Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка промышленной технологии получения высокоочищенного препарата тестикулярной гиалуронидазы

На правах рукописи

Для служебного пользования Экз.№ £

РГБ ОД

2 9 ЯКВ 2002

о.г. якин

РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА ТЕСТИКУЛЯРНОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа 2001

Работа выполнена в Уфимском научно-исследовательском инстит\ вакцин и сывороток им.И.И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат».

Научные руководители:

кандидат медицинских наук М.М. Алсынбаев, кандидат медицинских наук Н.В. Мельников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук В.А. Трофимов,

кандидат биологических наук И.А. Басченко

Ведущее учреждение: Московский научно-исследовательскь

институт эпидемиологии и микробиоло им. Г.Н. Габричевского

Защитадиссертации состоится « & » # в/оа д£> % 2001 г. в /у — часов на заседании региональной диссертационн совета К.002.124.01 по адресу: 450014, г.Уфа, ул. Новороссийская, 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиот Уфимского научно-исследовательского института вакцин и сыворс им. И.И. Мечникова\ГУП «Иммунопрепарат».

Автореферат разослан « » 2001. г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

В.П. Головин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Производство лечебных ферментных препаратов имеет огромное значение для обеспечения потребностей практического здравоохранения. Одним из ценнейших их представителей является препарат гиалуронидаза. Низкое содержание этого фермента в сыворотке крови человека делает нерентабельным промышленный выпуск гомологичного препарата, что заставляет искать альтернативные источники. В настоящее время в качестве такового используют семенники крупного рогатого скота (КРС) - доступное и дешевое сырье, позволяющее производить отечественный препарат «Лидаза» с относительно низкой себестоимостью.

Нельзя не учитывать тот факт, что препараты, изготовленные на основе сырья животного происхождения, гетерологичны для человека и могут вызывать различные аллергические реакции (Адо А.Д., 1978). Возможность развития таких реакций в ответ на введение тестику-лярной гиалуронидазы (ТГ) показана в работах К.ЗакатоЬ е{ а1. (1980) и г^ерГа!^ а1. (1997). Кроме того, в результате многолетнего применения в клинике накопился значительный материал, свидетельствующий, что у некоторых больных в ответ на введение данного препарата развиваются аллергические реакции различной степени тяжести. Это указывает на необходимость повышения качества препарата ТГ и, в первую очередь, снижения его аллергизирующих свойств.

Благодаря проведению углубленных исследований ведущими научными центрами мира и выпуску фирмами-производителями вы-сокоочищенных препаратов ТГ стало возможным их интенсивное и широкое применение в клинике. За последние годы, в печати, главным образом зарубежной, появилось много сообщений о высокой эффек-

тивности препаратов ТГ при лечении ишемии и инфаркта миокарда (Earnshaw J.S. et al., 1985), терапии химиорезистентных неоперабельных опухолей различных органов (Knocker S. et al.,1995; St. Croix В. et al., 1998), трансплантации почек (Johnsson С. et al., 1999) и в офтальмологии (Stein R. et al., 1982; Galder I.G. et al., 1986; Harooni M. et al., 1998).

Кроме того, за рубежом широко используется определение гиа-луронидазы (Г) в сыворотке крови человека с диагностической целью, для уточнения прогноза опухолевых и ревматоидных заболеваний, определения распространенности процесса. В нашей стране подобные исследования не проводились, что объясняется отсутствием как специфической антисыворотки, так и стандарта белка.

Необходимо отметить, что вопросам промышленного получения гиалуронидазы из семенников КРС посвящен ряд работ отечественных исследователей (Виха И.В. и др., 1971; Стекольников Л.И. и др., 1984; Пак В.Н. и др.,1995). К сожалению, качество выпускаемого е России препарата не сравнимо с зарубежными аналогами.

В связи с вышеизложенным, а также учитывая потребность практического здравоохранения в высококачественном препарате тести-кулярной гиалуронидазы, была сформулирована цель и определень задачи настоящего исследования.

Цель работы. Разработка способа получения из семенникоЕ крупного рогатого скота отечественного высокоочищенного препарате гиалуронидазы и изучение его свойств.

Задачи исследования:

1. Изучить качественный состав коммерческого препарата «Лидаза» производимого предприятиями России.

2. Разработать метод выделения высокоочищенной тестикулярно! гиалуронидазы.

