Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И РАСТИТЕЛЬНЫХ СБОРОВ МЕТОДАМИ ИОНО-ЭКСКЛЮЗИОННОЙ И ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

На правах рукописи

КУЗЬМЕНКО АЛЕКСЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И РАСТИТЕЛЬНЫХ СБОРОВ МЕТОДАМИ ИОНО-ЭКСКЛЮЗИОННОЙ И ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

1 5 НОЯ 2012

Москва 2012

005054926

005054926

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения РФ

Научный консультант:

доктор фармацевтических наук, профессор Решетняк Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор кафедры органической химии МГУ имени М.ВЛомоносова, заслуженный деятель науки РФ Зык Николай Васильевич

Доктор фармацевтических наук, профессор кафедры обшей и биоорганической химии МГМСУ Берлянд Александр Семенович

Первый заместитель директора ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Россельхозакадемии, доктор фармацевтических наук, профессор Сокольская Татьяна Александровна

Ведущая организация:

ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ.

Защита диссертации состоится «_» января 2013 г. в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук, профессор

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Фитотерапия и фитопрофилактика сегодня все шире и прочнее внедряются в медицинскую практику. Целесообразно применение лекарственных растений при первичной профилактике ряда заболеваний, поддерживающей или курсовой терапии. В настоящее время ассортимент лекарственных средств растительного происхождения, применяемых в отечественном здравоохранении, составляет более 40%. Не противопоставляя препараты, созданные на основе химического синтеза, лекарственным средствам, созданным на основе лекарственных растений, отметим, что последние обладают в ряде случаев менее выраженными побочными эффектами, обладая, однако несомненной эффективностью. Практикующие врачи должны иметь базовую информацию о современной научной трактовке традиционных подходов к лечению лекарственными растениями для определения их места в комплексном лечении. Это делает проблему изучения химического состава растений чрезвычайно важной и современные хроматографические методы здесь незаменимы. Выявление биологически активных соединений, присутствующих в том или ином лекарственном растении (или группе растений), помогает решению данной задачи, а также позволяет прогнозировать взаимосочетаемость и взаимодополняемость лекарственных растений для составления многокомпонентных сборов. В ГФ XI включены 83 статьи на лекарственное растительное сырье. Одним из обязательных разделов при определении подлинности лекарственного растительного сырья является раздел «Качественные реакции», который в настоящее время включает как собственно качественные и гистохимические реакции, так и проведение хроматографического анализа. Однако качественные реакции не позволяют с уверенностью говорить об идентификации сырья, а лишь о присутствии в сырье определенной группы или ряда групп биологически активных веществ, часто не специфических для данного вида сырья. Только хроматографическая методика анализа с использованием стандартных образцов и стандартных хроматограмм позволяет уверенно говорить об идентификации сырья. Однако при изучении методик анализа, включенных в 1080 нормативных документов (НД) на лекарственные средства, которые наиболее часто применяются в практике фармацевтического анализа, установлено, что только в 5% НД упоминается метод газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). В то же время, в связи с подготовкой нового издания отечественной фармакопеи разработан проект общей фармакопейной статьи (ОФС) «Газовая хроматография». Недостаточность развития данного метода в приложении к качественному и количественному анализу лекарственных растений очевидна. Высокая селективность, чувствительность и экспрессность данного метода позволяют эффективно использовать его для стандартизации лекарственного растительного сырья и сборов на его основе, при этом выявляются возможные фальсификации. Особое значение имеет здесь поиск высокоспецифичных веществ-маркеров, присущих конкретным видам растительного сырья, определение минимального порога содержания данного вида сырья в растительных сборах, при котором данное вещество-маркер идентифицируется, скрининг видов растительного сырья на предмет большей или меньшей специфичности химических веществ, входящих в состав данного вида сырья. В то же время для ряда видов лекарственного сырья стандартизация с помощью этого хроматографического метода недостаточно эффективна из-за отсутствия специфичных веществ-маркеров. В таком случае дополняющим хроматографическим методом может выступать ионо-эксклюзионная хроматография (ИЭХ). Данный хроматографический метод также недостаточно широко внедрен в фармацевтическую практику. Подбор хроматографических условий, скрининг растительного сырья на предмет содержания достаточно специфичного набора карбоновых кислот - актуальные задачи для совершенствования применения данного метода для контроля качества лекарственного растительного сырья. В конечном итоге, эти два

хроматографических метода могут выступать как взаимодополняющие при решении задачи стандартизации лекарственного растительного сырья и многокомпонентных сборов на его основе.

Цель и задачи исследований

Цель данного исследования - разработка новых подходов к стандартизации лекарственного растительного сырья и сборов на его основе с помощью двух взаимодополняющих хроматографических методов - газо-жидкостной и ионо-эксклюзионной хроматографии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

изучить современное состояние хроматографических методов, внедренных в фармацевтическую практику в приложении к стандартизации лекарственного растительного сырья и сборов на его основе, степень применяемости данных методов в действующей документации;

❖ провести скрининг применяющихся видов лекарственного растительного сырья на предмет наличия специфических веществ-маркеров, которые бы позволили эффективно стандартизовать данное сырье методом газо-жидкостной хроматографии с целью контроля качества данного сырья и выявления фальсификаций;

среди найденных веществ-маркеров выявить как высокоспецифичные, присущие лишь данному виду растительного сырья, так и не обладающие особой специфичностью.

❖ предложена схема стандартизации растительного сырья с использованием цельного «хроматографического образа».

❖ для растений, в составе которых найдены высокоспецифичные вещества-маркеры, определить минимальный порог содержания данного вида сырья в растительных сборах, при котором данное вещество-маркер идентифицируется.

•> в тех случаях, где стандартизация методом газо-жидкостной хроматографии недостаточно эффективна, предложить метод ионо-эксклюзионной хроматографии в качестве дополняющего метода.

♦> провести скрининг применяющихся видов лекарственного растительного сырья на предмет наличия специфических карбоновых кислот, подобрать хроматографические условия для эффективного определения данных кислот.

•> выявить виды лекарственного растительного сырья и многокомпонентных растительных сборов, для которых два данных хроматографических метода могут являться взаимодополняющими.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

В работе впервые предложена методология стандартизации лекарственного растительного сырья и многокомпонентных растительных сборов с использованием двух взаимодополняющих хроматографических методов - газо-жидкостной и ионо-эксклюзионной хроматографии. Проведен широкий скрининг видов лекарственного растительного сырья на предмет содержания высокоспецифических веществ-маркеров. В результате экспериментальных исследований отобрано 19 видов лекарственных растений. При этом для ряда растений, обладающих весьма специфическими веществами, установлено минимальное содержание данного сырья в лекарственных сборах, при котором возможна стандартизация данным методом. Подобраны хроматографические условия. Показано, что даже очень малая концентрация таких веществ в составе растения не является помехой для их идентификации методом газо-жидкостной хроматографии. В то же время для некоторых растений, в составе которых не обнаружено содержания высокоспецифических веществ,

предложена их стандартизация с использованием «хроматографического образа», основой которого является ряд «реперных» соединений. При этом соотношение содержания данных соединений обычно остается постоянным для разных партий сырья.

Для ряда растений изучена степень извлечения веществ-маркеров в зависимости от растворителя, на основе которого приготовлен экстракт.

Предложен алгоритм отбора лекарственных растительных сборов, для стандартизации которых метод ГЖХ может быть весьма эффективным. В качестве модельных отобрано 10 сборов, для них всесторонне обсуждены хроматографические условия, позволяющие проводить качественный и количественный анализ данных сборов, а также гарантировать их подлинность. Указаны виды сырья, наиболее успешно стандартизуемые по своему качественному и количественному содержанию в данных сборах. Изучена степень перехода веществ-маркеров из растительного сырья в состав сборов, на основании этих данных проведена классификация данных веществ по степени их пригодности для идентификации конкретных видов сырья в растительных сборах.

Выявлен ряд растений, стандартизация которых более успешно проводится методом ионо-эксклюзионной хроматографии по содержанию в них ряда карбоновых кислот. Особенно рекомендованы для стандартизации данным методом лекарственные растения, имеющие в своем составе такие специфические кислоты, как аскорбиновая, яблочная, янтарная, фумаровая и изовалериановая. Подробно изучены хроматографические условия для данного вида анализа.

Практическая значимость работы

Разработаны и оптимизированы газохроматографические методики для качественного и количественного определения биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье и сборах на его основе. Ряд высокоспецифических веществ-маркеров предложен в качестве эталонных для стандартизации конкретных видов растительного сырья.

Экспериментально показана возможность стандартизации с использованием цельного «хроматографического образа» тех видов лекарственного растительного сырья, в которых содержится более или менее широкий набор неспецифических веществ. Это значительно расширяет спектр растительного сырья, пригодного для стандартизации методом газожидкостной хроматографии.

Разработаны и оптимизированы методики стандартизации лекарственного растительного сырья с использованием ионо-эксклюзионной хроматографии.

Предложен алгоритм для выбора одного из двух предложенных хроматографических методов, учитывающий компонентный состав растительных сборов.

Положения, выносимые на защит}'

❖ Обоснование выбора специфических веществ-маркеров при газохроматографическом анализе лекарственного растительного сырья.

❖ Для ряда лекарственных растений, имеющих в своем составе высокоспецифические вещества-маркеры, установлено минимальное содержание данного вида растительного сырья в лекарственных сборах, при котором возможна стандартизация по этому виду сырья.

❖ Экспериментальное обоснование возможности стандартизации лекарственного сырья, имеющего в своем составе набор неспецифических веществ, с использованием цельного «хроматографического образа».

❖ Для ряда растений показана степень извлечения веществ-маркеров в зависимости от растворителя, на основе которого приготовлен экстракт.

❖ Обсуждается степень перехода веществ-маркеров из растительного сырья в состав многокомпонентных растительных сборов. Информативность этих данных использована при стандартизации сборов на примере 10 лекарственных растительных сборов.

♦> Обоснование возможности применения метода ионо-эксклюзионной хроматографии в качестве дополняющего метода для тех лекарственных растений, стандартизация которых методом газо-жидкостной хроматографии недостаточно эффективна.

