Разработка состава и стандартизация сбора, обладающего эстрогеноподобным действием

Полуэктова, Татьяна Викторовна

Диссертации по медицине → Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка состава и стандартизация сбора, обладающего эстрогеноподобным действием

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Полуэктова, Татьяна Викторовна Самара 2011 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 14.04.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка состава и стандартизация сбора, обладающего эстрогеноподобным действием

На правах рукописи

Полуэктова Татьяна Викторовна

РАЗРАБОТКА СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СБОРА, ОБЛАДАЮЩЕГО ЭСТРОГЕНОПОДОБНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 2 МАЙ 2011

Самара-2011

4846219

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России), г. Томск

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Калинюша Галина Илышична

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Мпзина Прасковья Георгиевна

доктор фармацевтических наук, профессор Кудашкина Наталья Владимировна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Иркутск

Защита состоится « 3 » июня 2011 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «</6 » Ош.-^\ЛЗ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

И.К. Пегрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время 10% всей популяции земного шара составляют женщины в климактерическом периоде, при этом их число ежегодно возрастает. Симптомы климакса и отдаленные последствия менопаузы значительно ухудшают здоровье и благополучие женщин, снижая качество их жизни. В настоящее время для купирования климактерических симптомов пациенткам широко назначается заместительная гормонотерапия. Однако существует ряд относительных и абсолютных противопоказаний к назначению гормональных препаратов [Кулаков В.А., Сметник В.П., 2001г.]. Поиск альтернативных методов лечения климактерических расстройств проводится постоянно. Одним из видов альтернативного лечения климактерических расстройств является терапия лекарственными растительными сборами и фитокомплексами на их основе.

Среди официнальных лекарственных сборов не представлены фитосредства, рекомендуемые для коррекции климактерических расстройств. Однако в официнальной и народной медицине используется ряд лекарственных растений и сборов, влияющих на отдельные симптомы климактерического периода.

Особенности патофизиологического механизма и симптоматических проявлений климактерического синдрома диктуют необходимость поиска новых фитосредств с поливалентным терапевтическим воздействием на организм.

Таким образом, создание нового многокомпонентного сбора для коррекции климактерических расстройств, его фармакогностическое и фармакологическое изучение, разработка критериев оценки качества и внедрение сбора в медицинскую практику является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось теоретическое и экспериментальное обоснование состава и разработка методик стандартизации многокомпонентного сбора, обладающего эстрогеноподобным действием.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анализ литературы по физиологии и средствам коррекции патологического течения климактерического периода.

2. Разработать состав сбора на основании данных литературы и экспериментальных исследований по эстрогенной, противовоспалительной и противомикробной активности лекарственных растений.

3. Провести исследование эстрогенной, противовоспалительной и противомикробной активности предлагаемого сбора.

4. Провести исследование химического состава предлагаемого сбора с целью выявления основных групп биологически активных веществ (БАВ) для его стандартизации.

5. Разработать методики стандартизации сбора и проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием».

Научная новизна. На основании анализа банка данных литературы и собственных фармакологических и фитохимических исследований впервые разработан состав лекарственного растительного сбора, обладающего комплексным действием на основные симптомы климактерических расстройств. Установлено, что водно-спиртовый экстракт сбора обладает эстрогенной, противовоспалительной и противомикробной активностью. Новизна предлагаемого нового фитосредства защищена патентом РФ.

Установлен качественный и количественный состав основных биологически активных веществ сбора (изофлавоноиды, кумарины, полисахариды, макро- и микроэлементы). Методами хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и ВЭЖХ идентифицированы: ононин, формононетин, генистеин, биоханин А, рутин, кверцетин, кофейная, галловая, феруловая кислоты.

Для определения подлинности сбора выявлены внешние и микроскопические признаки входящих в него ингредиентов. Разработаны критерии качества сбора по товароведческим показателям и содержанию ведущей группы БАВ - изофлавоноидов.

Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения изофлавоноидов в предлагаемом сборе методами хроматографии в тонком слое сорбента и спектрофотометрии, включенные в проект ФСП.

Практическая значимость. Теоретические и экспериментальные исследования показали целесообразность дальнейшего фармакологического исследования сбора в качестве нового фитосредства, позволяющего решить проблемы женщин при недостатке в организме эстрогенов.

Разработан проект ФСП «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием».

Получен патент на изобретение «Лекарственное средство для профилактики и лечения патологических проявлений климактерического синдрома» № 2376026 от 20.12.2009 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты теоретического и экспериментального обоснования состава

нового фитосредства «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием»;

2. Результаты исследования химического состава сбора, обладающего эстрогеноподобным действием;

3. Обоснование методик стандартизации предлагаемого сбора.

Связь задач исследования с планом научных работ. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского государственного медицинского университета в рамках комплексной темы «Изучение природных источников биологически активных веществ и получение на их основе новых лекарственных средств» (№ Государственной регистрации 0120.0 602076).

Апробация работы. Основные положения диссертации были обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006); Межрегиональной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические исследования новых лекарственных средств», посвященной памяти A.C. Саратикова (Томск, 2006); VII Межрегиональной научно-практической фармацевтической конференции «Биологически активные соединения в профилактике заболеваний и укреплении здоровья нации» (Новосибирск, 2007); 63 Всероссийской научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008); IX Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 11 статей и тезисов, отражающих основное содержание диссертации, из них 3 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ; получен 1 патент РФ на изобретение.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполняли на кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ (г. Томск), кафедрах микробиологии с курсом вирусологии и фармакологии СибГМУ (г. Томск), в ООО «БИОЛИТ», в лаборатории «Экогеогидрофизхим» филиала АО «Азимут Энерджи Сервисез» (г. Караганда, Республика Казахстан).

Объем и структура диссертационной работы. Материалы исследования изложены на 140 страницах машинописного текста. В тексте приведено 29 таблиц и 18 рисунков. Библиографический указатель включает 160 источников литературы, в том числе 30 зарубежных.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальных исследований, выводов, списка использованной литературы и приложения. Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования,

представлены научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе представлен анализ проблемы климактерия и современные методы коррекции его патологического течения, в том числе средствами растительного происхождения. Обозначена необходимость разработки комплексного фитосредства для коррекции климактерических расстройств. Во второй главе приведены сведения об объектах исследования, охарактеризованы методы и методики, использованные в работе. Третья глава посвящена теоретическому и экспериментальному обоснованию компонентного состава сбора, обладающего эстрогеноподобным действием. В четвертой главе приведены результаты исследования химического состава сбора и обоснования выбора группы БАВ для его стандартизации. Пятая глава посвящена разработке методик стандартизации предлагаемого сбора.

В приложении представлены акты внедрения результатов диссертационной работы, проект фармакопейной статья предприятия «Сбор, обладающий эстронеоподобным действием».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали серийные образцы официнального лекарственного сырья, а также сырья, собранного в естественных местах произрастания в Томской области и культивируемого в Алтайском крае. Сборы готовили в соответствии с требованиями статьи «Сборы» ГФ XI.

Для оценки перспективности выбранных объектов исследования были проведены фармакологические испытания эстрогенной, противомикробной и противовоспалительной активности.

Фармакологические исследования по вышеуказанным тестам проводили с использованием принятых для этих целей методик и моделей.

Методика определения эстрогенной (утеротропной) активности, использованная в эксперименте, сертифицирована и рекомендована

«Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». Данная методика основана на оценке изменений массы матки инфантильных крыс при введении исследуемого препарата относительно препарата сравнения.

Антигрибковые свойства сбора и его компонентов исследовали методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро по методике Вичкановой С.А. Антибактериальные свойства сбора и его компонентов определяли in vitro методом серийных разведений на мясопептонном бульоне (МПБ). Исследование противовоспалительной активности проводили на модели экссудативного воспаления при введении флогогенного агента - агара.

Исследование внешних и анатомических признаков компонентов сбора проводили в соответствии со статьями «Методы анализа лекарственного растительного сырья», «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ XI.

Готовые препараты изучали под микроскопом МИКМЕД-1 (увеличения х56; х120; х140; х280; х420; хбОО). Объекты фиксировали цифровым фотоаппаратом Canon А470. Снимки обрабатывали на компьютере в программе «Photoshop CS2».

Для идентификации и количественного определения БАВ в исследуемых объектах использовали качественные реакции, спектральные, хроматографические и другие общепринятые методы анализа.

Для хроматографического анализа, идентификации, количественного определения БАВ использовали стандартные образцы и известные вещества производства Sigma-Aldrich, Fluka.

