Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Антифибротический эффект и механизмы действия пегилированной гиалуронидазы и спиперона при пневмофиброзе (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

РЕЗЦОВА АЛЕНА МИХАЙЛОВНА

АНТИФИБРОТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ПЕГИЛИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ И СПИПЕРОНА ПРИ ПНЕВМОФИБРОЗЕ

(экспериментальное исследование)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

13 МАР 201-1

Томск-2014

005545974

005545974

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Дыгай Александр Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, заслуженный деятель науки РФ

Скурихип Евгений Германович, доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты:

Кондакова Ирина Викторовна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория биохимии опухолей, руководитель лаборатории

Серебрякова Валентина Александровна, доктор медицинских наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра патофизиологии, ассистент кафедры

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится _2014 г. в^'^часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01. при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

¿реЛрс

Автореферат разослан " ¿О" ф&брСЬМ 2014 г. Ученый секретарь

диссертационного совета ¿7

доктор биологических наук — Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Идиопатический фиброз лёгкого (ИФЛ) является наиболее распространённой и преимущественно смертельной формой идиопатической интерстициальной пневмонии. Болезнь возникает преимущественно в среднем или старшем возрасте и проявляется в рубцевании здоровой ткани лёгкого, что затрудняет дыхание больных. Больные после постановки диагноза живут не более 3-5 лет [Olson A.L., Swigris J.J., 2012]. В настоящее время в США 128000 американцев больны ИФЛ. Каждый год диагностируется 48000 новых случаев и 40000 больных ежегодно умирают от этой болезни. Эпидемиологическая обстановка в Российской Федерации имеет схожий тренд [Фещенко Ю.И., 2005]. Этиология этого хронического и быстро прогрессирующего заболевания недостаточно полно изучена, хотя такие факторы риска как курение и воздействия окружающей среды описаны [Kelly B.G. et al., 2002; Denham J.W., Hauer-Jensen M., 2002]. За последние 10 лет были достигнуты существенные успехи в понимании патогенеза ИФЛ. На данный момент акцент с преимущественно провоспалительной компоненты заболевания сместился в сторону фибробластического процесса, нефизиологического ремодулирования тканей, чрезмерного накопления белков внеклеточного матрикса (коллагена) и ангиогенеза [Loomis-King H. et al., 2013].

На протяжении последних трёх десятилетий в эксперименте на различных моделях пневмофиброза были описаны противовоспалительные и антифибротические свойства более 240 соединений [Moeller Antje, et al., 2006; Amber L. D., William E. L., 2011]. Между тем, подавляющее большинство соединений изучены в профилактическом режиме введения и только 5% из них испытаны в условиях развёрнутой фазы болезни. Уверенности в том, что прошедшие жёсткий отбор доклинических исследований соединения успешно пройдут клинические испытания, нет. В настоящее время только один терапевтический агент - пирфенидон, был одобрен для лечения идиопатического фиброза: Япония в 2010 г., Европа в 2011 г., Китай в 2011 г. В клинических испытаниях у пациентов, принимавших внутрь пирфенидон, было отмечено значительное увеличение жизненной ёмкости легких по сравнению с теми, кто не принимал препарат [Gomer R.H., 2013; Okuda R., et al., 2013]. Прогрессирование болезни замедлялось, но не останавливалось. На изолированных человеческих мононуклеарных клетках периферической крови было показано, что пирфенидон сокращает выработку фиброгенных медиаторов (TGF-ß) и воспалительных медиаторов (TNF-a, IL-lß) [Albera С., et al., 2013]. Примечательно, что FDA (Food and Drug Administration, США) отказалось одобрить использование пирфенидона. Это связано, во-первых, с незаконченностью клинических исследований, во-вторых, с развитием побочных эффектов при его назначении. Пирфенидон при приёме внутрь вызывает желудочно-кишечные расстройства, фоточувствительность, сыпь,

зуд, сухость кожи, печёночные дисфункции, головокружение, усталость, потерю веса [Cano-Jiménez Е., 2012; Cottin V., 2013]. Перспективный, на первый взгляд, пирфенидон в клиническую фазу исследований не проявил ожидаемую антифибротическую активность на этапе развёрнутой стадии болезни, кроме этого, препарат используется в высоких дозах и ограничен в применении при сопутствующей терапии.

Полученные за последние 3 года в ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН (г. Томск) данные экспериментальных исследований кардинально изменили существующую парадигму клеточной терапии стволовыми клетками (СК) дегенеративных заболеваний [Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., 2012; Дыгай A.M. и др., 2013]. Отказавшись от малоэффективного использования эмбриональных плюрипотентных стволовых клеток (с большой вероятностью спонтанной трансформации и индукции злокачественных опухолей) и взрослых донорских мезенхимальных стволовых клеток (с паракринным / иммуномодулирующим эффектом), была обоснована необходимость модуляции эндогенных СК и тканеспецифичных прогениторных клеток в лечении больных ИФЛ [Дыгай A.M. и др., 2011; Скурихин Е.Г. и др., 2012; Скурихин Е.Г. и др., 2013]. Доказательством состоятельности предложенной концепции терапии выступают восстановление целостности альвеолярного эпителия, снижение активности воспаления (в том числе продукции про-воспалительных сигнальных молекул), и / или нарушения фиброгенеза при избирательном воздействии лекарственных средств на костномозговые и регионарные СК и прогениторные клетки-мишени гемопоэтического и мезенхимального происхождения [Дыгай A.M. и др., 2011; Дыгай A.M. и др., 2013; Скурихин Е.Г. и др., 2013]. В качестве потенциального антифибротического средства предлагаются соединения, ремодулирующие легочной матрикс гиалуронана (в частности, гиалуронидаза) [Дыгай A.M. и др., 2012]. Однако период полувыведения из ткани гиалуронидазы не превышает 3-5 минут, что существенно уменьшает продолжительность терапевтического эффекта [Girish K.S., Kemparaju К., 2007; Edith S. A. Hofinger et al., 2007].

На сегодняшний день модификация молекул химическим или физическим пегилированием активно развивающееся направление фармакологии. Присоединение белков к полиэтиленгликолю практически не влияет на фармакологическую активность базовой для конъюгата молекулы, но улучшает её фармакинетические свойства: удлиняется период полураспада, замедляется выведение, отсутствуют пики плазменной / тканевой концентрации, понижаются токсичность, иммуногенность и аллергенность [Piedmonte D.M., Treuheit M.J., 2008; Jain N.K., Nahar Manoj, 2010]. Преимущества пегилированных лекарственных препаратов пептидной структуры, созданных с помощью ионизирующего излучения (ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», г. Новосибирск), над нативными аналогами продемонстрированы на модели цитостатической миелосупрессии [Дыгай A.M. и др., 2010].

Тяжесть ИФЛ у пациентов различна. Если для одних больных необходима монотерапия, то для больных с агрессивным течением фиброза этого не достаточно. Вполне закономерно, что эффективная стратегия лечения больных с ИФЛ на современном этапе должна быть ориентирована на более чем один профиброзный путь патогенеза. Исходя из этого, нами видится перспективной тактика "комплексной" терапии, основанная на использовании соединений, ремодулирующих матрикс гиалуронана и способных изменять активность СК. Снижение интенсивности воспаления и фиброгенеза модуляцией прогениторных / стволовых клеток нейротропными средствами была продемонстрирована на блеомициновой модели пневмофиброза A. Fabre с коллегами (2008), A.M. Дыгаем (2012) и Е.Г. Скурихиным с коллегами (2011,2012,2013).