Показано, что среди карбоновых кислот, определяемых данным методом, есть особо специфичные, а именно: аскорбиновая, яблочная, янтарная, фумаровая и изовапериановая, и наличие этих кислот в составе растения особенно значимо при стандартизации.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на IX, X, XVI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2002, 2003, 2009), Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002), Третьем международном симпозиуме «Separations in Bio Sciences» (Москва, 2003), IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2007), VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке: концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации» (Ташкент, 2009).

Связь задач исследований с проблемным планом научно-исследовательских работ

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры общей химии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М.Сеченова «Оценка качества и сертификация лекарственных препаратов лекарственного растительного сырья и продуктов его переработки» (Номер государственной регистрации 01970007164).

Личное участие автора

Наибольшая часть исследований выполнена лично автором диссертационной работы. Во всех работах, выполненных с соавторами, автору принадлежит постановка задачи, обоснование использования основных методов, анализ полученных результатов, непосредственное участие во всех проведенных исследованиях.

Публикации по теме работы

Основное содержание работы отражено в 33 научных публикациях, в том числе в 14 статьях в журналах, входящих в перечень ВАК ведущих рецензируемых научных журналов; опубликована монография.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав теоретических и экспериментальных исследований и выводов. Диссертация изложена на 315 страницах машинописного текста, содержит 76 рисунков и 40 таблиц. Указатель литературы включает 313 источников, в том числе 256 - на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлось лекарственное растительное сырье и многокомпонентные растительные сборы разных серий и разных производителей, реализуемые в аптечной сети.

При использовании метода газо-жидкостной хроматографии использвался газовый хроматограф 6890N, снабженный автосемплером и квадрупольным масс-спектрометрическим детектором с ионизацией электронным ударом 5973N (Agilent Technologies, США).

Разделение проводили на капиллярной колонке HP-5-MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм (Agilent Technologies, США).

Регистрацию хроматограмм проводили с помощью персонального компьютера и программного пакета ChemStation (Agilent Technologies, США). Для идентификации соединений по масс-спектрам электронного удара использовали библиотеку масс-спектров N1ST 2005®.

Для центрифугирования образцов применяли центрифугу Elmi СМ-50 (Латвия).

Для отбора точной аликвоты использовали автоматические дозаторы объемом 10-100 мкл, 20-200 мкл и 100-1000 мкл с пределом допускаемой погрешности измерения не более ± 5% (LABMATE, Польша).

При использовании метода ионо-эксклюзионной хроматографии применялись жидкостные хроматографы «Цвет-3006» с кондуктометрическим детектором и «Kontron-430А» со спектрофотометрическим детектором.

При проведении исследований использовались реактивы категории не ниже аналитической, приобретенные у ведущих химических фирм (Sigma, Aldrich, Merck).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с вычислением среднего квадратичного отклонения, стандартной ошибки, доверительного интервала. При оценке степени достоверности различий средних данных использовали критерий Стьюдента.

1. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ МЕТОДОМ ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1.1 Изучение степени извлечения веществ-маркеров в зависимости от типа

растворителя

Характерные химические вещества, выступающие в роли маркеров для конкретных видов лекарственного растительного сырья, часто содержатся в растениях в весьма небольших концентрациях, поэтому чрезвычайно важно выбрать подходящий растворитель, на основе которого будут готовиться растительные экстракты для газохроматографического анализа. Извлечение должно быть по возможности максимальным.

Мы исследовали два типа растворителя - этиловый спирт и ацетонитрил и провели измерения для четырёх видов растений: багульника болотного, эвкалипта прутьевидного, девясила высокого и аниса обыкновенного. Относительное содержание ледола и палюстрола для экстрактов багульника болотного на основе ацетонитрила и этилового спирта представлено на рис. 1 и 2.

Багульник болотный Ledum palustre являет собой пример растения с присущими ему весьма специфическими соединениями. Это, прежде всего, производное азулена ледол, получивший свое название от латинского наименования данного растения, а также его изомер палюстрол. Относительное содержание ледола и палюстрола в экстракте на основе ацетонитрила составляет, соответственно, 10,69+0,53 % и 12,52±0,56 % (рис. 1)

1

■

ш

1 й ; ;

Рис. 1. Относительное содержание ледола (1) и палюстрола (2) в экстракте сырья багульника болотного на основе ацетонитрила

Типичная хроматограмма экстракта сырья на основе ацетонитрила Ledum palustre представлена на рис.3 А.

.------------------НИВ--------------------------Данные соединения перешли в состав

растительного сбора «Грудной сбор №4» (ОАО «Красногорсклексредства»; ромашки цветков 20%, календулы цветков 20%, багульника побегов 20%, фиалки травы 20%, солодки корней 15%, мяты перечной листьев 5%), при этом относительное содержание данных веществ в составе сбора, вычисленное методом внутренней нормализации, составило 3,54±0,21% и 3,74±0,19% для ледола и палюстрола соответственно. Таким образом, эти вещества с успехом выполняют роль соединений-маркеров для данного вида растения. С целью проверки селективности определения мы исследовали экстракт сырья данного растения на основе этилового спирта, т. к. обычно вещества с наибольшим содержанием регистрируются методом газожидкостной хроматографии в составе экстрактов на основе обоих этих растворителей. Типичная хроматограмма сырья на основе этилового спирта Ledum palustre представлена на рис.3 В. Как видно из рисунка, эти два основных вещества, наряду с п-мента-1(7),8-диен-2-олом, присутствуют в составе экстрактов на основе обоих растворителей. Относительное содержание ледола и палюстрола составляет в экстракте на основе этилового спирта 0,46±0,02 % и 0,52±0,02 % (рис. 2). Относительное содержание п-мента-1(7),8-диен-2-ола составляет соответственно 2,21 ±0,1% и 0,27±0,01% для экстрактов на основе ацетонитрила и этилового спирта.

Эвкалипт прутьевидный Eucalyptus globulus представляет собой эфиромасличное растение с необычайно богатым набором летучих веществ, большинство из которых не являются специфическими именно для данного вида растения, поэтому для него особенно полезно провести анализ сравнения экстрактов на основе двух растворителей с целью выявить наиболее характерные вещества. При сравнении соединений, идентифицированных в обоих типах экстрактов, обращает на себя внимание наличие в достаточно

больших концентрациях в составе экстракта на основе ацетонитрила а-пинена (1,88±0,06%), эвкалиптола (4,70±0,19%), а-терпинеола

(0,64±0,02%), кариофиллена

(0,80±0,04%) и глобулола (2,37±0,12%). Также был найден типичный для эвкалипта фелландрен (0,59±0,02%).

В целом, из-за наличия очень большого числа веществ, ни одно из которых не является типичным лишь для данного вида сырья, эвкалипт прутьевидный может быть идентифицирован с использованием Рис. 2. Относительное содержание ледола (1) и палюстрола цельного «хроматографического

(2) в экстракте сырья багульника болотного на основе образа» этилового спирта.

Типичные хроматограммы экстрактов сырья эвкалипта прутьевидного на основе ацетонитрнла и этилового спирта представлены на рис. 4 и 5. Обращает на себя внимание достаточно низкая селективность определения при использовании в качестве растворителя этилового спирта. Принимая во внимание весьма богатый набор летучих веществ, присущих данному виду лекарственных растений, следует признать данный растворитель не удовлетворяющим требованиям селективности и чувствительности метода. Данные по двум другим видам лекарственного сырья - Inula helenium и Anisum vulgare - подтверждают этот вывод: наиболее приемлемым растворителем для стандартизации методом газо-жидкостной хроматографии является ацетонитрил.

1.2 Поиск веществ-маркеров

Был проведен широкий скрининг видов лекарственного растительного сырья на предмет наличия характерных веществ-маркеров. Исследовалось более 40 видов лекарственных растений, из них было отобрано 19 видов, для которых метод газожидкостной хроматографии является наиболее приемлемым с точки зрения селективности и воспроизводимости. Данными видами лекарственного сырья являлись следующие: Ledum palustre, Eucalyptus globulus, Inula helenium, Anisum vulgare, Origanum vulgare, Valeriana officinalis, Tanacetum vulgaris, Mentha piperita, Melissa officinalis, Thymus vulgaris, Leonurus quinquelobatus, Juniperus communis, Matricaria chamomilla. Calendula officinalis, Acorus calamus, Achillea millefolium. Salvia officinalis, Carum can'i, Meliolotus officinalis.

Методом газо-жидкостной хроматографии исследовались два образца сырья душицы обыкновенной Origanum vulgare. Типичные хроматограммы сырья серий 81010 и 80114 (ОАО «Красногорсклексредства») представлены на рис.6. Обращает на себя внимание хорошая воспроизводимость таких веществ-маркеров, как p-фелландрен (площади пиков 5,32% и 3,43% для образцов серий 81010 и 80114 соответственно), п-цимен (2,50% и 0,45%), р-оцимен (1,31% и 0,48%), бурбонен (2,32% и 0,57%), кариофиллен (6,04% и 1,84%), гермакрен Д (6,37% и 1,58%) и спатуленол (8,04% и 2,78%). При этом наблюдается высокая степень корреляции отношения площадей пиков, т.е. относительного содержания данных веществ в двух разных сериях этого сырья (см. табл.1). Относительное содержание коррелируется для всех семи веществ, причем если сравнивать соседние пики, то для Р-оцимена, бурбонена, кариофиллена, гермакрена Д и спатуленола наблюдается очень близкое отношение площадей пиков. Это означает, что профили хроматограмм совпадают с высокой степенью точности и позволяют стандартизовать данное сырье методом газожидкостной хроматографии.

На рис.7 представлены хроматограммы для двух серий сырья валерианы лекарственной Valeriana officinalis, полученные для разных хроматографических условий. В качестве веществ-маркеров выступают, прежде всего, изовалериановая кислота — высокоспецифичное вещество для данного вида сырья и борнеолацетат. Изовалериановая кислота является весьма надежным маркером для присутствия валерианы лекарственной в сборах (см. рис. 15, 16). В этом отношении характерна также хроматограмма для «Седативного сбора №2» ОАО «Красногорсклексредства») (трава пустырника 40%, шишки хмеля 20%, трава мяты 15%, корневища валерианы 15%, корневища солодки 10%). Несмотря на небольшое содержание валерианы (15%), изовалериановая кислота идентифицируется на хроматограмме.