Спектральные исследования проводили на приборе СФ-2000. Исследование фенольных соединений методом ВЭЖХ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Миллихром-А-02» в ООО «БИОЛИТ», с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы МультиХром-СПЕКТР для Windows.

Исследование элементного состава в сборе проводили атомно-эмиссионным анализом с индуктивно-связанной плазмой на спектрометре PROFILE Plus производства фирмы Teledyne Leeman Labs (США) в лаборатории «Экогеогидрофизхим» филиала АО «Азимут Энерджи Сервисез» в г. Караганда Республики Казахстан.

Валидацию методик проводили методом математической статистики по следующим показателям: прецизионность (воспроизводимость), точность и линейность.

О достоверности различий судили, используя параметрический (t-критерий Стьюдента) и непараметрический (Т-критерий Манна-Уитни) методы. Значимость различий считали достоверной при Pt, Pu < 0,05. Расчеты проводили с использованием программ STATISTICA 8.0 и SPSS 12.0.

Теоретическое и экспериментальное обоснование компонентного состава сбора

Учитывая сложность патогенеза климактерического синдрома для разрабатываемого сбора выбирали растения, корректирующие урогенитальные и психоэмоциональные проявления эстрогенодефицита, т.е. влияющие на ранние и средневременные симптомы климактерия. Этого можно достичь, используя растения, обладающие эстрогеноподобным, противовоспалительным, антибактериальным, антигрибковым и седативным действием. На основании анализа данных литературы и с учетом вышеперечисленных критериев в качестве перспективных для составления сбора нами было отобрано 8 видов лекарственного растительного сырья: корневища аира, шишки хмеля, цветки ромашки аптечной, трава (надземная часть) клевера лугового, трава хвоща полевого, трава (надземная часть) овса посевного, корневища бадана, корни солодки.

На основании фармакологических и микробиологических исследований нами было подтверждено, что экстракты выбранных растений обладают эстрогенной, противовоспалительной, противомикробной

активностью и данные виды сырья могут быть использованы для составления растительных сборов, влияющих на симптомы климактерия, связанные с дефицитом эстрогенов в организме женщин.

На основании проведенных исследований нами было предложено 2 прописи сбора, в состав которых вошли выше перечисленные виды лекарственного растительного сырья. Сбор №1 предлагается для создания лекарственного средства для наружного применения (спринцевание, тампоны, вагинальные суппозитории, кремы). В состав данного сбора, кроме травы хвоща полевого, корневищ аира болотного, шишек хмеля обыкновенного, цветков ромашки аптечной, травы клевера лугового и травы овса посевного, включены корневища бадана для усиления местного антимикробного и противовоспалительного эффекта. Сбор №2 предназначен для внутреннего применения. Корневища бадана в данном сборе могут оказывать нежелательный в климактерический период вяжущий эффект. Вместо бадана в состав сбора №2 для усиления эстрогенных свойств наиболее рационально включение корней солодки.

При определении соотношения компонентов в сборе исходили из того, что каждый из компонентов влияет на многочисленные звенья климактерического синдрома, обеспечивая в разной степени эстрогенную, антимикробную и противовоспалительную активность сбора. При этом основная цель сбора (эстрогенная активность) достигается включением травы клевера, травы овса посевного, шишек хмеля и корней солодки, составляющих около 60% сбора. Опыт создания лекарственных растительных сборов свидетельствует о том, что соотношение компонентов в многокомпонентных сборах не играет существенную роль в его фармакологическом эффекте. Это подтверждает незначительная разница (около 10%) в эффективности предлагаемых климактерических сборов в дозах 50-150 мг/кг.

Данные экспериментального исследования по эстрогенной (утеротропной) активности показали, что экстракты сборов № 1 и № 2

достоверно увеличивают массу матки крыс относительно препарата сравнения овестина, что свидетельствует о проявлении ими эстрогенной активности. Подтверждена противовоспалительная, антибактериальная и антигрибковая активность экстрактов сборов (табл. 1-4).

Таблица 1

Эстрогенная (утеротропная) активность исследуемых препаратов

Дозы, мг/кг Средняя масса матки, мг после введения препаратов, через дней введения Эстрогенная активность, % после введения препаратов, через дней введения

7 14 7 14

Экстракт сбора №1

50 0,302±0,03 0,635±0,04 88,04* 88,44*

100 0,311 ±0,04 0,670±0,05 79,53 ' 88,97*

150 0,329±0,04 0,702±0,05 72,78' 84,88*

Экстракт сбора №2

50 0,277±0,02 0,656±0,04 80,75* 91,36'

100 0,296±0,03 0,706±0,05 75,70" 93,75 '

150 0,340±0,03 0,723±0,05 75,22* 87,42'

Овестин

50 0,343±0,03 0,718±0,05 108,8" 112,18"

100 0,3 91 ±0,03 0,753±0,06 124** 117"

150 0,452±0,05 0,827±0,09 143,49" 129,21"

Интактные животные (крахмальная слизь)

0,315±0,03 0,640±0,05 - -

Примечание: количество животных в группе п=8; р < 0,05 - по отношению

к овестину; ** - по отношению к группе интактных животных

Таблица 2

Противовоспалительная активность экстрактов сборов

Препарат Прирост массы отека, %

Экстракт сбора №1 52,53 ±4,91

Экстракт сбора №2 47,19 ±4,05*

Индометацин (препарат сравнения) 42,34 ± 3,84*

Контрольные животные 78,5 ±6,51

Примечание: количество животных в группе п=8; р < 0,05 - по отношению к группе контрольных животных

Таблица 3

Антибактериальная активность экстрактов сборов

Препарат Тест - микроорганизмы и минимальная подавляющая концентрация, мкг/мл

Esherichia coli Н-304 Staphylococcus aureus Р-209 Pseudomonas aeruginosae А ТСС 9027 Proteus vulgaris

Экстракт сбора №1 62,5 62,5 250 62,5

Экстракт сбора №2 31,3-62,5 31,3-62,5 500 125

Таблица 4

Антигрибковая активность экстрактов сборов

Препарат Тест - микроорганизмы и минимальная подавляющая концентрация, мкг/мл

Trichophyton mentagrophytes Trichophyton rubrum Microsporum canis Candida albicans

Экстракт сбора №1 3,9 15,6 3,9 250

Экстракт сбора №2 15,5-31,3 62,5 15,6 н/а

Гризеофульвин 15,6-31,3 15,6-31,3 15,6-31,3 н/а

Примечание - н/а - антигрибковой активности не наблюдалось при концентрации вещества в 1000мкг/мл.

Исследование химического состава сбора

Для дальнейших исследований химического состава, разработки методик стандартизации и проекта нормативной документации выбран сбор №2, обозначенный нами как «Сбор, обладающий эстрогеноподбным действием», который предполагается использовать в наиболее простых лекарственных формах (настой, водно-спиртовый экстракт).

На основании результатов качественного и количественного определения БАВ установлено, что в климактерическом сборе присутствуют: эфирное масло (0,20%), фенольные соединения (7,05%), представленные флавоноидами (4,13%), кумаринами, фенолокислотами (2,80%), дубильными веществами (0,16%); сапонины, алкалоиды и соединения кремния (1,28%). К числу доминирующих групп БАВ в сборе

можно отнести сумму фенольных соединений, содержание которых составляет 7,05% , более 4% из них - флавоноиды. Данная группа БАВ имеет наибольшую значимость и с точки зрения обоснования фармакологического действия сбора.

К природным веществам, обладающим эстрогеноподобным действием, относятся изофлавоноиды. Эта группа БАВ, по данным литературы, характерна для компонентов предлагаемого сбора. Для анализа изофлавоноидов нами был проведен подбор систем для хроматографического исследования. Многочисленные системы растворителей, предлагаемые различными авторами, не являются избирательными, что не позволило нам достичь разделения и обнаружения изофлавоноидов в исследуемом экстракте сбора. Наилучшее разделение этой группы флавоноидов наблюдали при хроматографировании экстракта сбора на 40%-ном этаноле в 5% растворе натрия гидрокарбоната. Для детектирования использовали известные образцы изофлавоноидов: формононетин, биоханин, генистеин, ононин. Поскольку флюоресценция изофлавоноидов в УФ-свете аналогична фенолокислотам, при хроматографировании в дальнейшем использовали известные вещества кофейной, феруловой, галловой, п-оксибензойной кислот.