Принимая во внимание вышеизложенное, является актуальным изучение противовоспалительной и антифибротической активностей пегилированной на полиэтиленоксиде электронно-лучевым синтезом гиалуронидазы, а так же механизмов её действия, связанных с прогениторными / стволовыми клетками гемо- и мезенхимопоэза в условиях токсического пневмофиброза. Исследование представляет интерес и с той точки зрения, что позволит получить патогенетическое обоснование целесообразности коррекции фиброза лёгких назначаемыми совместно спипероном и пегилированной гиалуронидазой.

Степень разработанности. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения лекарственных препаратов для лечения ИФЛ нет. Существующий набор лечебных мероприятий для лёгочного фиброза ограничен и не эффективен. Клиническая практика использования глюкокортикоидов, циклофосфамида, иммунодепрессантов,

антикоагулянтов, комплексной терапии (антиоксидантами/ иммунодепрессантами, антифиброзными соединениями/

противовоспалительными соединениями/антиоксидантами, антагонистами рецепторов эндотелина и сосудорасширяющими средствами), направлена на лечение осложнений и является поддерживающей терапией. Разработанные в эксперименте подходы для лечения ИФЛ (использование иммунорегуляторных цитокинов, ограничивающих пролиферацию фибробластов и синтез коллагена, стимуляция ангиогенеза и ингибиция синтеза коллагена, лечение донорскими мезенхимальными стволовыми клетками, трансплантация лёгких) в клинической практике не оправдывают ожиданий.

Таким образом, существует высокая потребность в создании новых эффективных лекарственных средств для лечения ИФЛ в связи с отсутствием таковых.

Цель исследования. Изучить антифибротическую активность и механизмы действия пегилированной на полиэтиленоксиде гиалуронидазы при пневмофиброзе. Дать патогенетическую оценку целесообразности

совместного назначения пегилированной гиалуронидазы и спиперона в коррекции фиброзного заболевания лёгких.

Задачи исследования:

1. На модели блеомицин-индуцированного пневмофиброза изучить противовоспалительные и антифибротические эффекты пегилированной гиалуронидазы при различных режимах (профилактический, терапевтический) и способах введения (внутривенное, внутрижелудочное, интраназальное).

2. Оценить действие пегилированной гиалуронидазы на костномозговые и регионарные стволовые и прогениторные клетки гемо- и мезенхимопоэза при фиброзе лёгких.

3. В условиях интратрахеального введения блеомицина изучить возможность коррекции спипероном воспалительной реакции и фиброгенеза в лёгких, а так же механизмы его действия.

4. Исследовать противовоспалительную и антифибротическую активности пегилированной гиалуронидазы на фоне введения спиперона.

5. Оценить состояние мезенхимальных и гемопоэтических прогениторных / стволовых клеток в условиях коррекции пегилированной гиалуронидазой и спипероном блеомицин-индуцированного воспаления и фиброгенеза в лёгких.

Научная новизна работы. В работе на модели токсического пневмофиброза, вызванного назначением блеомицина, выявлена антифибротическая активность 8 ЕД пегилированной гиалуронидазы (пегГД), вводимой мышам линии С57ВЬ/6 интраназально, а также механизмы её действия. Продемонстрирована возможность повышения спипероном специфической фармакологической активности пегГД в условиях частично обратимого и необратимого пневмофиброза.

Результаты скрининговых исследований позволили выявить, что в условиях однократного интратрахеального (ИТ) введения блеомицина (частично обратимый пневмофиброз) антифибротическая активность 8 ЕД пегГД проявляется в случае интраназального введения и оказывается выше, чем у 16 ЕД тестикулярной гиалуронидазы. Внутривенное и внутрижелудочное введение конъюгата не влияет на отложение фибротических масс в лёгких. Пегилированная гиалуронидаза при ИТ инсталляции блеомицина эффективна, как в случае назначения в воспалительную фазу пневмофиброза (профилактический режим), так и в фибротическую фазу развития болезни (терапевтический режим). Подтверждение высокой антифибротической активности терапевтического введения пегилированного фермента получено и в условиях многократно повторяющегося токсического повреждения лёгких (необратимый пневмофиброз).

Причиной снижения пегГД интенсивности отложения фибротических масс выступает системное уменьшение количества МСК (СБЗГ, СВ34', СЭ45~, СЭ44+, СБ73+, СЭ90+, СБ106+), прогениторных фибробластных

клеток (CD45-) и пан-гемопоэтических клеток (CD45+). Воспалительная фаза развития пневмофиброза характеризуется сокращением в лёгких ГСК (Sca-1+, c-Kit+, CD34", (CD3, CD45R (В220), Ly6C, Ly6G (Grl), CDllb (Macl), TER-119)").

Выявлены основы противовоспалительной и антифибротической активности спиперона. В условиях частично обратимого пневмофиброза это связано с сокращением популяции прогениторных CD45+ -клеток в костном мозге и циркулирующей крови, падением их клональной активности (образование КОЕ-Н, КОЕ-ГЭММ, КОЕ-Г), а так же со снижением клональной активности костномозговых, циркулирующих в крови и легочных прогениторных С045_-клеток (образование КОЕ-Ф) и интенсивности дифференцировки МСК лёгких в клетки стромальных линий.

Последовательное назначение пегГД и спиперона более эффективно в терапии экспериментального фиброза лёгких, чем их изолированное курсовое введение. Кроме значительной антифибротической активности (патологическое отложение коллагена в блеомициновых лёгких не регистрируется), снижается инфильтрация интерстиции альвеол и альвеолярных ходов клетками воспаления. В основе этих эффектов лежит существенное падение числа прогениторных С045~-клеток и МСК в костном мозге и уменьшение ими экспансии лёгких.

Теоретическое и практическое значение работы. На моделях блеомицин-индуцированного пневмофиброза продемонстрирована высокая антифибротическая активность интраназально вводимой пегилированной гиалуронидазы, представляющей собой иммобилизированную на полиэтиленоксиде тестикулярную гиалуронидазу с помощью оригинальной технологии электронно-лучевого синтеза (разработанной ЗАО "Сибирским Центром Фармакологии и Биотехнологии", г. Новосибирск совместно с ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН, г. Томск). Тот факт, что активность пегилированного фермента проявляется не только при профилактическом режиме введения, но и при назначении во время фибротической фазы развития болезни (терапевтический режим), позволяет рассматривать его как «истинный» противофибротический фактор и предложить включить в качестве компонента антифиброзной терапии лёгких в наиболее тяжёлую фазу развития болезни.

Представленные в настоящем исследовании данные об эффектах пегГД на фоне введения спиперона указывают на перспективность последовательного изменения структурно-пространственной организации матрикса гиалуронана фиброзированных лёгких и модуляции функциональной активности нервной системы в лечении хронических заболеваний лёгких, в том числе ИФЛ.

Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам, выбраны современные высокоинформативные методические подходы, имеющиеся в научно-исследовательских лабораториях ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН и созданы новые

методы исследования. В качестве объекта исследования изучались мыши-самцы линии C57BL/6 в возрасте 8-10 недель. В работе использовались гистологические методы для оценки интенсивности воспаления и определения относительной площади фиброзированной ткани в легких. Цитометрический анализ поверхностных маркеров позволил определить фенотип клеток. Культуральными методами оценивалась функциональная активность стволовых и прогениторных клеток различных классов и различного происхождения. Результаты исследования обработаны методами статистического анализа.

Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов исследования, высокотехнологичного оборудования, а также адекватных критериев для статистической обработки результатов.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины: возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 5th International Conference on Drug Discovery & Therapy (Dubai, 2013), IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2012), первой всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва 2012), 6А Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stern Cell (October 1214, 2013, Dalian, China), 1-м Национальном Конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2013).

По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 9 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1 статья в иностранном журнале. Получен патент на изобретение «Способ повышения эффективности терапии нарушений в легочной ткани при цитостатических воздействиях», № 2497523, опубликовано 10.11.2013, бюллетень № 13. Получена приоритетная справка от 08.08.2013 на патент «Способ изучения дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток легких при пневмофиброзе», per. № 2013137273.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком, 17 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 401 источников, из них 34 отечественных и 367 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна, практическое значение работы.

В первой главе проведен анализ отечественной и зарубежной научной литературы по теме исследования. Изложены современные представления о патогенезе пневмофиброза и механизмах регенерации альвеолярного эпителия. Рассмотрены основные тенденции создания лекарственных препаратов, в том числе пегилирование фармакологически активных молекул, и структура, эффекты и механизмы действия объектов исследования — пегилированная гиалуронидаза и спиперон.

Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования. Эксперименты выполнены на 985 мышах-самцах линии C57BL/6 в возрасте 8-10 недель. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыщи) получены из питомника ФГБУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН (сертификат имеется). Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены этическим комитетом ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН.

Для моделирования токсической травмы альвеолярного эпителия использовали блеомицин (Blenoxane®; «Säo Paulo», Бразилия). Однократное повреждение лёгких — частично обратимый пневмофиброз, вызывали однократным интратрахеальным (ИТ) введением блеомицина (80 мкг / в 30 мкл NaCl 0,9% / мышь) [Sebti S.M. et al„ 1989; Chua F., et al., 2005]. Повторяющееся повреждение лёгких - необратимый пневмофиброз, вызывали однократной ИТ инсталляцией блеомицина (80 мкг / в 30 мкл NaCl 0,9% / мышь) с последующим (7, 14, 21, 28-й день эксперимента) интраназальным (ИН) назначением препарата (80 мкг / в 15 мкл NaCl 0,9% / мышь). Первое введение блеомицина принимали за 0 день эксперимента.

В условиях частично обратимого пневмофиброза 16 ЕД тестикулярной гиалуронидазы и 8 ЕД пегилированной гиалуронидазы (пегГД) (бычья тестикулярная гиалуронидаза, полученная из животного сырья (семенников КРС) оба соединения ЗАО "Сибирский Центр Фармакологии и Биотехнологии", г. Новосибирск) разводили в 18 мкл FBS и вводили ИН, внутривенно (ВВ) или внутрижелудочно (ВЖ) на 1, 3, 7, 10-й день эксперимента - фаза воспаления (профилактический режим). При необратимом пневмофиброзе пегГД (8 ЕД / 18 мкл FBS / мышь) и тестикулярную гиалуронидазу (16 ЕД / 18 мкл FBS / мышь) вводили ИН на 10-16, 18-23, 25-30, 36-42-й день - отложение фибротических масс (терапевтический режим).

В условиях частично обратимого пневмофиброза спиперон (spiperone «Sigma», США) вводили в дозе 1,5 мг/кг в 100 мкл NaCl 0,9% внутрибрюшинно (ВБ) через 3 ч и на 1, 3, 6, 7, 13-21-й день после ИТ инсталляции блеомицина (профилактический режим). В условиях необратимого пневмофиброза спиперон (1,5 мг / 100 мкл NaCl 0,9% / кг) вводили ВБ на 10-16, 18-23, 25-30, 36-42-й день эксперимента (терапевтический режим).

При изучении эффективности комплексного лечения частично обратимого пневмофиброза пегГД (8 ЕД / 18 мкл FBS / мышь) вводили ИН на 1,3,6,7,13-21-й день эксперимента, через 1 час ВБ вводили спиперон (1,5 мг / 100 мкл NaCl 0,9% / кг). В условиях необратимого пневмофиброза пегГД (8 ЕД / 18 мкл FBS / мышь) вводили ИН на 10-16, 18-23, 25-30, 36-42-й день эксперимента, через 1 час ВБ вводили спиперон (1,5 мг / 100 мкл NaCl 0,9% /кг).

Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора. Фоновые показатели получали при использовании интактных животных.

Гистологическое исследование ткани легких выполняли по стандартной методике, окрашивали гематоксилин-эозином, азур-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону [Лилли Р., 1969; Меркулов Г.А., 1969]. Определение экспрессии мембранных рецепторов анализировали с использованием мышиных моноклональных антител («BD Biosciences», США). Клональную активность CD45+- и С045"-клеток определяли клональными методами в нашей модификации [Ventura G.J. et al, 1990; Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Исследовали формирование колониеобразующих единиц недифференцированного (КОЕ-Н), гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарного (КОЕ-ГЭММ), гранулоцитарного (КОЕ-Г), эритроидного (КОЕ-Э) и фибробластного (КОЕ-Ф) типа. В условиях длительного культивирования оценивали способность МСК легких к самоподдержанию [Mensing N. et al., 2011; Скурихин Е.Г. и др., 2012]. Изучали дифференцировку МСК легких в клетки стромальных линий: остеобласты, адипоциты, хондроциты и фибробласты [Скурихин Е.Г. и др., 2012; Pershina О., Skurikhin Е., Khmelevskaya Е., 2012]. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программы статистики SPSS 12,0 и пакета статистических программ «Statistica 8.0». Данные представлены в виде М±ш, где М - среднее значение, m - стандартная ошибка среднего значения. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5% (Р<0,05). Используя выборочные коэффициенты асимметрии и эксцесса, оценивали степень приближения закона распределения исследуемого признака к нормальному. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараматрический критерий U-критерий Уилкоксона [Гланц С., 1999; Гмурман В.Е., 2002].

Третья глава диссертации посвящена описанию полученных результатов исследования. Числовые данные представлены в виде таблиц и рисунков.

На первом этапе настоящего исследования на модели частично обратимого пневмофиброза изучались противовоспалительные и

антифибротические свойства пегГД в сравнении с нативной гиалуронидазой в различных режимах, производился поиск оптимальных путей введения соединения.

Как видно из рисунка 1 и таблицы 1, основные эффекты вводимых ИН в профилактическом режиме пегГД и нативной гиалуронидазы были связаны с блокадой повреждения блеомицином альвеолярного эпителия и уменьшением содержания коллагеновых волокон в лёгких. При этом пегилированный фермент более эффективно замедлял отложение фиброзных масс по сравнению с нативной гиалуронидазой. Интенсивность воспалительной реакции в поврежденных блеомицином лёгких под воздействием соединений в целом не изменялась. Различия состоят в том, что у больных не леченых мышей инфильтрат локализовался преимущественно у корня лёгкого, при назначении пегГД и нативной гиалуронидазы наблюдалась диффузная инфильтрация воспалительными клетками. В инфильтрате леченных животных имело место незначительное увеличение количества макрофагов и снижение числа нейтрофилов (Рисунок 1).