зэо

палюстрол

п-мента-1 (7),8-диен-2-ол

53.759

70.405

0025.0030.0035.004О.С

В

п-мента-1 (7),8-диен-2-ол

ЗО -І 5.00 20.00 25.00 ЗО.ОО 35.00 40-00 45.00 50.

Рис.3. Типичные хроматограммы экстракта на основе ацетонитрила (А) и этилового спирта (В) сырья багульника болотного. Газовый хроматограф Agilent Technologies 6850 Series II с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973 Network. Градиент температуры - 35°С 3 мин, 35-220°С по 5°/мин, 220°С - 10 мин, 220-240°С по 2°/мин, 240°С - 5 мин, 35°С - 5 мин. Температура детектора - 200°С

Рис.4. Типичная хроматограмма экстракта на основе ацетонитрила сырья эвкалипта прутьевидного. Хроматографические условия как для рис.3.

Рис.5. Типичная хроматограмма экстракта на основе этилового спирта сырья эвкалипта прутьевидного. Хроматографические условия как для рис.3.

При изучении сырья пижмы обыкновенной Tanacetum vulgaris обращает на себя внимание наличие большого числа летучих веществ, что однако не мешает селективному определению некоторых веществ-маркеров, прежде всего З-туйен-2-она, который является для пижмы специфическим маркером (рис.8). Эвкалиптол и камфора всегда присутствуют в составе пижмы обыкновенной согласно литературным данным, однако не являются специфичными веществами для данного растения, так, в частности, данные вещества присутствуют в составе таких растений, как эвкалипт прутовидный, тысячелистник обыкновенный и шалфей лекарственный.

Сырье мяты перечной Mentha piperita часто входит в состав различных растительных сборов. Обращает на себя внимание присутствие весьма специфичных для мяты веществ -ментола, ментона, пиперитона и пулегона, которые переходят в состав растительных сборов даже при невысоком содержании сырья мяты. В нашем исследовании это подтверждает анализ лекарственных растительных сборов «Грудной сбор №4», «Сбор мочегонный», «Седативный сбор №2», «Желудочный сбор №3», «Фитогепатол №3», «Желчегонный сбор №2», особенно первых двух сборов, где содержание мяты перечной составляет 5 и 10% соответственно. Тем не менее, при анализе обоих этих сборов идентифицируется ментол (см. рис. 19), что объясняется наиболее высоким содержанием именно ментола в ряду вышеперечисленных производных циклогексена и циклогексана, характерных для сырья мяты перечной. Относительное содержание ментола составляет 4,29+0,21 %, в то время как для ментона, пиперитона и пулегона относительное содержание составляет 2,60±0,10%, 1,21 ±0,06% и 1,35±0,06% соответственно.

Ромашка аптечная Matricaria chamomilla относится к растениям, имеющим в своем составе высокоспецифичные маркеры, находящиеся в достаточном количестве в составе растения и переходящие в состав многих растительных сборов. Это, прежде всего, а-бисаболол, бисаболола оксиды, ß-фарнезен, а также уникальное для данного вида растения вещество - (22)-2(гекса-2,4-диин-1-илиден)-1,6-диоксаспиро[4,4]нон-3-ен. Данное вещество было идентифицировано нами при анализе сборов «Фитогепатол №3» (ОАО «Красногорсклексредства» - ромашки цветков 23%, мяты перечной листьев 23%, ноготков цветков 23%, тысячелистника травы 23%, пижмы цветков 8%) и «Грудной сбор №4» (ОАО «Красногорсклексредства» - ромашки цветков 20%, календулы цветков 20%, багульника побегов 20%, фиалки травы 20%, солодки корней 15%, мяты перечной листьев 5%) - см. рис. 17. В данном случае играет роль сочетание двух факторов - высокая концентрация (2Z)-2(гекса-2,4-диин-1-илиден)-1,6-диоксаспиро[4,4]нон-3-ена в сырье и большое содержание (20% и 23%) данного вида сырья в сборах. Типичная хроматограмма сырья данного лекарственного растения представлена на рис. 9.

Календула лекарственная Calendula officinalis - еще один вид лекарственных растений, имеющих в своем составе весьма специфичные маркеры. Типичная хроматограмма данного вида сырья представлена на рис. 10.

Наиболее характерны для данного растения производные нафталина - для данной серии сырья это а-аморфен, а-кадинол и 5-кадинен. Д-Кадинен использовался нами при стандартизации растительных сборов «Фитогепатол №3» и «Мочегонный сбор» (ОАО «Красногорсклексредства»), для второго сбора использовался также а-кадинол (см. рис. 17 и 19).

Также к видам сырья, обладающим ярко выраженными маркерами, относится сырье аира болотного Acorus calamus. Наиболее характерными веществами здесь являются ß-элемен (относительное содержание 0,17±0,01%), шиобунон (0,16+0,01%), метилизоэвгенол (1,96±0,10%), азарон (27,03±1,08%) и азариловый альдегид (по литературным данным, обеспечивает запах данного сырья - 0,97±0,05%). Обращает на себя внимание весьма большое содержание азарона. Также можно отметить присутствие 1,2-диметокси-4-(2-метокси-1-пропенил)бензола (3,82±0,19%) и элимицина (1,03±0,03%). Все эти вещества перешли из состава сырья в состав лекарственного сбора «Желудочный сбор №3» (ОАО «Красногорсклексредства») (крушины коры 30%, крапивы листьев 30%, мяты перечной

листьев 20%, валерианы корней и корневищ 10%, аира корневищ 10%). Таким образом, сырье данного вида растения является легко стандартизуемым методом газо-жидкостной хроматографии ввиду большого набора специфических соединений.

Таблица 1. Корреляция отношения площадей пиков веществ- маркеров для двух серий сырья душицы обыкновенной.

Соединение Площадь пика для серии 81010 Отношение площадей пиков Площадь пика для серии 80114 Отношение площадей пиков

(3-фелландрен 5,32 2,13 3.43 7,62

п-цимен 2,50 1,91 0,45 0,94

р-оцимен 1,31 0,56 0,48 0,84

Бурбонен 2,32 0.38 0,57 0.31

кариофиллен 6,04 0.95 1,84 1,16

гермакрен Д 6,37 0,79 1.58 0,57

спатуленол 8,04 2,78

Рис.6. Типичные хроматограммы экстракта сырья душицы обыкновенной двух разных серий.

TIC: 06.D\data.n

4000(X°-

3500000-

3000000-

2500000

2СЮОООО

1500000

1oooooo

500000

изовалериановая

кислота^ борнеолацетат спатуленол

25.12Є28.176

33.708 26.339 І 29-903 І

І 2іЗО-144 27.8С30.477

ÜJ ü!

Abundance

2000000 1800000 1ЄООООО 1400000 1200000 1OOOOOO 800000 ЄООООО 400000 200000

спатуленол изовалериановая кислота / борнеолацетат

~ПС: OO.DNdata.ms 33.27Т

31.312

3537. Обі

В

34з^37.854

32 -.34.98іТ\, ----

п Iäl*®*

^оЗЭ.41.600

ЮІОО 15.00 20.00 25. ОО ЗО.ОО 35.00 40.00 45.00 50І00 55.00 ЄО.ОО

Рис.7. Типичные хроматограммы экстракта сырья валерианы лекарственной (ОАО «Красногорсклексредства» серия 141210 - А; серия 161417 - В).

А: газовый хроматограф Agilent Technologies 6850 Series II с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973 Network. Условия хроматографирования: колонка Agilent Technologies HP-5MS длиной 30м и внутренним диаметром 0,25 мм, температура колонки 30-240°С. Скорость подъема температуры 5°/мин; конечный изотермический участок 10 мин. Температура испарителя 200°С. Температура инжектора 30°С; скорость газа-носителя (гелий) - 1 мл/мин.

В: газовый хроматограф Agilent Technologies 6850 Series II с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973 Network. Градиент температуры - 35°С 3 мин, 35-220°С по 5°/мин, 220°С - 10 мин, 220-240°С по 2°/мин, 240°С - 5 мин, 35°С - 5 мин. Температура детектора - 200°С.

Abu ndance

Рис.8. Типичные хроматограммы экстракта сырья пижмы обыкновенной (ОАО «Красногорсклексредства» серия 152527 - А: серия 174568 - В). А: газовый хроматограф Agilenl Technologies 6850 Series II с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973 Network. Градиент температуры - 35°С 3 мин, 35-220°С по 5°/мин, 220°С - 10 мин, 220-240°С по 2°/мин, 240°С - 5 мин, 35°С - 5 мин. Температура детектора - 200°С

В: Условия хроматографирования: колонка Agilent Technologies HP-5MS длиной 30м и внутренним диаметром 0,25 мм, температура колонки 30-240°С. Скорость подъема температуры 5°/мин; конечный изотермический участок 10 мин. Температура испарителя 200°С.

Рис.9. Типичная хроматограмма экстракта сырья ромашки аптечной. Хроматографические условия как для рис.3.

Акэигтс! гипсе

Рис.10. Типичная хроматограмма экстракта сырья календулы лекарственной. Хроматографические условия как для рис.6.

2. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ СБОРОВ МЕТОДОМ ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

2.1 Применение высокоспецифичных веществ-маркеров для стандартизации лекарственных растительных сборов

Состав седативного сбора «Фитоседан 3» (ОАО «Красногорсклексредства») следующий: пустырника травы 25%, душицы травы 25%, чабреца травы 25%, валерианы корневищ с корнями 17%, донника травы 8%.

Для сырья донника обыкновенного Meliolotus officinalis L. наиболее характерными веществами оказываются кумарин и гидрокумарин (рис. 11).

При небольшом числе определяемых веществ концентрация кумарина оказывается весьма значительной, что позволяет использовать это вещество в качестве маркера (см. рис.15 и 16) даже при таком небольшом содержании донника в сборе, как 8%.