При детектировании фенольных соединений в УФ-свете было установлено наличие в сборе не менее 11 различных зон адсорбции. Сравнение их окраски и значений с известными веществами и данными литературы позволило с определенной степенью достоверности идентифицировать в составе сбора формононетнн (Яг около 0,12), ононин (Яг около 0,26), генистеин около 0,11). Зоны с около 0,70, 0,84, 0,85, имеющие флюоресценцию, близкую к изофлавоноидам, но не совпадающие по с известными веществами, ориентировочно отнесли к фенолокислотам. При более детальном хроматографическом исследовании было установлено присутствие в сборе кофейной, галловой, феруловой кислот (рис.1).

•,0,85 _

АI*, 0,84

11*, 0,268

^ 0,07

РМД!

М,12

0,065

2 3 4 5 6 7

•_•

9 10

Рис.1. Схема хроматограммы на бумаге этанольного экстракта сбора в сравнении с известными веществами

Обозначения: 1 - экстракт сбора на 40%-ном этиловом спирте; 2 - ононин; 3 -биоханин; 4 - генистеин; 5 - формононетин; 6 - кофейная кислота; 7 - галловая кислота; 8 - феруловая кислота; 9 - л-оксибензойная кислота; 10 - и-кумаровая кислота. Растворитель: 5% раствор натрия гидрокарбоната. Проявитель: УФ-свет, 365/254 нм.

Для уточнения качественного состава веществ фенолъной природы нами проведен сравнительный анализ этанольных экстрактов сбора и его ингредиентов методом высокоэффективой жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Обнаружение фенольных соединений в сборе проводили по времени удерживания компонентов в сравнении с известными веществами флавоноидов и фенолокислот.

При сравнении ВЭЖ-хроматограмм в составе сбора идентифицированы формононетин, биоханин, ононин, генистеин кверцетин, рутин и галловую кислоту (рис.2).

7.96 AU

Рис.2. ВЭЖ- хроматограмма экстракта сбора на 40%-ном этиловом спирте

Получение пошсахаридного комплекса (ПСК) и его фракционный анализ проводили по общепринятой методике путем последовательного фракционного выделения водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ и гемицеллюлоз А и В. Содержание полисахаридов определяли гравиметрическим методом. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Содержание и состав полисахаридного комплекса сбора

Тип полисахарида Содержание, % Качественный состав полисахаридов

Водорастворимые полисахариды (ВРПС) 7,30 ± 0,50 Glc, Gal, Ara, Rha

Пектиновые вещества (ПВ) 5,87 ± 0,23 Glc, Gal, Ara, Rha, GalUa

Гемицеллюлоза А (ГЦ А) 2,10 ±0,11 Glc, Gal, Rha

Гемицеллюлоза В (ГЦ В) 2,27 ±0,10 Glc, Gal, Xyl

Примечание: M ± m, M - среднее, m - доверительный интервал, п - 3 измерения.

Как видно из таблицы 5 в полисахаридном комплексе сбора преобладают водорастворимые полисахариды - 7,30%; также представлены пектиновые вещества - 5,87%; фракции гемицеллюлозы А и В представлены по 2%. Таким образом, сумма полисахаридного комплекса в сборе составляет 17,54%.

Исследование элементного состава сбора проведено с использованием атомно-эмиссионного анализа с индуктивно-связанной плазмой (табл.6). Установлено, что исследуемый сбор содержит не менее 30 химических элементов. Для коррекции климактерических расстройств наибольшее значение имеют такие элементы, как кальций, магний, калий, натрий, кремний, железо, селен.

Таблица 6

Результаты анализа элементного состава сбора методом атомно-эмисснонного анализа с индуктивно-связанной плазмой

Макро- и микроэлементы Содержание, мг/кг Макро- и микроэлементы Содержание, мг/кг

Алюминий А1 323,13 Олово 5п 8,23

Серебро А6 5,67 Титан Т1 <0,2

Бор В 26,60 Ванадий V <0,5

Барий Ва 2,13 Вольфрам \У <0,1

Висмут В1 <0,2 Кремний 338,97

Кадмий С<1 <0,1 Цирконий Хх <0,1

Кобальт Со <0,5 Цинк Ъп 52,16

Хром Сг 11,73 Мышьяк АБ <0,1

Медь Си 6,63 Кальций Са 4586,21

Железо Ре 145,62 Германий йе 4,67

Литий и 3,8 Калий К 61227,21

Марганец Мп 24,96 Магний м8 11865,48

Молибден Мо 1,80 Натрий N3 3227,34

Никель N1 47,90 Селен ве <0,15

Свинец РЬ 3,20 Скандий Яс <0,02

Сурьма БЬ 1,90 Фосфор Р 7895,88

Стронций 8г 37,66

Разработка методик стандартизации сбора, обладающего эстрогеноподобным действием Одним из условий внедрения нового лекарственного сбора в медицинскую практику является его стандартизация и разработка на основе полученных результатов проекта нормативной документации.

Важнейшими характеристиками подлинности сбора, наряду с методиками качественного и количественного анализа БАВ, являются внешние и микроскопические признаки. Нами разработаны характеристики

подлинности «Сбора, обладающего эстрогеноподобным действием» по внешним и микроскопическим (анатомическим) признакам его компонентов. В качестве диагностических признаков выявлены структура эпидермиса, простых и железистых волосков, устьиц, характер минеральных включений и другие (рис.3-9).

а б в

Рис.3. Фрагменты анатомического строения травы клевера лугового (х180;х240;х420): а _ простые одноклеточные волоски; б - кристаллоносная обкладка; в - розетка в месте прикрепления волоска.

а бег

Рис.4. Фрагменты анатомического строения травы овса посевного (*180;х420; ;х600): а - простые одноклеточные волоски цветковых чешуек; б - гантелеобразные устьица; в - простые одноклеточные конусовидные выросты с крючкообразной верхушкой; г - проводящие сосуды.

Рис.5. Фрагменты анатомического строения цветков ромашки аптечной (*56;х420;х600): а ~ трубчатый цветок; б эпидермис листочка обвертки; в -эфирномасличные железки.

Рис.6. Фрагменты анатомического строения шишек хмеля обыкновенного (х420): а - клетки верхнего (внутреннего) эпидермиса со складчатой кутикулой; б - простые одноклеточные волоски; в - эфирномасличные (лупулиновые) железки.

а б в

Рис.7. Фрагменты анатомического строения корневищ аира (х180;х420):

а - основная ткань с крупными межклетниками - аэренхима; б - секреторные клетки с эфирным маслом; в - центрофлоэмный пучок.

а б(вид сверху) б(вид сбоку)

Рис.8. Фрагменты анатомического строения травы хвоща полевого (х420): а - клетки эпидермиса в бороздках стебля и ветвей с сильноизвилистыми стенками и двумя рядами устьиц с лучистой складчатостью; б -клетки эпидермиса ребер стеблей и ветвей с выростами, образованными двумя короткими смежными стенками клеток (вид сверху и сбоку).

а б

Рис.9. Фрагменты анатомического строения корней солодки (х240;х420):

а- группы склеренхимных волокон с остатками кристаллоносной обкладки;

б — обрывки сосудов.

Для определения подлинности сбора разработаны условия хроматографического определения изофлавоноидов. Для проведения анализа использовали экстракт сбора на 40%-ном этиловом спирте, полученный для количественного определения суммы изофлавоноидов. Хроматографическое исследование проводили на пластинках Kieselgel F254 (Merk) в системе хлороформ-метанол (97:3) в присутствии известных веществ формононетина и ононина.

Для количественного определения суммы изофлавоноидов в исследуемом сборе предлагаем использовать метод прямого спектрофотометрического определения.

В УФ-спектре экстракта присутствуют максимумы поглощения, характерные для изофлавоноидов (ононин 258±5нм, формононетин 248±5нм, генистеин 260±5нм, биоханин 261±5нм).

Для определения содержания изофлавоноидов в сборе отрабатывали параметры экстракции. Оптимальными параметрами методики являются: измельченность сбора - 3 мм; экстрагент - 40%-ый этиловый спирт, температура водяной бани - 80°С, время экстракции - 30 минут; двукратная экстракция.

Исходя из оптической плотности полученного раствора Б, по калибровочному графику находили содержание изофлавоноидов в пересчете на ононин. Содержание суммы изофлавоноидов в пересчете на абсолютно сухой сбор в процентах вычисляли по соответствующей формуле. Расчет

изофлавоноидов также можно проводить с использованием удельного показателя поглощения ононина.

