Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Механизмы регенеративных эффектов пегилированной гиалуронидазы при хроническом гепатите

'Г)

005060337

На правах рукописи

МАРКОВА ТУ ЯНА СЕРГЕЕВНА

МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ ПЕГИЛИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 О МАЙ2ЕШ

Томск-2013

О,

I

С •"'•••.

005060337

\

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор, академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ Дыпш Александр Михаилович

доктор медицинских наук Зюзьков Глеб Николаевич

Официальные оппоненты:

Венгеровский Александр Исаакович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы РФ, Государственное бюджетное обршювательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедра фармакологии, заведующий кафедрой

Мясная Наталья Владимировна, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательскии институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория иммунофармакологии, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук

Защита состоится "21." -1ШАЯ_2013 г. в-часов на заседании

диссертационного ^вста Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательскии институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан ^ -2013 г"

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук _ Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хронический гепатит представляет собой тяжелое распространенное заболевание печени, при котором недостаточная способность органа к регенерации зачастую приводит к замещению функционирующей паренхимы соединительной тканью, нарушению его структурной организации и развитию цирроза печени (Маянский Д.Н. и др., 1998; Павлов Ч.С., 2007; Ивашкин В.Т. и др., 2008; Абдурахманов Д.Т., 2010). Фармакологическое действие существующих гепатопротекторных лекарственных средств направлено преимущественно на защиту, либо стимуляцию сохранившихся клеточных элементов печени (Венгеровский А.И. и др., 1988, 1996, 2009, 2012; Ивашкин В.Т. и др., 2012). Однако данная концепция фармакологического вмешательства в ряде случаев оказывается несостоятельной. Зачастую не удается, не только восстановить морфофункционапьное состояние органа, но и предупредить прогредиентный характер течения патологического процесса (Байматов В.Н., 1998; Лучшее В.И. и др., 2004; Блюм Х.Е., 2005; Крель П.Е. и др., 2009). Низкая эффективность существующих гепатопротекторных средств определяет необходимость разработки принципиально новых патогенетически обоснованных методов терапии патологических состояний печени.

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников открыли возможность развития нового направления в лечении многих заболеваний — с помощью клеточной терапии (Сухих Г.Т. др., 2002; Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Зюзьков Г.Н., 2006; Дыгай A.M. и др., 2009; Zyuz'kov G.N. et al., 2005; Liu M. et al., 2008; Williams A.R. et al., 2011). При этом наиболее физиологичным подходом к решению задач регенеративной медицины является фармакологическая стимуляция эндогенных стволовых клеток (СК) (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2009; Zyuz'kov G.N. et al., 2005, 2007; Dygai A.M. et al., 2011; 2012). Ранее в ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН в экспериментах in vitro и in vivo была показана возможность модификации функций прогениторных клеток различных классов с помощью нативной гиалуронидазы (Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Дыгай A.M. и др., 2009). Основной мишенью данного фермента является гиалуроновая кислота (ГК), представляющая собой наиболее распространенный гликозаминогликан в организме, связывающий in situ посредством специфических рецепторов (CD44, RHAMM) клетки-предшественники различных классов (Дыгай A.M. и др., 2009; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003; Nedvetzki S. et al., 2004; Avigdor A. et al., 2004; Zhu H. et al., 2006). При этом обнаружено, что в определенных условиях гиалуронидаза способна расщеплять ГК межклеточного матрикса до полимеров, активирующих процессы клеточного деления и дифференцировки, а также вызывать усиление индуцируемого внешними факторами выхода СК в кровь (Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Дыгай A.M. и др., 2009, 2012; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003).

Учитывая вышесказанное, весьма перспективным представляется разработка оригинального подхода управления регенераторным потенциалом тканей за счет модификации свойств ГК с помощью гиалуронидазы. Вместе с тем значительное количество ингибиторов данного фермента в организме (Максименко А. В. и др., 2001; Пушкарь Д.Ю. и др., 2006; LeBoeuf R.D. et al., 1986; .Afify A.M. et al., 1993) предопределяет возможность стимуляции родоначальных клеток с помощью его введения in vivo лишь в дозах существенно превышающих терапевтически допустимые (Волкова М.А., 1998; Козлов В.А. и др., 2004; Дыгай A.M. и др., 2009; Anderson J.А., 1992), что делает невозможным создание на основе нативной гиалуронидазы безопасного средства для регенеративной медицины.

В то же время существует нанотехнология электронно-лучевого синтеза (Дыгай A.M. и др., 2009, 2010, 2011, 2012; Vereschagin E.I. et al., 2001), позволяющая получать конъюгаты биологически активных веществ с низкомолекулярными носителями - иммобилизированные лекарственные средства, которые в отличие от своих нативных аналогов белковой природы оказываются практически неиммуногенными и нетоксичными. Указанные свойства при этом определяются «перекрытием» молекулами носителя (в качестве которого наиболее предпочтительным является использование полиэтиленгликоля (ПЭГ)) антигенных детерминант белков, что делает их практически невидимыми для элементов системы иммунного надзора (Delgado С. et al., 1992; Avgoustakis К., 2004; Maullu С. et al., 2009; Huang Z. et al., 2009). Более того, данные конструкции оказываются еще в значительной степени защищенными от протеолитических ферментов, что определяет возможность их эффективного перорального использования, представляющего собой наиболее комплаентный путь приема средств для регенеративной медицины (Гольдберг Е.Д. и др., 2008; Дыгай A.M. и др., 2009; Gol'dberg E.D. et al., 2008).

Исходя из вышеизложенного, весьма актуальным представляется изучение возможности стимуляции процессов восстановления ткани печени при ее хроническом поражении путем активации функций эндогенных прогениторных клеток с помощью иммобилизированной (пегилированной) формы гиалуронидазы (Пэг-ГД).

Цель исследования. Выявить гепатопротекторные свойства пегилированной гиалуронидазы, вскрыть роль модификации функций прогениторных клеток в развитии терапевтических эффектов и изучить механизмы их регуляции в условиях моделирования хронического токсического гепатита.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние Пзг-ГД на морфофункционалыюе состояние печени в условиях экспериментального хронического токсического гепатита.

2. Определить состояние пулов клеток-предшественников различных классов в печени, костном мозге и периферической крови при введении Пэг-

ГД.

3. Оценить изменение секреции факторов роста печеночных колониеобразующих единиц (КОЕ-Печ) элементами микроокружения печеночной ткани и восприимчивости прогениторных элементов к регуляторным стимулам под воздействием Пэг-ГД.