3. Создать промышленную технологию и провести научно обоснованную оптимизацию процесса получения высококачественного препарата тестикулярной гиалуронидазы.

4. Провести сравнительное изучение аллергенности препаратов тестикулярной гиалуронидазы различной степени очистки на моделях активной системной анафилаксии и гиперчувствительности замедленного типа.

5. Изучить физико-химические и иммунохимические свойства полученного высокоочищенного препарата тестикулярной гиалуронидазы и оценить его стабильность при хранении.

Научная новизна. Создана научно обоснованная технология, позволяющая получать высококачественный целевой продукт - препарат гиалуронидазы, обладающий высокой удельной активностью и стабильными физико-химическими свойствами.

Впервые установлено наличие в коммерческом и разработанном препаратах гиалуронидазы сывороточного происхождения, которая при рН выше 6,0 полностью теряет свою активность.

Показано, что высокая аллергенность существующего коммерческого препарата «Лидаза» обусловлена присутствием в нем контами-нирующих веществ и прежде всего - бычьего сывороточного альбумина (БСА), содержание которого достигает 27,7 %.

Новизна проведенных исследований подтверждена:

1) патентом РФ № 2158131 от 27.10.2000 г. «Способ получения тестикулярной гиалуронидазы»;

2) патентом РФ № 2159284 от 20.11.2000 г. «Способ получения гиалуронидазы».

Практическая значимость работы. Разработана промышленная технология получения из семенников КРС высокоочищенного ареактогенного препарата тестикулярной гиалуронидазы.

Показано, что высокая аллергенность существующего коммерческого препарата «Лидаза» зависит, в основном, от наличия в нем бычьего сывороточного альбумина.

На основании проведенных исследований на препарат ТГ составлены:

1) проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП), где заложены требования на ограничение содержания в препарате БСА (не более 200 мкг/мл), общего белка (не более 5 мг/мл), удельная активность должна быть не менее 13 у.е./мг;

2) опытно-промышленный регламент (ОПР), обеспечивающий получение препарата необходимого качества.

В соответствии с разработанной нормативно-технической документацией (НТД) приготовлены четыре экспериментально-производственные серии препарата ТГ, которые прошли контроль в ОБТК ГУП «Иммунопрепарат». Получены паспорта качества.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод выделения высокоочищенной гиалуронидазь из семенников КРС.

2. Создана промышленная технология получения препарата тести кулярной гиалуронидазы с высокой удельной специфической ак тивностью, обеспечивающая стабильность физико-химически; свойств, максимальное освобождение от контаминаций и основ ного аллергизирующего компонента - БСА.

i. Получен отечественный высокоочищенный гипоаллергенный препарат гиалуронидазы, что позволит свести к минимуму риск возникновения нежелательных реакций при терапии больных. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и эбсуждались на Всероссийской научной конференции «Актуальные зопросы разработки, производства и применения иммунобиологиче-жих и фармацевтических препаратов», посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат» (Уфа, >000); на VIII Российском национальном конгрессе «Человек i лекарство» (Москва, 2001). Диссертация апробирована на заседали ученого совета Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова "УП «Иммунопрепарат» (протокол № 5 от 20.06.2001 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть >абот в центральной печати, из них два патента.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125-ти страницах, иллюстрирована 14-ю таблицами и 13-ю рисунками. Эна состоит из введения, обзора литературы (2 главы), раздела :обственных исследований (4 главы), заключения, выводов и списка 1итературы, содержащего 195 источников (60 отечественных и I35 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Объектом исследований были: I) препарат «Лидаза» (коммерческие серии производства Санкт-Петербургского АО «Самсон», Пермского НПО «Биомед» и Уфимского ГУП «Иммунопрепарат»);

2) очищенные препараты тестикулярной гиалуронидазы (экспериментальные и экспериментально-производственные серии, приготовленные в лаборатории препаратов крови УфНИИВС им. И.И.Мечникова и цехе цитомединов ГУП «Иммунопрепарат»);

3) семенники КРС (70 кг), которые получали с Уфимского и Минского мясоперерабатывающих комбинатов;

4) концентрированный уксусно-кислый экстракт семенников КРС (90 л), полученный из цеха цитомединов ГУП «Иммунопрепарат»;

5) сыворотка крови КРС (10 л) производства Московского мясоперерабатывающего комбината;

6) альбумин бычий сывороточный кристаллический производства фирмы «Merck», Германия.