Г

д Е ....--и. :!

Рисунок 1 - Морфологическая картина лёгких мышей линии С57ВЬ/6 при частично обратимом пневмофиброзе (А, Б) и мышей с частично обратимым пневмофиброзом, леченных интраназальным введением нативной гиалуронидазы (В,Г) и пегГД (Д,Е) в профилактическом режиме. А, В, Д - 14-й день эксперимента; Б, Г, Е - 21-й день. Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону. ув. хЮО.

Внутривенное и внутрижелудочное введение пегГД в профилактическом режиме не оказывает влияния на воспаление и содержание соединительной ткани в блеомициновых лёгких.

Таблица 1 - Влияние нативной гиалуронидазы и пегГД при интраназальном введении на содержание соединительной ткани (% от общей площади ткани) в легких мышей линии С57ВЬ/6 при частично обратимом пневмофиброзе (М ± т)__

День исследования Интактный контроль Блеомицин Блеомицин + нативная гиалуронидаза Блеомицин + пегГД

7 1.13 ±0,07 3,07 ±0,07* 3,05 ±0,17 * 2,35 ± 0,16 *,#

14 1,14 ±0,03 3,91 ± 0,07 * 2,60 ±0,21 *,# 2,33 ±0,15 *,#

21 1,15 ±0,06 4,26 ± 0,14 * 3,24 ± 0,07 *, и 2,90 ±0,11 *,#

Примечание - Р < 0,05 - отмечена достоверность различия показателя: от интактного контроля - *, от блеомицинового контроля - #.

Представленные результаты позволяют сделать вывод, что ИН введение пегГД в профилактическом режиме изменяет характер воспалительной реакции и препятствует отложению фибротических масс в паренхиме лёгких у мышей при частично обратимом пневмофиброзе, при этом антифибротический эффект 8 ЕД пегилированного фермента более выражен, чем у 16 ЕД нативной гиалуронидазы.

При поиске потенциальных антифибротических соединений необходимо различать лекарства, обладающие высокой активностью во время воспаления и раннего фиброгенного ответа, и лекарства, препятствующие прогрессированию фиброза. Вторая группа соединений более значима для клинического применения и это предопределило оценку активности пегГД в условиях интенсивного фиброгенеза.

Модель токсического пневмофиброза, вызванная однократным ИТ введением блеомицина, наиболее широко применяется в экспериментальных исследованиях для изучения патогенеза и поиска возможных способов лечения фиброзных заболеваний лёгких. Считается, что лёгкие содержат низкие уровни такого фермента как блеомицин-гидролаза. Это и обуславливает высокую чувствительность к блеомицин-индуцированному повреждению ткани [ЗеЫл Б.М. е! а1., 1989]. Блеомицин вызывает субплевральное рубцевание аналогичное человеческому заболеванию [СЬиа ¥. й а1., 2005]. Внутриальвеолярные почки, интрамуральные включения коллагена и закрытие альвеолярного пространства присутствуют у пациентов с ИФЛ и у животных, леченных блеомицином [Шикл К. Р. У., 1995]. Однако, несмотря на явные преимущества обсуждаемой модели, следует упомянуть о частичной обратимости фиброза в условиях введения блеомицина [1гЫск1 в. е1 а1., 2002]. Медленное и необратимое прогрессирование болезни у пациентов с ИФЛ у экспериментальных животных, получавших блеомицин однократно, невоспроизводимо [СЬиа Р. е1 а!., 2005].

А

Рисунок 2 - Морфологическая картина лёгких мышей линии С57ВЬ/6 интактного контроля (А), мышей, получавших блеомицин однократно (Б), и у мышей, получавших блеомицин курсом (В) (21-й день опыта). Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону. ув. хЮО.

В настоящем исследовании нами разработана модель многократно повторяющихся ("циклических") травм альвеолярного эпителия. После первого ИТ последующие введения блеомицина производили ИН. Целесообразность выбранного подхода была подтверждена гистологическими исследованиями. У животных, получавших блеомицин курсом, выявлены гиперпластические альвеолярные эпителиальные клетки и прогрессирующее накопление в лёгких фибротических масс, наблюдаемые у больных ИФЛ (Рисунок 2, 3). Кроме этого, начиная с 40-го дня опыта, наблюдалась гибель животных, с повторяющимися токсическими травмами, чего не наблюдалось у мышей с однократной инсталляцией цитостатика. К окончанию наблюдения популяция больных животных сократилась на 30%.

Рисунок 3 - Содержание соединительной ткани в лёгких мышей линии С57ВЬ/6 в условиях однократного и курсового введения

блеомицина. По оси абсцисс сроки исследования (день), по оси ординат содержание коллагеновых волокон в легких (% от площади лёгочной ткани) (М ± т), * - достоверность различия с животными интактного контроля (Р<0,05).

В условиях многократно повторяющегося повреждения альвеолярного эпителия было получено подтверждение высокой эффективности пегилированного фермента. Так, ИН введение пегГД в терапевтическом режиме препятствовало отложению коллагеновых волокон в паренхиме лёгких (Таблица 2). Антифибротические свойства 8 ЕД пегГД более выражены, чем у 16 ЕД нативной гиалуронидазы.

Таблица 2 - Влияние нативной гиалуронидазы и пегГД при интраназальиом введении на содержание соединительной ткани (% от общей площади ткани) в легких мышей линии С57В1/6 при необратимом пневмофиброзе (М ± т)_

Группы Сроки исследования

21 день 40 день 60 день

Интактный контроль 1,15 ±0,12 1,12± 0,3 1,23± 0,07

Необратимый пневмофиброз 5,13± 0,20* 4,12± 0,14 * 5,96±0,11 *

Необратимый пневмофиброз + нативная гиалуронидаза 2,84 ± 0,32 *, # 2,61 ± 0,41 *, # 5,90 ±0,79*

Необратимый пневмофиброз + пегГД 1,86 ± 0,19 # 2,09 ± 0,19 *, # 4,78 ±0,64*

Примечание - Р < 0,05 - отмечена достоверность различия показателя: от интактного контроля — *, от блеомицинового контроля — #.

Как видно, пегГД эффективна не только в профилактическом, но и в терапевтическом режиме введения. В этой связи пегилированный фермент может рассматриваться как "истинный" противофибротический фактор. Следует отметить, что при отмене лечения необратимого фиброза (42-й день) в лёгочной ткани вновь наблюдается прогрессивное отложение коллагена (60-й день). Это обстоятельство указывает на необходимость постоянного введения пегГД.

В нашей работе мы стремились изучить основы эффектов пегГД. При лечении частично обратимого пневмофиброза у животных отмечается снижение инфильтрации интерстиция альвеол гемопоэтическими клетками: ГСК в острую стадию воспаления (7-й день) и прогениторных С045+-клеток в фибротическую фазу развития болезни (21-й день). Реакция клеток мезенхимального происхождения в ответ на назначение пегГД была противоположной. Так, на 21-й день болезни число прогениторных CD45~-клеток и, в том числе, клеток с фенотипом CD31", CD34", CD45", CD44+, CD73+, CD90+, CD106+ в лёгочной ткани увеличивается. При этом популяция костномозговых МСК сокращается.