4. Вскрыть влияние Пэг-ГД на продукцию хемоагграктантов родоначальных клеток элементами микроокружения костного мозга и печеночной ткани.

5. Оценить состояние периферической крови и костномозгового кроветворения при введении Пэг-ГД на фоне моделирования хронического токсического гепатита.

Научная новизна. Впервые выявлены выраженные гепатопротекторные эффекты пегилированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы. Обнаружено значительное уменьшение выраженности воспалительно-некротических и склеротических морфологических изменений в печени и снижение содержания щелочной фосфатазы в сыворотке крови при пероральном введении данного средства. Показано, что в основе выявленного противовоспалительного, противосклеротического и антихолестатического действия Пэг-ГД лежит стимуляция регенераторных процессов печеночной ткани, связанная с активацией регионарных КОЕ-Печ и направленной миграцией мультипотентных мезенхимальных СК костного мозга в орган-мишень. При этом развитие указанных феноменов определяется возрастанием выработки клеточными элементами микроокружения гуморальных факторов, стимулирующих КОЕ-Печ, на фоне повышения их восприимчивости к регуляторным стимулам, а также падением продукции хемоаттрактантов СК стромальными клетками костного мозга при увеличении их выработки элементами микроокружения печени. Продемонстрировано, что мобилизация мультипотентных СК из гемопоэтической ткани, вызванная введением Пэг-ГД при моделировании хронического гепатита, не сопровождается значимым «негативным» влиянием на систему крови.

Практическая значимость. На основании результатов исследований подготовлен отчет для Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения о специфической активности пегилированной с использованием оригинальной технологии гиалуронидазы (разработанной ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г. Томск совместно с ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г. Новосибирск) для получения разрешения на ее клинические исследования в качестве гепатопротектора.

Полученные данные фундаментального характера о закономерностях функционирования клеток-предшественников различных классов в условиях патологии печени, а также о механизмах действия изучаемого средства —

аналога регулятора функций прогениторных клеток, внесли существенный вклад в развитие фармакологической стратегии регенеративной медицины и могут использоваться для разработки новых медицинских клеточных технологий.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на VI, VII и VIII Региональных конференциях молодых ученых им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011, 2012, 2013); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); Российской конференции молодых ученых ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 7 — в реферируемых журналах, рекомендуемых перечнем ВАК; получено 2 патента на изобретение: патент (RU) № 2439147 «Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток» (опубл. 10.01.2011, Бюл. № 1) и патент (RU) на изобретение № 2477752 «Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении» (опубл. 20.03.2013, Бюл. № 8).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, приложения и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает 308 источников, из них 100 отечественных и 208 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты были выполнены на 74 беспородных крысах, массой 250300 г, и 298 мышах линии CBA/CaLac обоего пола в возрасте 2-х месяцев, массой 18-20 г. Мыши 1 категории, конвенциональные линейные животные, получены из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется).

Экспериментальной моделью патологии печени являлся хронический токсический гепатит (ХГ). У крыс ХГ моделировался внутрижелудочным введением 50% раствора тетрахлоруглерода (ТХУ) на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз). У мышей поражение печени вызывали внутрижелудочным введением ТХУ в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь по той же схеме.

Пегилировання гиалуронидаза была разработана ФГБУ «НЙИ фармакологии» СО РАМН совместно с ООО «Саентифик фьючер менеджмент» (г. Новосибирск). Средство представляло собой бычью тестикулярную гиалуронидазу (гиалуронат-эндо-р-Ы-ацетилгексозаминидазу),

конъюгированную с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза с полиэтиленгликолем молекулярной массой 1,5 кДа. Процесс пегилирования вызывали путем внесения фермента в 2% раствор ПЭГ, предварительно обработанный потоком ускоренных электронов ионизирующего излучения, генерируемого ускорителем ИЛУ-6, до конечной концентрации 70 ЕД/мл ГД (доза 1,5 Мрад, энергия электронов 2,5 МэВ, поглощённая доза 2-10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час).

Пэг-ГД вводили per os, начиная с 19 дня эксперимента (на 3-й сут после последнего введения ТХУ): крысам в дозе 35 ЕД/кг в течение 2 сут, в дозах 35 и 50 ЕД/кг через день в течение 10 сут; мышам - в дозе 50 ЕД/кг в течение 2 сут.

С целью исследования терапевтических эффектов Пэг-ГД (на беспородных крысах) определяли общие изменения состояния экспериментальных животных и печени, а также гистологические и биохимические исследования на фоне моделирования хронического гепатита. Для этого оценивали прирост массы тела животных (г) в % и весовой коэффициент печени (отношение массы органа в мг к массе животного в г). Биохимические исследования сыворотки крови проводили на предмет содержания в ней аспартат-, аланин-аминотрансфераз (АсАТ, Ал AT) и щелочной фосфатазы (ЩФ) на 21-е и 40-е сут эксперимента. Активность данных ферментов определяли по общепринятым методикам, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы «Cormay» и стандартные наборы фирм «Cormay» и «Витал Диагностик» (г. Санкт-Петербург). При морфологическом исследовании выделяли печень животных, фиксировали в 10% нейтральном формалине и на гистологических препаратах органа, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли количество клеток инфильтрата с помощью окулярной сетки Автандилова (Автандилов Г.Г., 1990). Площадь соединительной ткани определяли на гистологических препаратах печени, окрашенных пикрофуксином (Меркулов Г.А., 1969), с помощью средств компьютерной обработки графических данных.

Для изучения механизмов гепатопротекторного действия Пэг-ГД методом клонирования in vitro исследовали содержание фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) в костном мозге и периферической крови (Гольдберг Е.Д. и др., 1992), а также количество паренхиматозных стволовых клеток в печени (КОЕ-Печ) (Дыгай A.M. и др., 2005). Количество мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в костном мозге и периферической крови определяли с помощью метода лимитирующих разведений при длительном культивировании клеточного материала (Зюзьков Г.Н. и др., 2005; In't Anker P.S. et al., 2003). Продукцию печеночными клетками ростовых факторов, активных в отношении тканеспецифичных регионарных CK, определяли по колониестимулирующей активности супернатантов печеночных элементов, которую тестировали микрометодом в 96 луночных планшетах («Costar», США). С помощью оригинального культурального метода (Дыгай A.M. и др., 2010, 2012) изучали продукцию суммы факторов миграции CK

клетками печени и костного мозга. Критерием оценки выработки факторов миграции являлось изменение выхода фибробластных и паренхиматозных колониеобразующих единиц после инкубации соответствующего интактного клеточного материала на агаровой среде (субстрате). При этом величину исследуемого параметра оценивали по разности двух полученных значений -количеству не связавшихся клеток после их помещения на агар, содержащий тестируемый материал, и субстрат без клеток (результаты трактуются по обратной зависимости от значений). Продукцию SDF-la-фактора клетками тканей определяли по его содержанию в кондиционных средах с помощью иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы «R&D Systems» (США) согласно прилагаемым методическим указаниям.