В работе использованы животные, полученные из питомника лабораторный животных ГУП «Иммунопрепарат»: 250 беспородных морских свинок массой (250±5.0) г; 450 аутбредных белых мышей массой (18±2) г; 20 кроликов породы шиншилла массой (2,0±0,5) кг.

Для экстракции и очистки гиалуронидазы из семенников КРС использовали следующие методы:

1. Экстракцию осуществляли согласно промышленному регламенту на препарат «Лидаза» № ПР 04863057-4-97.

2. Осаждение балластных белков риванолом проводили по моди фицированному методу С.Е. Тукачинского и В.П. Моисеево£ (1961).

3. Фракционирование концентрированного экстракта семеннико! (КЗС) крупного рогатого скота сульфатом аммония проводили п< модифицированному нами методу В.Х. Кирсе и соавт. (1978).

4. Фракционирование КЭС полиэтиленгликолем осуществляли по методам J.M. Curling (1980), В.Н. Пака и В.И. Офицерова (1995) в нашей модификации.

5. Разделение КЭС на ионосбменниках проводили по схемам И.В. Виха и соавт. (1971), С.Н. Yang et al. (1975), В.Н. Пака и В.И. Офицерова (1995).

6. Изменение солевого состава ферментсодержащих растворов проводили на хроматографической колонке размером 8x40 см, заполненной сефадексом G-25.

7. Для концентрирования и диафильтрации полуфабриката использовали отечественные установки АР-0,2; 1,0; 2,0 с полыми волокнами ВПУ-15 и ультрафильтрационную установку, заправленную мембранами УПМ-20; 30; 50.

Общепринятые анализы проводили согласно методикам, изложенным в ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобио-погических препаратов». Определение гиалуронидазной активности троводили по методу, изложенному в ФС 42-2606-93 на препарат «Лидаза». Протеолитическую активность в препаратах и растворах, содержащих гиапуронидазу, определяли по методу J.Ansone (1939) в модификации И.С. Петровой и М.М. Винцюкайте (1966).

Определение содержания БСА проводили методом ракетного чммуноэлектрофореза в 1%-ном растворе агарозы. Диск-электрофо-зез в полиакриламидном геле осуществляли по модифицированному методу U.K. Laemmli (1970) и в соответствии с рекомендациями фир-иы «Pharmacia».

В работе использованы следующие аллергологические методы: активная системная анафилаксия по А.Д. Адо и И.С. Гущину (1973) в модификации В.А. Трофимова (1996); реакция гиперчувствительности

9

замедленного типа по Федосеевой В.Н. и соавт. (1993), Любимову Б.И. и соавт. (1999), Хаитову P.M. и соавт. (1999).

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили на основе общепринятых статистических методов (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962; Малета Ю.С., Тарасов В.В., 1982). Различие считали достоверным при Р< 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение. На начальном этапе работы изучен качественный состав и определено количественное содержание некоторых примесей, присутствующих в коммерческом препарате. Наиболее «чистым» оказался препарат производства НПО «Биомед», г. Пермь (рис. 1), однако и в нем содержание БСА составило, в среднем, 16,1%. В препарате производства Уфимского ГУП «Иммунопрепарат» БСА определялся на уровне 2,7 мг/мл (15,3% от общего белка), а в препарате Санкт-Петербургского предприятия - 4,1 мг/мл (22,4%).

мг/мл 10

АО'Самсон" НПО'Биомед" ГУП "Иммунопрепарат"

□ Белок 18,3 11.2 17,6

И6СА 4,1 1,6 2,7

Рис. 1. Содержание общего белка и БСА в препарате "Лидаза", выпускаемом предприятиями России

Таким образом, на долю высокоаллергенного белка (БСА) приходилось до 1/4 от терапевтической дозы. Кроме того, в препаратах присутствуют ферменты с иной специфичностью -нейтральные протеазы. Учитывая, что при подкожном и внутримышечном введении в месте инъекции создается рН, близкий к нейтральному, протеазы способны проявлять свою ферментативную активность и воздействовать на ткани больного. Следовательно, интенсивное и многократное парентеральное применение этих препаратов весьма проблематично.