Таким образом, пегГД препятствовала блеомицин-индуцированной инфильтрации лёгких гемопоэтическими стволовыми клетками (фаза воспаления) и пан-гемопоэтическими клетками (фаза отложения коллагена). С другой стороны, лечение увеличивает представительство клеток мезенхимального происхождения в лёгких в сроки наиболее интенсивного отложения фибротических масс.

Объяснение качественным изменениям клеточного состава в блеомициновых лёгких при лечении пегГД нам видится в изменении физико-химических свойств матрикса гиалуронана. Основная мишень гиалуронидазы - гиалуроновая кислота (ГК). Известно, что при блеомицин-индуцированном и радиационном пневмофиброзе концентрация ГК в лёгких экспериментальных животных повышается в разы [Bitencourt C.S. et al., 2011]. Это обусловлено повреждением паренхимы и воспалением [Savani R.C. et al., 2000; Dentener M.A. et al., 2002; Jiang D. et al., 2007]. Считается,

что повышение концентрации ГК обеспечивается стромальными и эпителиальными клетками [Pasonen-Seppanen et al., 2003]. ГК синтезируется и "выдавливается" из клетки через плазматическую мембрану в межклеточное пространство. ГК-цепочки во внеклеточном матриксе достигают огромных размеров (105 и 107 Да). Из-за сильного отрицательного заряда карбоксильных групп молекулы гиалуроновой кислоты взаимно отталкиваются, в водных растворителях полимер занимает неоправданно большой объём. Сформированные "полости" занимаются молекулами воды. Возникающая структура обеспечивает устойчивость и пластичность тканей, а повышение внутреннего давления приводит к физическому разделению структуры гиалуронана и образованию так называемых "автомобильных дорог" (пространство для миграции клеток) [Toole В. P., Trelstad R. L., 1971; Pratt R.M., et al. 1975]. Совпадение миграции клеток воспаления с накоплением ГК известно давно [Toole В. P., Trelstad R. L., 1971], позднее это было продемонстрировано для стволовых клеток [Christophis С. et al., 2011; Jha А.К. et al., 2011]. В этих условиях уменьшаются межклеточные контакты, ослабляется крепление клеток с внеклеточным матриксом, нарушается межклеточная коммуникация, облегчается деление мононуклеаров [Culp L. A. et al., 1979]. С озвученных выше позиций, вероятно, вводимая ИН пегГД изменяет структурно-пространственную организацию матрикса гиалуронана (разрушает "автомобильные дороги") и тем самым нарушает инфильтрацию паренхимы лёгких ГСК.

Иная картина наблюдается в лёгких после отмены лечения пегГД. К 21-у дню опыта матрикс гиалуронана, по всей видимости, восстанавливается. В этот период в лёгочной ткани увеличивается количество СБ45~-клеток, в частности МСК. Напрашивается вывод об активации мезенхимальной составляющей фиброгенеза, в частности дифференцировки МСК в фиброциты [Скурихин Е.Г. и др., 2012; Pershina О., Skurikhin Е., Khmelevskaya Е., 2012]. Однако в этот период гистопатологические показатели лёгких больных животных улучшаются. Ранее C.S. Bitencourt с коллегами (2011) показали, что при блеомицин-индуцированном пневмофиброзе тестикулярная гиалуронидаза увеличивает количество МСК бронхо-альвеолярного пространства. Блокаду фиброза и нарушение отложения коллагена на фоне расширения пула МСК авторы связали с мезенхимально-эпителиальным переходом и снижением продукции трансформирующего фактора роста (transforming growth factor - TGF-P) [Bitencourt C.S. et al., 2011]. Подобный механизм, вероятно, реализуется и в результате лечения пегГД

Обсуждая вопрос повышения в лёгких уровня СЭ45~-клеток в условиях лечения, мы хотели бы обратить внимание на участие фибробластных клеток в ремодулировании легочной ткани. Как известно, в эту фазу фиброциты / фибробласты мигрируют вдоль границы внеклеточного матрикса и ремодулируют повреждение. После чего наблюдается апоптическая гибель фибробластов. Одновременно из раны удаляются клетки воспаления и

наиболее интенсивно a-SMA миофибробласты [Fattman C.L., 2008]. Кроме этого, фибробластоподобные клетки способны дифференцироваться в миофибробласты, которые, в свою очередь, активно сокращают раневую поверхность [Maharjan Anu S. et al., 2011]. Нами не исключается активация такого механизма опосредованно через остатки ГК, концентрация которых повышается в присутствии гиалуронидазы. Как известно, продукты деградации ГК (высокомолекулярные остатки) способствуют дифференцировки моноцитов в фиброциты [Wang J.F. et al., 2007]. Возможно, дополнительно остатки ГК привлекают для ремодуляции циркулирующие в крови фиброциты [Maharjan Anu S. et al., 2011].

При изучении вопроса о возможном влиянии спиперона на развитие токсического пневмофиброза был выявлен ряд закономерностей. Так, на модели частично обратимого пневмофиброза спиперон уменьшал инфильтрацию интерстиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками (плазматические клетки, макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты) (714-й день) (Рисунок 4). Кроме этого, спиперон препятствовал отложению соединительной ткани в лёгких (7, 14, 21-й день) (таблица 3).

Рисунок 4 - Морфологическая картина лёгких мышей линии С57В176 с частично обратимым пневмофиброзом (А, Б), мышей с частично обратимым пневмофиброзом, леченных спипероном (В, Г), и мышей с частично обратимым пневмофиброзом, леченных пегГД и спипероном (Д,Е). Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону (А, В, Д) и гематоксилином и эозином (Б, Г, Е), ув. * 100, 21-й день эксперимента.

Таблица 3 - Влияние изолированного и совместного с пегилированной гиалуронидазой введения спиперона на содержание соединительной ткани (% от общей площади ткани) в легких мышей линии С57ВЬ/6 при частично обратимом пневмофиброзе (М ± т)_

Сроки исследования (дни) Интактный контроль Блеомицин Блеомицин + Спиперон Блеомицин + Спиперон + пегГД

7 1,12 ±0,05 3,07 ± 0,07 * 2,09 ±0,11 # 1,45 ± 0,18 #

14 1,13 ±0,02 3,91 ±0,07* 2,75 ±0,12 *# 1,22 ±0,14 #

21 1,15 ±0,07 4,26 ±0,14* 2,12 ±0,13 *# 1,40 ± 0,20 #

Примечание - Р < 0.05 - отмечена достоверность различия показателя от интактного контроля - *; от блеомицинового контроля -#.

Хронологически этому предшествовало сокращение популяции ГСК в костном мозге и лёгких (7-й день) и падение клональной активности костномозговых и циркулирующих в крови гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарных КОЕ (на 3, 7, 14, 21-й день и на 3-й день соответственно) и гранулоцитарных КОЕ (на 3, 7, 21-й день и на 3, 7, 14, 21-й день соответственно) (Рисунок 5). Противовоспалительный эффект спиперона прослеживался и в фазу отложения коллагеновых волокон, на что указывало уменьшение количества пан-гемопоэтических СЭ45+ -клеток в блеомициновых лёгких на 21-й день опыта.