Нами проведена валидационная оценка методики прямого спектрофотометрического определения суммы изофлавоноидов по воспроизводимости, прецизионности (точности) и линейности. При этом было установлено, что она является правильной и воспроизводимой. Для стандартизации сбора предлагаем ввести в проект ФСП показатель «содержание изофлавоноидов в пересчете на ононин, не менее 1,5%».

В связи с тем, что сбор, обладающий эстрогеноподобным действием предполагается использовать в виде водно-спиртового экстракта, кроме ведущей группы веществ для стандартизации сбора предлагаем ввести показатель «содержание экстрактивных веществ, извлекаемых 40%-ным этиловым спиртом», как наиболее оптимальный экстрагент для изофлавоноидов.

Для оценки качества сбора определены его основные товароведческие показатели и микробная чистота по методикам Государственной фармакопеи XI издания.

ВЫВОДЫ

1. На основании анализа банка данных литературы и собственных исследований предложено лекарственное растительное сырье для сбора, обладающего эстрогеноподобным действием: шишки хмеля, цветки ромашки аптечной, трава хвоща полевого, трава овса посевного, трава клевера лугового, корневища аира, корни солодки, корневища бадана.

2. На основании экспериментальных данных предложены две прописи сбора, обладающего эстрогенной активностью в сочетании с противовоспалительным и антимикробным действием.

в том числе: водорастворимые полисахариды - 7,30±0,05%, пектиновые вещества - 5,87±0,23%, гемицеллюлоза А - 2,10±0,11%, гемицеллюлоза В - 2,27±0,10%; соединения кремния - 1,28±0,06%; эфирное масло -0,20±0,01%.

4. Методами хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и ВЭЖХ в составе сбора идентифицированы: флавоноиды - рутин, кверцетин; изофлавоноиды - формононетин, ононин, биоханин, генистеин; фенолокислоты - галловая, кофейная, феруловая; тритерпеновые соедининия - олеаноловая и урсоловая кислоты.

5. Разработаны методики определения подлинности сбора по внешним, микроскопическим признакам компонентов сбора и хроматографическим характеристикам изофлавоноидов.

6. Разработана методика оценки качества сбора по содержанию изофлавоноидов методом прямой спекгрофотометрии.

7. Разработаны показатели качества сбора, обладающего эстрогеноподобным действием: содержание изофлавоноидов в пересчете на ононин не менее 1,5%, экстрактивных веществ, извлекаемых 40%-ным этиловым спиртом не менее 20%; влажность не более 13 %; золы общей не более 8%; золы, нерастворимой в 10%-ном растворе кислоты хлористоводородной не более 3%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм не более 10%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,25 мм не более 5%; органической примеси не более 3%; минеральной примеси не более 2%.

8. На основании выполненных исследований разработан проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием».

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Полуэктова, Т.В. Антимикробные свойства компонентов противоклимактерического сбора / Т.В. Полуэктова, Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина, М.Т. Джумаева // Бюллетень Сибирской медицины. -Томск, 2006. - том 5. - приложение 2. - С.122-124.

2. Коломиец, Н.Э. Проблема подлинности и качества лекарственного растительного сырья, реализуемого на фармацевтическом рынке России / Н.Э. Коломиец, Е.А. Лукша, Г.И. Калинкина, В.В. Шейкин, В.Ю. Андреева, Т.В. Полуэктова // Фармация, 2009. - Т.57 - №8. - С.33-38.

3. Полуэктова, Т.В. Хроматографическое исследование изофлавоноидов климактерического сбора /Т.В. Полуэктова, Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // Химия растительного сырья, 2011. - №2. - С. 141-144.

4. Полуэктова, Т.В. Оценка противовоспалительных свойств компонентом противоклимактерического сбора / Т.В. Полуэктова, Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // Всероссийская научно-практическая конференция «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» - Томск, 2006. - С.194-196.

5. Полуэктова, Т.В. Фитотерапия климактерических расстройств / Т.В. Полуэктова, Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // Науки о человеке: материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2006. -С.136.

6. Лукша, Е.А. Проблема урологических заболеваний и основные направления их решения с помощью фитотерапии / Е.А. Лукша, Н.Э. Коломиец, Т.В. Полуэктова // Аптечное дело. - 2007. - №1. — С.36-47.

7. Дмитрук, С.Е. Фармакогностическая оценка биологически активных добавок, реализуемых на российском рынке / С.Е. Дмитрук, Г.И. Калинкина, Е.А. Лукша, Н.Э. Коломиец, Т.В. Полуэктова // УП Межрегиональная научно-практическая фармацевтическая конференция «Биологически активные соединения в профилактике заболеваний и укреплении здоровья нации», 23мая 2007. - Новосибирск, 2007. - С.11-13.

8. Полуэктова, Т.В. Количественное определение флавоноидов в многокомпонентных сборах / Т.В.Полуэктова, Е.А.Лукша, Н.Э.Коломиец, Г.И.Калинкина, Л.А.Тихонова // Сборник научных трудов Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. -Пятигорск, 2008. - вып.63. - С.319.

9. Полуэктова, Т.В. Оценка специфической активности климактерического сбора / Т.В. Полуэктова, Е.А. Лукша, Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина // «Health & education»: 8 th International congress millennium, Москва, Россия, 14-17 ноября 2008. - C.262-263.

10. Патент на изобретение «Лекарственное средство для профилактики и лечения патологический проявлений климактерического синдрома» № 2376026 от 20.12.2009г.

11. Полуэктова, Т.В. Возможности фитокоррекции климактерического синдрома / Т.В. Полуэктова, Н.Э. Коломиец // Фармация Казахстана, 2010. -№12.-С.13-15.

12. Калинкина, Г.И. Роль фармакогностического анализа в оценке качества лекарственного растительного сырья, реализуемого на фармацевтическом рынке России / Г.И. Калинкина, Н.Э. Коломиец, Т.В. Полуэктова, Е.Н. Сальникова и др. // Научно-методическая конференция «Гаммермановские чтения — 2011»: сборник научных трудов. - Спб.: Издательство СПХФА, 2011.-С.32-33.

Тираж 100 экз. Заказ 472. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. (3822) 533018.

Оглавление диссертации Полуэктова, Татьяна Викторовна :: 2011 :: Самара

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. КЛИМАКТЕРИЧЕСКИЕ РАССТРОЙСТВА И ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ИХ КОРРЕКЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Характеристика климактерических расстройств.

1.2. Лекарственные средства, применяемые для коррекции климактерических расстройств.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристика объектов исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Методы химического, хроматографического и спектрального исследования биологически активных веществ.

2.2.2. Методы морфологического и микроскопического исследования.

2.2.3. Методы товароведческого анализа.

2.2.4 Методы микробиологической и фармакологической оценки

2.3. Методы статистической обработки результатов исследований.

ГЛАВА 3. ОБОСНОВАНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА И ОЦЕНКА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СБОРА, ОБЛАДАЮЩЕГО ЭСТРОГЕНОПОДОБНЫМ ДЕСТВИЕМ.

3.1. Теоретическое обоснование компонентного состава сбора.

3.2. Экспериментальное обоснование компонентного состава сбора

3.2.1. Исследование эстрогенной (утеротропной) активности компонентов сбора.

3.2.2. Исследование противовоспалительных свойств компонентов сбора.

3.2.3. Исследование антибактериальной активности компонентов сбора.

3.2.4 Исследование антигрибковых свойств компонентов сбора.

3.3. Оценка фармакологических свойств сбора.

3.3.1. Исследование эстрогенной (утеротропной) активности.

3.3.2. Исследование противомикробной и противовоспалительной активности.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА СБОРА, ОБЛАДАЮЩЕГО ЭСТРОГЕНОПОДОБНЫМ ДЕСТВИЕМ.

4.1. Качественный и количественный анализ основных групп биологически активных веществ.

4.2. Исследование фенольных соединений.

4.3. Исследование полисахаридов.

4.4. Исследование сапонинов.

4.5. Исследование элементного состава.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК СТАНДАРТИЗАЦИИ СБОРА,

ОБЛАДАЮЩЕГО ЭСТРОГЕНОПОДОБНЫМ ДЕСТВИЕМ.

5.1. Изучение морфологических и анатомических признаков подлинности сбора.

5.2. Разработка методики количественного определения изофлавоноидов в сборе.

5.3. Определение экстрактивных веществ в сборе.

5.4. Разработка товароведческих показателей сбора.

