Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Технология очистки тестикулярной гиалуронидазы, лекарственные формы и их стандартизация

На правах рукописи

КУЛАКОВА ЕЛЕНА БОРИСОВНА

ТЕХНОЛОГИЯ ОЧИСТКИ ТЕСТИКУЛЯРНОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ, ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ И ИХ СТАНДАРТИЗАЦИЯ

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь - 2003

Работа выполнена в ФГУП «Пермское НПО «Биомед»

Научный руководители:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Сафонова Г.М.

кандидат фармацевтических наук, доцент

Молохова Е.И.

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Сульдин A.B. кандидат фармацевтических наук, доцент Сытник Г.Н.

Ведущая организация: Казанский государственный медицинский университет

Защита состоится 22 апреля 2003 г., в 13 00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Автореферат разослан «22» марта 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Метелева Е.В.

hC(kO ЙРР Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди существующих лечебных фермент-содержащих средств особое место занимают препараты гиалуронидазы. Уникальная способность гиалуронидазы катализировать реакции гидролитического расщепления гиалуроновой кислоты и родственных ей соединений делает ее незаменимой в лечении различных заболеваний человека.

В нашей стране препараты с гиалуронидазной активностью «Лидаза», «Ронидаза» выпускаются около 30 лет. К сожалению, качество выпускаемых в России препаратов несравнимо с зарубежными аналогами. За этот период накопилось значительное количество материалов, показывающих возникновение нежелательных побочных реакций, причиной которых, по-видимому, является то, что препараты гиалуронидазы готовят на основе гетерологично-го для человека сырья животного происхождения - тестикул крупного рогатого скота (КРС). По литературным данным до 20 % терапевтической дозы лидазы приходится на долю высокоаллергенного белка, что значительно увеличивает антигенную нагрузку на организм.

Действующая в нашей стране ФС 42-2606-93, регламентирующая качество выпускаемых препаратов гиалуронидазы, ограничивает не верхний предел содержания общего белка, что необходимо для снижения антигенной нагрузки, а, напротив, лимитирует нижний предел: «...не менее 10 мг/мл». Исходя из требований к величине общей (64-128 УЕ/мл) и удельной активностей (не менее 4 УЕ/мг белка), следует заключить, что содержание белка в препарате допускается до 32 мг/ мл.

Вопросы разработки новых требований к препарату и совершенствование технологии импортзамещающих ферментных препаратов на основе гиалуронидазы, являются актуальными для отечественной фармации и здравоохранения.

Эти исследования важны для расширения сферы применения препаратов гиалуронидазного действия в различных областях медицины. Существующая практически только одна лекарственная форма препарата — инъекционная - ограничивает возможности его использования, в том числе при применении гиалуронидазы в акушерстве и гинекологии. В этом плане создание новой лекарственной формы гиалуронидазы - суппозиториев - является альтернативным, перспективным и позволяет избежать ряда негативных явлений парентерального введения.

В ММА им. И.М. Сеченова в 70-х годах прошлого столетия были разработаны суппозитории с гиалуронидазой, предназначенные для изготовления в аптечных условиях. Однако исследования по выбору суппозиторной основы и объем проведенных экспериментов недостаточны для автоматического перенесения полученных данных в промышленное производство.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось создание промышленных технологий и стандартизация очищенного препарата тестикулярной гиалуронидазы, предназначенной для инъекционного введения и ректального в виде суппозиториев.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить качественный состав коммерческих препаратов лидазы, выпускаемых предприятиями России. Провести исследования по очистке тестикулярной гиалуронидазы от примесей и получению препарата с высокой удельной активностью.

2. Создать промышленную технологию очищенного инъекционного препарата гиалуронидазы.

3. Провести доклинические исследования очищенного препарата гиалуронидазы.

4. Теоретически и экспериментально обосновать состав, разработать технологию суппозиториев с гиалуронидазой.

5. Исследовать стабильность суппозиториев с гиалуронидазой в процессе хранения. Провести доклиническую и клиническую оценку суппозиториев с гиалуронидазой.

6. Разработать нормативную документацию на очищенный инъекционный препарат тестикулярной гиалуронидазы и суппозитории с гиалуронидазой.