Тимьян обыкновенный Thymus vulgaris L. является растением, весьма богатым летучими соединениями, и мы провели сравнительный анализ экстрактов сырья тимьяна на основе ацетонитрила (рис. 12) и этилового спирта (рис. 13). Для тимьяна наиболее характерным соединением считается тимол, получивший и свое наименование от латинского названия растения, однако данное соединение не всегда достаточно селективно определялось в наших условиях.

Рис. 11. Типичная хроматограмма экстракта сырья донника.

Газовый хроматограф Agilent Technologies 6850 Series И с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973 Network. Условия хроматографирования: колонка Agilent Technologies HP-5MS длиной 30м и внутренним диаметром 0.25 мм. температура колонки 30-240°С. Скорость подъема температуры 5°/мин; конечный изотермический уча - 1 мл/мин.

Сравнительный анализ хроматограмм, представленных на рис. 12 и 13, показывает, что при использовании в качестве экстрагента ацетонитрила мы получаем хорошее разделение таких характерных веществ, как 3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ол и линалоол (3,7-диметил-1,6-октадиен-3-ол), которые предлагаются нами в качестве наиболее характерных маркеров, и, в то же время, наблюдаем селективное разделение ряда других веществ.

Присутствие тимола в других видах сырья в достаточном количестве нечасто (встречается также в душице). Изомером тимола является карвакрол, именно это вещество было обнаружено при анализе сборов «Фитоседан 3» (время удерживания 22,24 мин) и «Успокоительный сбор №3» (см. рис. 33 и 34). Рис. 14 показывает наличие тимола (время удерживания 23,18 мин) в другом образце сырья тимьяна при других хроматографических условиях. Наряду с тимолом определяются и 3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ол и линалоол.

Обсуждая состав экстракта на основе ацетонитрила (рис. 12), отметим, что содержание 3,7-диметил-2,6-окгадиен-1-ола многократно превышает содержание прочих веществ, в том числе линалоола. 3,7-Диметил-2,6-октадиен-1-ол в большом количестве находим и в составе экстракта на основе этилового спирта (рис.13). Оба эти вещества мы обнаружили при анализе седативного сбора «Фитоседан 3» (ОАО Красногорсклексредства) (рис. 15), при этом определение линалоола отличается наибольшей воспроизводимостью. Из двух возможных маркеров- 3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ола и линалоола предпочтительным является второй. Карвакрол и его изомер тимол также могут выступать в качестве характерных веществ-маркеров.

Из состава пустырника пятилопастного Leonurus quinquelobatus в качестве вещества-маркера переходит гексагидрофарнезилацетон - изомер фитона.

Душица обыкновенная Origanum vulgare L. относится к растениям с богатым составом летучих соединений, однако в состав сбора перешел лишь ß-оцимен (изомер октатриена). Это связано, прежде всего, с небольшим количественным содержанием характерных веществ-маркеров в составе сырья.

Рис.12. Типичная хроматограмма экстракта сырья тимьяна обыкновенного на основе ацетонитрила. Хроматографические условия как для рис. 11.

Рис.13. Типичная хроматограмма экстракта сырья тимьяна обыкновенного на основе этилового спирта.

Хроматографические условия как для рис.11.

Аналогичный «Фитоседану 3» состав имеет растительный сбор «Успокоительный сбор №3» (ЗАО Фирма «Здоровье»), Типичная хроматограмма данного сбора представлена на рис. 16.

Изовалериановая кислота (время удерживания 14,28 мин) является маркером валерианы лекарственной Valeriana officinalis (рис. 15, 16). Также мы видим присутствие линалоола и карвакрола (маркеры тимьяна обыкновенного), кумарина и гидрокумарина (маркеры донника лекарственного), гексагидрофарнезилацетона (маркер для пустырника). Профили хроматограмм на рис. 15 и 16 в целом сходны, особенно обращают на себя внимание большие пики линалоола и карвакрола.

Состав лекарственного растительного сбора «Фитогепатол №3» (Желчегонный сбор №3, ОАО «Красногорсклексредства») следующий: ромашки цветков 23%, мяты перечной листьев 23%, ноготков цветков 23%, тысячелистника травы 23%, пижмы цветков 8%. Хроматографические условия при анализе данного сбора были такими же, как для седативного сбора «Фитоседан 3» (ОАО «Красногорсклексредства»), Типичная хроматограмма для данного сбора представлена на рис.17.

Из маркеров, характерных для ромашки аптечной Matricaria cliamomilla, можно указать на p-арнезен, гермакрен, бисаболол оксид В. бисаболол оксид А и особенно (2Z)-2(reKca-2,4-диин-1-илиден)-1,6-диоксаспиро[4,4]нон-3-ен. Структурная формула данного вещества представлена на рис.18. Данное вещество является спироциклическим полипном, при этом транс-изомер встречается лишь в цветках ромашки аптечной, т. е. это - специфический маркер для данного растения.

Abundance

"TIC: 06.D\data.ms

линалоол

21 .Э-+3

1700000 1600000 іsooooo:

1400000І 13000001200000-11ooooo-

1OOOOOOt ЭООООО

sooooo:

700000І

600000:

SOOOOO;

400000

300000

200000:

1 OOOOO:

3.7-диметил-2,6-октадиен-1-ол

28 457

І і

зо. 1 оє

' ; 1 65

15.ЭОЗ-Н " і і ill I

| | 1 Э:5223.48S| 29.262^

40.Э59

40.050

1 O.OO 15.00 20.00 25. OO ЗО.ОО 35.OO 40.00 45. ОС

Рис.14. Типичная хроматограмма экстракта сырья тимьяна обыкновенного на основе ацетонитрила для других

(по сравнению с рис.12) хроматографических условий: температура колонки: начальный изотермический участок 35°С-5 мин, 35-100°С, со скоростью подъема температуры 2°С/мин, 100-200°С, со скоростью подъема температуры 5°С/мин, 200-250°С, со скоростью подъема температуры 10°С/мин и конечным изотермическим участком 15 мин. Температура испарителя 200°С. Температура инжектора 300°С. Температура источника ионов 250°С. Скорость газа-носителя (гелия) - 1 мл/мин.

Пижма обыкновенная Tanacetum vulgaris является лекарственным растением с богатым набором летучих веществ, при этом ряд идентифицированных веществ (эвкалиптол, камфора, карвакрол) не являются специфическими для данного растения. Для пижмы в качестве маркеров можно предложить, прежде всего, производные туйона, в частности, 3-туйен-2-он. Однако данное вещество не перешло в состав сбора из-за малого содержания сырья пижмы в сборе (8%).

о

Рис.15. Типичная хроматограмма экстракта растительного сбора «Фитоседан 3» (ОАО «Красногорсклексредства»). Хроматографические условия как для рис.6.

~ГЮ: 02.DNdata.ms

изовалериаповая

Гексапщрофариезнл ацетон, несслскплшо, 25,65 25.51 мин

Кумарин. 27,05 мин

Рис. 16. Типичная хроматограмма экстракта растительного сбора «Успокоительный сбор №3» (ЗАО Фирма «Здоровье»). Хроматографические условия как для рис.6.

8500000-; 8000000

7000000; 6500000; 6000000-; 5500000:

sooooooj

4500000; 4000000

ззооооо зоооооо

Р" фарнезен, время удерживания 19,07 мин

Бисаболол оксид А

(2г)-2(гекса-2.4-диин-1 -илиден)-1.6-зиоксаспиро[4,4]нон-3-ен

Бисаболол

Рис.17. Типичная хроматограмма экстракта растительного сбора «Фитогепатол №3» (Желчегонный сбор №3, ОАО «Красногорсклексредства»: ромашки цветков 23%, мяты перечной листьев 23%, ноготков цветков 23%, тысячелистника травы 23%, пижмы цветков 8%). Хроматографические условия как для рис.6

В состав практически любого сбора, содержащего в своем составе мяту перечную

Mentha piperita, переходят характерные для этого растения маркеры - ментол, ментон,

иногда пиперитон и пулегон, причем данные

весьма характерные маркеры будут

присутствовать в составе сбора даже при

содержании сырья мяты не более 5%. В

частности, при анализе седативного сбора №2

(состав сбора: трава пустырника 40%, шишки

хмеля 20%, трава мяты 15%, корневища

валерианы 15%, корневища солодки 10%)

наиболее характерными маркерами выступают

именно вещества, присущие сырью мяты.

п , 0 _ , . . Состав «Мочегонного сбора» (ОАО

Рис.18. Структурная формула (2Z)-2(reKca-2,4- ч

диин-1-илиден)-1,6-диоксасг7иро[4,4]нон-3-ена «Красногорсклексредства») следующий:

толокнянки листьев 40%, ноготков цветков '.

укропа плодов ¿0%, элеутерококка корневищ и корней и мяты перечной листьев по 10%. Ранее нами предлагался способ стандартизации сырья толокнянки обыкновенной методом ионо-эксклюзионной хроматографии по содержанию флавоноидов [7 в Публикациях по теме диссертации]. При совместном содержании данного сырья в составе сборов возможна стандартизация методом газо-жидкостной хроматографии. Основным веществом-маркером, переходящим из состава данного сырья в состав мочегонного сбора является гидрохинон.

Веществами, присущими укропу огородному Anethum graveolens L., являются лимонен и карвон. Сырье укропа богато летучими соединениями, однако при данном составе сбора именно эти два вещества могут выступать в качестве маркеров, концентрация данных веществ максимальна.

Для календулы лекарственной Calendula officinalis, как уже упоминалось, характерными маркерами выступают бициклические сесквитерпены кадинанового типа: у- и 5-кадинены, бициклосесквифелландрен и третичный сесквитерпеновый спирт а-кадинол, при этом 8-кадинен заявляется нами как маркер Calendula officinalis и для лекарственного сбора «Фитогепатол №3» (ОАО «Красногорсклексредства»).

dance

Рис. 19. Типичная хроматограмма экстракта растительного сбора «Сбор мочегонный» (толокнянки листьев 40%, ноготков цветков 20%, укропа плодов 20%. элеутерококка корневищ и корней и мяты перечной листьев по 10%). Хроматографические условия как для рис.6

Несмотря на небольшое содержание (10%) сырья мяты перечной в данном сборе, характерные для этого растения вещества (ментол и ментон) присутствуют в летучей фракции сбора. Эти же вещества выступают в качестве маркеров для двух желчегонных сборов: «Фитогепатол №3» и «Желчегонный сбор №2» (ОАО «Красногорсклексредства). Содержание сырья мяты перечной в них 23% и 20% соответственно.

