Антитела - являются гуморальными факторами иммунной системы и обладают способностью специфически взаимодействовать с широким кругом как эндогенных, так и экзогенных соединений; по этой причине они могут выполнять функцию связующего звена между указанными регуляторными структурами.

В настоящем литературном обзоре будет рассмотрено значение ключевых белков системы свёртывания крови: тромбина и его физиологических ингибиторов (антитромбина III и а2-макроглобулина), а также пептидов ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем (ангиотензина II и брадикинина) в развитии патологии, и их взаимосвязь с гуморальными факторами иммунитета. 1.1. Белковые Факторы регуляции системы гемостаза.

Свёртывающая система крови (система гемостаза) - ферментативная система, сохраняющая циркулирующую кровь в жидком состоянии, поддерживающая целостность кровеносных сосудов и обеспечивающая остановку кровотечения путём образования фибриновых тромбов [22].

В процесс гемостаза вовлечено несколько компонентов: стенки кровеносных сосудов, форменные элементы крови, плазменная система свёртывания крови, клеточные и белковые факторы тканей организма. В настоящее время охарактеризованы практически все составляющие свёртывающей системы крови. Определена их биологическая роль в ферментативном каскаде [16].

На рисунке 1 представлена схема каскадно-комплексного механизма действия свёртывания крови.

В таблице 1 приведены основные факторы свёртывания и их некоторые свойства

Рисунок 1. Схема каскадно-комплексного механизма свёр