Научная новизна. Создана научно обоснованная технология, позволяющая получать очищенный инъекционный препарат гиалуронидазы с высокой специфической удельной активностью и стабильными физико-химическими свойствами (приоритетная справка № 2002129245 от 01.11.02 г. на изобретение «Получение препарата гиалуронидазы»).

Разработаны оптимальный состав и технология суппозиториев с гиалуронидазой, обладающих высокой биодоступностью.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований:

1. Разработана и внедрена промышленная технология очищенного препарата тестикулярной гиалуронидазы, позволяющая уменьшить длительность технологического процесса в 2 раза и снизить материалоемкость и энергоемкость производства. Разработаны и утверждены фармакопейная статья предприятия ФСП 42-0028-3745-02 «Лидаза лиофилизат для приготовления. раствора для инъекций 64 УЕ Гиалуронидаза» и промышленный регламент производства препарата лидазы ПР 42-6802055-3-03. На основе разработанной технологии приготовлено пять экспериментально-произврдственных серий препарата лидазы, соответствующих требованиям ФСП 42-0028-3745-02. .

2. Разработаны промышленная технология суппозиториев с гиалу-ронидазой и способ определения гиалуронидазной активности в суппозиториях. Разработана и утверждена ФСП 42-0028-0907-01 «Гиалуронидаза суппозитории 64 УЕ». Подготовлен проект регламента производства препарата «Гиалуронидаза суппозитории 64 УЕ».

3. Очищенный препарат Пермского НПО «Биомед» выбран, из выпускаемых отечественных препаратов лидазы, в качестве компонента для изготовления лекарственного препарата гиалуронидазы пролонгированного действия - лонгидазы. Опытные серии лонгидазы проходят клинические испытания.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждались на XIV Республиканской молодежной научной конференции (Сыктывкар, 2000); на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им И.И. Мечникова ГУП « Иммунопрепарат» (Уфа, 2000); на межвузовской научно-практической конференции, посвященной 85-летию высшего образования на Урале (Пермь, 2001); на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ и получена 1 приоритетная справка на изобретение.

Связь задач исследования с проблемным планом научно-исследовательских работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно- исследовательских работ НПО «Биомед» (номера государственной регистрации 01.960.0.11488,01.2001.08830)

На защиту выносятся:

- результаты поиска методов очистки гиалуронидазы, выделенной из семенников крупного рогатого скота;

- промышленная технология инъекционного препарата тестикулярной гиалуронидазы с высокой удельной активностью, обеспечивающая стабильность физико-химических свойств;

- обоснование состава и технологии суппозиториев с гиалуронидазой, предназначенных для лечения гинекологических заболеваний;

- стандартизация суппозиториев с гиалуронидазой.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах, иллюстрирована 62 таблицами, 21 рисунком. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, раздела собственных исследований (3 главы), выводов, списка литературы, содержащего 191 источник (106 отечественных и 85 зарубежных), 8 приложений на 14 страницах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении изложены актуальность, цели и задачи исследований, научная новизна, практическая значимость работы.

В первой главе представлен обзор литературы по теме диссертации, включающий характеристику физико-химических и биологических свойств гиалуронидазы, описание лекарственных форм фермента и их применения в медицине, изложение технологических принципов производства препаратов гиалуронидазного действия.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования, изложен разработанный метод определения гиалуронидазной активности в суппозиториях.

Разработка технологии очищенного инъекционного препарата тестикулярной гиалуронидазы (глава 3).

На начальном этапе исследований проведено изучение основных характеристик коммерческих препаратов лидазы, выпускаемых в России (табл. 1). Установлено, что выпускаемые препараты имеют высокое содержание белка и низкую удельную активность. С помощью метода гель-хроматографии показано присутствие во всех препаратах как высоко-, так и низкомолекулярных примесей.

Технология препарата лидазы Пермского НПО «Биомед» включает экстрагирование из семенников КРС и концентрирование на полых волокнах экстракта, содержащего гиалуронидазу; затем с целью удаления балластных белков и гемпигментов, проводится двукратное замораживание-оттаивание концентрата. Этот способ является длительным (общая продолжительность технологического процесса около 60 дней), требует больших энергозатрат и не обеспечивает получение очищенного препарата.