Типичная хроматограмма экстракта растительного сбора «Сбор мочегонный» представлена на рис.19.

2.2 Алгоритм выбора хроматографического метода

В ходе изучения более 40 видов лекарственного растительного сырья методом ГЖХ нами с определенностью было установлено, что все вещества-маркеры можно разделить на три группы - уникальные, специфические и неспецифические. Уникальные вещества-маркеры идентифицируются, как правило, лишь в одном виде лекарственных растений, по

крайней мере, из тех, что используются в медицинской практике. Специфические маркеры можно найти в незначительном числе растений, и, наконец, вещества, относящиеся к неспецифическим маркерам, характерны для многих растений, обнаруживаются часто, и по одному лишь из них никогда нельзя судить о подлинности сырья.

К первой группе относится небольшое число химических веществ, прежде всего это (22)-2(гекса-2,4-диин-1-илиден)-1,6-диоксаспиро[4,4]нон-3-ен (ромашка аптечная), кумарин и гидрокумарин (донник лекарственный), изовалериановая кислота (валериана лекарственная), бициклические сесквитерпены кадинанового типа (календула лекарственная). Ко второй группе мы можем отнести ледол и палюстрол (багульник болотный), ментол и родственные ему вещества (мята перечная), Р-элемен, шиобунон, азарон и азариловый альдегид (аир болотный), анетол (анис обыкновенный), гераниол ацетат и Р-цитраль (мелисса лекарственная), 3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ол, линалоол и тимол (тимьян обыкновенный), производные фурана (ягодное сырье растений из семейства брусничные УассМасеае). Третья группа веществ наиболее многочисленна, в нее входят в основном терпены и терпеноиды, хотя есть и весьма часто встречающиеся вещества, относящиеся к другим классам (фитол, гексагидрофарензил ацетон, сквален и др.). К числу терпенов и терпеноидов относятся такие вещества как эвкалиптол, пинен, терпинеол, кариофиллен, фелландрен, спатуленол, гермакрен и многие другие.

ушпсальные вешества-маркеры

неспецнфцчес кие вешества-маокеоы

1,6-диоксасппро[4.4]нон-3-ен,2-(2,4-гексаднвпн1гадден)

кумарин,гпдрокумарпн

изовалериановая кислота

бициклические сесквитерпены кадинанового типа

спецпфпчес кие вешества-маркеры

■ ментол,ментон, пулегон, шшеритон 1 ледол,палюстрол

■ 3,7-димепт-2.6-октадпен-1 -ол п линалоол

а- пинен, эвкалиптол, а- терпинеол, фелландрен

Р - фелландрен . п- цимен, р -оцимен, кариофиллен, гермакрен Д .

спатуленол

эвкалиптол, камфора

Рис. 20. Пример классификации веществ-маркеров для дальнейшего выбора хроматографического метода

Необходимо отметить, что классификация обнаруженных в данном виде растительного сырья химических веществ (см. рис. 20) является первостепенной задачей при стандартизации и позволяет сделать вывод о том, можно ли ограничиться методом ГЖХ, или необходимо использовать ИЭХ в качестве дополняющего хроматографического метода.

При стандартизации сырья, в составе которого находятся уникальные вещества-маркеры, установлено, что данные вещества практически всегда позволяют установить подлинность сырья вне зависимости от того, в больших или малых концентрациях данные вещества присутствуют в составе растения. Сама высокая специфичность данных веществ

гарантирует их идентификацию на хроматограмме. Пример лекарственного растения с высоким содержанием маркера - ромашка аптечная, в составе которой концентрация (27.)-2(гекса-2,4-диин-1-илиден)-1,6-диоксаспиро[4,4]нон-3-ена варьируется от 3,35% до 4,43%. В то же время, пример лекарственного растения с невысоким содержанием маркеров -календула лекарственная, в составе которой содержание бициклических сесквитерпенов кадинанового типа варьируется от 0,56% до 5,75%, т. е. одни из этих веществ находятся в составе растения в малых концентрациях, а другие - в больших, но за счет своей высокой специфичности данные вещества позволяют подтверждать подлинность данного вида сырья. При подтверждении наличия данного вида сырья в составе растительных сборов практически не играет роли относительное содержание этого сырья в сборе, т. к. оно редко бывает ниже 5%, а этого оказывается достаточно для идентификации таких веществ.

В то же время, при стандартизации сырья, в составе которого идентифицируются вещества-маркеры, относящиеся ко второй группе, относительное содержание сырья в сборе играет уже более определенную роль. Так, идентификация сырья мяты перечной в сборах оказывается возможной при содержании данного вида сырья в сборе не менее 5%, для сырья багульника этот показатель колеблется в диапазоне 5-7%, для сырья тимьяна обыкновенного его относительное содержание должно быть 7-9%. В целом, чувствительность метода ГЖХ обычно позволяет стандартизовать лекарственные сборы и по количественному содержанию такого вида сырья. Всего в работе установлено минимально возможное содержание в составе растительных сборов, позволяющее использовать метод ГЖХ для стандартизации, для 14 видов растительного сырья.

Алгоритм выбора хроматографического метода для стандаризации лекарственного растительного сырья схематически представлен на рис. 21. При наличии в составе сырья хотя бы одного известного уникального вещества-маркера вполне достаточно воспользоваться методом ГЖХ как для стандартизации данного конкретного вида сырья, так и для стандартизации растительных сборов по данному виду сырья. В том случае, если мы имеем дело с растительным сырьем, про которое известно, что оно содержит специфические вещества-маркеры, то обычно применяется метод ГЖХ с привлечением нескольких веществ-маркеров в качестве «реперных» соединений, если же в данном виде сырья присутствуют в достаточном числе неспецифические вещества-маркеры, то будет применяться метод ГЖХ с использованием «хроматографического образа» (пример - эваклипт прутьевидный). Если же в составе лекарственного растительного сырья мы обнаруживаем лишь небольшое число неспецифических веществ-маркеров, то в качестве дополняющего хроматографического метода рекомендуется использовать ИЭХ.

Рис.21. Алгоритм выбора хроматографического метода для стандаризации лекарственного растительного сырья.

3. ИОНОЭКСКЛЮЗИОННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В ЛЕКАРСТВЕННОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ

3.1 Выбор элюента

Поскольку нами были исследованы два детектора - кондуктометрический для прибора «Цвет-3006» и УФ-детектор для прибора «Комгоп 430А», то выбор элюента был индивидуален для каждого вида детектора.. В качестве элюентов были изучены следующие алифатические кислоты: щавелевая, янтарная, адипиновая. Эти элюенты с успехом переводили исследуемые кислоты в молекулярную форму, однако вследствие недостаточного сродства этих кислот к сорбенту времена удерживания большинства определяемых кислот были слишком велики. Кроме того, все эти кислоты могут встречаться в реальных объектах в концентрациях значительно меньших, чем в элюенте. При этом установлено, что зависимость высоты отрицательного пика определяемой кислоты от концентрации не является линейной.

Следующей группой кислот, использованных в качестве элюентов, были ароматические кислоты, такие как бензойная, фталевая и салициловая. Из этих кислот наиболее подходящее сродство к сорбенту показала бензойная кислота. Кроме того, пики алифатических кислот, имеющих большое время удерживания (валериановая, капроновая, каприловая), при использовании фталевой и салициловой кислот в качестве элюентов имели несимметричную форму. Таким образом, мы остановились на бензойной кислоте в качестве элюента.

Для наилучшего разделения в ИЭХ требуется как можно более низкий рН элюента для перевода анализируемых кислот в молекулярную форму. Однако любая кислота в больших концентрациях может давать высокий фоновый сигнал за счет своей электропроводности. Как показали эксперименты, бензойная кислота даже при своей максимальной концентрации (5 мМ) имеет очень низкое значение фоновой электропроводности, вследствие чего концентрация бензойной кислоты регламентируется только ее растворимостью. Максимально возможное значение концентрации бензойной кислоты — 5 мМ достигается только после суточной диффузии растворенной кислоты в деионизованной воде. Использование каких-либо солей бензойной кислоты (К, Ка, 1л) недопустимо, поскольку соли имеют значительно более высокий рН. Эксперименты показали, что использование бензойной кислоты в качестве элюента не позволяет селективно разделить некоторые пары кислот, такие как гликолевая - молочная, лимонная - винная. Однако если содержание какой-либо одной кислоты из пары значительно выше второй, пики можно обсчитать по высотам согласно общепринятой схеме.

Одним из способов улучшения селективности при совместном определении вышеперечисленных пар кислот является добавление в элюент сильной минеральной кислоты, например, серной, но, к сожалению, количество добавки ограничено способностью кондукгометрического детектора скомпенсировать повышенный фоновый сигнал элюента. Как правило, концентрация добавки не может превышать 4-5 ммоль. Еще одним недостатком является резкое повышение пределов обнаружения определяемых кислот. Иногда предел обнаружения кислоты может быть повышен почти на порядок. Таким образом, мы можем рекомендовать использование этого приема только в случае реального объекта с большими концентрациями исследуемых кислот. При этом соотношение между концентрациями пар кислот может быть равно 1:1.

Поскольку УФ-детектор практически нечувствителен к минеральным кислотам, в качестве элюентов нами были использованы следующие кислоты: серная, соляная, фосфорная. Азотную кислоту не используют, поскольку она является достаточно сильным

окислителем и может переводить исследуемые кислоты в их оксиформы. Однако 1 мМ азотная кислота используется для регенерации ионоэксклюзионных колонок. Все три исследованные кислоты дают примерно одинаковую селективность при разделении фенолкарбоновых кислот, однако, мы остановились на серной кислоте, т. к. фосфорная кислота довольно часто образует комплексные соединения как с исследуемыми кислотами, так и с матрицей реального анализируемого объекта. Соляная кислота в больших концентрациях (> 10 мМ) является слишком реакционноспособной для металлических частей хроматографа. Смытое с металлических поверхностей железо значительно уменьшает число сорбционных центров ионоэксклюзионного сорбента.