Существующая технология производства лечебного препарата «Лидаза» включает в себя стадии: экстракции с помощью 0,1 N водного раствора уксусной кислоты; центрифугирования - для отделения балластного осадка; концентрирования - с целью достижения необходимой величины гиалуронидазной активности (ГА) и лиофилизации готового продукта.

Прежде чем приступить к разработке промышленной технологии по очистке препарата и с целью оптимизации условий экстракции были апробированы различные способы повышения эффективности этого процесса. Изменение рН, ионной силы и использование различных кислот (соляной, серной), также как и попытка очистки концентри-зованного продукта на ДЭАЭ-ионообменнике по методу Виха И.В. и ;оавт. (1971), не увенчались успехом. В последнем случае возникла трудность с изменением солевого состава раствора и, кроме того, зольшие количества нерастворимых белков и липопротеинов (ЛП) нарушали процесс хроматографического разделения.

С целью освобождения уксусно-кислого экстракта от нестабильных, денатурированных белков и ЛП была изучена возможность применения риванола, хлороформа, активированного угля, полиэтилен-■ликоля (ПЭГ) и сульфата аммония. Использование чистого этанола и

11

смеси этанола с эфиром мы в принципе не рассматривали, так как в этом случае для осуществления процесса требуется применение дорогостоящего холодильного оборудования и поддержание низких температур. В результате большого числа экспериментальных фракционирований с использованием всех вышеперечисленных агентов показано преимущество целенаправленного применения хлороформа (табл. 1). Наилучшие показатели удельной активности были получены при добавлении хлороформа до конечной 5 %-ной концентрации. При этом также удалось достичь значительного (89,1 %) удаления гемпиг-ментов.

Таблица 1

Характеристика концентрированного экстракта семенников КРС до и после обработки его хлороформом при различных значениях рН

Полуфабрикат РН Белок, мгАмл ' ГА, ! у.еУмл ПЭГП (400 нм) Прозрачность (540нм) Липопротеины

мг% %

КЭС 4,8 20,3±1,2 76,0±6,2 2,55±0,1 0,380±0,01 600,0+36,0 0,0

КЭОХ 4,3 9,1+0,5 70,5+3,9 0,32+0,01 0,055+0,01 354,0+28,0 40,9

4,о -9,8+0,6 53,1+4,4 0,25+0,01 0,045±и,01 85,0+7,0 55,6

5,5 10,5+0,8 72,0±4,2 0,26+0,01 0,040+0,01 46,0+3,0 92,3

6,8 16,2+1,4 71,5+4,0 0,41+0,02 0,150+0,01 219,0+15,0 63,4

Примечание: КЭС - концентрированный экстракт семенников;

КЭОХ - концентрированный экстракт семенников,обработанный хлороформом;

ГА - гиалуронидазная активность;

ПЭГП - показатель экстинкции гемпигментов.

Следующая задача исследований состояла в выборе условий и режима проведения ультрафильтрации. Процесс проводили на аппарате АР-0,2; 1,0; 2,0 (в зависимости от объема исходного раствора) с полыми волокнами ВПУ-15 и на пилотной ультрафильтрационной установке, заправленной мембранами УПМ-20, 30 и 50. Показано, что при использовании в качестве диафильтрующего раствора 0,01 М ацетатного буфера, содержащего 0,15 М №С1, рН 4,5-4,8, также как и

в гипотонической среде 0,01 М фосфатного, буфера, рН 7,8, содержащего 0,001 М NaCI, фермент, в основном, сохранял стабильность, но в ряде случаев наблюдалось некоторое снижение ГА (на 5-10%).

Из литературных источников (Borders J.C.L. et al., 1968) известно об ингибирующем влиянии ионов Fe++, Fe+,-+ и Cu++ на гиалуронидазную активность. Поэтому нами дополнительно поставлены эксперименты с использованием высокоочищенной воды, полученной на обратноосмотической установке «Milli Q». Применение воды с удельным сопротивлением не менее 10 МОм/см позволило получить полуфабрикат с более высокой (на 5-15 %) активностью. Вполне логично предположить, что в воде с более высоким удельным сопротивлением содержание указанных ионов снижено, что и отражается на ферментативной активности ТГ. Определение концентрации вышеуказанных ионов металлов не представляется целесообразным, поэтому за критерий чистоты воды приняли показатель электропроводности.