Для оценки влияния Пэг-ГД на восприимчивость КОЕ-Печ и КОЕ-Ф к фактору стволовой клетки (ФСК) («Sigma», США), фактору роста фибробластов-1-основному (ФРФ) («Sigma», США) и инсулину («Sigma», США) клеточный материал костного мозга и печени подвергали 30 минутному воздействию (преинкубации) 0,1 ЕД/мл раствора Пэг-ГД на основе среды DMEM («Sigma», США) (Дыгай A.M. и др., 20И). После преинкубации исследовали способность миелокариоцитов образовывать КОЕ-Ф в полувязкой культурапьной среде при добавлении ФРФ; клеток печени формировать в жидкой культурапьной среде, содержащей инсулин - КОЕ-Печ и КОЕ-Ф, а содержащей ФСК - только КОЕ-Печ.

Оценку показателей периферического звена системы эритрона осуществляли с помощью автоматического анализатора ABACUS («Diatron», Австрия) в ветеринарном режиме (Кост Е.А., 1975; Меньшиков В.В., 1987; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992).

Содержание кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) в костном мозге и периферической крови определяли in vitro методом клонирования в полувязкой культуральной среде. Интенсивность созревания эритроидных и грануломоноцитарных клеток-предшественников оценивали по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в одной лунке) (Гольдберг Е.Д. и др., 1992).

Обработку результатов проводили с помощью методов вариационной статистики с применением параметрического t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Уилкоксона-Манна-Уитни (Лакин Г.Ф., 1973; Урбах В.Ю., 1975; Зайцев Г.Н., 1984). Частоту встречаемости мезенхимальных стволовых клеток определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведений одномерной модели Пуассона оценивали посредством линейной log-log регрессии (Bonnefoix Т. et al., 2001; In't Anker P.S. et al„ 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе моделирования хронического токсического гепатита с помощью тетрахлоруглерода уже после его 3-го введения началась гибель

экспериментальных животных, которая к концу эксперимента составила 10%. На вскрытии у погибших животных печень была увеличена в размере, желтого цвета, глинистой консистенции с очагами кровоизлияний и макроскопическими признаками острой дистрофии печени. Исследование общих изменений состояния экспериментальных животных и печени в процессе развития токсического гепатита выявило значительное снижение процента прироста массы их тела и возрастание весового коэффициента пораженного органа.

При этом наблюдалось значительное повышение ферментативной активности сыворотки крови. Так, концентрация АлАТ, АсАТ и ЩФ на 21-е сут опыта составляла 180,0%, 163,0% и 396,2% от фона соответственно.

Гистологическое исследование печени также выявило значительное поражение органа. Отмечалось выраженное нарушение долькового строения печени. На препаратах были видны поля грануляционной ткани, замещающей погибшие гепатоциты, в которых происходило новообразование сосудов и печеночных протоков. В большом количестве встречались тельца Каунсильмена, а в сохранившихся гепатоцитах выраженная крупнокапельная жировая дистрофия, а также образование жировых кист. В то же время имела место значительная регенерационная гипертрофия печеночных клеток и обилие митозов гепатоцитов. При этом некробиотические изменения были существенно более выраженные на 21-е сут исследования, а лимфоцитомакрофагальная инфильтрация и разрастание склеротической ткани - к концу эксперимента. Так, на 40-е сут опыта количество клеток инфильтрата и площадь соединительной ткани в печени достигали 213,9% и 526,9% от фоновых значений соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Количество клеток инфильтрата (А) и относительная площадь соединительной ткани (Б) в печени крыс при введении тетрахлоруглерода (белые столбики) и при введении пегилированной гиалуронидазы: в дозе 35 ЕД/кг в течение 2 сут (серые столбики), в дозе 50 ЕД/кг через день в течение 10 сут (заштрихованные столбики) и в дозе 35 ЕД/кг через день в течение 10 сут (черные столбики) на фоне моделирования патологии печени. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: А - в усл. ед.; Б - в % от общей площади. Область межпунктирного пространства - область доверительного интервала значения показателя у интактных мышей при р<0,05.

Таким образом, курсовое введение тетрахлоруглерода сопровождалось развитием тяжелого хронического гепатита с признаками начальной стадии цирроза печени (нарушение ее долькового строения).

Введение Пэг-ГД по различным схемам на фоне моделирования патологического процесса выявило ее значительные гепатопротекторные эффекты. Применение пегилированного фермента во всех случаях существенно корригировало рост сывороточной концентрации ЩФ. При этом минимальных значений данный параметр достигал при пятикратном введении фармакологического агента в дозах 35 ЕД/кг и 50 ЕД/кг на 21-е и 40-е сут соответственно. Вместе с тем Пэг-ГД не оказывала статистически значимого влияния на содержание АлАТ и АсАТ в сыворотке крови.

В ходе гистологического исследования препаратов печени при введении Пэг-ГД на фоне моделирования ее хронического патологического процесса отмечалась сохранность долькового строения печени на фоне существенного снижения выраженности признаков жировой дистрофии, некроза гепатоцитов, инфильтрации печеночной паренхимы и других проявлений гепатита. При этом относительная площадь инфильтрата достигала минимума при пятикратном введении фармакологического агента в дозах 50 ЕД/кг и 35 ЕД/кг: на 21-е сут -до 58,6% и 64,9%, и на 40-е сут - до 76,8% и 84,4% от контрольных значений соответственно (рис. 1, А). Кроме того, Пэг-ГД во всех случаях снижала интенсивность процесса фиброзирования в печени (с минимумом до 66,6% от контрольных значений на 40-е сут опыта при введении средства 5 раз в дозах 50 ЕД/кг и 35 ЕД/кг) (рис. 1, Б).