Исходя из анализа существующих методов разделения и очистки белков, был определен и выполнен комплекс исследований, направленных на очистку фермента гиалуронидазы, который включает в себя фракционирование солями, осаждение органическими растворителями, очистку сорбентами.

Используемые для очистки фермента соли в концентрациях, не снижающих гиалуронидазную активность, незначительно уменьшают количество балластного белка. Лучший результат получен при применении натрия хлорида. В этом случае концентрация белка снизилась в 1,5 раза.

В экспериментах с органическими растворителями использованы гек-сан и хлороформ. Действие гексана оказалось мало эффективным. В предварительных исследованиях были определены концентрации хлороформа, при которых практически не снижается гиалуронидазная активность. Исследования показали, что в концентрированном экстракте после обработки 2,05,0 % об. хлороформа при рН 4,5 в 1,6 раза снижается содержание белка и соответственно в 1,6 раза увеличивается удельная активность.

Таблица 1

Основные показатели качества препаратов лидазы, выпускаемых в РФ, 1999 г

Наименование предприятия Внешний вид Растворимость, сек Гиалуро-нидазная активность, УЕ/мл Содержание белка, мг/мл Удельная активность, УЕ/мг белка

НПО «Био- мед», г. Пермь Пористая масса, уплотненная в таблетку белого цвета с желтоватым оттенком 68±3 75±2,5 ]4,7±1,4 5,1 ±0,2

ГУП «Имму-нопрепарат», г. Уфа Пористая масса, уплотненная в таблетку, белого цвета с коричневым оттенком 72±3 72±2,1 16,5±0,6 4,4±0,1

АО «Самсон», г. Санкт-Петербург Пористая масса, уплотненная в таблетку, белого цвета с коричневым оттенком 15=3 67±1,6 14,1 ±0,4 4,7±0,2

Предприятие по производству бактерийных препаратов, г. Омск Пористая масса, уплотненная в таблетку, белого цвета 15±1 75±2,6 8,4±0,2 8,9=:0,4

Было выявлено, что при использовании хлороформа из концентрата эффективно удаляются гемпигменты, и в соответствии с этим в 3 раза снижается показатель цветности.

Осадок, образующийся при действии хлороформа, имеет вид мелкодисперсной взвеси, которая хорошо отделяется только центрифугированием. Это создает трудности при масштабировании процесса в производственных условиях. С целью устранения данного недостатка была использована композиция двух методов: осаждение с помощью 2 %об. хлороформа в присутствии 0,5 моль/л натрия хлорида. В результате получен осадок балластного белка, легко отделяемый фильтрацией через миткаль.

На рис. 1 представлены хроматографические профили исходного концентрированного экстракта (А) и концентрата, обработанного хлороформом в присутствии натрия хлорида (Б). В последнем случае видно уменьшение содержания высокомолекулярных примесей, особенно в области молекулярной массы (ММ), близкой к ММ фермента. Однако, количество низкомолекулярных примесей (менее 6500) еще велико. Этот факт, а также присутствие остаточного хлороформа, указывают на необходимость дополнительной очистки препарата.

На следующем этапе исследований проведена оценка возможности очистки гиалуронидазы с помощью сорбентов.

При выборе сорбентов мы руководствовались следующими требованиями к ним: высокая эффективность; минимальное время и трудозатраты при подготовке к работе; отсутствие консервантов и веществ, неразрешенных для применения в производстве лекарственных препаратов; возможность получения в стерильном, апирогенном виде; возможность использования и регенерации в промышленных условиях; низкая стоимость. Для удаления из ферментсодержащего раствора балластных веществ первоначально использовано 15 доступных нам в лабораторных условиях сорбентов: опытные образцы гранулированной целлюлозы, смола ЭДЭ10 П, полисорб, гель гидро-ксида алюминия, а также различные марки активных углей, которые используют в пищевой и медицинской промышленности.