Для выбранной нами в качестве элюента серной кислоты был проверен интервал концентраций 0,5 - 100 мМ. Как показали эксперименты, селективность определения растет с увеличением концентрации кислоты до 25 мМ, дальнейшее увеличение концентрации не дает какого-либо видимого улучшения селективности. В интервале концентраций от 20 до 25 мМ наблюдается некоторое ухудшение эффективности за счет размывания заднего фронта. Таким образом, оптимальной концентрацией серной кислоты в качестве элюента является концентрация 20 мМ.

3.2 Хроматографические условия для определения карбоповых кислот

Введение органических добавок в водные растворы элюентов, снижая диэлектрическую проницаемость среды и блокируя адсорбционные центры сорбента, уменьшает гидрофобное взаимодействие между молекулами органических кислот и стационарной фазой. Обычно для снижения времени удерживания в условиях ИЭХ используют добавки различных спиртов и ацетонитрила.

Зависимость времени удерживания некоторых карбоновых кислот, находящихся в лекарственных растениях от концентрации органических растворителей представлена в табл.2.

Таблица 2. Изменение времени удерживания (мин) органических кислот в зависимости от концентрации органического модификатора (элюент: 5 мМ раствор бензойной кислоты, колонка: 8 х 300 мм, Атгппех 0-155, скорость подачи элюента 0,7 мл/мин)

Кислота без модификатора ацетонитрил изопропанол

5% 10% 5% 10%

Лимонная 7,3 7Д 6,7 7,2 6,9

Уксусная 15,5 14,7 14,2 14,8 14,7

Фумаровая 13,1 12,2 11,7 12,9 12,5

Малеиновая 6,9 6,7 6,5 6,8 6,6

Янтарная 14,7 14,1 13,8 13,9 13,8

Яблочная 8,2 8,0 7,6 8,1 7,8

Щавелевая 5,0 4,8 4,6 4,9 4,8

Как и ожидалось, времена удерживания изученных слабоудерживаемых и среднеудерживаемых кислот изменяются не столь сильно, как это могло наблюдаться для сильноудерживаемых кислот (для алифатических, начиная с капроновой). Для ароматических кислот, у которых сильны взаимодействия ароматических колец кислоты и матрицы катионообменника, снижение времени удерживания также бывает более значительным. Пределы обнаружения ряда органических кислот, встречающихся в составе лекарственных растений, представлены в табл.3.

Таблица 3. Пределы обнаружения органических кислот.

Кислота Предел обнаружения, мг/л

Лимонная 7,3

Уксусная 26,3

Фумаровая . 2,5

Малеиновая 0,25

На сорбенте Атшех (2-155 было исследовано взаимное влияние карбоновых кислот. Полученные данные приведены в табл. 4. Как видно, недостаточно хорошо разделяются при данных условиях янтарная и фумаровая кислоты. Для их лучшего разделения использовали УФ-детектирование и НгЭОд в качестве элюента. Это помогало и отделению оксапат-иона от неорганических кислот, что важно, учитывая тот факт, что щавелевая кислота присутствует в составе любых растений.

Одним из факторов, влияющих на проведение анализа в ИЭХ, является скорость подачи элюента. Зависимость времени удерживания лимонной кислоты от скорости подачи элюента представлена в табл. 5.

Таблица 4. Кратность избыточных количеств кислот, не мешающих определению карбоновых кислот (элюент: 5 мМ раствор бензойной кислоты, колонка: 8 х 300 мм,

Атшех (2-155)

Кислота Лим. Укс. Фум. Мал. Янт. Ябл.

Лимонная - 1200 >300 40 1000 >300

Уксусная 400 - 150 250 80 450

Фумаровая >300 >400 - 200 50 500

Малеиновая 40 800 >200 - 1500 100

Янтарная 400 500 50 800 - 500

Яблочная 150 800 1000 100 100 -

Таблица 5. Зависимость времени удерживания лимонной кислоты от скорости подачи элюента (элюент: 5 мМ раствор бензойной кислоты, колонка: 8 х 300 мм, Агшпех С>-155, скорость подачи элюента 0,7 мл/мин, объем вводимой пробы 100 мкл)

Скорость подачи элюента, мл/мин Время удерживания, мин

0,3 22,0

0,5 13,2

0,7 8,2

0,8 7,2

Для низших членов рядов моно- и дикарбоновых кислот с увеличением скорости потока элюента происходит линейное снижение времени удерживания. Однако известно, что при увеличении размера молекулы время удерживания уменьшается по вогнутой кривой. Эта закономерность была подтверждена нами для лимонной кислоты (рис. 22). Предел обнаружения лимонной кислоты при скорости подачи 0,7 мл/мин составил 7,3 мг/л.

І..НИІ!

20

Рис. 22. Зависимость времени удерживания (О лимонной кислоты от скорости подачи элюента (Ї7).

Детектор - кондукгометрический, элюент: 5 мМ бензойная кислота, колонка Ашіпех 0-155 (8x300 мм).

Для ряда карбоновых кислот была проведена оценка воспроизводимости определения по высотам пиков и временам удерживания при использовании стандартных растворов. Была взята выборка из пяти результатов измерений высот пиков и времен удерживания. Результаты для достаточно редко встречающейся в лекарственных растениях фумаровой кислоты представлены в табл.6.

Таблица 6. Оценка воспроизводимости определения фумаровой кислоты по высотам пиков и временам удерживания (элюент: 5 мМ раствор бензойной кислоты, колонка: 8 х 300 мм, Апипех <2-153, скорость подачи элюента 0,7 мл/мин)

52 Б Эг х± Vп

Метрологические характеристики для высот пиков 3,200 1,788 0,015 121,8 ±2,2

Метрологические характеристики для времен удерживания. 0,018 0,132 0,010 13,1 ±0,2

Р = 0,95; п = 5 (выборка из пяти измерений); х (0,95;4) = 2,78; 4п = л/5 = 2,236.

33 Стандартизация лекарственного растительного сырья методом ионо-эксклюзионной хроматографии

Публикаций по исследованию лекарственных растений методом ИЭХ чрезвычайно мало. Работ, исследующих какое либо значительное число видов лекарственных растений, не найдено вовсе. По-видимому, это частично связано с тем, что не совсем ясна роль отдельных карбоновых кислот в лекарственных свойствах некоторых растений, поэтому кроме чисто аналитических задач нами была поставлена задача проследить корреляции между содержанием каких-либо карбоновых кислот и фармакологическими свойствами отдельных лекарственных растений или групп таких растений. Исходя из этого, выборка лекарственных растений должна быть достаточно большой, и число исследованных нами растений было около сорока. Среди них были наиболее известные, часто употребляемые лекарственные растения (зверобой продырявленный, пустырник пятилопастный, эвкалипт прутьевидный, шалфей лекарственный и др.), но были и более редкие растения.

Пробоподготовка перед анализом состояла в следующем: 2 г сухой травы мелко измельчали в лабораторной мельнице, затем заливали 20 мл деионизованной воды, помещали в фарфоровую чашку и нагревали на водяной бане в течение 15 мин. В тех случаях, когда растительное сырье существовало в виде коры или корневищ (дуб обыкновенный, крушина слабительная, валериана лекарственная, одуванчик лекарственный, кровохлебка лекарственная, девясил высокий, аир болотный, солодка голая) нагревание на водяной бане проводилось в течение 30 мин. Полученное извлечение оставляли охлаждаться в течение 15 мин, затем центрифугировали на центрифуге (8000 об./мин) в течение 3 мин и отфильтровывали. Таким образом, извлечение было готово к анализу.

Работу проводили на приборе «Цвет 3006» с кондуктометрическим детектором на сорбенте Апипех (2-155 с 5 мМ раствором бензойной кислоты в качестве элюента, кроме тех случаев, когда требовалось лучшее разделение кислот, имеющих близкие времена удерживания (щавелевая и неорганические кислоты; янтарная и фумаровая).

В таких случаях настои и отвары растений исследовались на приборе «Когигоп» на сорбенте Апипех А5 при использовании УФ-детектора (X = 210 нм). В частности, на сорбенте Апипех <2-155 невозможно было получить разделение щавелевой кислоты и неорганических кислот, тогда как и та, и другие в значительных количествах присутствуют практически во всех лекарственных растениях. Эта задача решалась при параллельном измерении на приборе «Котгоп», т. к. времена удерживания неорганических кислот и щавелевой кислоты составляло, соответственно, 2,3 и 7,5 мин (И = 0,8 мл/мин). Неорганические ионы не удерживаются на колонке.

При качественной идентификации хроматограмм отдельные пики карбоновых кислот идентифицировались методом добавок при использовании стандартных растворов. При этом

кислоты, имеющие даже очень близкие времена удерживания, при несовпадении давали два отчетливо разных пика, как бы «раздвигая» друг друга.

Качественный и количественный состав некоторых из исследованных лекарственных растений представлен в табл.7. При этом содержание карбоновых кислот было пересчитано в % массы от массы сухого сырья. Как видно из таблицы, в составе абсолютно всех лекарственных трав обнаружена щавелевая кислота, содержание которой меняется от 0,22 до 0,57%. Всего было исследовано 27 видов лекарственных растений. Практически во всех лекарственных растениях обнаружена лимонная кислота, ее содержание меняется от 0,05 до 0,32%.

Также одной из характерных кислот является яблочная, содержание которой меняется от 0,04 до 0,52%. Помимо указанных в таблице кислот, в нескольких растениях была обнаружена уксусная кислота: в валериане - 0,12± 0,01%, в бузине - 0,09± 0,01%, в листьях сенны - 0,12± 0,01%, в солодке - 0,08+ 0,01%, в почках березы - 0,10+0,01%.

Валериановая кислоты была найдена в валериане лекарственной (0,13± 0,01%), в бузине (0,10+0,01%), в крушине (0,06± 0,01%).

Как было сказано ранее, для разделения фумаровой и янтарной, щавелевой и неорганических кислот, мы проводили исследования на приборе «Комгоп-430А» с УФ-детектором. Типичная хроматограмма отвара валерианы лекарственной, полученная на этом приборе, представлена на рис. 23. Как видно из хроматограммы, указанные кислоты подвергаются хорошему разделению.