Таким образом, в условиях однократной инсталляции блеомицина противовоспалительный эффект спиперона связан с угнетением ГСК и прогениторных кроветворных клеток. Не исключается нами и нарушение миграции костномозговых кроветворных клеток в лёгкие. Доказательством этой гипотезы выступают данные цитометрических исследований, свидетельствующие о расширении костномозговой популяции СЭ45+-клеток на фоне уменьшения их числа в лёгких.

Содержание КОЕ-ГЭММ в костном мозге

□ Интакгаьгй контроль 3 Блеомицин ■ Блеомицин+Спиперон

Сроки исследования (день)

Сроки исследования (Мнъ)

3 а1' 2 Я.

Содержание КОЕ-Г в костном мозге * О Интакгный контроль Н Блеомицин ■ Блеомицин+Спиперон

Сроки исследования (день)

8 Содержание КОЕ-Г в крови

5 3 *

>> с. 5 м £ 8.6-се « 5 I4" #

и оз *

О * * * #

А I Я * 1 Шщ* 1 1Ш* 1

3 7 14 71

Сроки исследования (день)

Рисунок 5 - Влияние спиперона на рост КОЕ-ГЭММ и КОЕ-Г в культурах неадгезирующих мононуклеаров костного мозга и циркулирующей крови (ХЮ6 неадгезирующих мононуклеаров) у мышей линии С57ВЬ/6 при частично обратимом пневмофиброзе (М ± ш) Примечание. Р < 0,05 -достоверность различия показателя: от интактаого контроля - *, от блеомицинового контроля - #.

Далее мы изучили действие спиперона на клетки мезенхимального происхождения. На 21-й день обратимого пневмофиброза препарат заметно сокращал субпопуляцию легочных клеток, демонстрирующих фенотип СОЗ Г, СОЭ4 , С045", СЭ44+, СБ73+, С090+, СШ06+. Другой важный аспект

17

действия спиперона был связан с пролиферацией и дифференцировкой МСК. Так, в опытной группе препарат снижал скорость формирования монослоя в культуре МСК-подобных клеток фиброзированных лёгких. Одновременно усугублялась ингибиция остеогенеза и адипогенеза, снижалась интенсивность хондрогенной и фибробластной дифференцировки стволовых клеток мезенхимального ряда. Дополнительной характеристикой действия спиперона выступало последовательное уменьшение роста фибробластных КОЕ в костном мозге, крови, лёгких (Рисунок 6).

50 Содержание KOE-Ф в костном мозге

# □ Интакгный контроль 1Блеомицин

1,5 - Содержание КОЕ-Ф в^крови

S 3 я 0 о 5,11 s g 1 ■ 1 1

| |,5- в» 8

О S X . 1

7 Сроки исследования^день)

Рисунок 6 - Влияние спиперона на рост КОЕ-Ф в культурах адгезирующих мононуклеаров костного мозга, циркулирующей крови и легких (х10 адгезирующих мононуклеаров) у мышей линии С57ВЬ/6 при частично обратимом пневмофиброзе (М ± т) Примечание. Р < 0,05 - отмечена достоверность различия показателя: от интактного контроля - *, от блеомицинового контроля - #.

Итак, нарушение блеомицин-индуцированного фиброза спипероном можно связать с сокращением числа легочных незрелых и зрелых клеток мезенхимального ряда, а так же с угнетением дифференцировки МСК в клетки стромальных линий, в том числе в фиброциты.

Наши цитометрические исследования показали, что под влиянием спиперона популяция лёгочных CD45", CD31", CD34" клеток в фазу отложения коллагена (21-й день) увеличивалась в 1,95 раза (Р<0,05) по сравнению с контрольной группой (частично обратимый пневмофиброз). Возможно, лечение спипероном стимулирует процессы регенерации, в частности, восстановление альвеолярного эндотелия в лёгких.

Спиперон - селективный антагонист D2 дофаминовых рецепторов. В этой связи возможны дофаминовые механизмы регуляции мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток. Лёгочная ткань богата дофамином и дофаминовыми рецепторами (D14 тип) [Amenta F. et al., 2002], в том числе описаны дофаминовые Di и D2 рецепторы в сосудах лёгкого [Kobayashi Y. et al., 1995; Bruzzone P. et al., 2002]. В силу возможной блокады D2

Содержание КОЕ-Ф в легких #

* 2Ь- *

3 о ■

2 О20 й 5

I S15

=1 I ее оЮ

я О Ъ =5- X — # * ¿1 lil

7 Сроки исследования^ень)

дофаминовых рецепторов не исключаются сосудистые эффекты спиперона в условиях однократного ИТ введения блеомицина. Учитывая, что спиперон блокирует 5-НТ2А / 5-НТ| серотониновые рецепторы, мы полагаем, что его антифибротические эффекты частично могут быть связаны с нарушением серотонинового механизма пролиферации фибробластов и синтеза коллагена фибробластами, с одновременным уменьшением уровней ТСР-Р1, соединительнотканного ростового фактора и ингибитора активатора плазминогена-1 в лёгких [ТаЬге А. е! а1., 2008]. Некоторые авторы связывают синтез коллагеновых волокон в лёгких с активностью адренергической системы [Вег§ Л.А. ег а1., 1981; вт Б/Ы. е1 а1., 1987; БкипкЫп Е., (Л а1., 2013]. В этой связи необходимо отметить, что спиперон является антагонистом аш-адренорецепторов.

В последнем разделе настоящей работы мы попытались усилить антифибротические эффекты пегГД путём дополнительного назначения спиперона. Из результатов гистологических исследований следует, что последовательное введение пегГД и нейротропного соединения в профилактическом режиме более эффективно в лечении частично обратимого пневмофиброза, чем изолированное назначение соединений: патологическое отложение коллагена в лёгких больных животных не регистрировалось (Таблица 3, Рисунок 4). Как позитивное свойство "комплексного" лечения следует отметить противовоспалительный эффект, приобретённый с введением в схему спиперона.

Рисунок 7 - Морфологическая картина лёгких мышей линии С57ВЬ/6 интактного контроля (А, Б), мышей с необратимым пневмофиброзом (В, Г), мышей с необратимым пневмофиброзом, леченных спипероном (Д, Е) или спипероном и пегГД (Ж, 3). Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону (А, В, Д, Ж) и гематоксилином и эозином (Б, Г, Е, 3), ув. х 100, 21-й день эксперимента.

Таблица 4 - Влияние изолированного и совместного с пегшшрованной гиалуронидазой введения спиперона на содержание соединительной ткани (% от общей площади ткани) в легких мышей линии С57В1У6 при необратимом пневмофиброзе (М ± ш)_

Сроки исследования (дни) Интактный контроль Необратимый пневмофиброз Необратимый пневмофиброз + Спиперон Необратимый пневмофиброз + Спиперон + пегГД

21 1,15 ±0,06 5,13 ±0,75* 1,86± 0,18 # 1,05 ± 0,08 #

40 1,12 ±0,18 4,12 ±0,40* 1,52 ± 0,20 # 1,52 ± 0,20 #

60 1,23 ±0,16 5,96 ± 0,93 * 4,96 ± 1,34 * 2,78 ± 0,42 *, #

Примечание - Р < 0,05 - отмечена достоверность различия показателя от интактного контроля — *; от блеомицинового контроля - #.