В целом, полученные результаты свидетельствуют о выраженных гепатопротекторных свойствах Пэг-ГД, проявляющихся в антихолестатическом, противовоспалительном и противосклеротическом действии. При этом отсутствие влияния препарата на концентрацию аминотрансфераз в сыворотке крови, указывающее на сохранение на фоне фармакотерапии высокого уровня интенсивности цитолитических процессов в печени (Венгеровский А.И. и др.,2006; Ивашкин В.Т. и др., 2009; Schmucker D.L. et al., 1990), позволяет исключить мембраностабилизирующий эффект терапевтического действия Пэг-ГД.

Учитывая ранее полученные в ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН данные о несостоятельности механизмов регенерации «глубокого резерва» (связанной с недостаточной активацией эндогенных прогениторных клеток) при ряде тяжелых патологических состояний (Зюзьков Г.Н. и др., 2005, 2007; Ставрова Л.А. и др., 2005; Дыгай A.M. и др., 2011) и принципиальной возможности их фармакологической стимуляции, а также сведения о модифицирующем действии нативной гиалуронидазы на функции CK (Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Дыгай A.M. и др., 2009; Зюзьков Г.Н., 2010), было проведено исследование влияния Пэг-ГД на состояние печеночных, костномозговых и циркулирующих клеток-предшественников в условиях моделирования патологического процесса. При этом выбор в качестве объекта исследования пула родоначальных элементов гемопоэтической ткани

и

(представляющей собой наиболее значительное и мобильное депо СК в организме (Сухих Г.Т. и др., 2002; Гольдберг Е.Д. и др., 2006)) и периферической крови определялся наличием уникального свойства СК — под воздействием определенных внешних, либо внутренних стимулов покидать «нишу» ткани-депо, попадать в кровоток и мигрировать в отдаленные органы с дальнейшей реализацией их ростового потенциала (Дыгай A.M. и др., 2009, 2012;Dygai A.M. et al., 2011; Zyuz'kov G.N. et al., 2005; 2012).

В ходе эксперимента было установлено, что курсовое введение ТХУ не приводило к статистически значимым изменениям содержания как коммитированных, так и мультипотентных прогениторных клеток в исследуемых тканях на 21-е сут опыта (рис. 2, Б). В то же время в дальнейшем (23, 26-е сут) отмечалось достоверное снижение количества тканеспецифических колониеобразующих клеток в печени (рис. 3, А) на фоне возрастания числа КОЕ-Ф (содержащих в своем составе, помимо стромальных прекурсоров, истинные/мультипотентные мезенхимальные СК (Owen М. et al., 1988; Zyuz'kov G.N. et al., 2005)) в костном мозге (рис. 2, А). Выявленные феномены, вероятно, явились следствием токсического действия ТХУ на регионарные СК органа-мишени (Дыгай A.M. и др., 2011) и результатом стимуляции костномозговых предшественников под влиянием активации стресс-реализующих систем организма (Гольдберг Е.Д. и др., 2006), которая, однако, не сопровождалась их мобилизацией.

Таким образом, возможность развертывания одного из наиболее эффективных механизмов регенерации (за счет миграции СК из резервных источников) оказывалась не реализованной, что полностью совпадает с полученными нами ранее сведениями о несостоятельности механизмов компенсации «глубокого резерва» в условиях хронического токсического гепатита (Дыгай A.M. и др., 2011, 2012; Zyuz'kov G.N. et al., 2005).

Вместе с тем было выявлено значительное изменение функционирования прогениторных клеток при введении Пэг-ГД на фоне моделирования патологии печени. Использование в качестве гепатопротектора пегилированной гиалуронидазы вызывало существенно более раннее и значительное увеличение числа КОЕ-Ф в костном мозге до 293,2%, 164,6% и 151,2% от аналогичных значений у животных контрольной группы на 21, 23 и 26-е сут опыта соответственно (рис. 2, А). Причем, данные изменения наблюдались на фоне резкого возрастания содержания мезенхимальных предшественников в периферической крови (до 294,3% и 822,2% от фона при изучении КОЕ-Ф и МСК на 21-е сут опыта соответственно) (рис. 2, В, Г) и сопровождались повышением количества КОЕ-Печ, достигающего наибольших значений к концу наблюдений (26-е сут) — до 311,4% от аналогичного параметра у контрольных мышей (рис. 3, А).

16 п 12

4 -О

йЗи

В

Ф

гЬ

rf

15 -О

21 23

26

12

± i:

г J

..........-Т—I-

21

23

Рис. 2. Содержание КОЕ-Ф (А) и МСК (Б) в костном мозге, КОЕ-Ф (В) и МСК (Г) в периферической крови у мышей линии СВА/Са1ас при хроническом токсическом гепатите (белые столбики) и при введении пегилированной гиалуронидазы (серые столбики) на фоне моделирования патологии печени. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: А - на 2,5 * 10 миелокариоцитов; Б - на 2,5 х 10 мононуклеаров; В - на 106 миелокариоцитов; Г-на 106 мононуклеаров. Область межпунктирного пространства - область доверительного интервала значения показателя у интактных мышей при р<0,05.

Развитие описанных реакций со стороны различных пулов регенераторно-компетентных клеток, очевидно, явилось следствием повышения функциональной активности (пролиферации) СК костного мозга и их миграции в орган-мишень с дальнейшей реализацией ростового потенциала либо в тканеспецифичные клетки, либо в элементы микроокружения, которые опосредованно определяли ускоренное течение репаративных процессов в печени (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2009; 2012; Orlic D. et al., 2001).

Состояние пула клоногенных клеток, как известно, во многом, определяется способностью клеточных компонентов микроокружения к продукции широкого спектра гуморальных регуляторных факторов -цитокинов (Гольдберг Е.Д. и др., 1999; Gordon M.Y., 1988). Данные вещества участвуют в локальном контроле процессов пролиферации, дифференцировки, миграции и хоминга клеток-предшественников (Натан Д.Г. и др., 1994, 1996;

Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2012; Lau A.S. et al., 1996; Zyuz'kov G.N. et al., 2005, 2007).

В связи с этим были проведены эксперименты по изучению влияния Пэг-ГД на продукцию гуморальных факторов регуляции функций прогениторных клеток клеточными элементами микроокружения печени и костного мозга в условиях хронического гепатита.

В ходе исследований моделирование патологического состояния сопровождалось повышением выработки гуморальных факторов роста, активных в отношении тканеспецифичных печеночных предшественников (КСА), клеточными элементами печени до 160,7%, 195,6% и 153,4% от фона на 21, 23 и 26-е сут соответственно (рис. 3, Б). Выявленные изменения со стороны локальной системы регуляции функций резидентных прогениторных клеток, вероятно, явились ее компенсаторной реакцией (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2012) в ответ на повреждающее действие гепатотропного яда, выраженность которой, однако, оказывается недостаточной для предотвращения истощения пула КОЕ-Печ в органе-мишени (Dygai A.M. et al., 2011).