Для доочистки ТГ были апробированы различные типы сорбентов и подобраны условия хроматографии на ДЭАЭ- и КМ-ионообменниках. Лучшие показатели разделения достигнуты при использовании ДЭАЭ-сефарозы CL-6B и ДЭАЭ-теоперл 650М. Учитывая, что ДЭАЭ-теоперл обладает более высокими рабочими характеристиками и значительно дешевле, чем сефароза, все последующие исследования проводили с использованием именно этого сорбента. Повышение молярности буфера с 0,001 до 0,01 М на этапе хроматографического разделения на ДЭАЭ-теоперл, по сравнению с методом, предложенным И.В.Виха и соавт. (1971), снижало длительность подготовки сорбента, а при использовании буфера с более высокой молярностью наблюдалось существенное снижение чистоты получаемого фермента.

13

Затем были. подобраны и оптимизированы условия хроматографии на этапе сорбции-элюции ТГ на КМ-сефарозе CL-6B. В качестве базовой модели использован метод, предложенный В.Н.Паком и В.И.Офицеровым (1995). Применение ацетатного буфера, содержащего 0,1 М NaCI, позволило сократить время проведения процесса за счет исключения части примесных белков, элюирующихся вместе с исходным буфером. Ферментативная активность определялась во фракциях, полученных в градиенте концентрации 0,1-0,3 М NaCI, хотя по данным указанных выше авторов полное элюирование ТГ отмечалось при 0,6 М NaCI. Такое значительное расхождение результатов наших работ и опубликованных данных можно объяснить различным качественным составом исходного раствора. Выяснено, что получение высокоочищенной ТГ возможно тремя способами (рис. 2).

I. ДЭАЭ-сефароза CL-6B, рН 7,8

I

Сефакрил S-200, рН 4,8

I

КМ-сефароза CL-6B, рН 4,8 Выход - 35 %

II. ДЭАЭ-сефароза CL-6B, рН 7,0

i

КМ-сефароза CL-6B, рН 4,8

1

Сефакрил S-200, рН 4,8 Выход - 41 %

III. ДЭАЭ-сефароза CL-6B, рН 7,8

Сефадекс G-150, рН 5,6 I

КМ-сефароза CL-6B, рН 5,6 Выход - 50 %

Рис. 2. Варианты получения высокоочищенной гиапуронидазы

Выбран вариант I, который сочетал удовлетворительный выход и достаточно высокую степень очистки фермента. Способ заключается в удалении примесных белков на ДЭАЭ-теоперл с использованием 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,8, сорбции ТГ на КМ-сефарозе, уравновешенной 0,05 М ацетатным буфером, рН 4,8, содержащем 0,1 М №С1 и элюции белка 0,3 М №С1. Указанный метод использовали для получения ТГ в препаративных количествах.. Выход фермента составил 30-40 %, что компенсируется высоким качеством конечного продукта и сохранением его основных физико-химических свойств.

После адаптации указанной схемы к промышленным условиям и проведения дополнительной серии исследований была разработана технология крупномасштабного производства препарата тестикуляр-ной гиалуронидазы.

Таким образом, в первой части исследований выяснено, что в процессе экстракции из семенников КРС извлекается значительное количество белков, не обладающих специфической активностью. Разработан метод выделения ТГ, предложена технология, осуществимая в производственных условиях. Кроме того, показано, что уда-пение высокоаллергенного белка, каким является БСА, возможно только при использовании ионообменной хроматографии. Применение риванола, ПЭГа и сульфата аммония не позволило добиться подобного результата.

На заключительном этапе исследований изучены аллергенность >1 физико-химические свойства препарата. Сравнительное изучение соммерческой (КГ) и трех экспериментально-производственных (ЭГ) зерий препарата различного качественного состава проводили с ис-юльзованием метода активной системной анафилаксии на морских ;винках (табл. 2).

В первом опыте сравнивались КГ, сер. 154 и ЭГ, сер. 2. Морских свинок (по 20 в каждой группе) иммунизировали, вводя внутрибрю-шинно ту или другую гиалуронидазу по 1 мл, содержащему 1 терапевтическую дозу (64 у.е.), и спустя 2 недели разрешали внутривенным введением. соответствующего препарата. При разрешении в дозе 0,5 мл все животные в обеих группах выжили, но картина анафилактического шока была выражена гораздо ярче у животных первой (КГ, сер. 154) группы. Индекс \Л/СО составил 2,3 против 1,2 во второй (ЭГ, сер. 2) группе (в табл. 2 не показано).