5.5. Определение микробиологической чистоты.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Полуэктова, Татьяна Викторовна, автореферат

Актуальность темы. Во второй половине XX столетия отчетливо проявилась тенденция к увеличению продолжительности жизни населения. Согласно демографическим данным ВОЗ в XXI веке предполагается увеличение количества пожилых людей. В связи с увеличением продолжительности жизни в современном обществе растет и интерес к проблемам здоровья женщин старшей возрастной группы. В настоящее время 10% всей популяции земного шара составляют женщины в климактерическом периоде и ежегодно их число возрастает. Симптомы климакса и отдаленные последствия менопаузы значительно ухудшают здоровье и благополучие женщин, снижая качество их жизни. В настоящее время для купирования климактерических симптомов пациенткам широко назначается заместительная гормональная терапия. Однако существует ряд относительных и абсолютных противопоказаний к назначению гормональных препаратов. Поиск альтернативных методов лечения климактерических расстройств проводится постоянно. Одним из видов альтернативного лечения климактерических расстройств является терапия лекарственными растительными сборами и фитокомплексами на их основе.

Многокомпонентные лекарственные сборы давно и прочно вошли в медицину. Это объясняется эффективностью и мягкостью их действия, отсутствием, как правило, нежелательных побочных эффектов, простотой производства, низкой стоимостью при достаточно высоком уровне спроса. Среди официнальных лекарственных сборов не представлены фитосредства, рекомендуемые для коррекции климактерических расстройств. Однако в официнальной и народной медицине используется ряд лекарственных растений и сборов, влияющих на отдельные симптомы климактерического синдрома.

Особенности патофизиологического механизма и симптоматических проявлений климактерического синдрома диктуют необходимость поиска новых фитосредств с гормоноподобным (эстрогеноподобным) действием на организм.

Цель исследования. Целью диссертационной работы явилось теоретическое и экспериментальное обоснование разработки состава и методик стандартизации многокомпонентного сбора, обладающего эстрогеноподобным действием.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

4. Провести исследование химического состава предлагаемого сбора с целью выявления основных групп БАВ для его стандартизации.

Научная новизна работы. На основании анализа банка данных литературы и собственных фармакологических и фитохимических исследований впервые разработан состав лекарственного растительного сбора, обладающего комплексным действием на основные симптомы климактерических расстройств. Установлено, что водно-спиртовый экстракт сбора обладает эстрогеноподобной, противовоспалительной и противомикробной активностью. Новизна предлагаемого фитосредства защищена патентом РФ.

Установлен качественный и количественный состав основных биологически активных веществ сбора (изофлавоноиды, кумарины, полисахариды, макро- и микроэлементы, в том числе соединения кремния). Методами хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и ВЭЖХ идентифицированы: ононин, формононетин, генистеин, биоханин А, рутин, кверцетин, кофейная, галловая, феруловая кислоты.

Для определения подлинности сбора выявлены внешние и микроскопические признаки входящих в него ингредиентов. Разработаны критерии качества сбора по товароведческим показателям и содержанию ведущих действующих веществ — изофлавоноидов.

Разработан проект ФСП «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты теоретического и экспериментального обоснования состава нового фитосредства «Сбор, обладающий эстрогеноподобным действием»;

2. Результаты исследования химического состава сбора, обладающего эстрогеноподобным действием;

3. Обоснование методик стандартизации предлагаемого сбора.

Апробация работы. Основные положения диссертации были обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006); межрегиональной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические исследования новых лекарственных средств», посвященной памяти A.C. Саратикова (Томск, 2006); VII Межрегиональной научно-практической фармацевтической конференции «Биологически активные соединения в профилактике заболеваний и укреплении здоровья нации» (Новосибирск, 2007); 63 Всероссийской научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008); IX международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 11 статей и тезисов, отражающих основное содержание диссертации, из них 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, получен 1 патент РФ на изобретение.

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка состава и стандартизация сбора, обладающего эстрогеноподобным действием"

ВЫВОДЫ

1. На основании анализа банка данных литературы и собственных исследований предложено лекарственное растительное сырье для сбора, обладающего эетрогеноподобным действием: шишки хмеля, цветки ромашки аптечной, трава хвоща полевого, трава овса посевного, трава клевера лугового, корневища аира, корни солодки, корневища бадана.

3. Установлено, что основными биологически активными веществами сбора являются: фенольные соединения 7,05±0,35%: флавоноиды 4,13±0,23%, в т.ч. изофлавоноиды 1,8±0,10%, фенолокислоты 2,80±0,16%, дубильные вещества 0,16±0,01%; сапонины 2,80±0,14%; полисахариды 17,54±0,10%, в том числе: водорастворимые полисахариды — 7,30±0,05%, пектиновые вещества - 5,87±0,23%, гемицеллюлоза А - 2,10±0,11%, гемицеллюлоза В — 2,27±0,10%; соединения кремния - 1,28±0,06%; эфирное масло -0,20±0,01%.

4. Методами хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и ВЭЖХ в составе сбора идентифицированы: флавоноиды — рутин, кверцетин; изофлавоноиды — формононетин, ононин, биоханин, генистеин; фенолокислоты - галловая, кофейная, феруловая; тритерпеновые соедининия - олеаноловая и урсоловая кислоты.

6. Разработана методика оценки качества сбора по содержанию изофлавоноидов методом прямой спектрофотометрии.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Полуэктова, Татьяна Викторовна

1. Абрамченко, В.В. Профилактика и лечение нарушений обмена кальция в акушерстве, гинекологии и перинатологии / В.В. Абрамченко. — СПб.: ЭЛБИ-СПб., 2006. 240 с.

2. Александров, Ю.А. Хмелевое сырье для использования в лечебно-профилактических и лекарственных целях / Ю.А. Александров // Труды IV междунар. симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». — М., 2001. — Т.2. — С. 25-26.

3. Алексеева, М.А. Определение полифенольных соединений хмеля с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ / М.А. Алексеева, К.И. Эллер, А.П. Арзамасцев // Хим.-фарм. журн. 2004. - Т. 38. - №12. - С. 39-41.

4. Аммосов, A.C. Тритерпеноиды растений родов Glycyrrhiza L. и Meristotropis Fisch. Et Mey / A.C. Аммосов, В.И. Литвиненко // Хим.-фарм. журн. 2003. - Т. 37. - №2. - С. 31 -41.

5. Арзамасцев, А.П. Антиэстрогены: Номенклатура, свойства и фармакопейный анализ / А.П. Арзамасцев, Н.С. Воронцова // Хим.-фарм. журн. 2003. - Т. 37. - №5. - С. 33-37.

6. Арзамасцев, А.П. Основные аспекты совершенствования фармакопейного анализа / А.П. Арзамасцев, Н.П. Садчикова, В.Л. Багирова // Хим.-фарм. журн. 2000. - №5. - С. 47-49.

7. Атлас лекарственных растений России / Под общей ред. В.А. Быкова. -Москва, 2006. 345 с.

8. Бабаскин, B.C. Антигипертензивное действие суммы флавоноидов клевера лугового / B.C. Бабаскин, B.C. Добрянский, М.В. Киселевский // Фармация. 1994. - №6. - С. 54-55.

9. Бандюкова, В.А. О вероятности обнаружения флавонов, флавоноидов, изофлавоноидов в некоторых семействах высших растений / В.А. Бандюкова, Э.Т. Аванесов // Растительные ресурсы. 1973. — Т.9. -Вып.4. - С. 508-515.

10. Бандюкова, В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографирования на бумаге / В.А. Бандюкова // Растительные ресурсы. 1965. — т.1. — вып.4. - С. 591-597.

11. Бандюкова, В.А. Тонкослойная хроматография флавоноидов / В.А. Бандюкова, A.A. Шинкаренко // Химия природных соединений. 1983 . — №1. - С.20-24.

12. Бандюкова, В.А. Фенолокислоты их эфиры и гликозиды / В.А. Бандюкова // Химия природных соединений. 1983. - № 3. - С. 263-273.

13. Белов, В.И. Энциклопедический справочник медицины и здоровья / В.И. Белов, Т.Д. Рендюк, А.Н. Кондратович. Москва: Русское энциклопедическое товарищество, 2005. - 960с.

14. Беляков, К.В. Методические подходы к определению биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье спектрофотометрическим методом / К.В Беляков. М., 2004. — 186 с.

15. Берштейн, И.Я. Спектрофотометрический анализ в органической химии / И.Я. Берштейн, Ю.Я. Калинский. Л.: Химия, 1986. - 200 с.

16. Браславский, В.Б. Количественное определение суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот в почках некоторых видов Populus L. / В.Б. Браславский, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, H.A. Безрукова // Растительные ресурсы. 1991. - Вып.З. - С.130-134.