Высокая эффективность комплексного лечения была подтверждена и на модели необратимого пневмофиброза при назначении пегГД и спиперона в фибротическую фазу развития болезни (Таблица 4, Рисунок 7).

Итак, представленные данные гистологических исследований подтверждают перспективность профилактики и лечения фиброза лёгких изменением структурно-пространственной организации матрикса гиалуронана (пегГД) с последующей модуляцией функциональной активности нервной системы (антагонистами преимущественно дофаминовых рецепторов).

Обсуждая вопрос об основах ускорения спипероном регенерации фиброзированных легких в условиях введения пегГД следует учитывать то обстоятельство, что в данном случае наблюдалась выраженная ингибиция мезенхимальных стволовых / прогениторных клеток (Таблица 5). С этими субпопуляциями клеток мы связываем резкое уменьшение токсического повреждения альвеолярного эпителия, полное купирование отложения фибротических масс в паренхиме лёгких. ГСК и пан-гемопоэтические клетки, вероятно секретируют спектр молекул, обладающих, как минимум, противовоспалительным действием.

Таблица 5 - Влияние вводимых изолированно или совместно пегилированной гиалуронидазы и спиперона на стволовые и прогениторные клетки костного мозга и лёгких при частично обратимом пневмофиброзе (по данным цитометрических

Лёгкие / Костный мозг Лечение пневмофиброза

без лечения спиперон пегГД пегГД + спиперон

мск +/+ о/ •/о о/о

прогениторные фибробластные клетки +/+ •/ •/ о/о

ГСК +/+ о/ о/

пан-гемопоэтические клетки +/+ о/ о/

Примечание - показатель увеличивается +, уменьшается - по отношению к здоровым мышам; показатель увеличивается • и уменьшается о по отношению к не леченным мышам с пневмофиброзом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пегилированная гиалуронидаза, вводимая интраназально, препятствует токсическому разрушению альвеолярного эпителия и отложению фибротических масс в паренхиме легких у мышей при пневмофиброзе. Пегилированная гиалуронидаза эффективна на моделях частично обратимого и необратимого пневмофиброза, при профилактическом и терапевтическом режимах введения. В основе снижения отложения фибротических масс в легких пегилированной гиалуронидазой лежит уменьшение клональной активности легочных прогениторных фибробластных клеток. На моделях частично обратимого и необратимого пневмофиброза выявлена противовоспалительная и антифибротическая активность спиперона, которая связана с уменьшением пролиферации и дифференцировки легочных МСК, и ингибиции костномозговых ГСК и гемопоэтических прогениторных клеток. Дополнительное введение спиперона повышает антифибротическую активность пегилированной гиалуронидазы. Полученные результаты являются основой для проведения клинических исследований, направленных на внедрение в медицинскую практику гиалуронидазы на носителях в качестве антифибротического средства с целью профилактики и лечения фиброзных заболеваний легких.

ВЫВОДЫ

1. При токсическом пневмофиброзе пегилированная гиалуронидаза, вводимая интраназально в профилактическом или терапевтическом режимах, препятствует разрушению альвеолярного эпителия, изменяет характер воспалительной реакции и уменьшает содержание соединительной ткани в лёгких у мышей линии C57BL/6. При этом антифибротическая активность 8 ЕД конъюгата выше, чем у 16 ЕД тестикулярной гиалуронидазы. Внутривенное и внутрижелудочное введение пегилированной гиалуронидазы не влияет на воспаление и отложение фибротических масс в лёгких.

2. Пегилированная гиалуронидаза уменьшает количество гемопоэтических стволовых клеток ((CD3, CD45R (В220), Ly6C, Ly6G (Grl), CDllb (Macl), TER-119)"", Sca-1+, c-Kit\ CD34") в лёгких в воспалительную фазу пневмофиброза, легочных прогениторных С045+-клеток — в фибротическую фазу развития болезни. На популяции костномозговых гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток пегилированная гиалуронидаза не влияет.

3. В фибротическую фазу пневмофиброза пегГД увеличивает число легочных прогениторных CD45" клеток и клеток с фенотипом мезенхимальных стволовых клеток (CD3T, CD34", CD45", CD44+, CD73+, CD90 , CD106+), при этом клональная активность прогениторных CD45 -клеток снижается. В этих условиях количество МСК и зрелых CD45" -клеток в костном мозге уменьшается.

4. При пневмофиброзе противовоспалительный эффект спиперона развивается одновременно с уменьшением количества костномозговых и

циркулирующих в крови прогениторных CD45+-icneTOK, и снижением их способности формировать in vitro КОЕ-Н, КОЕ-ГЭММ, КОЕ-Г. Антифибротической активности препарата сопутствует уменьшение клональной активность костномозговых, легочных и циркулирующих в крови прогениторных CD45~-mieTOK, а так же снижение интенсивности дифференцировки легочных МСК в адипоциты, хондроциты, остеобласты и фибробласты.

5. Последовательное назначение пегилированной гиалуронидазы и спиперона более эффективно в терапии пневмофиброза, чем изолированное введение соединений: отложение коллагена в блеомициновых лёгких не регистрируется, снижается инфильтрация интерстиция альвеол и альвеолярных ходов клетками воспаления. Повышение спипероном антифибротической активности пегГД гиалуронидазы отмечается при профилактическом и терапевтическом режимах введения соединений.

6. Лечение пневмофиброза пегилированной гиалуронидазой и спипероном увеличивает количество ГСК в костном мозге и лёгких в воспалительную фазу развития болезни и сокращает популяции прогениторных С045"-клеток и МСК в тканях в сроки активного отложения фибротических масс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дыгай, A.M. Реакции системы крови и стволовых клеток в условиях блеомициновой модели фиброза легких / A.M. Дыгай, Е.Г. Скурихин, Т.В. Андреева, Л.А. Ермолаева, Е.С. Хмелевская, О.В. Першина, В.А. Крупин, А.М. Резцова, И.Э. Степанова, В.Е. Гольдберг // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - 152, № 8. - С. 132-136.

2. Дыгай, A.M. Противофибротическая и противовоспалительная активность нейролептика при пневмофиброзе / A.M. Дыгай, Е.Г. Скурихин, Т.В. Андреева, О.В. Першина, Л.А. Ермолаева, Е.С. Хмелевская, В.А. Крупин, А.М. Резцова, И.Э. Степанова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2011.- 152, № 12. - С. 618 - 622.

3. Скурихин, Е.Г. Влияние антисеротонинового препарата на развитие фиброза легких и систему крови при интратрахеальном введении блеомицина / Е.Г. Скурихин, Т.В. Андреева, Е.С. Хмелевская, Л.А. Ермолаева, О.В. Першина, В.А. Крупин, H.H. Ермакова, А.М. Резцова, И.Э. Степанова, В.Е. Гольдберг, A.M. Дыгай // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2011. -№4. — С. 206-211.

4. Дыгай, A.M. Антифибротический эффект нейролептика и иммобилизированной гиалуронидазы при совместном назначении в условиях пневмофиброза / A.M. Дыгай, Е.Г. Скурихин, H.H. Ермакова, О.В. Першина, В.А. Крупин, A.M. Резцова, Л.А. Ермолаева, Е.С. Хмелевская, И.Э. Степанова, A.B. Артамонов, A.A. Бекарев, П.Г. Мадонов, Д.Н. Киншт, В.Е. Гольдберг, Т.А. Семиглазова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - 154, № 9. - С. 312 - 317.