40 30 20 -10

A

21

23

T

26

Рис. 3. Содержание КОЕ-Печ в печеночной ткани (А) и колониестимулирующая активность (КСА) (Б) в отношении паренхиматозных печеночных предшественников кондиционных сред клеток печени у мышей линии СВА/СаЬас при хроническом токсическом гепатите (белые столбики) и при введении пегилированной гиалуронидазы (серые столбики) на фоне моделирования патологии печени. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя на 10 нуклеаров. Область межпунктирного пространства - область доверительного интервала значения показателя у интактных мышей при р<0,05.

Ряд особенностей был выявлен при исследовании продукции факторов миграции элементами костного мозга. Развитие патологии печени сопровождалось снижением секреции 80Р-1 стромальными миелокариоцитами

во все сроки исследования (с минимумом до 74,0% от фона на 26-е сут опыта) (рис. 4, В).

Вместе с тем изучение продукции совокупности веществ, обеспечивающих кооперацию СК с элементами микроокружения (СФМ), показало повышение их продукции на 21-е и 26-е сут эксперимента (рис. 4, А). Так, количество не связавшихся с субстратом, содержащим нуклеары гемопоэтической ткани, КОЕ-Ф в данные сроки составляло 29,8% и 34,0% от фона соответственно. Выявленный феномен объясняет описанные выше противоречивые данные об отсутствии выхода в кровь прогениторных клеток костного мозга в условиях ХГ на фоне снижения выработки SDF-1 миелокариоцитами (Dygai A.M. et al., 2011). При этом обнаруженные факты указывают на важную роль не только SDF-1, представляющего собой, по мнению ряда авторов, основной хемоатграктант СК (Куртова А.В. и др., 2007; Дыгай A.M. и др., 2011; Aiuti А. et al., 1997; Strieter R.M. et al., 2000; Dygai A.M. et al., 2011), но и иных факторов кооперации и адгезии (Гольдберг Е.Д. и др., 2006) в реализации процессов миграции предшественников.

Кроме того, моделирование хронического гепатита приводило к падению продукции СФМ клетками печени на 23-и сут, сменяющемуся увеличением их продукции на 26-е сут опыта, на фоне отсутствия статистически значимых изменений выработки ими SDF-1 (рис. 3, Б, Г). Данное обстоятельство свидетельствует о том, что даже в случае развития мобилизации СК из тканей-депо детерминированность хоминга циркулирующих родоначальных элементов в орган-мишень могла бы быть обеспечена лишь к концу периода наблюдения.

Полученные результаты позволяют говорить о несостоятельности локальных механизмов регуляции функций прогениторных клеток при хроническом гепатите, заключающейся в отсутствии адекватной реакции клеток микроокружения тканей, которая могла бы предупредить истощение пула регионарных СК, в том числе за счет обеспечения условий для миграции предшественников из тканей-депо.

Исследование влияния Пэг-ГД на секреторную функцию элементов микроокружения тканей выявило ее значительное корригирующее действие в отношении продукции гуморальных факторов. Так, введение ферментного препарата сопровождалось значительным усилением выработки КСА клетками микроокружения печени. Количество гуморальных регуляторов в кондиционных средах составляло 333,8%, 431,4% и 288,5% от фона на 21, 23 и 26-е сут соответственно (рис. 3, Б). Кроме того, наблюдалось выраженное увеличение синтеза SDF-1 и других факторов кооперации и адгезии (СФМ) элементами печени (рис. 4, Б, Г). Причем, возрастание содержания SDF-1 в кондиционной среде данных нуклеаров регистрировалось на протяжении всего эксперимента (с максимумом до 295,8% на 23-е сут), а выработка совокупности факторов хоминга отмечалась лишь на 21, 23-е сут опыта. Данное обстоятельство подтверждает представленное выше предположение о далеко не исключительной роли SDF-1 в обеспечении миграционных процессов СК in vivo (Гольдберг Е.Д. и др., 1992; Дыгай A.M. и др., 2012).

50 40 30 20 -10 О

I

рИ

0,8 0,6 -0,4 -0,2 0

- ■

А

Рис. 4. Количество не связавшихся КОЕ-Ф костного мозга после его инкубации на агаровой среде, содержащей миелокариоциты (А) и клетки печени (Б) и динамика содержания ЯОР-1 а фактора в кондиционных средах прилипающих миелокариоцитов (В) и клеток печени (Г) у мышей линии СВА/СаЬас при хроническом токсическом гепатите (белые столбики) и при введении пегилированной гиалуронидазы (серые столбики) на фоне моделирования патологии гепатита. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: А, Б - на 106 мононуклеаров; В, Г - в н/мл. Область межпунктирного пространства - область доверительного интервала значения показателя у интактных мышей при р<0,05.

Существенное влияние Пэг-ГД оказывала также на секреторную активность клеток микроокружения костного мозга. Исследуемое средство снижало продукцию миелокариоцитами 80Р-1 до 84,8%, 74,4% и 89,2% от контрольных значений на 21, 23 и 26-е сут опыта соответственно (рис. 4, В), При этом аналогичные изменения регистрировались в случае изучения синтеза совокупности субстанций «движения» СК нуклеарами гемопоэтической ткани. Число КОЕ-Ф, не связавшихся с субстратом, содержащим клетки костного мозга мышей, получавших Пэг-ГД, было достоверно выше такового у животных без лечения во все сроки в 2,4; 1,5 и 1,6 раз на 21, 23 и 26-е сут опыта соответственно (рис. 4, А).

Таким образом, под влиянием Пэг-ГД имела место модуляция функционирования клеточных элементов микроокружения тканей, характеризующаяся изменениями, направленными на восполнение популяции СК в печени как за счет повышения выработки факторов роста ее стромальными элементами, так и путем стимуляции процессов мобилизации

СК из гемопоэтической ткани и их детерминированного хоминга в орган-мишень.