17. Вайс, Р.Ф. Фитотерапия. Руководство: пер. с нем. / Р.Ф Вайс, Ф. Д. Финтельманн. — М.: Медицина, 2004. 552 с.

18. Вихляева, Е.М. Руководство по эндокринной гинекологии / Е.М. Вихляева. М.: МИА, 2006. - 784 с.

19. Воронков, М.Г. Кремний и жизнь. Биохимия, токсикология и фармакология соединений кремния / М.Г. Воронков, Г.И. Зельчан, Э.Я. Лукевиц. Рига, 1971. - 327 с.

20. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Под ред. Е.Е.Сироткиной. Томск, 1987. - 184 с.

21. Гаммерман, А.Ф. Дикорастущие лекарственные растения СССР / А.Ф. Гаммерман, И.И. Гром. Москва: Медицина, 1976. - 286 с.

22. Гариков, А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. Методы обнаружения и оценки ошибок / А.К. Гариков. — Ленинград: Химия, 1984. — 168 с.

23. Гейсман, Т.А. Антоцианы, халконы, ауроны, флавоны и родственные им водорастворимые растительные пигменты. — в кн.: Биохимические методы анализа растений. Медицина, 1960. - С.453-519.

24. Георгиевский, В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В.П.Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук. — Новосибирск: Наука, 1990. 336 с.

25. Годованный, A.A. Хмель и его использование. Киев, 1990. — 330с.

26. Горбунова, Т.А. Лечение растениями. Рецептурный справочник / Т.А. Горбунова. Москва: Аргументы и факты, 1994. - 304 с.

27. Горохова, В.Г. Высокоэффективная жидкостная хроматография растительных фенольных соединений / В.Г. Горохова, H.A. Тюкавкина,

28. B.А. Бабкин // Четвертый всесоюзный симпозиум по фенольным соединениям: тез. докл. Ташкент: ФАН, 1982. - С. 21.

29. ГОСТ 21946-76 ГОСТ 21948-76. Хмель-сырец и хмель прессованный. Методы испытаний. — М.: «ИПК издательство стандартов», 2001. —17с.

30. Государственная фармакопея СССР. Десятое издание. - М.: Медицина, 1986.- 1078 с.

31. Государственная фармакопея СССР. Вып.1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М: Медицина, 1987. - 336 с.

32. Государственная фармакопея СССР. Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989.-400 с.

33. Государственный реестр лекарственных средств. Москва: Ремедиум, 2008.-1208 с.

34. Гринкевич, Н.И. Химический анализ лекарственных растений / Н.И. Гринкевич, Л.А. Сафронич. Москва: Высшая школа, 1983. - 176 с.

35. Гублер, Е.В. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях / Е.В. Гублер, A.A. Генкин. Л.: Медицина, 1973.- 141 с.

36. Долгова, A.A. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии /

37. A.A. Долгова, Е.Я. Ладыгина. М.: Медицина. - 1977.-255 с.

38. Дрожина, Е.В. Разработка биологически активной добавки на основе сухого экстракта травы овса посевного / Е.В. Дрожина, Н.Ю.Фролова // Человек и лекарство: тез. докл. VII Рос. нац. конгр. М., 2000. - С.569.

39. Дейнека, В.И. ВЭЖХ в исследовании флавоноидов. Определение рутина / В.И. Дейнека, A.M. Григорьев, В.М. Староверов // Хим.-фарм. журн. -2004. Т. 38. - №9. - С. 23-25.

40. Егоров, М.В. Качественный и количественный анализ сырья и препаратов солодки / М.В. Егоров, В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, В.А. Быков // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. — 2009. — №1. С. 175-180.

41. Ермакова, В.А. Фармакогностическое изучение и стандартизация сборов, брикетов, растительных порошков: Автореф. дисс. докт. фарм. наук /

42. B.А. Ермакова. Москва, 1999. - 46 с.

43. Жидкостная хроматография растительных фенольных соединений. Обращенно-фазовая хроматография фенолокислот / H.A. Тюкавкина,

44. B.Г. Горохова, В.А. Бабкин и др. // Химия древесины. 1979. — №4.1. C. 76-80.

45. Зайдиева, ЯЗ. Новые возможности лечения климактерических расстройств в постменопаузе // Южно-Российский медицинский журнал. 2003. - №2. - С.64-70.

46. Закс, A.C., О влиянии вегетотропных средств и их комбинаций с амидопирином на асептическое воспаление и сосудистую реакцию / A.C. Закс, M.JI. Суслина // Фармакол. и токсикол. 1975. - № 3. - С. 308-311.

47. Заозерская, И.Е., Оценка минеральной плотности костной ткани и факторов риска развития остеопороза у женщин в пременопаузе, проживающих в Санкт-Петербурге / Р.К. Чурсина, H.A. Гавриш // Журнал акушерства и женских болезней. 2005. - №1. - С. 103-112.

48. Запорожец, O.A. Спектрофотометрическое определение гидроксикоричной кислоты и ее производных в препаратах эхинацеи / O.A. Запорожец, Е.А. Крушинская, В.Н. Барвинченко // Хим.-фарм. журн. 2003. - Т. 37. - №12. - С. 11-13.

49. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях / М.Н. Запрометов. М., 1993. - 272с.

50. Иллюстрированный определитель растений Средней России: В 2 т. Т.1 / И.А. Губарев, К.В. Киселева, B.C. Новиков, В.Н. Тихомиров. М.: ООО «Товарищество научных изданий КМК», 2001. - 526с.

51. Ильин, В.Б. Элементный химический состав растений / В.Б.Ильин // Новосибирск: Наука, 1985. 129 с.

52. Использование хмеля в фитотерапии / O.A. Горошко, В.П. Пахомов, И.А. Самылина, И.Н. Никулина // Практическая фитотерапия. 2000. —№1.I1. С. 39-44.

53. Исследование состава шишек хмеля / O.A. Горошко, В.П. Пахомов, И.А. Самылина, И.Н. Никулина // Фармация. 2000. - №4. - С.48-50.

54. Казаков, A.JI. Химические исследования флавоноидов клевера, синтез изофлавонов и их биологическая активность.: Автореф. дисс. канд. фарм. наук / А. Л. Казаков. Ростов-на-Дону, 1973. - 26с.

55. Каминский, Л.С. Статистическая обработка лабораторных и клинических данных / Л.С. Каминский. Л.: Медицина, 1964. — 252 с.

56. Кира, Е.Ф. Бактериальный вагиноз / Е.Ф. Кира. СПб.: ООО «Нева-Люкс», 2001.-364 с.

57. Кира, Е.Ф. Заместительная гормональная терапия урогенитальных расстройств у женщин старшей возрастной группы // Проблемы репродукции, 1996. №3. - С. 44-49.

58. Кирхнер, Ю. Тонкослойная хроматография: пер. с англ.: В 2 т. Т.1 / Ю. Кирхнер. М.: Химия, 1981.-535с.

59. Климактерический синдром и методы его негормональной коррекции / И.Д. Евтушенко, С.Н. Удинцев, Е.А. Краснов, В.Ю. Серебров. Томск: «Чародей», 2006. - 128 с.

60. Клиническая гинекология. В 2 т. Т. 2 / И.В. Дуда, В л. И. Дуда, В.И. Дуда. Мн.: Выш. шк., 1999. - 379 с.

61. Клышев, Л.К. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследования) / Л.К. Клышев, В.А. Бандюкова, А.С. Алюкина. Алма-Ата: Наука, 1978. - 220 с.

62. Ковалева, Н.Г. Лечение растениями / Н.Г. Ковалева. Москва, 1971. -351 с.

63. Количественное определение суммы гидроксикоричных кислот в надземной части Echinacea purpurea (L.) Moench / В.А. Куркин, О.И. Авдеева, Е.В. Авдеева, П.Г. Мизина // Растительные ресурсы. 1998. -Т. 34., В. 2. - С.81-85.

64. Компанцева, Е.В. Идентификация и количественное определение флавоноидов в многокомпонентном лекарственном средстве кардиотонического действия / Е.В. Компанцева, А.Ю. Айрапетова // Фармация, 2000. № 1. - С.40-41.

65. Корсун, В.Ф., Корсун E.B. Энциклопедия фитотерапии. Травы жизни профессора Корсуна / В.Ф. Корсун, Е.В. Корсун. М.: ЗАО Центрполиграф, 2007. - 443 с.

66. Корсун, В.Ф. Лекарственные растения при сердечно-сосудистых заболеваниях / В.Ф. Корсун, A.A. Ройзман, Т.В. Чуйко. Минск, 2003. -179 с.