Типичные хроматограммы отваров некоторых лекарственных растений представлены на рис. 24-27.

Особый интерес представляет вопрос об идентичности качественного состава карбоновых кислот внутри вида при условии различий в сроках заготовки, районировании и при разных сроках и условиях хранения. Для выяснения этих вопросов нами были исследованы по три различных образца трех лекарственных растений: зверобоя продырявленного, бузины черной и шалфея лекарственного. Имея различный количественный состав компонентов, что вполне объяснимо, эти образцы, тем не менее, имеют идентичный качественный состав. Это позволяет сделать, по крайней мере, два вывода: во-первых, морфологические особенности растения задают его химический состав, который не меняется в зависимости от типа почвы, времени произрастания и т.п., во-вторых, профиль хроматограммы позволяет проводить оценку подлинности заготовленного сырья, исходя из химического состава по карбоновым кислотам. Необходимо также заметить, что многие лекарственные травы не стандартизованы по своему химическому составу, ввиду недостаточной изученности этого вопроса в ряде случаев. Поэтому метод ИЭХ мог бы стать перспективным методом стандартизации лекарственных растений по карбоновым кислотам, особенно в тех случаях, когда растения содержат в своем составе специфические кислоты, такие как янтарная, фумаровая, винная и валериановая.

Таблица 7. Содержание карбоновых кислот (в % от массы сухого сырья) в различных лекарственных растениях

Лекарственное растение Лимонная Щавелевая Яблочная Винная Янтарная Фумаровая

Брусника (Vaccinium vilisiilala) 0,08±0,01 0,57±0,03 0,52±0,3 0,50+0,02 - -

Лир болотный (Acorns calamus) 0,14+0,01 0.2810,02 0,1210,01 - 0,12+0,01

Тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium) 0,06010,0 03 0,28±0,02 0,06010,005 - 0,2010,02

Пустырник сердечный (Leoiuirus carcliaca) 0,070+11,0 03 0,3510,03 0,0910,01 - -

Шалфей лекарственный (Salvia officinalis) 0,12+0,01 0,4010,03 0.1110,01 - 0.5810.03 -

Ромашка аптечная (Chamomilla recutita) 0,2310,02 0,4710,03 0,2210,02 - 0,18+0,03

Тимьян ползучий (Thymus serpylhun) 0,11 ±0,01 0,3010,02 0.1410,01 - - -

Крапива двудомная (Urtica dioica) 0,12+0,01 0,5210,02 0.09Ю.01 - -

Крушина слабительная (Rhamnus catharctica) - 0.4810,02 0,2110,02 - -

Девясил высокий (Inula helenium) 0,08±0,01 0,2310,02 0.05010,005 - -

Рис.23. Типичная хроматограмма отвара валерианы лекарственной. 1 - неорганические кислоты: 2 - щавелевая: 3 - лимонная: 4 - яблочная: 5 - аскорбиновая: 6 - фумаровая; 7 - уксусная; 8 - валериановая. Детектор - УФ, длина волны - 210 нм. Элюент: серная кислота 20 мМ. Скорость потока - 0.8 мл/мин. Колонка:

Аттех А5 (6x250 мм).

Рис. 24. Типичная хроматограмма отвара пустырника сердечного. 1 - неорганические и щавелевая кислоты; 2 — лимонная; 3 — яблочная. Детектор - кондуктометрический. Элюент: 5 мМ бензойнаякислота. Скорость потока - 0.7 мл/мин. Колонка: Атіпех О-ІбБ (8x300 мм).

а« .ам» «. мил

Рис. 25. Типичная хроматограмма отвара бузины черной. 1 - неорганические и щавелевая кислоты;

2 - лимонная; 3 - яблочная; 4 - аскорбиновая;

5 - фумаровая; 6 - уксусная. Детектор -кондуктометрический. Элюент: 5 мМ бензойная кислота. Скорость потока - 0.7 мл/мин. Колонка: Атіпех 0-155 (8x300 мм).

Рис. 26. Типичная хроматограмма отвара тысячелистника обыкновенного.

1 - неорганические и щавелевая кислоты;

2 - лимонная; 3 - яблочная; 4 - фумаровая. Детектор - кондуктометрический. Элюент: 5 мМ бензойная кислота. Скорость потока - 0.7 мл/мин. Колонка: Атіпех (}-155 (8x300 мм).

Рис. 27. Типичная хроматограмма отвара зверобоя продырявленного.

1 - неорганические и щавелевая кислоты;

2 - лимонная; 3 - яблочная; 4 - аскорбиновая; 5 - янтарная. Хроматографические условия как для рис. 26.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено изучение литературных данных, касающихся современного состояния хроматографических методов, внедренных в фармацевтическую практику в приложении к стандартизации лекарственного растительного сырья и сборов на его основе, степени применяемости данных методов в действующей документации. Сделан вывод о явной недостаточности внедрения данных методов в современную фармацевтическую практику.

2. Выполнен скрининг более 40 применяющихся видов лекарственного растительного сырья в целях выявления наличия специфических веществ-маркеров, позволяющих эффективно стандартизовать данное сырье методом газо-жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием для контроля его качества и выявления фальсификаций. Для 19 видов лекарственного растительного сырья обоснован выбор специфических веществ-маркеров при газохроматографическом анализе.

3. Среди найденных веществ-маркеров выявлены как высокоспецифичные, присущие лишь данному виду растительного сырья((22)-2(гекса-2,4-диин-1-илиден)-1,6-диоксаспиро[4,4]нон-3-ен для ромашки аптечной, кумарин и гидрокумарин для донника лекарственного, изовалериановая кислота для валерианы лекарственной, бициклические сесквитерпены кадинанового типа для календулы лекарственной), так и не обладающие особой специфичностью. Для ряда лекарственных растений, имеющих в своем составе высокоспецифические вещества-маркеры, установлено минимальное содержание данного вида растительного сырья в лекарственных сборах, при котором возможна стандартизация по этому виду сырья.

4. Для растений, в составе которых не обнаружено содержания высокоспецифических веществ (эвкалипт прутьевидный, душица обыкновенная, пижма обыкновенная и др.), предложена их стандартизация с использованием «хроматографического образа», основой которого является ряд «реперных» соединений (гексагидрофарензил ацетон, сквален, эвкалиптол, пинен, терпинеол, кариофиллен, фелландрен, спатуленол, гермакрен)

5. Предложен алгоритм отбора лекарственных растительных сборов, для стандартизации которых метод газо-жидкостной хроматографии может быть весьма эффективным. В качестве модельных отобрано 10 сборов, для них всесторонне обсуждены хроматографические условия, позволяющие проводить качественный и количественный анализ данных сборов, а также гарантировать их подлинность. Указаны виды сырья, наиболее успешно стандартизуемые по своему качественному и количественному содержанию в данных сборах. Изучена степень перехода веществ-маркеров из растительного сырья в состав сборов, на основании этих данных проведена классификация данных веществ по степени их пригодности для идентификации конкретных видов сырья в растительных сборах.

6. Для тех видов лекарственного растительного сырья, для которых стандартизация методом газо-жидкостной хроматографии недостаточно эффективна (зверобой продырявленный, чистотел большой, девясил высокий и др.), предложен метод ионо-эксюпозионной хроматографии (ИЭХ) в качестве дополняющего метода. Методом ИЭХ изучено 37 видов лекарственного растительного сырья. Предложен алгоритм выбора того или иного метода, или их совместного использования.

7. Из одиннадцати исследованных ИЭХ сорбентов выбраны два наиболее подходящих для эффективного и селективного разделения смесей моно- и дикарбоновых и оксикислот, а также ароматических карбоновых кислот. Для алифатических карбоновых кислот наиболее удачным признан Aminex Q-15S (8% сшивки, размер

частиц 22 ± 3 мкм, емкость 1,7 мэкв/мл, гелевого типа) при использовании кондуктометрического детектирования, для ароматических карбоновых кислот рекомендован сорбент Апипех А5 (8% сшивки, размер частиц 13 ± 2 мкм, емкость 1,7 мэкв/мл) при использовании УФ-детектора.

8. Для каждого из указанных сорбентов выбран наиболее подходящий для аналитических целей элюент. Для сорбента Апипех (2-155 рекомендована бензойная кислота, как имеющая наибольшее сродство к смоле. Для сорбента Апипех А5 из трех изученных минеральных кислот (серная, фосфорная, соляная) сделан выбор в пользу серной кислоты, как дающей наилучшее разделение и не обладающей нежелательными эффектами (комплексообразование, коррозионная активность).

9. Установлены аналитические характеристики метода ИЭХ с кондуктометрическим детектированием для определения ряда карбоновых кислот.

10. Методом ИЭХ с кондуктометрическим и УФ-детектированием идентифицированы и количественно определены в водных настоях и отварах лекарственных растений биологически активные карбоновые кислоты, в том числе: одноосновные (уксусная, валериановая), двухосновные (щавелевая, янтарная), оксикислоты (яблочная, лимонная, винная), дикарбоновые кислоты этиленового ряда (фумаровая). Проведена корреляция между фармакологическим действием лекарственных растений и содержанием в них карбоновых кислот. Установлено, что растения, обладающие противовоспалительным действием, обычно содержат янтарную кислоту.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кузьменко А.Н. Стандартизация лекарственного растительного сырья и растительных сборов хроматографическими методами (монография) / Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю. // Москва, Изд. Моск. ун-та, 2010, 104 с.

2. Кузьменко А.Н. Определение ацетат-иона в инфузионных растворах методом ион-эксклюзионной хроматографии / Кузьменко А.Н., Евграфов A.A., Решетняк В.Ю., Иванов A.A., Панов В.П. // «Человек и лекарство»: тез. докл. IX Российского национального конгресса. - Москва. 8-12 апреля 2002. - С.644.

3. Кузьменко А.Н. Определение цитрат- и ацетат- ионов в гемоконсервантах и инфузионных растворах методом ион-эксклюзионной хроматографии / Кузьменко А.Н., Панов В.П., Иванов A.A., Шпигун O.A., Евграфов A.A., Решетняк В.Ю., Попков В.А. // Хим.-фарм! журнал. - 2002. - Т.36, № 7. - С.44-47.