Таблица 2

Аллергенность препаратов гиалуронидазы различного качественного состава в реакции активной системной анафилаксии на морских свинках

Препарат, серия 1-й опыт 2-й опыт

% смертности Индекс \Л/СО % смертности Индекс \Л/СО

КГ, сер. 154 66,7 3,3 83,3 3,7

ЭГ, сер.1 83,3 3,8

ЭГ, сер.2 14,3 2,1

ЭГ, сер.З 33,3 2,5

При увеличении разрешающей дозы до 1 мл, в первой группе погибло 66,7 % животных, а во второй лишь 14,3 %. Индекс \А/СР составил, соответственно, 3,3 и 2,1.

Во втором опыте изучалась аллергенность ЭГ, сер. 1 и 3 в сравнении с КГ, сер. 154. Разрешение морских свинок производили внутривенным введением 1 мл соответствующего препарата (64 у.е.) Смертность животных в первой группе (КГ, сер. 154) составила 83,3 %, а индекс УУСО был равен 3,7. Во второй (ЭГ, сер. 1) и третье£

ЭГ, сер. 3) группах смертность составила 83,3 и 33,3 %, а индекс NCD - 3,8 и 2,5, соответственно.

Таким образом, сравнительное изучение сенсибилизирующих :войств препаратов ТГ позволило установить следующее. Коммерче-:кая сер. 154 обладала высокой анафилактогенностью. Вариант до-юлнительной очистки, использованный для получения ЭГ, сер. 1, ючти вдвое снижал содержание общего белка, практически полночью позволял удалить ЛП, но содержание БСА снижалось незначи-ельно. Вопреки ожидаемому результату аллергенность препарата не 1зменилась. Смертность животных и величина-индекса WCD остаюсь на прежнем уровне.

Далее, для получения ЭГ, сер. 2 мы целенаправленно использо-али хроматографические методы очистки с целью более полного увлечения БСА. Содержание белка при этом снизилось до 4,4 мг/мл, iCA - до 0,2 мг/мл. Простые арифметические подсчеты показывают, то разница концентрации белка между сер. 1 и сер. 2 ЭГ составляет

2»дг*/в*г» КО l//-\-rv"\ r\ LIV иг» ПЛП1Л Cf"4 Л ПЛМУЛ т*тг*п П lir/l*n Мииндм г»п/-»

IVIt/KlJI, v to l\Ui I IU 11 \_/ l_/W I \ II^IIAU^ril W/l l»l I / llri J I. у 11 I kJI IV t V I WJ IV*

ами, около 70 % удаленного белка составляет БСА, и, как следствие, нафилактогенность снизилась практически в два раза. ЭГ, сер. 3, олученная с использованием дополнительной стадии очистки на КМ-ефарозе, имела более высокую степень очистки, но дальнейшего нижения показателя АСА не наблюдалось. Варианты очистки, при-¡ененные для получения ЭГ, сер. 2 и 3, характеризовались практиче-ки равноценным снижением аллергенности (смертность животных по тношению к КГ, сер. 154 меньше на 52,4 и 50,0 % , соответственно).

Для более полной оценки сенсибилизирующих свойств препара-ов гиалуронидазы исследована их способность вызывать ГЗТ у мы-jen (рис. 3). Препараты испытывались с активностью 1 ТД/мл. ИР у мвотных, которым вводили КГ, сер 154, составил (9,7±2,7)%, а при

17

введении ЭГ, сер. 1 был даже несколько выше - (10,8±4,2)%. ИР у мышей при введении ЭГ, сер. 2 составил всего (3,6+0,7)%, что значительно меньше 5%-го критерия, с которого начинается учет аллерген-ности, и только при введении 10-кратной дозы препарата отмечено небольшое возрастание этого показателя - до (6,9+0,7)% (на рис. 3 не показано).

Следовательно, вариант очистки, использованный для получения ЭГ, сер. 1, не позволяет устранить сенсибилизирующие свойства, выявляемые в данном тесте, и только дополнительное применение комбинированной ионообменной хроматографии обеспечивает получение гипоаллергенного препарата (ЭГ, сер. 2 и 3).