67. Кочетков, Н.К. Методы химии углеводов / Н.К. Кочетков. Москва: Химия, 1967.-512 с.

68. Крупникова, Т.А. Количественное определение оксикоричных кислот в листьях кукурузы / Т.А. Крупникова, Л.И. Драник, В.Н. Давыдова // Растительные ресурсы. 1971. - вып.З. - С. 449-452.

69. Крымская, М.Л. Климактерический период. М.: Медицина, 1989. -272с.

70. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов. Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ», 2004. - 1180с.

71. Куркин, В.А. Фенилпропаноиды — перспективные природные биологически активные соединения / В.А. Куркин. — Самара, 1996. 80с.

72. Лавренов, В.К. Полная энциклопедия лекарственных растений / В.К. Лавренов, Г.В. Лавренова. М.: Олма-Пресс, 1999. - Т.2. - 388 с.

73. Лекарственные растения СССР и их применение / Под ред. А.Д. Туровой. М.: Медицина, 1974. - 424 с. .

74. Ли, Шичень Китайские целебные травы. Классический труд по фармакологии / Пер. с англ. Л.А. Игоревского. М.: Центрполиграф, 2004.-370 с.

75. Мазур, H.A. Старческий возраст и особенности фармакотерапии сердечно-сосудистых заболеваний. // Русский медицинский журнал. — 1996. Т. 4, - № 8. - С. 480-486.

76. Марченко, Л.Г. Лекарственные растительные сборы / Л.Г.Марченко, Л.В. Пастушенков, Д.Н.Синев. СПб., 1991. - 135 с.

77. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: В 2-х т. Т.1 / М.Д.

78. Машковский. 14-е изд. - М.: ООО «Издательство Новая Волна»: Издатель С.Б. Дивов, 2002. - 540 с.

79. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: В 2-х т. Т.2 / М.Д. Машковский. 14-е изд. - М.: ООО «Издательство Новая Волна»: Издатель С.Б. Дивов, 2002. — 608 с.

80. Медик, В.А. Руководство по статистике в медицине и биологии: В 2-х т./ В.А. Медик, М.В. Токмачев, Б.Б. Фишман / Под ред. проф. Ю.М. Комарова. Т.1. Теоретическая статистика. -М.: Медицина, 2000. — 412 с.

81. Методы исследования углеводов: Пер. с англ. В.А. Несмеянова / Под. ред. проф. Харлина. М.: Мир, 1975. - 445 с.

82. Механизмы формирования различных зависимостей доза-эффект для эстрогенов / П.В. Сергеев, Т.В. Ухина, К.Г. Гуревич, Н.Л. Шимановский // Хим.-фарм. журн. 2001. - Т. 35. - №9. - С. 6-7.

83. Мышляева, Л.В Аналитическая химия кремния / Л.В. Мышляева, В.В. Краснощеков. Москва: Медицина, 1972. - 273 с.

84. Неоперативная гинекология: Руководство для врачей. 3-е изд., стер. /

85. B.П. Сметник, Л.Г. Тумилович. М.: Медицинское информационное агентство, 2002. — 591 с.

86. Никитин, А.И. Фитоэстрогены (лекция) // Проблемы репродукции. — 2000. Т.6, - №3. — С. 13-20.

87. Ноздрюхина, Л.Р. Нарушение микроэлементного обмена и пути его коррекции / Л.Р. Ноздрюхина, Н.И. Гринкевич. Москва: Наука, 1980. — 280 с.

88. Обольский, Д.М. Цимицифуга кистевидная: химический состав, фармакологические свойства и применение в медицине / Д.М. Обольский, Т.А. Сокольская, A.A. Денисов // Фармация. — 2007. — №1. —1. C. 52-56.

89. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньшикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. М.: Фирма "Слово", 2006. - 554 с.

90. Определение суммы фенольных соединений в шишках хмеля / O.A. Горошко, В.П. Пахомов, И.А. Самылина, И.Н. Никулина // Материалы итоговой научной работы Института клинической фармакологии за 2000г. М., 2001. - С.24-25.

91. ОСТ 91500.05.001-00. Отраслевой стандарт. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. — М., 2000г. — 36 с.

92. Патология климактерия: Руководство для врачей / Под ред. JT.B. Аккер. — М.: ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство», 2010.-440 с.

93. Печенникова, Е.В. О биологическом значении микроэлементов (обзор зарубежной литературы) / Е.В. Печенникова, В.В. Вашкова, Е.А. Можаев // Гигиена и санитария. 1997. - № 4. - С. 41 - 43.

94. Полная энциклопедия народной медицины: В 2-х т. Т.2 / Москва: Олмапресс, 1998. 466 с.

95. Прокопенко, Ю.П. Применение препарата «Овестин» при сексуальных проблемах у женщин в менопаузальном периоде / Ю.П. Прокопенко // Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов. — 1997. №3. -С. 61-63.

96. Радзинский, В.Е. Лекарственные растения в акушерстве и гинекологии: Справочник /В.Е. Радзинский, Е.Т. Михайленко, К.А. Захаров / Под ред. В.Е. Радзинского. 6-е изд., перераб. и доп. — М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2005. - 320 с.

97. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т. 3. Семейства

98. Fabaceae Asteraceae / Отв. ред: A.JI. Буданцев. - СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2010. - 601 с.

99. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейство Asteraceae (Compositae). — СПб.: Наука; 1993;-352 с.

100. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения; их химический» состав, использование; Семейства Hydrangeaceae Haloragaceae. — Л.: Наука, 1987. -326 с.

101. Руководство по климактерию: Руководство для врачей / Под ред. В.И. Кулакова, В.П. Сметник. М.: Медицинское информационное агентство, 2001.-685 с.

102. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. член-корр. РАМН проф. Р.У. Хабриева. 2-е изд., перераб: и доп. - М.: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. - 832 с.

103. Руководство по эндокринологической гинекологии / Под ред. Е.М. Вихляевой. М.: МИА, 1997. 601с.

104. Сампиев, A.M. Количественное определение флавоноидов, изофлавоноидов и фенолкарбоновых кислот в траве стальника / A.M. Сампиев, Н* А. Давитавян // Хим;-фарм. журн. 2009. - Т. 43; - №7. - С. 25-31.

105. ЮЗ.Самылина, И.А. Пути использования лекарственного растительного сырья и его стандартизация / И.А. Самылина, И.А. Баландина // Фармация. 2004. - №2. - С. 39-41.

106. Самылина, И.А. Лекарственные растения Государственной фармакопеи / И.А. Самылина, В.А. Северцева, ч.1, 2., М., 2003. 534 с.

107. Сергеев, П.В. Рецепторы / П.В. Сергеев, Н.Л. Шимановский, В.И. Петров. М., 1999. - 614 с.

108. Сметник, В.П. Селективные модуляторы эстрогенных рецепторов: альтернатива заместительной гормонотерапии / В.П. Сметник, С.Н. Карелина, Т.Е. Самойлова // Акушерство и гинекология. — 2001. №3. — С.10-12.

109. Сорокин, В.В. Разработка состава системы экстрагентов для экстрагирования биологических активных веществ клевера лугового / В. В. Сорокин // Фармация из века в век: сб. науч. трудов. СПб, 2008. -ч.2. - С.129-132.

110. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. -М.: АстраФармСервис, 2010. 1728 с.

111. Стыскин, Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Е. Л. Стыскин, Л. Б. Ициксон, Е. В. Браудэ. М.: Химия, 1986.-288 с.

112. Турищев, С.Н. Лекарственные растения в профилактике старения / С.Н. Турищев // Фармация. 2003. - №6 . - С. 44-45.

113. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. — М.: Медицина, 2002. 656 с.

114. Фармакотерапия с основами фитотерапии: В 2-х т. Т.2 / под ред. Л.В. Пастушенко и др.. СПб, 1995. - 250 с.

115. Федеральный реестр БАД к пище. Москва, 2002. - 531 с.

116. Федосеева, Г.М. Способ определения фенольных соединений / Г.М. Федосеева // Тезисы докладов конференции изобретателей и рационализаторов. Иркутск, 1980. - С. 84-85.

117. Фенилпропаноиды лекарственных растений / В.А. Куркин, Г.Г. За-песочная., Е.В. Авдеева, В.Н. Ежков. Самара: ООО «Офорт»; ГОУВПО «СамГМУ», 2005. - 128 с.

118. Флора Сибири. Lycopodiaceae Hydrocharitaceae: В 14 т. T.l / Сост. И.Л. Кашина, И.М. Красноборов, Д.Н. Шауло и др. — Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1988. — 200 с.