В результате проведенных экспериментов выбран уголь ОУ-Б в концентрации 100 г/л. Поскольку значительная доля балластного белка очищаемого экстракта приходится на долю бычьего сывороточного альбумина (БСА), исследована возможность его сорбции активным углем марки ОУ- Б. В модельных опытах установлено, что 1 г угля ОУ-Б сорбирует из раствора до15 мг БСА.

При сравнении хроматографических профилей исходного концентрированного экстракта (рис. 1 А) и концентрата после обработки углем (рис. 1 В) видно, что уголь значительно уменьшает количество низкомолекулярных примесей. Однако содержание белка и удельная активность еще находятся на уровне таковых коммерческого препарата, т.е. использование только одного активного угля для очистки концентрата недостаточно.

Поэтому была проведена очистка фермента с помощью комплексного метода, включающего фракционирование солью, осаждение органическим растворителем, очистку сорбентом. А именно, после обработки концентрированного экстракта смесью 2 %об. хлороформа в присутствии 0,5 моль/л натрия хлорида проведена доочистка активным углем в концентрации 100 г/л. Использование комплексного метода позволяет значительно снизить количество высоко- и низкомолекулярных примесей (рис. 1 Г).

/

и.

т .......I ' п " г " ■......т I ' I

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

В

В,280 нм

50-)

1 г 1'

-]—:-т-1 (-1--1 Г

5 10 15 20 23 30 35 40 45 50

Фракции

т ; I—1—г

5 10 15 20 23 30 35 40 45 50

280 нм

704

г " 1 I' I г • ; ' г ■ ; 'I.....;

5 10 15 20 25 3 0 35 40 45 50

Фракции

Рис. 1. Хроматографический профиль (ультрагель АсА44) экстрактов, содержащих фермент гиалуронидазу:

А - концентрированный экстракт; Б - концентрированный экстракт после обработки хлороформом и натрия хлоридом; В - концентрированный экстракт после обработки углем; Г -концентрированный экстракт после комплексной обработки (хлороформ, натрия хлорид, уголь)

В результате получен очищенный полуфабрикат

препарата, который имеет удельную активность 12 УЕ/мг белка, что почти в 3 раза лучше исходного концентрата и в 2 раза лучше коммерческого препарата НПО "Биомед". Одновременно более, чем в 9 раз по сравнению с исходным концентратом улучшился показатель цветности (рис. 2). Особо следует отметить, что хлороформ в препарате после обработки углем не обнаруживается.

Исходя из полученных результатов, принято решение использовать в промышленном производстве очищенной тестикулярной гиалуронидазы комплексный метод, комбинируя обработку концентрированного экстракта хлороформом в присутствии натрия хлорида и доочистку его активным уг-

лем.

Рис. 2. Динамика удельной активности (А) и цветности (Б) концентрированного экстракта на разных этапах очистки: I - исходный концентрат; 2 - концентрат, обработанный хлороформом; 3 -концентрат, обработанный хлороформом и натрия хлоридом; 4 - концентрат, обработанный хлороформом, натрия хлоридом и активным углем ОУ-Б.

На рис. 3 представлены схемы производства препарата лидазы по существующей и предлагаемой технологиям. В технологии коммерческого препарата, как уже было сказано, в качестве основного метода очистки используется прием вымораживания на стадиях ТП 4 (Получение второго концентрата) и ТП 5 (Получение полуфабриката лидазы). Общая продолжительность этих двух стадий около 600 ч.

В разработанной технологии длительные, энергоемкие стадии вымораживания заменены на стадии осаждения хлороформом в присутствии натрия хлорида и обработки углем. Кроме того, в предлагаемой технологии отсутствуют этапы центрифугирования. Общая продолжительность стадий ТП 4 и ТП 5 сократилась до 36 ч. Как видно из схемы, изменения, введенные

СУЩЕСТВУЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ

ТП 41

ТП 42

ВР1-2

Получение воды очншрнной, санитарная обработка

Вымер аживашш 1 концентрата, 258 ч

ТПЗ

Получение гервого ко нцешрата, б ч

Центрифугирование, 4 ч

ТП4.3 Фильтрация, 10 ч

ТП4.4 концентрирование

ТП4 Получение

второго

кокдекграта

ТП51 Вь&юражнваше 2 концентрата, 288 ч

ТП5.2 Центрифугирование,2 ч

ТП53 Фильтрация

ТП54 Диафклырация, 13 ч

£

\

ТП 4.1

ТП 5 Получеше

полуфабриката

лидазы

ТП6

Получение стдшльншо раствора лидазы

V

ТП 7

Ампулир авание

УМ08

Маркировка, фасовка и упаковка готовой про дукцри

Рис.3 Технологические схемы производства препарата лидазы

РАЗРАБОТАННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ

Концентрирование, 4 ч

ТП4.2 Осаждение, 2 ч (хлороформ, 1ЧаС1)

ТП4.3 Фильтрация, 20 ч

ТП51 О^р аботка унвм, 4,5 ч

ТП5.2 ТП5.3 Фильтрация Диафильтрадия, 55 ч

в технологический процесс, касаются только двух стадий. Остальные стадии выполняются в соответствии с действующим регламентом.

В производственных условиях проведена отработка предложенного технологического процесса при изготовлении 5 опытно-промышленных серий.

Уже на стадии ТП 4, где по существующей технологии идет очистка от балластных белков с помощью замораживания- оттаивания, а по предлагаемой - с помощью хлороформа в присутствии натрия хлорида, видна достоверная разница в концентрации белка. На последующих стадиях разница становится еще более достоверной (рис. 4 А). Соответственно изменяется и удельная активность. По сравнению с существующей технологией она возрастает более, чем в 2 раза (рис. 4 Б).

На рис. 5 представлены хроматографические профили лиофилизиро-ванных препаратов коммерческой серии 1471002 и препарата опытно-промышленной серии 51002, изготовленного по новой технологии. Можно отметить более высокую степень очистки последнего.

Выход препарата с 1 кг сырья по предлагаемой технологии составил 330 доз, существующая технология обеспечивает выход 334 дозы с 1 кг сырья. Таким образом, получен очищенный препарат гиалуронидазы при сохранении выхода. Общая продолжительность технологического процесса с учетом всех стадий уменьшилась в 2 раза.

мг/доза 20

ТПЗ ТП4 ТП5 ТП6

ТПЗ ТП4 ТП5 ТП6

Рис. 4. Динамика очистки гиалуронидазы по существующей (1) и предлагаемой (2) технологиям:

А - содержание белка; Б - удельная активность фермента. * - р<0,05; ** - р<0,01;*** - р<0,001 по* /-критерию Стьюдента по отношению к существующей технологии. -

Рис. 5. Хроматографический профиль (ультрагель АсА44) препаратов лидазы: А - коммерческий препарат; Б — препарат, полученный по разработанной технологии.

Таблица 2

Основные показатели качества препарата лидазы, 2002 г._

Наименование показателей Существующая технология Предлагаемая технология

I .Описание Пористая масса, уплотненная в таблетку, белого цвета с желтоватым, розоватым и коричневатым оттенком. Пористая масса, уплотненная в таблетку, белого цвета

2.Время растворения 50-70 сек 15-18 сек.

З.Прозрачность 0,073-0,084 0,013-0,024

4. Цветность 0,413-0,480 0,067-0,139

5. рН 4,3-4,6 5,0-6,0

6. Потеря в массе при 1 высушивании 5,0-7,0 5,0-7,0

7. Пирогенность Апирогенен Апирогенен

8. Токсичность Нетоксичен Нетоксичен

Э. Стерильность Стерилен Стерилен

!0. Количественное

определение:

гиалуронидазная активность 70- 90 УЕ/ мл 70-90 УЕ/ мл

белок 12-16 мг/ мл 5,2-6,7 мг/мл

удельная активность 4,3 - 7,5 УЕ/мг 11,9-16,4 УЕ/мг

В табл. 2 представлены величины нормируемых физико-химических и биологических показателей препаратов гиалуронидазы, изготовленных по существующей и разработанной технологиям.

По основным показателям препарат лидазы, изготовленный по новой технологии, превосходит коммерческий. Помимо уже отмеченных количественных показателей, улучшился внешний вид (цвет препарата стал белый), сократилось в 3 раза время растворения, улучшились прозрачность и цветность препарата. Показатель рН очищенного препарата соответствует требованиям ведущих зарубежных Фармакопей (B.Ph,I998, Eur. Ph, 1999).