КГ ЭГ1 ЭГ2 ЭГЗ Б

Рис. 3. Зависимость показателей анафилактогенности и гиперчувствитель ности замедленного типа от содержания общего белка и бычьего сы вороточного альбумина в препаратах тестикулярной гиалуронидазы.

Затем было проведено сравнительное изучение некоторых физи ко-химических свойств препаратов различной степени очистки. Моле

(улярную массу ТГ определяли двумя способами: гель-фильтрацией 4 электрофорезом. При изучении очищенных препаратов гиалурони-}азы методом электрофореза в денатурирующих условиях определяюсь одна основная полоса с ММ 60 «Да, две минорных и 3 слабо окрашенные зоны высокомолекулярных белков. При разделении на \.сА 34 коммерческий препарат был представлен 10 фракциями, а ЭГ, ;ер. 2 - тремя белковыми пиками с ММ 160, 60 и 40 кДа. В последнем :лучае распределение ГА по фракциям А, В и С составило 80,4; 19,6 I 0%, соответственно.

Увеличение относительного содержания фракции А на 65% по равнению с КГ, сер. 154 возможно вследствие образования поли-1ерных форм фермента во время лиофильного высушивания препа-1ата, при котором снижение ГА не превышало 7%. Примерно такая же еличина потерь наблюдается и при высушивании коммерческого репарата. Лиофильно высушенные экспериментальные серии со-рэняли ГА при хранении в интервале температур от 0 до 10 °С в те-ение одного года (срок наблюдения).

Дополнительные исследования, проведенные с использованием [етода ускоренного «старения» (прогрев при температуре 37 °С в эчение 30 сут.), позволили установить, что уровень специфической кгивности фермента в ЭГ, сер. 4 снизился на 10 %, а в ЭГ, сер.1, 2, 3 зменений активности не наблюдалось (статистически не остоверны). Указанные экспериментальные серии препарата содер-али различное количество солей и стабилизаторов. Полученные ре-/'льтаты позволяют сделать вывод о стабильности тех серий препа-эта, где в качестве стабилизатора использовался глицин в количест-э 20 г/л, общее содержание К\ Са++ и Мд++ доводилось до '3 осмолярности по №С1 и имелось некоторое количество Сахаров 1е более 1 %).

Показано, что активность препаратов ТГ проявляется в интервале рН от 3,0 до 8,0. Оптимальным является значение рН, равное 4,0 (рис. 4). Однако динамика изменения активности в коммерческом и экспериментальных препаратах значительно различается.

рн

Рис. 4. Влияние рН среды на специфическую активность препаратов тести кулярной и сывороточной гиалуронидаз

Так, в коммерческом препарате при рН 8,0 отмечается боле« низкое значение ГА ~ 2,6 % от активности при рН 4,0, но более высо кое при рН 3,0 (21,7 %), чем в ЭГ - 6,9 и 6,2 %, соответственно.

Резкое снижение ГА в обоих препаратах наблюдается при рЬ выше 5,0. Учитывая, что при рН более 6,0 специфическая активност! сывороточной Г не определяется (этот фермент был специально вы делен для проведения сравнительного изучения), можно предполо жить, что динамика ГА в исследуемых препаратах связана именно I

СГ. Следовательно, специфическая активность, определяемая в интервале рН от 6,0 до 8,0, обусловлена наличием нейтральной гиалу-ронидазы.

Неоспорим тот факт, что при физиологических условиях, существующих в крови и тканевой жидкости, где рН находится в пределах 3,8-7,2, биологическая эффективность препарата будет определяться именно таким значением рН.

При изучении зависимости ГА от концентрации №С1 было установлено, что в гипертонической среде полученный препарат проявля-эт относительно более высокую активность по сравнению с КГ [рис. 5).

ЫаС1,М

эис. 5. Влияние различных концентраций №С1 на специфическую активность препаратов тестикулярной гиалуронидазы при рН 4,0

При концентрации NaCl, равной 0,4 М, наблюдалось снижение ГА коммерческого препарата на 68 %, в то время как ЭГ - только на 24 %. При увеличении содержания NaCl в буфере до 0,5 М гиалуро-нидазная активность КГ и ЭГ снижалась на 92 и 29 %, соответственно.