В то же время ГК, являющаяся основной мишенью Пэг-ГД (Noble P.W., 2002; Stern R., 2003; Avigdor A. et al., 2004), представляет собой не только один из основных компонентов межклеточного матрикса, в котором она может составлять до 40% от всех гликозаминогликанов, но и входит в состав гликокаликса клеток и их рецепторов к биологически активным веществам (Дыгай A.M. и др., 2011, 2012; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003; Zyuz'kov G.N. et al., 2005). При этом известно, что модификация свойств ГК мембранных структур может сопровождаться изменением аффинности воспринимающего аппарата клеток (Дыгай A.M. и др., 2011). Для изучения прямого действия Пэг-ГД на мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга и КОЕ-Печ было исследовано влияние их преинкубации в растворе фермента в условиях in vitro на чувствительность к регуляторным стимулам.

Предварительная обработка клеток печени и миелокариоцитов пегилированным ферментом сопровождалась значительным усилением выхода КОЕ-Печ и КОЕ-Ф соответственно в метилцеллюлозной среде, не содержащей дополнительных ростовых факторов (рис. 5). В данном случае колониестимулирующая активность питательной среды, очевидно, определялась совокупностью биологически активных веществ эмбриональной телячьей сыворотки (Гольдберг Е.Д. и др., 1992; Дыгай A.M. и др., 2011). При этом повышение уровня образования КОЕ-Печ в культуре печеночных клеток регистрировалась на фоне, напротив, снижения роста КОЕ-Ф из данного клеточного материала. Указанный феномен свидетельствовал о значительном влиянии Пэг-ГД на дифференцировочные потенции родоначальных клеток (Гольдберг Е.Д. и др., 2007; Зюзьков Г.Н. и др., 2007) и стимуляции их развития в тканеспецифичном паренхиматозном направлении.

Кроме того, клеточные элементы, полученные после воздействия на них фермента, обладали существенно более выраженной восприимчивостью к ответу (чем интактные нуклеары) на специфические факторы роста. Так, способность КОЕ-Ф костного мозга реагировать на раннедействующий плейотропный фактор роста фибробластов стимуляцией колониеобразования увеличивалась на 99,5% (рис. 5, А), а чувствительность КОЕ-Печ печени к фактору роста стволовой клетки возрастала на 95,4% (рис. 5, Б).

Вместе с тем, результаты исследования способности клеток-предшественников печени к колониеобразованию при дополнительном добавлении в культуру ткани инсулина были не столь однозначны. С одной стороны, отмечалось усиление выхода КОЕ-Печ, с другой - снижение образования стромальных колоний (КОЕ-Ф). Данные факты, учитывая несопоставимость уровней изменения выхода паренхиматозных и фибробластных КОЕ (количество КОЕ-Печ увеличилось на 39,0%, а число КОЕ-Ф уменьшилось на 92,7%), позволяют предположить зависимость описанной реакции родоначальных клеток не только от влияния фермента на

их дифференцировочные потенции, но и от усиления Пэг-ГД ингибирующего воздействия инсулина на рост КОЕ-Ф (рис. 5, В, Г) (Дыгай A.M. и др., 2011).

Пэг-ГД

Пэг-ГД

Пэг-ГД

Пэ^ГД

Рис. 5. Интенсивность роста КОЕ-Ф (А) из интактных клеток костного мозга мышей линии CBA/Calac и миелокариоцитов, обработанных пегилированной гиалуронидазой (Пэг-ГД) и интенсивность роста КОЕ-Печ (Б, В) и КОЕ-Ф (Г) из интактных клеток печени мышей линии CBA/Calac и клеток печени, обработанных Пэг-ГД без добавления специфического фактора роста (белые столбики) и при добавлении в культуру фактора роста фибробластов (А), фактора роста стволовой клетки (Б) и инсулина (В, Г) (серые столбики). По оси абсцисс - опытные группы, по оси ординат - значения показателя: А - на 2,5 х 105 миелокариоцитов; Б, В, Г - на 10 нуклеаров.

Полученные результаты свидетельствуют о значительном повышении чувствительности прогениторных элементов, подвергшихся воздействию Пэг-ГД, к гуморальным регуляторным стимулам - ростовым факторам (Козлов В.А., 2004). При этом механизмом развития выявленных феноменов, вероятно, является модификация восприимчивости рецепторов к лигандам в результате изменения их состояния из-за деградации гиалуроновой кислоты, входящей в состав гликокаликса клеток-эффекторов (Henry C.B. et al., 1999; Stem R., 2003).

Система крови является одной из ключевых гомеостатических систем (Гольдберг Е.Д. и др., 2006), которая в значительной степени предопределяет

течение восстановительных процессов в организме. При этом известно, что стимуляция выхода в кровь прогениторных клеток из тканей может сопровождаться истощением их резерва (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Dygai A.M. et al., 2011) и, как следствие, в случае рассмотрения в качестве депо СК гемопоэтическую ткань, приводить к существенным гематологическим сдвигам. В связи с этим, учитывая факт обнаруженного мобилизующего СК костного мозга действия Пэг-ГД, весьма важным представляется исследование ее влияния на процессы кроветворения в условиях хронического гепатита.

В ходе эксперимента при моделировании патологии печени наблюдалось снижение числа предшественников КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в гемопоэтической ткани в начальные сроки эксперимента (на 21-е и 21, 23-и сут соответственно) на фоне ускорения созревания данных прекурсоров, сменяющееся в дальнейшим возрастанием их содержания (рис. 6), по-видимому, связанными с активацией стресс-реализующих систем организма (Гольдберг Е.Д. и др., 1996, 2006).

*Й

Нг

11 23 26 28

гЬ 1*1

ш

21 23 26 28

21 23 26 28

Рис 6 Содержание эритроидных (КОЕ-Э) (А) и грануломоноцитарных (КОЕ-ГМ) (Б) прекурсоров в костном мозге мышей линии СВА/Са1ас и интенсивность созревания КОЕ-Э (В) и КОЕ-ГМ (Г) при хроническом токсическом гепатите (белые столбики) и при введении пегилированной гиалуронидазы (заштрихованные столбики) на фоне моделирования патологии печени. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: А, Б - на 105 миелокариоцитов; В, Г - в услов. ед Область межпунктирного пространства - область доверительного интервала значения показателя у интактных мышей при р<0,05.

Указанные изменения функционирования гемопоэтических прекурсоров сопровождались падением числа незрелых нейтрофильных гранулоцитов (до 54,34% на 26-е сут) в гемопоэтической ткани (рис. 7, А) и количества палочко-(21-е сут) и сегментоядерных (21-28-е сут) нейтрофилов (рис. 7, В, Г) в периферической крови. При этом выявленное выраженное несоответствие уровней снижения показателей костномозгового и периферического звеньев системы крови свидетельствовало о значительной роли перераспределительных механизмов в формировании лейкопении (Гольдберг Е.Д. и др., 2006). В то же время имело место возрастание содержания эритрокариоцитов (23-и сут) в костном мозге и циркулирующих ретикулоцитов (21-26-е сут) и эритроцитов (23, 26-е сут).