Основные характеристики препарата, полученного по новой технологии, введены в качестве требований к нормируемым показателям в ФСП 420028-3745-02 «Лидаза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 64 УЕ Гиалуронидаза».

Доклиническая оценка очищенного препарата гиалуронидазы (глава 4).

Изучена острая токсичность очищенного препарата гиалуронидазы на мышах. Максимально переносимую дозу выявить не удалось. При дозе, соответствующей 14400 терапевтических доз (ТД), вводимой внутрибрюшинно, и при дозе, соответствующей 20000 ТД, вводимой внутривенно, все животные остались живы.

Оценка хронической токсичности гиалуронидазы очищенной на грызунах-крысах (100 ТД препарата вводили внутрибрюшинно в течение 30 дней) и негрызунах - кроликах (20 ТД препарата вводили внутривенно в течение 30 дней), местно-раздражающего действия и аллергенных свойств на морских свинках, показала полную безвредность препарата.

Разработка технологии и оценка качества ректальной лекарственной формы гиалуронидазы (глава 5).

Биологическая природа гиалуронидазы и присутствие у нее гидрофильных свойств делает целесообразным использование суппозиторных основ гидрофобного характера и эмульгаторов неионогенного типа.

При разработке состава суппозиториев проводили исследования влияния свойств основ и поверхностно-активных веществ (ПАВ) на гиалурони-дазную активность по плану латинского квадрата 4x4 с повторными наблюдениями. Параметром оптимизации избрали активность высвободившейся из суппозиториев в течение 4 часов гиалуронидазы. Метод высвобождения-прямая диффузия без применения полупроницаемой мембраны.

Методом случайного баланса определены факторы, влияющие на процесс высвобождения гиалуронидазы из суппозиториев и их технологию:

А - суппозиторная основа: а)- гидрогенизат хлопкового жира, а2 — ви-тепсол W 35, а3 - смесь витепсолов HI5 и W 35, а4 - твердый кондитерский жир;

В - ПАВ: вгэмульгатор Т-2, в2- смесь эмульгаторов МГД и Т-2 (1:1), ву эмульгатор МГД , в4- без эмульгатора;

С - агрегатное состояние гиалуронидазы (из расчета 64-

128 УЕ в одном суппозитории): Сржидкий концентрат, с2- лиофилизирован-ный неизмельченный порошок, с3- смесь концентрата и лиофилизированного неизмельченного порошка (1:1), с4 - лиофилизированный порошок с размерами частиц менее 200 мкм.

Дисперсионным анализом установлено, что наибольшее влияние на процесс высвобождения гиалуронидазы оказывает природа суппозиторной основы.

Выявленные с помощью множественного критерия Дункана различия средних величин фактора А показали, что наилучшие результаты по высвобождению гиалуронидазы из суппозиториев обеспечивают витепсолы и твердый кондитерский жир. Среди используемых ПАВ наиболее эффективен при высвобождении гиалуронидазы из суппозиториев эмульгатор МГД. Гиалуро-нидазу в состав суппозиториев целесообразно вводить в виде измельченного порошка.

Установлено, что витепсолы Н-15 и W-35, а также твердый кондитерский жир с эмульгатором МГД, используемые в качестве основы, обеспечивают 100% высвобождение гиалуронидазы из суппозиториев в течение 4 ч.

Поскольку гиалуронидазная активность определяется спектрофото-метрически, необходимо было исключить влияние на УФ-спектр фермента компонентов суппозиторной основы. Для этого на выбранных суппозитор-ных основах приготовлены модельные образцы суппозиториев с содержанием гиалуронидазной активности от 64 до 128 УЕ. и без нее («плацебо»). Из них получены вытяжки и изучены спектры поглощения (рис. 6).

А

Б

олхкм

// ХУ

:г\

1 /

одооо

// \\ '! \ / ^ \

\

600 О нм

600 О ям

Рис.6 УФ-спектры вытяжек из суппозиториев на основе твердого кондитерского жира (А) и смеси витепсолов Н-15 и \V-35 (Б): 1 - из суппозиториев с гиалуронидазой; 2 - из основ без гиалуронидазы; 3 - раствор субстанции лидазы, серия 1391000.

500 О

Как видно из рис. 6, используемые основы не оказывают какого-либо влияния на величину оптической плотности в области 450-650 нм, в которой определяется активность гиалуронидазы. Кроме того, профиль спектров поглощения вытяжек полностью совпадает с профилем гиалуронидазы, используемой в качестве субстанции для приготовления суппозиториев.

Суппозитории, изготовленные на основе смеси витепсолов Н15 и W 35, были использованы в экспериментах на кроликах для оценки биологической доступности фермента гиалуронидазы при ректальном введении.

На рис. 7 приведены кинетические профили изменения гиалуронидаз-ной активности в сыворотке крови при различных путях введения препарата. Сравнительный анализ площадей под фармакокинетической кривой показал, что степень биодоступности гиалуронидазы при ректальном способе введения в 1,5 раза выше в сравнении с внутримышечным, и составляет 70,0%.

часы

Рис.7. Кинетические профили изменения гиалурониданой активности в сыворотке крови кроликов: 1 - внутривенное введение,

2 - ректальное введение (суппозитории),

3 - внутримышечное введение.

Для количественной оценки активности гиалуронидазы в суппозиториях использована методика, разработанная нами. В одном суппозитории должно быть не менее 64 УЕ гиалуронидазной активности.

Технологическая схема приготовления суппозиториев с гиалуронида-зой представлена на рис. 8.

Суппозитории с гиалуронидазой, приготовленные на выбранных основах, были заложены на хранение. Через 2 года 3 месяца суппозитории не изменили своих свойств по всем показателям: внешнему виду, средней массе,

ВР 1.1. Подготовка веншляци одного воздуха

ВР 1 2 Приготовление дезинфицирующих растворов

ВР 1.3. Подготоаа производственных помещений

ВР 1 4 Подготовка оборудования, посуда, вспомогательных материале®

ВР 1 5 Подготовка технологической одежды и персона®

ТП 2 ! Розлив полуфабриката гиалуронидазы

ТП 2.2 Лиофилыюе высушивание

ТП 2.3 Сбор лиофилизироваиного порошка в емкисти

ТП 2.4 Контроль порошка гиалуронидаза

ТП4.1 Приготовление концентрата

ТП 4.2 Смешившие концентрата с основой

ЭР I Санитарная подготовка

производства

н

тп а

Сточныеводы от промывки оборудования, помещений.

Получение сухого порошка гиалуронидазьг

ВРЗ Приготовлениежировой

основы и ее

стерилизация

ТП4 Приготовление суппозиторной №ССЫ

1 >

ТП 5 Формирование суппозиториев

1

ТПб Фасовка суппозиториев

4

УМО?^ Маркировка и упаковка

4

ТП 8 Контроль готового препарата

\

;.8 Технологическая схема производства препарата «Гиалуронидаза суппозито-;т 64 УЕ»

времени полной деформации, микробиологической чистоте,

гиалуронидазной активности. Полученные материалы позволили установить срок хранения для данной лекарственной формы 2 года.

Доклиническая оценка хронической токсичности и местно-раздражающего действия суппозиториев с гиалуронидазой, вводимых вагинально и ректально, выполнена в центре по химии лекарственных средств (г.Москва). На основании полученных результатов суппозитории с гиалуронидазой были рекомендованы для клинического изучения.

Клинические испытания проводились в Центре акушерства и гинекологии (г. Москва), клинике Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и МСЧ № 9 (г. Пермь). В результате показана эффективность суппозиториев с гиалуронидазой при лечении гинекологических заболеваний и при родовспоможении.

В 2002 г Фармакологический комитет Российской Федерации принял разрешение рекомендовать медицинское применение препарата гиалуронида-зы в лекарственной форме - суппозитории ректальные.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан метод удаления высоко- и низкомолекулярных при месей, присутствующих в промышленном препарате «Лидаза», путем обработки экстракта из тестикул крупного рогатого скота, содержащего фермент гиалуронидазу, хлороформом в присутствии натрия хлорида с последующей доочисткой активным углем.

2. На основе разработанного метода создана промышленная технология очистки тестикулярной гиалуронидазы, позволяющая получать препарат для инъекций с удельной активностью более 12 УЕ/мг белка.

3. Доклиническая оценка очищенного инъекционного препарата гиалуронидазы показала его безвредность: отсутствие токсических свойств, мест-нораздражающего и аллергенного действия.

4. На основании результатов математического планирования и обработки экспериментальных данных, полученных в ходе технологических и биофармацевтических исследований, разработаны составы и технология суппозиториев с гиалуронидазой для применения в гинекологической практике. Установлено, что витепсолы Н-15 и \V-35, а также твердый кондитерский жир с эмульгатором МГД, используемые в качестве основы, обеспечивают практически полное высвобождение гиалуронидазы из суппозиториев.

5. Степень биодоступности гиалуронидазы при ректальном способе введения в 1,5 раза выше в сравнении с внутримышечным и составляет 70,0%, что показано при сравнительном анализе площадей под фармакокинети-ческой кривой. Установлена стабильность при хранении в течение 2 лет и 3 месяцев суппозиториев с гиалуронидазой, упакованных в бумагу с полимерным покрытием и в пленку целлюлозную лакированную.

6. Разработана и внедрена в производство технология

очищенного препарата для инъекций, оформлены и утверждены ФСП 420028-3745-02 «Лидаза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 64 УЕ Гналуронидаза», промышленный регламент производства препарата лидазы ПР 42-6802055- 3-03. Оформлена и утверждена ФСП 42-0028-0907-01 «Гиалуронидаза суппозитории 64УЕ», разработан проект регламента производства препарата «Гиалуронидаза суппозитории 64 УЕ», получено разрешение МЗ РФ на медицинское применение препарата гиалуронидазы в лекарственной форме - суппозитории ректальные.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кулакова, Е.Б. К вопросу об очистке препарата лидазы / Е.Б. Кулакова, Г.М. Сафонова // XIV Республиканская молодежная научная конференция: Тез. Докл.-Сыктывкар, 2000,- Т.1.- С. 10.

2. Кулакова, Е.Б. Разработка технологии очистки препарата лидазы / Е.Б. Кулакова, Е.И. Молохова, Г.М. Сафонова // Матер.Межвуз.конфер. ПГФА, 2000.-С.153.

3. Использование препарата «Лидаза в свечах» в лечении больных с подо-стрым воспалением придатков матки / Н.В. Старцева, Г.М. Сафонова, Л.В. Волкова, Е.Б. Кулакова, В.И. Липина // VIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»:Тез. Докл.- Москва, 2001.-С. 339.

4. Молохова, Е.И. Выбор основы для изготовления суппозиториев с гиалу-ронидазой. / Е.И. Молохова, Е.Б. Кулакова, Г.М. Сафонова // Матер.Межвуз.конфер. ПГФА, 2001.-С.131-132.

5. Сафонова, Г.М. О сравнительном изучении динамики гиалуронидазной активности в сыворотке крови кроликов при парентеральном и ректальном введении лидазы. / Г.М. Сафонова, Л.В. Волкова, Е.Б.Кулакова //Актуальные вопросы разработки производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Матер. Всеросс.науч. конфер.-Уфа, 2000.-Ч.2.-С.28-30.

6. Молохова, Е.И. Разработка и биофармацевтическая оценка суппозиториев с гиалуронидазой / Е.И. Moлoxoвá, Г.М. Сафонова, Е.Б. Кулакова // Фармация.-2002.- № 4.-С.22-24.

7. Кулакова, Е.Б. О результатах оценки суппозиториев с гиалуронидазой в клинике / Е.Б. Кулакова, Г.М. Сафонова, Н.В. Старцева // Объединенный медицинский журнал.-2002.-№ З.-С.14-16.

Подписано в печать V7.0~i.D5. Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Усл.печ.л. А^Аб» .Тираж 100экз.Заказ 95".

614600, г.Пермь, ул.Букирева, 15. Типография Пермского университета.