Таким образом, в результате проделанных исследований разработана промышленная технология получения гипоаллергенного высокоочищенного препарата тестикулярной гиалуронидазы, позволяющая снизить содержание общего белка в 5 раз, практически полностью удалить БСА, ЛП и нейтральные протеазы.

Полученный препарат обладает высокой удельной активностью, полностью сохраняет все основные физико-химические и имму-нохимические свойства.

Достигнутый качественный уровень не является окончательным. Из литературных источников известно, что ТГ имеет короткий период полураспада в "крови, который составляет около (3,2±0,8) мм (Wolf R., 1981). Кроме того, при внутримышечном введении биодос тупность препарата определяется в пределах от 42 до 60 % (Сафонова Г.М. и др., 2000).

В этой связи представляется целесообразным использовал полученную высокоочищенную ТГ для создания модифицированной препарата. Существующие отечественные наработки в этой облает! (Стекольников Л.И. и др., 1977; Максименко A.B. и др., 1986; Некрасо! A.B. и др., 1998) создают благоприятные условия и позволяют наде яться на успешное проведение исследований. Кроме того, учитыва все преимущества внутривенного способа доставки лечебны средств, необходимо проведение дополнительных работ и в это! направлении.

выводы

Разработан метод выделения высокоочищенной гиалуронидазы из семенников КРС, стабильной по физико-химическим свойствам.

Показано, что высокая аллергенность коммерческого препарата «Лидаза» обусловлена присутствием балластных веществ, среди которых содержание БСА достигает 1/4 части от общего количества белка.

Разработана и оптимизирована промышленная технология производства тестикулярной гиалуронидазы, обеспечивающая получение гипоаллергенного высокоочищенного препарата с удельной активностью не менее 13 у.е./мг белка.

Впервые установлено наличие в коммерческом и разработанном препаратах гиалуронидазы сывороточного происхождения, которая при рН выше 6,0 полностью теряет свою активности. Уровень специфической активности, определяемый в препаратах при рН 4,0, по сути является суммой активностей тестикулярных гиалуронидаз.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Якин О.Г., Исрафилов А.Г., Мельников Н.В. Определение молекулярной массы тестикулярной гиалуронидазы методом диск-электрофореза // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Матер. Всеросс. науч. конфер. - Уфа, 2000. - Ч. 2. - С. 18 -20.

Якин О.Г., Исрафилов А.Г., Козырева М.Х., Алсынбаев М.М., Сит-дикова A.B. Изучение качественного состава лечебного ферментного препарата «Лидаза» // Там же. - С. 20 - 22.

Мельников Н. В., Якин О.Г., Нигамов Ф.Н., Вахитов Р.З., Козырева М.Х. Способ получения тестикулярной гиалуронидазы: Патент РФ № 2158131, 7 А61 К35/54, С. 12 N 9/26. - Опубл. 27.10.2000 г. // Б.И.-2000.-№30.

Якин О.Г., Мельников Н.В., Козырева M. X., Вахитов Р.З., Нигамов Ф.Н., Вахитов Р.Ш., Юсупов В.Г. Способ получения гиалуронидазы: Патент РФ № 2159284, С. 7 12 N 9/26, А 61 К 35/54. - Опубл. 20.11.2000 г//Б.И. - 2000. - №32

Якин О.Г., Трофимов В.А., Алсынбаев М.М. Получение и сравнительное изучение аллергенности различных вариантов препарата «Лидаза» // VIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тез. докл. - Москва, 2001. - С.89.

Якин О.Г., Нигамов Ф.Н., Трофимов В.А., Салихова Н.Х., Алсынбаев М.М. Влияние условий проведения ультрафильтрации и качества воды на ферментативную активность препарата «Лидаза» II Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Матер, науч. конфер. - Томск, 2001. - С. 58 - 60.

ЯкинОлег Геннадьевич

Разработка промышленной технологии получения высокоочищенного препарата тестикулярной гиалуронидазы

Автореферат

Ответственный за выпуск Р.К. Каримова Лицензия МП РФ № 03855 от 25.01.01 г.

Подписано к печати 14.11.01. Бумага печатная пром. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Arial. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1,27. Тираж 50 экз. Заказ 1165.

© РИО ГУП «Иммунопрепарат» 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105, тел.: (3472) 213-214. Лицензия МП РФ № 00944 от 2.02.01 г.