Введение Пэг-ГД приводило к возрастанию числа КОЕ-Э (21, 26-е сут) и КОЕ-ГМ (21, 28-е сут) в гемопоэтической ткани (рис. 6, А, Б), очевидно, связанному со снижением интенсивности их созревания (Дыгай A.M. и др., 2009) в данные сроки (рис. 6, В, Г).

При этом выявленные изменения со стороны пула прогениторных элементов сопровождались уменьшением количества незрелых (21, 23-е сут) и зрелых (21, 26-е сут) нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге (рис. 7, А, Б). В то же время в периферической крови отмечалось повышение числа палочко- (23, 28-е сут) и сегментоядерных (21, 26, 28-е сут) нейтрофилов, очевидно, определяемое стимуляцией инфлюкса костномозгового резерва данных клеток деградацией гиалуроновой кислоты (Stern R., 2003) барьера «костный мозг - кровь» под влиянием Пэг-ГД и облегчения их выхода в циркуляцию (Дыгай A.M. и др., 1992; Zyuz'kov G.N. et al„ 2007). При этом к концу эксперимента содержание сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови соответствовало аналогичному параметру у интактных животных (рис. 7, В, Г).

Со стороны эритроидного ростка кроветворения имело место увеличение числа эритрокариоцитов в костном мозге к концу эксперимента (до 128,4% от контроля на 28-е сут опыта), связанное с возрастанием интенсивности дифференцировки КОЕ-Э в указанные сроки до 274,5% от такового у контрольных животных. Вместе с тем регистрируемые изменения не приводили к достоверным сдвигам содержания клеток красной крови в сосудистом русле. Указанный феномен мог быть связан либо с ограничением срока наблюдения десятью сутками после применения Пэг-ГД и невозможностью в связи с этим регистрации подъема данных показателей в более позднем периоде, либо с «неэффективностью эритропоэза» при введении пегилированного фермента. При этом второе обстоятельство, учитывая тот факт, что «неэффективный эритропоэз» является одним из физиологически обусловленных механизмов регуляции равновесия в системе эритрона в условиях постоянно меняющихся потребностей организма в продукции эритроцитов (Гольдберг Е.Д., 1989), может свидетельствовать об оптимизации процессов жизнедеятельности кроветворной ткани при введении Пэг-ГД в

условиях моделирования патологии печени. Так как в данном случае для компенсации патологического состояния наиболее адекватными являются энергозатраты на мобилизацию СК в периферическую кровь на фоне поддержания в ней исходного уровня клеток красной крови.

12 10 -

21 23 26 28

~2\ 23~~ 26 28

Рис 7 Содержание незрелых (А), зрелых (Б) нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и палочкоядериых (В), сегментоядерных (Г) нейтрофилов в периферической крови мышей линии СВА/Са1ас при хроническом токсическом гепатите (белые столбики) и при введении пегилированной гиалуронидазы (серые столбики) на фоне моделирования патологии печени. По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: А, Б - х 10 /бедро; В, Г Г/л. Область межпунктирного пространства - область доверительного интервала значения показателя у интактных мышей при р<0,05.

На основании полученных данных было сделано заключение об отсутствии, по крайней мере, значимого «негативного» влияния пегилированной ГД на систему крови при хроническом гепатите (Dygai A.M. et al., 2011).

В целом результаты исследований свидетельствуют о выраженных гепатопротекторных свойствах пегилированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы. При этом механизмами действия средства очевидно, являются стимуляция как регионарных паренхиматозных стволовых клеток печени, так и миграция мультипотентных СК костного мозга в орган-мишень с дальнейшей реализацией их ростового потенциала и

образованием тканеспецифичных клеток, либо элементов микроокружения, опосредованно определяющих ускоренное течение репаративных процессов (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2009; Zyuz'kov G.N., 2005). В свою очередь, развитие указанных феноменов связано с модификацией свойств межклеточного матрикса, изменением секреторной и связывающей способностей клеточных элементов микроокружения тканей, а также с повышением восприимчивости клеток-предшественников к регуляторным стимулам (рис. 8). Причем, выявленная разнонаправленность действия Пэг-ГД в отношении секреторной функции (продукция факторов хоминга) элементов микроокружения «ткани-депо» и органа-мишени и сведения литературы о повышении адгезивных свойств СК, подвергшихся воздействию гиалуронидазы (Гольдберг Е.Д. и др., 2007), позволяют говорить об исключительно высокой эффективности и максимально выраженной направленности миграционных процессов, определяемых как гуморальными, так и клеточными механизмами.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют не только о принципиальной возможности, но и, безусловно, о высокой перспективности создания на основе гиалуронидазы, пегилированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза, оригинального

высокоэффективного гепатопротекторного средства.

ПОРАЖЕННАЯ ТКАНЬ (ПЕЧЕНЬ)

OcTvtjtbtlL'!

Irvvv4

ГЕМОПОЭТИЧЕСКАЯ ТКАНЬ (ТКАНЬ-ДЕПО СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК)

Рис. 8. Схема механизмов регенеративного действия пегилированной гиалуронидазы (Пэг-ГД) при хроническом гепатите. МСК - мультипотентные (мезенхимальные) стволовые клетки;

Стрелками указаны стимулирующее (J) и ингибирующее (J) действие препаратов на продукцию SDF-1-фактора клетками

ВЫВОДЫ

1. Введение пегилированной с помощью нанотехнологии электроннолучевого синтеза гиалуронидазы при моделировании хронического токсического гепатита оказывает выраженное противовоспалительное, противосклеротическое и антихолестатическое действие.

2. Механизмом терапевтического действия Пэг-ГД является стимуляция регенераторных процессов в печени, связанная с активацией регионарных печеночных клеток-предшественников и направленной миграцией мультипотентных мезенхимальных СК костного мозга в орган-мишень.

3. Реализация компенсаторных изменений функционирования резервных систем клеточного обновления в печени при введении Пэг-ГД связана с возрастанием выработки клеточными элементами микроокружения гуморальных регуляторов, стимулирующих КОЕ-Печ, на фоне повышения их восприимчивости к регуляторным стимулам.