5. Дыгай, A.M. Антифибротическая активность иммобилизированной на полиэтиленоксиде гиалуронидазы в условиях блеомицин-индуцированного пневмофиброза / A.M. Дыгай, Е.Г. Скурихин, H.H. Ермакова, О.В. Першина, В.А. Крупин, A.M. Резцова, Л.А. Ермолаева, Е.С. Хмелевская, A.B. Артамонов, A.A. Бекарев, П.Г. Мадонов, Д.Н. Киншт // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - 154, № 9. - С. 375 - 380.

6. Скурихин, Е.Г. Дифференцировка мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток легких при пневмофиброзе / Е.Г. Скурихин, Е.С. Хмелевская, О.В. Першина, H.H. Ермакова, В.А. Крупин, А.М. Резцова, Л.А. Ермолаева, В. Д. Якушина, И.Э. Степанова, В.М. Резцова, Н.В. Чердынцева, М.Н. Стахеева, A.M. Дыгай // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2012. - № 4. - С. 192-199.

7. Дыгай, A.M. Гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки в патогенезе пневмофиброза / A.M. Дыгай, Е.Г. Скурихин, О.В. Першина, Е.С. Хмелевская, H.H. Ермакова, Л.А. Ермолаева, В.А. Крупин, А.М. Резцова, И.Э. Степанова // Сборник тезисов II Российского конгресса с международным участием: Молекулярные основы клинической медицины

возможное и реальное - СПб.: Изд-во «Человек и его здоровье», 2012. -С.239 — 240.

8. Дыгай, A.M. Стволовая клетка, как мишень в коррекции пневмофиброза / A.M. Дыгай, Е.Г. Скурихин, О.В. Першина, Е.С. Хмелевская, Н.Н. Ермакова, В.А. Крупин, А.М. Резцова, Н.Э. Степанова, А.В. Артамонов, А.А. Бекарев, Д.Н. Киншт, П.Г. Мадонов // IV съезд фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». Материалы съезда. -М., Казань. -2012. - С. 61.

9. Дыгай, A.M. Антифибротические эффекты иммобилизированной гиалуронидазы при повторяющихся травмах альвеолярного эпителия блеомицином / A.M. Дыгай, Е.Г. Скурихин, Н.Н. Ермакова, А.М. Резцова, О.В. Першина, Е.С. Хмелевская, В.А. Крупин, И.Э. Степанова, В.М. Резцова, А.В. Артамонов, А.А. Бекарев, П.Г. Мадонов, Д.Н. Киншт // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - 155, № 4. - С. 499 - 504.

10. Skurikhin, E.G. Antifibrotic Properties of Pegylated Hyaluronidase in Pneumofibrosis. Spiperone Increases the Effects of Pegylated Hyaluronidase. / E.G. Skurikhin, E.S. Khmelevskaya, O.V. Pershina, N.N. Ermakova, V.A. Krupin, L.A. Ermolaeva, V.D. Yakushina, A.M. Reztsova, V.M. Reztsova, I.E. Stepanova, A.M. Dygai // 5th International Conference on Drug Discovery & Therapy. - 2013, Dubai, UAE.-P. 79.

11. Skurikhin, E.G. Anti-fibrotic effects of reserpine on lung fibrosis : stem cells in the pathogenesis of Pneumofibrosis. / E.G. Skurikhin, E.S. Khmelevskaya, O.V. Pershina, N.N. Ermakova, V.A. Krupin, L.A. Ermolaeva, V.D. Yakushina, A.M. Reztsova, V.M. Reztsova, I.E. Stepanova, A.M. Dygai // The Open Conference Proceeding Journal. - 2013. - № 4. - P. 31-46.

12. Skurikhin, E.G. The Role of Endogenous Stem Cells and Progenitor Cells in the Pathogenesis of Myelosupression, Pneumofibrosis and Diabetes / E.G. Skurikhin, O.V. Pershina, E.S. Khmelevskaya, N.N. Ermakova, V.A. Krupin, A.M. Reztsova, L.A. Ermolaeva, V.M. Reztsova, I.E. Stepanova, A.M. Dygai // BIT's 6th Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cells. - 2013, Dalian, China.-P. 645.

13. Дыгай, A.M. Влияние иммобилизированной гиалуронидазы на стволовые и прогениторные клетки при пневмофиброзе / A.M. Дыгай, Е.Г.Скурихин, Е.С. Хмелевская, Н.Н. Ермакова, А.М. Резцова, О.В. Першина, В.А. Крупин, И.Э. Степанова, В.М. Резцова, А.В. Артамонов, А.А. Бекарев, П.Г. Мадонов, Д.Н. Киншт // Клеточные технологии в биол. и медицине. - 2013. - № 4. - С.244-249.

14. Дыгай, А.М. Модуляция эндогенных стволовых и прогениторных клеток - новый подход в лечении дегенеративных заболеваний / A.M. Дыгай, Е.Г. Скурихин, О.В. Першина, Е.С. Хмелевская, Н.Н. Ермакова, В.А. Крупин, А.М. Резцова // 1-й Национальный Конгресс по регенеративной медицине. Материалы конгресса. - М. 2013. - С. 79-80.

15. Скурихин, Е.Г. Антифибротическая активность конъюгатов на основе амфифильного плюроника F68 и гидрофобного плюроника L31 с гиалуронат-эндо-^К-ацетилгексозаминидазой при фиброзе легкого / Е.Г. Скурихин, А.М. Резцова, H.H. Ермакова, В.А. Крупин, О.В. Першина, Е.С. Хмелевская, A.B. Артамонов, A.A. Бекарев, П.Г. Мадонов, Д.Н. Киншт, Д.В. Рейхард, В.Е. Гольдберг, A.M. Дыгай // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2014. - Т. 157 - № 1.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВБ - внутрибрюшинно ВВ - внутривенно ВЖ - внутрижелудочно ГАГ - гликозаминогликан ГД - гиалуронидаза

ГК (ВМ, НМ) — гиалуроновая кислота (высокомолекулярная,

низкомолекулярная)

ИН — интраназально

ИТ — интратрахеально

ИФЛ - идиопатический фиброз легких

КМ — костный мозг

КОЕ- Н, ГЭММ, -Г, -Э, -Ф - колониеобразующая единица недифференцированная, гранулоцито-эритроидно-макрофагально-

мегакариоцитарная, гранулоцитарная, эритроидная, фибробластная ПегГД- пегилированная гиалуронидаза

CK (ГСК, МСК) - стволовые клетки (гемопоэтические, мезенхимальные)

ЭМП - эпителиально-мезенхимальный переход

CD (cluster of differentiation) - кластер дифференцировки

c-Kit - рецептор для фактора стволовых клеток

DMEM - среда Игла в модификации Дульбекко

FBS - фосфатный буферный раствор

FITC — флуоресцеин изотиоционат

GF (CTGF, PDGF, TGF-ß, VEGF) - фактор роста (соединительной ткани, тромбоцитарный, трансформирующий ß, сосудистого эндотелия) IL (ИЛ) - интерлейкин

Sea (stem cell antigen) - антиген стволовой клетки TNF-а — фактор некроза опухоли а а-SMA - а -актин гладких мышц

Тираж 100 экз. Заказ 108. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники.

634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. 533018.