119. Флора Сибири. Poaceae (Gramineae): В 14 т. Т.2 / Сост. Г.А. Пешкова, О.Д. Никифорова, М.Н. Ломоносова и др. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1990.-361 с.

120. Флора Сибири. Araceae Orchidaceae: В 14 т. Т.4 / Сост. Н.В. Власова,

121. B.М. Доронькин, Н.И. Золотухин и др. Новосибирск: Наука, 1987. -347 с.

122. Флора Сибири. Salicaceae Amaranthaceae: В 14 т. Т.5 / Сост. М.Н. Ломоносова, Н.М. Большаков, И.М. Красноборов и др. - Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1992.-312 с.

123. Флора Сибири. Berberidaceae Grossulariaceae: В 14 т. Т.7 / Сост. Г.А. Пешкова, Л.И. Малышев, О.Д. Никифорова и др. - Новосибирск: ВО «Наука». Сибирская издательская фирма, 1994. - 312 с.

124. Флора Сибири. Fabaceae (Leguminosae): В 14 т. Т.9 / Сост. A.B. Положий,

125. C.Н. Выдрина, В.И. Курбатский, О.Д. Никифорова и др. Новосибирск: ВО «Наука». Сибирская издательская фирма, 1994. - 280 с.

126. Флора Сибири. Asteraceae (Compositae): В 14 т. Т.13 / Сост. И.М. Красноборов, М.Н. Ломоносова, H.H. Тупицына и др. Новосибирск: Наука. Сиб. предприятие РАН, 1997. - 472 с.

127. Флора Сибири. Дополнения и исправления. Алфавитные указатели: В 14 т. Т. 14 / Сост. В.М. Доронькин, A.B. Положий, В.И. Курбатский и др. -Новосибирск: Наука, 2003. — 188 с.

128. Хроматография. Практическое приложение метода: В 2-х частях / Под ред. Э. Хефтмана. М.: Мир, 1986. - ч. 2. - 422 с.

129. Шасс, Е.Ю. Фитотерапия / Е.Ю. Шасс. М.: Медицина, 1952. - 217 с.

130. Шалашвили, К.Г. Флавоноиды растений рода Trifolium L. флоры Грузии: Автореф. дисс. канд.хим.наук / К.Г. Шалашвили // Тбилиси, 1986. —28с.

131. Шталь, Э. И. Хроматография в тонком слое / Э.И. Шталь. Москва: Мир, 1965.-481 с.'

132. Agnusdei, D. SERM's, a novel option to maintain health in the postmenopause / D. Agnusdei, J. Compston // M. Dutitz, 2000. Vol.16. -P.21.

133. Arin, M.J. High-performance liquid chromatography combined with ultraviolet and mass spectrometric detection / M.J. Ann, M.T. Diez, J.A. Resines // J. Chromatogr. 1995. - A 849(2): - P. 341-348.

134. Assessment report on Avena sativa L., herba Avena sativa L., fructus. — European Medicines Agency, 2008. — 21 p.

135. Avenanthramides in oats {Avena sativa L.) and structure-antioxidant activity relationships / K. Bratt, K. Sunnerheim, S. Bryngelsson et al. // J. Agric. Food Chem. 2003. - Vol.51. - №3. - P. 594-600.

136. Corletto, F. Female climacteric osteoporosis therapy with titrated horsetail (Equisetum arvense) extract plus calcium (osteosil calcium): randomized double blind study / Corletto, F. // Miner.Ortoped.Traumatol. 1999. — Vol.50.-P. 201-206.

137. Efficacy and tolerability of the Black cohosh (Actea racemosa) ethanolic extract BNO 1055 on climacteric complaints. / W. Wuttke, K. Raus, C. Gorkow // Maturitas. 2006. - Vol.55. - Suppl. 1. - P. 583-591.

138. Effects of cimicifuga racemosa on estrogen-dependent tissues / W. Wuttke, H. Jerry, D. Seidlovawuttke // Maturitas. 2000. - Vol.35. - Suppl. 1. - P. 34.

139. Effects of dietary red clover on blood factors and cardiovascular fatty streak formation in hypercholesterolemic rabbits / S. Asgaiy, J. Moshtaghian, G. Naderi et al. // Phytotherapy research. 2007. - Vol.21. - P. 768-770.

140. Effects of phytoestrogens derived from red clover on atherogenic adhesion molecules in human endothelial cells / T. Simoncini, S. Garibaldi, X. D. Fu et al. // Menopause. 2008. - Vol.15. - P. 542-550.

141. Effects of the flavonoid biochanin A on gene expression in primary human hepatocytes and human intestinal cells / Y. J. Moon, S. Zhang, D. A. Brazeau, M. E. Morris // Molecular nutrition & food research. 2007. - Vol.51. - P. 317-323.

142. Fessenden, R.J. The biological properties of silicon compounds / R.J. Fessenden, JS. Fessenden // Adv. Drug. Res. 1987. - №4. - P. 95-132.

143. Geller, S. E. Botanical and Dietary Supplements for Menopausal Symptoms / S. E. Geller // Journal Womens Health (Larchmt). 2005. - Vol.14. - P. 634649.

144. Geller, S. E. Soy and red clover for mid-life and aging / S. E. Geller, L. Studee // Climacteric. 2006. - Vol.9. - P 245-263.

145. Henderson, V.W. Hormone Therapy and the Brain. A Clinical Perspective on the Role of Estrogen / V.W. Henderson. New York; London. 1999. -P. 14-21.

146. Kuiper, G.G. The estrogen receptor beta subtype: a novel mediator of estrogen action in neuroendocrine systems. / G.G. Kuiper, P.J. Shughrue, I. Merchentaler et al. // Front Neuroendocrinol., 1998. Vol.19. - P. 253-286.

147. Kuiper, G.G. Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors alpha and beta. / G.G. Kuiper, B. Carlsson, K. Grandien et al. //Endocrinology, 1997. 138(3): - P. 863-870.

148. Mabry, T.J. The systematic identification of flavonoids / T.J. Mabry, K.R. Markham, M.B. Thomas. New York-Heidelberg-Berlin. - 1970. - 354 p.

149. Mclntyre, A. The Complete Woman's Herbal / A. Mclntyre // Henry Holt Co., New York. 1999. - 139 p.

150. Markham, K.R. Analysis and identification of flavonoids in practice / K.R. Markham, S.J. Bloor // In: Flavonoids in health and disease. — 1998. P. 1-34.

151. Metabolites of dietary (Soya) isoflavones in human urine / G.F. Kelly, C. Nelson, M.A. Waring et al. // Clin. Chem. Acta. 1993; 223: 9-22;

152. Mizobuchi, S. A new flavanone with antifungal activity isolated from hops / S. Mizobuchi, Y. Sato // Agric. Biol. Chem. 1984. - Vol.48. - P.2771-2775.

153. Moon, Y.J. Pharmacokinetics and bioavailability of the bioflavonoid biochanin A: effects of quercetin and EGCG on biochanin A disposition in rats / Y. J. Moon, M. E. Morris // Molecular pharmaceutics. 2007. - Vol.4. -P. 865-872.

154. Pharmacokinetics of isoflavones, daidzein and genistein, after ingestion of soy beverage compared with soy extract capsules in postmenopausal Thai women / A. Ekasin, T. Supanimit et al. // BMC Clinical Pharmacology. 2005. -Vol.5.-P. 234-238.

155. Radak, T.L. Caloric Restriction and Calcium's Effect on Bone Metabolism and Body Composition in Overweight and Obese Pre-Menopausal Women // Nutrition Reviews. 2004 - Vol.62. - Iss.12. - P. 468-481.

156. Revoux, R. Ovestin vaginal cream and suppositories for treatment of menopausal vaginal atrophy / R. Revoux, W.H.M. Van der Velden, D. Popovic // Reproduction. 1982. - Vol.6. - P. 101-106.

157. Seasonal variation of red clover (Trifolium pratense L., Fabaceae) isoflavones and estrogenic activity / В L. Nancy, O. R. Cassia, P. Yao et al. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2006. - Vol.54. - P. 1277-1282.

158. The Flavonoids: Advances in Research / J.B. Harborne, T.J. Mabry. -London: New York: Champan and Hall. 1982. - 744 p.

159. The Specific Role of Isoflavones on Estrogen Metabolism in Premenopausal Women / B.K. Nagi, A. Cantor, K. Allen et. al. // Cancer. 2002. - Vol. 94(4).-P. 1166-1174.