4. Отсутствие мобилизации клеток-предшественников костного мозга в периферическую кровь при моделировании хронического токсического гепатита связано с повышением продукции совокупности факторов, обеспечивающих кооперацию СК с элементами микроокружения, несмотря на снижение выработки ими 80Р-1. При этом не наблюдается усиления хоминга в печень циркулирующих в кровотоке регенераторно-компетентных клеток вследствие уменьшения синтеза связывающих их веществ стромальными элементами печени.

5. Мобилизация в периферическую кровь и миграция костномозговых клеток-предшественников в пораженную патологическим процессом ткань печени под влиянием Пэг-ГД определяется снижением продукции хемоаттрактантов СК стромальными клетками костного мозга на фоне увеличения их выработки элементами микроокружения органа-мишени.

6. Введение Пэг-ГД в условиях моделирования хронического гепатита сопровождается увеличением содержания кроветворных прекурсоров в гемопоэтической ткани на фоне падения скорости их созревания. При этом наблюдается кратковременное уменьшение числа нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и ускорение восстановления количества нейтрофилов в периферической крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Мирошниченко Л.А., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В, Ставрова Л.А., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Минакова МЮ Гурто Р.В. Гепатопротекторные эффекты иммобилизированнои с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы и механизмы их развития // Бюллетень экспериментальной биологии и

медицины.- 2011.- Т. 151,№1,-С. 86-90.

2 Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л А Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Чайковскии A.B., Маркова Т.С., Минакова М.Ю., Гольдберг В.Е., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Гурто Р.В. Влияние иммобилизированнои с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы на чувствительность прогениторных клеток к регулярным факторам // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2011. — №1. —С. 47-51.

3 Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Минакова МЮ Гемостимулирующие свойства иммобилизированного с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза эритропоэтина И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 151, №2 - С. Л)7 Z\V.

4 Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Мирошниченко Л.А., Чайковский A.B., Маркова Т С Гурто Р В., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г. Модуляция иммобилизированной гиалуронидазой гемостимулирующего действия иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - J№J. - С. ¿чъ-

303 5 Маркова Т.С., Зюзьков Г.Н., Влияние иммобилизированной гиалуронидазы на мобилизацию прогениторных клеток гранулоцитарным колониесгимулирующим фактором // Сибирский онкологический журнал (Материалы VI Региональной конференции молодых ученых им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск) - 2011. - прил. Х°1. - С. 75-76.

6 Маркова Т.С., Зюзьков Г.Н. Гепатопротекторные эффекты иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронат-эндо-р-№ацетилгексозаминидазы (Материалы VII Региональной

конференции молодых ученых им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск) -

2012. - прил. №1.-С. 103-104.

7 Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л А Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Гурто Р.В., Минакова М Ю Чайковский A.B., Маркова Т.С., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов

П.Г., Киншт Д.Н. Гипогликемические свойства иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронат-эндо-ß-N-ацетилгексозаминидазы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2012.-Т. 153,№1.-С. 106-110.

8. Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Ставрова JI.A., Мирошниченко JI.A., Удут Е.В., Хрнчкова Т.Ю., Симанина Е.В., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Гурто Р.В., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Фомина Т.И., Ермолаева JI.A., Ветошкина Т.В., Дубская Т.Ю. Гепатопротекторные эффекты иммобилизированных препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы и механизмы их развития // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2012.-№1,-С. 14-18.

9. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Гурто Р.В., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко JI.A., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Минакова М.Ю., Агафонов В.И. Гуморальные механизмы регуляции функций прогениторных клегок в условиях хронического гепатита // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 154, № 9. -С. 278-281.

10. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Ставрова JI.A., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Артамонов A.B., Бекарев A.A., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н. Пегилированная гиалуронат-эндо-Р-К-ацетилгексозаминидаза - модификатор функций стволовых клеток и гепатопротектор нового поколения // IV съезд фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» республика Татарстан г. Казань. Изд-во Фолиум Москва. - 18-21 сент. 2012. - С.60-61.

П.Маркова Т.С., Чайковский A.B. Механизмы гемостимулирующего действия иммобилизированной гиалуронат-зндо-р-Т^-ацетилгексозаминидазы // Материалы конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» / Под редакцией д.м.н. Зюзькова Г.Н., Томск 2012. - С.24-26.

12. Маркова Т.С., Чайковский A.B. Гепатопротекторные эффекты пегилированной технологии электронно-лучевого синтеза гиалуронат-эндо-ß-N -ацетилгексозаминидазы и механизмы их развития // Материалы конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» / Под редакцией д.м.н. Зюзькова Г.Н., Томск 2012. - С. 26-28.

13. Чайковский A.B., Маркова Т.С. Реакции системы крови и механизмы их развития под влиянием пегилированной гиалуронат-эндо-ß-N-ацетилгексозаминидазы в условиях хронического гепатита // Материалы конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» / Под редакцией д.м.н. Зюзькова Г.Н., Томск 2012. -С. 52-54.

14. Чайковский A.B., Маркова Т.С. Перспективы использования гиалуронат-эндо-Р-М-ацетилгексозаминидазы в регенеративной медицине и гематологии // Материалы конференции молодых ученых «Актуальные

проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» / Под редакцией д.м.н. Зюзькова Г.Н., Томск 2012. - С.54-56.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланинаминотрансфераза Ac AT - аспартатаминотрансфераза ГК — гиалуроновая кислота

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидная

КОЕ-Ф - колониеобразующая единица фибробластная

КОЕ-Печ - колониеобразующие единицы печени

КСА - колониестимулирующая активность

МСК - мезенхимальные стволовые клетки

ПЭГ - полиэтиленгликоль

Пэг-ГД — пегилированная гиалуронидаза

CK - стволовая клетка

СФМ - сумма факторов миграции

ТХУ - тетрахлоруглерод

ФРФ - фактор роста фибробластов-1-основной ФСК - фактор стволовой клетки ХГ - хронический гепатит щф _ щелочная фосфатаза

SDF-lo - (stromal derived factor-la) стромальный фактор la

Подписано к печати 15.05.2013. Тираж 100 экз. Кол-во стр. 24. Заказ № 14-13 Бумага офсетная. Формат А-5. Печать RISO Отпечатано в типографии ООО «РауШ мбх» Лицензия Серия ПД № 12-0092 от 03.05.2001г. 634034, г. Томск, ул. Усова 7, ком. 046 тел. (3822) 56-44-54