4. Кузьменко А.Н. Определение фумарат-ионов в инфузионном растворе «Мафусол» методом ион-эксклюзионной хроматографии / Кузьменко А.Н., Панов В.П., Иванов A.A., Шпигун O.A., Попков В.А., Решетняк В.Ю., Евграфов A.A. // Хим.-фарм. журнал. - 2002 -Т.36, № 10.-С.51-52.

5. Кузьменко А.Н. Использование метода ион-эксклюзионной хроматографии для анализа фармацевтических препаратов / Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю., Евграфов A.A., Иванов

A.A., Бендрышев A.A., Шпигун O.A. // «Современные проблемы хроматографи »: тез. докл. Всероссийского симпозиума. - Москва, 18-22 марта 2002. - С. 129.

6. Kuzmenko A.N. Application of ion-exclusion chromatography for the analysis and quality control of pharmaceutical formulations / Kuzmenko A.N., Ivanov A.A., Shpigun O.A., Popkov V.A., Reshetnyak V.Yu., Evgrafov A.A. // «Separations in Bio Sciences»: Proc. of the 3rd International Symposium. - Moscow, 13-18 May 2003, P. 170.

7. Кузьменко A.H. Исследование химического состава лекарственных растений методом ион-эксклюзионной хроматографии / Кузьменко А.Н., Иванов A.A., Евграфов A.A., Решетняк

B.Ю., Попков В.А., Федосеев Е.Е. // X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Москва, 7-11 апреля 2003. Тез. докл.: Москва, С. 726.

8. Доброхотов Д.А. Сравнительное изучение компонентного состава вытяжек из лекарственного сбора для лечения и профилактики заболеваний пародонта на основе различных растворителей методом газо-жидкостной хроматографии / Доброхотов Д.А., Кузьменко А.Н., Нестерова О.В., Разживин Р.В. ,Решетняк В.Ю., Попков В.А. // Материалы IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов». Москва 4-5 июня 2007, С.103.

9. Миронов С.Е. Совершенствование методов идентификации основных биологически активных веществ в препаратах «Стоматофит» и «Мараславин» / Миронов С.Е., Нестерова О.В., Кузьменко А.Н., Доброхотов Д.А. // Материалы IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов». Москва 4-5 июня 2007, С.108.

10. Разживин Р.В. Изучение компонентного состава летучей фракции экстрактов растений, входящих в состав сборов, применяемых при лечении заболеваний органов дыхания, методом газовой хроматографии с хромато-масс-спектрометрическим детектированием / Разживин Р.В., Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю., Нестерова О.В., Попков В.А. // Сб. науч. тр. «Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты», 15 выпуск, Москва 2007, С. 100-106.

П.Миронов С.Е. Изучение состава терпеноидной фракции в препаратах «Стоматофит» и «Мараславин» с целью разработки критериев определения их подлинности / Миронов С.Е., Нестерова О.В., Кузьменко А.Н., Доброхотов Д.А. // Сб. науч. тр. «Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты», 15 выпуск, Москва 2007, С. 141-144.

12. Доброхотов Д.А. Разработка показателей подлинности сбора для комплексного лечения заболевания пародонта, осложненного аллергическим состоянием / Доброхотов Д.А. Нестерова О.В., Разживин Р.В., Кузьменко А.Н. // Фармацевтический вестник Узбекистана. -2007,-№2.-С. 19-22.

13. Кузьменко А.Н. Определение карбоновых кислот в лекарственных растениях методом ионо-эксклюзионной хроматографии / Кузьменко А.Н., Попков В.А. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2007. - № 4. - С. 8-10.

14. Разживин Р.В. Изучение компонентного состава экстрактов пяти видов растительного сырья, составляющего сбор желудочно-кишечный, методом газовой хроматографии с хромато-масс-спектрометрическим детектированием / Разживин Р.В., Кузьменко А.Н. // «Здоровье и образование в XXI веке: концепции болезней цивилизации»: тез. докл. VIII межд. конгресса. - Москва. 2007.- С. 530.

15. Разживин P.B. Изучение компонентного состава летучей фракции жидких экстрактов из лекарственного растительного сырья, входящего в состав комплексных средств, используемых при заболеваниях органов мочевыводящей системы / Разживин Р.В., Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю., Нестерова О.В., Попков В.А. // Хим. технология. - 2008. -Т.9, № 8. - С. 408-410.

16. Фетисова А.Н. Эмпирический расчет состава жирных кислот и глицеринов в оценке качества лекарственных средств / Фетисова А.Н., Попков В.А., Кузьменко А.Н. // Вести. Моск. ун-та. Сер. 2 Химия. - 2008. - Т.49, № 3. - С. 209-212.

17. Разживин Р.В. Применение хромато-масс-спектрометрии для изучения компонентного состава фармакопейных видов лекарственного растительного сырья / Разживин Р.В., Решетняк В.Ю., Кузьменко А.Н., Нестерова О.В., Попков В.А. // Вести. Моск. ун-та. Сер. 2 Химия. - 2009. - Т.50, № 1. - С. 67- 70.

18. Разживин Р.В. Возможность применения специфических маркеров определенных видов лекарственного растительного сырья при анализе многокомпонентных растительных сборов и фиточаев / Разживин Р.В., Решетняк В.Ю., Кузьменко А.Н., Нестерова О.В., Попков В.А. // Вести. Моск. ун-та. Сер. 2 Химия. - 2009. - Т.50. № 2. - С. 129-132.

19. Решетняк В.Ю. Определение кислородсодержащих веществ в составе экстракта элеутерококка / Решетняк В.Ю., Кузьменко А.Н., Попков В.А. // «Человек и лекарство»: тез.докл. XVI Российского национального конгресса. - Москва. 6-10 апреля 2009. - С. 726.

20. Кузьменко А.Н. Определение аскорбиновой кислоты в плодах малины методом ионо-эксклюзионной хроматографии / Кузьменко А.Н. // «Человек и лекарство»: тез.докл. XVI Российского национального конгресса. - Москва. 6-10 апреля 2009. - С. 688.

21. Кузьменко А.Н. О возможности стандартизации сырья «Крапивы листья» методом газожидкостной хроматографии / Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю., Попков В.А. // «Человек и лекарство»: тез.докл. XVI Российского национального конгресса. - Москва. 6-10 апреля 2009. - С. 688.

22. Разживин Р.В. Принципы выбора веществ-маркеров для анализа состава лекарственных растений при использовании метода газо-жидкостной хроматографии / Разживин Р.В., Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю., Попков В.А. // «Человек и лекарство»: тез.докл. XVI Российского национального конгресса. - Москва. 6-10 апреля 2009. - С. 723.

23. Ермакова В.Ю Сравнительное изучение химического состава плодов и сухого экстракта клюквы болотной / Ермакова В.Ю., Решетняк В.Ю., Кузьменко А.Н., Дунин A.C. // «Человек и лекарство»: тез.докл. XVI Российского национального конгресса. - Москва. 6-10 апреля 2009. - С. 657.

24. Кузьменко А.Н. Изучение компонентного состава растительного лекарственного сбора / Кузьменко А.Н. // Вести. Моск. ун-та. Сер. 2 Химия. - 2009. - Т. 50, № 3. - С. 212-216.

25. Кузьменко А.Н. Стандартизация растительного сбора методом газо-жидкостной хроматографии / Кузьменко А.Н. // Вести. Моск. vn-та. Сер. 2 Химия. - 2009. - Т. 50 № 4 -С. 278-281.

26. Доброхотов Д.А. Определение компонентного состава летучей фракции экстракта цветков календулы с целью выделения веществ-маркеров / Доброхотов Д.А., Нестерова О.В., Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю. // «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации»: тез. докл. научно- практической конференции. - Ташкент. 2009. - С. 168.

27. Кузьменко А.Н. Использование метода газо-жидкостной хроматографии для стандартизации лекарственных растительных сборов / Кузьменко А.Н. // Фармацевтический вестник Узбекистана. - 2009. - № 2. - С. 32-36.

28. Кузьменко А.Н Использование методов ионо-эксклюзионной и газо-жидкостной хроматографии для стандартизации лекарственного растительного сырья и сборов на его основе / Кузьменко А.Н. // Фармацевтический вестник Узбекистана. - 2009. - № 3. - С. 35-40.

29. Кузьменко А.Н. Изучение состава растительного лекарственного сбора методом газожидкостной хроматографии с хромато-масс-спектрометрическим детектированием / Кузьменко А.Н., Пашкова Е.Б., Пирогов A.B., Разживин Р.В., Решетняк В.Ю. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2 Химия. - 2010. - Т. 51, № 2. - С. 132-138.

30. Кузьменко А.Н. Использование газо-жидкостной хроматографии для стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе / Кузьменко А.Н. // Рос. хим. ж. (Журн. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). - 2010. - Т. LIV, №6. - С.114-119.

31. Харчилава И.А. Определение биологически активных веществ в корневище имбиря аптечного хроматографическими методами / Харчилава И.А., Нестерова О.В., Кузьменко А.Н. // Естественные и технические науки. - 2010. - Т. 50, №6. - С. 246-251.

32. Кузьменко А.Н. Изучение компонентного состава летучей фракции экстрактов растений, входящих в состав сбора для лечения заболеваний пародонта, методом газовой хромато-масс-спектрометрии / Кузьменко А.Н., Доброхотов Д.А., Разживин Р.В., Нестерова О.В., Решетняк В.Ю., Попков В.А. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2010. -№ 10. - С. 3-9.

33. Доброхотов Д.А. Компонентный состав экстрактов растений, входящих в состав сбора для лечения заболеваний пародонта / Доброхотов Д.А., Кузьменко А.Н., Нестерова О.В., Решетняк В.Ю., Попков В.А., Пашкова Е.Б., Пирогов A.B. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2 Химия.-2011.-Т. 52,№2.-С. 149-153.

Подписано в печать 27.10.2012г.

Усл.п.л. - 2.5 Заказ №11125 Тираж: ЮОэкз.

Копицентр «Чертеж.ру» ИНН 7701723201 107023, г.Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru