Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Эффекты и механизмы реализации ростового потенциала прогениторных клеток под влиянием нативной и пегилированной гиалуронидазы

На правах рукописи

ЧАЙКОВСКИЙ АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ

ЭФФЕКТЫ И МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ РОСТОВОГО ПОТЕНЦИАЛА ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ПОД ВЛИЯНИЕМ НАТИВНОЙ И ПЕГИЛИРОВАННОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ

14.03.03 - патологическая физиология

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2012

1 0 [.«ми 2012

005017290

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

Дыгай Александр Михайлович

доктор медицинских наук

Зюзьков Глеб Николаевич

Официальные оппоненты:

Чурин Алексей Александрович, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, отдел лекарственной токсикологии, заведующий отделом

Ваизова Ольга Евгеньевна, доктор медицинских наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедра фармакологии, профессор кафедры

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Защита состоится " 3/ " ¿уМЛ_2012 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Б.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последние десятилетия значительно расширились представления о свойствах и закономерностях функционирования поли(мульти)потентных клеток-предшественников организма высших млекопитающих (Сухих Г.Т. и др., 2002; Гольдберг Е.Д. и др., 2005; Дыгай A.M. и др., 2009; Beltrami А.Р. et al., 2012). Данные элементы (истинные СК) не завершают программу своей дифференцировки на протяжении всей жизни организма и являются самообновляющимися СК, назначение которых заключается в регенерации тканей в ответ на физиологическую убыль клеток, либо их гибель, вызванную повреждающим фактором (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Gussoni Е. et al., 1999). Ростовой потенциал и плюрипотентность взрослых стволовых клеток (СК) делают принципиально возможным их использование для замещения тканей путем трансплантации, либо создания искусственно воспроизведенных тканей (Чертков И.Л. и др., 1991; Дыгай A.M. и др., 2009; Чехонин В.П. и др., 2010; Williams A.R. et al., 2011). Однако применение клеток и тканей, особенно взятых от эмбрионов, в клинических условиях требует решения многих не только морально-этических и правовых, но, безусловно, и биологических проблем, и может рассматриваться лишь как направление с весьма отдаленными перспективами (Дыгай A.M. и др., 2010, 2011, 2012; Serakinci N. et al., 2004; Rubio D. et al., 2005; Rosland G.V. et al., 2009; Torsvik A., et al., 2010).

В то же время существует альтернативная - фармакологическая стратегия клеточной терапии. При этом наиболее физиологичным и рациональным из неинвазивных подходов к решению задач регенеративной медицины является стимуляция функций эндогенных прогениторных клеток, основанная на принципе подражания деятельности естественных регуляторных систем их функционирования в организме (Годьдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2007, 2009, 2010, 2011,2012; Зюзьков и др., 2012).

Согласно современным представлениям, состояние пула прогениторных элементов in situ во многом определяется функциональной активностью клеточных элементов микроокружения тканей и продуктами их жизнедеятельности. Именно микроокружение определяет пролиферативный статус, миграцию, а также выбор той или иной программы дифференцировки родоначальных клеток (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2009; Dombrowski С. et al., 2009).

Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой один из основных компонентов межклеточного матрикса. При этом важная роль в ее метаболизме принадлежит гиалуронидазе - ферменту, под действием которого происходит образование полимеров с различной молекулярной массой, способных оказывать разное влияние на многие биологические процессы и функциональную активность клеточных элементов (Noble P.W., 2002; Stern R., 2004). Причем установлено, что низко- и среднемолекулярные формы ГК стимулируют пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток, а ГК с

высокой молекулярной массой, обладают противоположным действием. Кроме того, ГК in situ связывает предшественники посредством расположенных на них CD44 и RHAMM - рецепторов, а также входит в состав гликокаликса клеток, в том числе прогениторных, и их рецепторов к биологически активным веществам (Cichy J. et al„ 2004; Avigdor A. et al., 2004; Schade U.M. et al., 2006).

Учитывая указанные обстоятельства, весьма перспективным представляется создание подхода управления регенераторным потенциалом тканей за счет модификации свойств ГК с помощью гиалуронидазы. Однако значительное содержание ингибиторов данного фермента в сыворотке и тканях организма предопределяет его быструю инактивацию и делает практически невозможным получение выраженных системных (резорбтивных) фармакологических эффектов (Максименко А. В. и др., 2001; Wolf R.А. et al., 1984; Afify A.M. et al., 1993).

В то же время существует нанотехнология электронно-лучевого синтеза, позволяющая получать конъюгаты биологически активных веществ белковой природы с низкомолекулярными носителями. При этом создаваемые соединения оказываются в значительной степени защищенными от факторов деградации (Дыгай A.M. и др., 2009,2010, 2011, 2012).

Исходя из вышеизложенного весьма актуальным представляется изучение возможности стимуляции процессов восстановления поврежденных тканей путем активации эндогенных прогениторных клеток за счет модификации свойств межклеточного матрикса, направленное на разработку новых средств для регенеративной медицины.

Цель исследования: Вскрыть механизмы модуляции функций прогениторных клеток под влиянием гиалуронидазы и определить возможность управления регенераторным потенциалом кроветворной ткани с помощью пегилированного фермента.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние костномозгового и циркулирующего пулов мезенхимальных и кроветворных предшественников при введении различных доз нативной гиалуронидазы.

2. Исследовать влияние гиалуронидазы на мобилизацию прогениторных клеток в периферическую кровь, индуцируемую гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ).

3. Выявить изменения связывающей способности элементов микроокружения костного мозга в отношении родоначальных клеток, а также адгезирующих свойств клеток-предшественников под действием гиалуронидазы.

4. На модели цитостатической миелосупрессии определить терапевтическую активность донорских прогениторных клеток, подвергшихся воздействию фермента, при их трансплантации.

5. Изучить специфическую активность пегилированной гиалуронидазы в отношении прогениторных клеток различных классов при ее парентеральном и пероралыюм введении.

6. Исследовать гемопоэзстимулирующие эффекты пегилированной гиалуронидазы (Пэг-ГД) и вскрыть механизмы их развития.

Научная новизна. Впервые показана важная роль ГК в регуляции функций прогениторных клеток и выявлена возможность управления их пролиферативно-дифференцировочным потенциалом с помощью гиалуронидазы. При этом обнаружена зависимость эффектов от дозы вводимого in vivo фермента. Относительно низкие дозы ГД приводят к повышению функциональной активности мезенхимальных и кроветворных предшественников костного мозга, а также к стимуляции их выхода в кровь, индуцируемого Г-КСФ. Потенцирование мобилизующей прогениторные клетки активности Г-КСФ наблюдается, несмотря на возрастание адгезивных свойств клеток-предшественников, и связано с воздействием фермента на элементы микроокружения гемопоэтической ткани. В условиях моделирования цитостатической миелосупрессии показано повышение способности СК, подвергшихся воздействию ГД, к реализации ростового потенциала. Выявлено увеличение терапевтической активности трансплантата, представляющего собой мононуклеары периферической крови, содержащие мобилизованные Г-КСФ стволовые клетки, при дополнительном введении донорам гиалуронидазы. При этом обнаружена важная роль ускоренного структурно-функционального восстановления гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) в стимуляции регенерации кроветворной ткани. Впервые продемонстрировано возрастание специфической активности фермента в отношении прогениторных клеток после его пегилирования с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза. Выявлены выраженные гемопоэзстимулирующие эффекты Пэг-ГД при ее пероральном введении, связанные с увеличением функциональной активности кроветворных предшественников на фоне повышения их восприимчивости к регуляторным стимулам и увеличения фидерных свойств стромальных элементов ГИМ.

Практическая значимость. Продемонстрирована принципиальная возможность и высокая эффективность управления регенераторным потенциалом СК с помощью гиалуронидазы. Предложен оригинальный подход получения трансплантационного материала, представляющего собой мононуклеары периферической крови, максимально обогащенные регенераторно-компетентными клетками. Разработан способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток и способ стимуляции миелопоэза. Показана перспективность создания средства для регенеративной медицины на основе пегилированной с использованием нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы (разработанной ФГБУ «НИИ

фармакологии» СО РАМН (г. Томск) совместно с ООО «Саентифик фьючер менеджмент» (г. Новосибирск)).

Полученные результаты вносят существенный вклад в развитие фармакологической стратегии регенеративной медицины и могут использоваться в экспериментальной биологии и медицине с целью разработки медицинских клеточных технологий, методов лечения дегенеративных заболеваний и для изучения биологии стволовых клеток.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Российской научной конференции, посвященной 25-летию НИИ фармакологии СО РАМН «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2009 г.); XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы» (Екатеринбург, 2010); V, VI и VII Региональных конференциях молодых ученых им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2010, 2011, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ; получено 2 патента на изобретения: патент (RU) № 2439147 «Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток» (опубл. 10.01.2011, Бюл. № 1) и патент (RU) на изобретение № 2442589 «Способ стимуляции миелопоэза» (опубл. 20.02.2012, Бюл. № 5).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 20 таблицами. Библиографический указатель включает 402 источника, из них 79 отечественных и 323 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 844 мышах линии CBA/CaLac массой 20-25 г в возрасте 2-2,5 мес. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

В качестве средств на основе гиалуронидазы использовали: лекарственное средство нативного фермента («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ) и иммобилизированную (пегилированную) с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазу (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г. Новосибирск).

Модифицированный фермент представлял собой конъюгат гиалуронидазы с полиэтиленгликолем (Пэг) молекулярной массы 1500 Да. Синтез вещества осуществлялся путем внесения в 2% раствор Пэг, предварительно

обработанный потоком ускоренных электронов ионизирующего излучения (доза 1,5 Мрад, энергия электронов 2,5 МэВ, поглощённая доза 2-10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час), генерируемого ускорителем ИЛУ-10, до конечной концентрации 70 ЕД/мл гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ).

Препарат нативной гиалуронидазы вводили интактным животным и мышам на фоне моделирования феномена мобилизации стволовых клеток внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2-х дней в дозе по 1 ООО ЕД/кг и río 5000 ЕД/кг. Мобилизация стволовых клеток вызывалась введением гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) - нейпогена («Hoffman-la Roche», Швейцария) в дозе по 125 мкг/кг 1 раз в день в течение 5-и сут.

С целью изучения механизмов мобилизации CK гиалуронидазой в условиях in vitro изучали способность клеток-предшественников (КОЕ-Ф) связываться со стромой и межклеточным матриксом (Гольдберг Е.Д. и др., 2007). В качестве модели стромы использовали монослой 3-х недельных культур цельного костного мозга интактных мышей, облученный дозой 20 Гр (гамма-аппарат «Рокус-М», Россия, энергия 1,25 МэВ). Межклеточный матрикс (МКМ) моделировался путем обработки 3-х недельной культуры миелокариоцитов 99% раствором диметилсульфоксида, вызывающего гибель клеток (Mosmann T.R., 1983). Дополнительными вариантами субстратов для связывания являлись строма и МКМ, обработанные ГД (1 ЕД/мл полной культуральной среды в течение 24 ч).

Сравнительное исследование терапевтической эффективности клеточного материала (мононуклеаров периферической крови), полученного после использования Г-КСФ и гиалуронидазы проводили на модели цитостатической мйелосупрессии, вызываемой однократным внутрибрюшинным введением 5-фторурацила («Эбеве Фарма ГмбХ», Австрия) в дозе Vi МПД (114 мг/кг); Клеточный материал для трансплантации брали: в одном случае у мышей, которым вводили только Г-КСФ («Нейпоген», «Hoffman-la Roche», Швейцария), Г-КСФ и гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ) одновременно - в другом. Г-КСФ вводили подкожно в дозе 125 мкг/кг/сут в течение 3 дней, а гиалуронидазу внутрибрюшинно в дозе 1000 ЕД/кг/сут в течение 2-х дней. Забор клеток крови осуществляли на 4-е сут после начала введения препаратов.

При изучении фармакологических эффектов Пэг-ГД в отношении прогениторных клеток интактных мышей средство вводили внутрибрюшинно и внутрижелудочно (через зонд) 1 раз в сутки в течение 2-х дней по 20 ЕД/мышь, а в условиях моделирования мобилизации CK - per os 1 раз в день в течение 2 сут в дозах: 50, 250, 500 и 1000 ЕД /кг.

Исследование гемостимулирующих свойств Пэг-ГД проводили на модели цитостатической миелосупрессии, вызываемой однократным

внутрибрюшинным введением циклофосфана (Циклофосфан-Лэнс, ЗАО «Верофарм», г. Москва) в максимально переносимой дозе (МПД) (250 мг/кг по

результатам пробит-анализа). При этом Пэг-ГД применяли per os 1 раз в день в

течение 2 сут в дозе по 50 ЕД/кг.

Содержание фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф), а также коммитированных клеток-предшественников эритро- (КОЕ-Э) и грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) в костном мозге изучали in vitro методом клонирования в полувязкой культуральной среде (Гольдберг Е.Д. и др., 1992). Пролиферативную активность гемопоэтических прекурсоров определяли с помощью метода «клеточного самоубийства» путем поглощения гидроксимочевины в культуре ткани (Гольдберг Е.Д. и др., 1992). Интенсивность созревания эритроидных и грануломоноцитарных клеток-предшественников оценивали по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в одной лунке) (Гольдберг Е.Д. и др. 1992). Эритропоэтическую (ЭПА) и колониестимулирующую (КСА) активности кондиционных сред прилипающих и неприлипающихъ миелокариоцитов, а также сыворотки крови тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. ЭПА и КСА выражали количеством выросших эритроидных и грануломоноцитарных колоний (на 10 миелокариоцитов) (Гольдберг Е.Д. и др. 1992). Количество мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и периферической крови определяли с помощью метода лимитирующих разведений при длительном культивировании клеточного материала (in 't Anker P.S. et al, 2003) в собственной модификации (на 10 нуклеаров).

Для оценки влияния Пэг-ГД на восприимчивость эритроидных (КОЬ-Э) и грануломоноцитарных (КОЕ-ГМ) кроветворных клеток-предшественников к эритропоэтину (ЭП) («Рекормон», Хоффман ля Роше, Швейцария) и Г-КСФ («Нейпоген», Хоффман ля Роше, Швейцария) неприлипающие миелокариоциты подвергали 30 минутному воздействию (преинкубации) 0,1 ЕД/мл раствора имГД на основе среды DMEM (Sigma, США). После преинкубации исследовали способность миелокариоцитов образовывать КОЕ-Э и КОЕ-ГМ (Гольдберг Е.Д. и др., 1992) при добавлении ЭП и Г-КСФ соответственно.

Оценку показателей периферического звена системы эритрона осуществляли с помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS, в ветеринарном режиме. Изучение количества различных форм лейкоцитов в периферической крови и показателей костного мозга осуществляли стандартными гематологическими методами (Кост Е.А., 1975; Меньшиков В.В., 1987; Голованов М.В., 1991).

Обработку результатов проводили с помощью методов вариационной статистики с применением параметрического t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни (Лакин Г.Ф., 1973; Урбах В.Ю., 1975; Зайцев Г.Н., 1984). Частоту встречаемости мезенхимальных стволовых клеток (МCK) определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведений одномерной модели Пуассона оценивали посредством линейной log-log регрессии (Bonnefoix Т. et al., 2001; t'Anker P.S. et al., 2003).

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе экспериментов внутрибрюшинное введение интактным мышам нативной гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг приводило к существенному возрастанию содержания эритроидных и грануломоноцитарных прекурсоров в гемопоэтической ткани, а также повышению их митотической активности и скорости созревания. Кроме того, имело место увеличение числа коммитированных стромальных предшественников (КОЕ-Ф) и мультипотентных мезенхимальных CK в костном мозге. Указанные изменения, очевидно, являлись следствием образования под действием фермента большого количества низко- и среднемолекулярных форм ГК, способных стимулировать процессы пролиферации и дифференцировки клеточных элементов (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Stern R., 2003; Schade U.M. et al., 2006).

В то же время использование высоких доз гиалуронидазы (5000 ЕД/кг) приводило не к столь однозначным изменениям изучаемых показателей. В частности, отмечалось падение количества КОЕ-Ф в костном мозге (до 28,3% от фона на 8-е сут) при отсутствии значимых изменений со стороны популяции наиболее ранних мезенхимальных предшественников (МСК). Кроме того, увеличение степени деградации ГК сопровождалось падением числа КОЕ-Э в костном мозге на 3, 5-е сут, снижением уровня их пролиферативной активности и скорости дифференцировки. Вместе с тем по сравнению с животными, получавшими 1000 ЕД/кг гиалуронидазы, имело место увеличение содержания КОЕ-ГМ (3, 5-е сут) в гемопоэтической ткани, не связанное с изменением темпа деления данных прекурсоров. Описанная феноменология могла являться следствием либо активации (под влиянием образующегося при данном воздействии in situ континуума ростовых факторов) созревания мультипотентных предшественников в КОЕ-ГМ, либо быть связанной со снижением интенсивности созревания последних (Дыгай A.M. и др., 2009). В любом случае полученные результаты свидетельствуют о значительном нарушении функционирования прогениторных элементов, проявляющемся в разобщении процессов их пролиферации и дифференцировки при выраженном разрушении ГК. При этом наиболее вероятной причиной развития указанных реакций является повреждение гиалуроновой кислоты гликокаликса клеток и их рецепторов к биологически активным веществам, в состав которых входит данный гликозаминогликан (ГАГ) (Ponta Н. et al., 2003; Zhu Н. et.al., 2006).

Помимо уникальной способности к самоподдержанию, высокого пролиферативного и дифференцировочного потенциала, стволовые клетки обладают еще одним уникальным свойством. При необходимости они могут покидать тканевую «нишу» и попадать в кровоток с последующим «оседанием» в зоне повреждения и развитием в программируемом «новым» специфическим микроокружением направлении, и тем самым, обеспечивать регенерацию тканей в ответ на физиологическую убыль клеток, либо их гибель, вызванную повреждающим фактором (Minguell J.J. et al., 2001; Tocci A. et al., 2003). В связи с этим дальнейшим этапом исследования явилось изучение мобилизующей прогениторные клетки активности гиалуронидазы.

В ходе эксперимента ни при одном из используемых вариантов введения ГД не происходило существенных сдвигов со-стороны циркулирующего пула коммитированных и мультипотентных мезенхимальных предшественников.

В то же время данный фермент в дозе 1000 ЕД/кг оказывал значительный потенцирующий эффект в отношении мобилизации СК, индуцируемой Г-КСФ. При этом максимальные изменения регистрировались со стороны мультипотентных мезенхимальных СК, обладающих наибольшим ростовым и регенеративным потенциалом (Сухих Г.Т. и др., 2002; Augeilo A. et al„ 2011; Зюзьков Г.Н. и др., 2001). Их содержание на 3-й сут составляло 1000,0% от фона, что в 3,2 раза выше, чем при введении одного Г-КСФ, являющегося на сегодняшний день основным и самым эффективным препаратом, используемым для мобилизации СК (Дыгай A.M. и др., 2010). Вместе с тем следует отметить, что в случае комбинации препаратов темп снижения содержания стромальных и кроветворных клеток-предшественников в периферической крови сохранялся на уровне контрольных значений. Так, уменьшение количества КОЕ-Ф, содержащих в своем составе помимо коммитированных мезенхимальных прекурсоров истинные/мультипотентные СК (Гольдберг Е.Д. и др., 2006), с 3-х по 8-е сут составляло 75,6% и 74,3% в группе мышей, получавших только Г-КСФ, и цитокин с 1000 ЕД/кг гиалуронидазы совместно соответственно (рис. 1).

Данные результаты косвенно свидетельствуют о сохранении у родоначальных элементов, подвергшихся воздействию низкой дозы фермента, функциональной способности к энграфтингу в тканях, что, безусловно, представляется важным в плане возможного использования фракции мононуклеаров периферической крови (обогащенной СК), полученной после совместного применения препаратов, для их трансплантации (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2009).

Вместе с тем увеличение дозы гиалуронидазы до 5000 ЕД/кг, в зависимости от типа исследуемых клеток-предшественников, либо отменяло развитие феномена рекрутирования СК в периферическую кровь (МСК), индуцируемого Г-КСФ, либо резко снижало его выраженность (КОЕ-ГМ).

Весьма важным, в плане рассмотрения фармакологических веществ в качестве средств для регенеративной медицины, является их потенциальная способность вызывать истощение популяции регенераторно-компетентных клеток, в том числе в тканях-депо (Гольдберг Е.Д. и др., 2005; Дыгай A.M. и др., 2009). В связи с этим особый интерес представляет исследование состояния пула прогениторных элементов костного мозга при сочетанном использовании Г-КСФ и ГД. Введение 1000 ЕД/кг фермента на фоне стимуляции процесса мобилизации СК с помощью Г-КСФ не только не сопровождалось падением содержания родоначальных клеток в гемопоэтической ткани, но и, напротив, приводило к их значительному накоплению. Так, количество КОЕ-Ф и МСК достигало на 3-й сут опыта 236,6% и 182,1% от фона соответственно. Более того, отмечалось увеличение содержания в костном мозге как КОЕ-Э (3-8-е сут), являющееся закономерным результатом выявленного ранее действия ГД

(Гольдберг Е.Д. и др., 2007), так и рост числа КОЕ-ГМ (3, 5-е сут) по сравнению с таковым при введении только Г-КСФ, считающегося наиболее сильным активатором предшественников грануломоноцитопоэза (Дыгай A.M. и др., 2010). Причем механизмом повышения функциональной активности данных элементов, по видимому, являлась не простая суммация эффектов двух препаратов (так как самостоятельная активность ГД в отношении гранулоцитарных прекурсоров чрезвычайно мала по сравнению с таковой у Г-КСФ (Гольдберг Е.Д. и др., 2008), а потенцирование специфической активности цитокина за счет модификации свойств рецепторов клеток-мишеней к нему под влиянием ГД (Дыгай A.M. и др., 2011, 2012).

Вместе с тем не столь однозначные, а, во многом, и противоположные результаты были получены при использовании дополнительно к Г-КСФ 5000 ЕД/кг гиалуронидазы. Увеличение дозы фермента сопровождалось существенно более выраженным возрастанием количества КОЕ-Ф в костном мозге на 3-й сут опыта (до 1100,0% от контроля, в отличие от 236,6% при введении 1000 ЕД/кг ГД), сменяющимся падением их числа на 5-е сут (относительно мышей, получавших только Г-КСФ) на фоне отсутствия изменений содержания мультипотентных мезенхимапьных предшественников. Учитывая данные обстоятельства можно предположить, что регистрируемое столь выраженное увеличение числа КОЕ-Ф в костном мозге (которое, очевидно, не могло явиться следствием только отмены их мобилизации) было связано с повышением образования данных элементов в результате стимуляции под влиянием Г-КСФ дифференцировки МСК в более зрелые элементы стромы, формирующие в дальнейшем микроокружение (Гольдберг Е.Д. и др., 2005). Тем не менее, нельзя исключить также вероятность повышения чувствительности КОЕ-Ф к ростовым факторам (в данном случае, очевидно, к вводимому извне Г-КСФ) в начальные сроки после воздействия высокой дозы фермента.

Иная динамика наблюдалась со стороны кроветворных предшественников. При этом если в случае изучения КОЕ-Э не регистрировалось значимых изменений данного показателя (в отличие от группы мышей, которым вводили Г-КСФ), то при исследовании содержания КОЕ-ГМ отмечалось падение их числа, достигающее на 8-е сут опыта 9,5% от контроля (введение Г-КСФ). Выявленное отсутствие четких закономерностей со стороны пула мезенхимальных и кроветворных родоначальных клеток подтверждают сделанное ранее предположение о нарушении функционирования прогениторных элементов при выраженной деградации гиапуроновой кислоты (Гольдберг Е.Д. и др., 2007).

Развитие процесса мобилизации СК из тканей-депо происходит под влиянием, в первую очередь, изменений со стороны клеточных элементов микроокружения, не принимающих непосредственного участия в выполнении основной функции ткани. Клетки микроокружения определяют состояние пула СК не только за счет выработки широкого спектра гуморальных факторов, но и в результате прямого межклеточного взаимодействия (Гольдберг Е.Д. и др.,

2006; Дыгай A.M. и др., 2011). Межмембранное связывание при этом служит для передачи необходимых питательных веществ, миграции и хоминга («оседания» и «приживления») клеток-предшественников в специфических участках ткани, в которых (под влиянием нового микроокружения) происходит их дальнейшее развитие. При этом кооперация со стромальными элементами обеспечивает представление ростовых факторов (специфические факторы роста, гормоны и гормоноподобные вещества) клеткам-предшественникам в биологически доступной форме (Гольдберг Е.Д. и др., 2006; Crocker P.R. et al., 1985; Gordon M.Y., 1988; Blazsek I. et al., 1995).

Рис. 1. Содержание КОЕ-Ф (А) и MCK (Б) в костном мозге, КОЕ-Ф (В) и МСК (Г) в периферической крови мышей линии CBA/CaLac при введении гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг (белые столбики) и 5000 ЕД/кг (серые столбики). По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат — значения показателя: А - на 2,5 х 105 миелокариоцитов; Б - на 106 миелокариоцитов; В - на 2,5 х 105 мононуклеаров; Г - на 10s мононуклеаров. Область межпунктирного пространства — область доверительного интервала значения показателя у интактных мышей при р<0,05.

Для изучения механизмов мобилизации прогениторных клеток под влиянием гиалуронидазы была исследована способность мезенхимальных прекурсоров, полученных от мышей, которым вводили Г-КСФ и данный фермент, связываться с моделируемыми в условиях in vitro стромой и экстрацеллюлярным матриксом (Гольдберг Е.Д. и др., 2008).

В ходе эксперимента введение ГД приводило к увеличению сродства КОЕ-Ф как к межклеточному веществу (на 82,6%), так и к строме (на 91,3%). Применение цитокина также сопровождалось стимуляцией кооперации КОЕ-Ф с экстрацеллюлярным матриксом, однако при этом имело место значительное снижение способности родоначальных клеток связываться со стромой в целом. Вместе с тем при обработке используемых субстратов in vitro гиалуронидазой во всех случаях наблюдалось падение уровня взаимодействия клеток-предшественников с клеточными и внеклеточными компонентами микроокружения гемопоэтической ткани.

В то же время при совместном введении Г-КСФ и гиалуронидазы отмечалось повышение зависимости адгезии КОЕ-Ф к межклеточному матриксу от состояния гиалуроновой кислоты в нем. Так, обработка субстрата ферментом приводила к более выраженному нарушению взаимодействия КОЕ-Ф с межклеточным матриксом (до 57,3%, что в 1,5 раза больше, чем при введении мышам только гиалуронидазы). В то же время гиалуронидаза, вводимая in vivo вместе с Г-КСФ, снижала действие последнего, направленное на нарушение кооперации мезенхимальных прекурсоров со стромой. Имело место увеличение числа КОЕ-Ф, связавшихся с облученной культурой интактных миелокариоцитов (до 173,9%), по сравнению с аналогичным параметром при наслоении клеток костного мозга, взятых у мышей, которым вводили лишь Г-КСФ.

На основании полученных результатов было сделано заключение, что реализация феномена потенцирования мобилизации прогениторных клеток, индуцированной Г-КСФ, с помощью гиалуронидазы, определяется исключительно влиянием фермента на элементы микроокружения гемопоэтической ткани. При этом возрастание адгезивной способности самих предшественников, подвергшихся воздействию ГД, указывает на возможность облегчения хоминга циркулирующих СК в тканях (Гольдберг Е.Д. и др., 2008). Данное обстоятельство представляется важным в плане возможного практического использования мобилизованных Г-КСФ и ГД прогениторных клеток для их трансплантации с целью терапии различных заболеваний.

В настоящее время наиболее широкое применение клеточная терапия (КТ) нашла в онкологической практике для лечения гематологических осложнений (Husebekk A. et al., 1998). При этом зачастую используют аутогенные или аллогенные мононуклеары периферической крови, получаемые после стимуляции выхода СК в циркуляцию препаратами Г-КСФ (Husebekk А. et al., 1998). В связи с этим, а также для изучения сохранности функциональной способности родоначальных элементов к реализации своего ростового потенциала после воздействия на них ГД на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной 5-фторурацилом, были проведены эксперименты по сравнительному исследованию терапевтической активности клеточного материала, представленного мононуклеарами периферической крови, после использования Г-КСФ и цитокина совместно с ГД.

Внутривенная клеточная терапия (КТ) приводила к значительному ускорению регенерации кроветворной ткани. В обеих опытных группах практически во все сроки наблюдения регистрировалось значительное увеличение числа ретикулоцитов, эритроцитов, а также общего количества лейкоцитов, палочко- и сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и тромбоцитов в периферической крови. Однако существенно более выраженные изменения были в группе мышей, которым вводили клеточный материал, полученный после совместного использования препаратов. Значительные сдвиги отмечались также при изучении костномозгового кроветворения. Трансплантация клеточного материала сопровождалась возрастанием количества незрелых (ННГ) и зрелых (ЗНГ) нейтрофильных гранулоцитов, и эритрокариоцитов в гемопоэтической ткани. При этом число данных клеточных элементов было достоверно выше в случае введения нуклеаров от мышей, получавших оба фармакологических агента. Максимальная разница между показателями у животных опытных групп составляла 44,2%, 41,8% и 45,3% в отношении количества ННГ (7-е сут), ЗНГ (12-е сут) и эритрокариоцитов (5-е сут) соответственно.

Изучение механизмов ускорения регенерации кроветворной ткани при КТ выявило определяющую роль в этом процессе увеличения содержания эритроидных и грануломоноцитарных клеток-предшественников в костном мозге, а также повышения их пролиферативной активности и скорости созревания. Причем во всех случаях более значимые изменения имели место у мышей после введения трансплантанта, полученного с использованием ГД. В частности, количество КОЕ-Э и КОЕ-ГМ на 7-е сут в этой группе было выше на 90,9% и 61,5% соответственно, чем после введения клеточных элементов от животных, получавших только Г-КСФ (рис. 2). Кроме того, КТ приводила к увеличению числа КОЕ-Ф в костном мозге, также более выраженному после введения трансплантационного материала от мышей, которым назначали оба препарата. Выявленные изменения со стороны пула КОЕ-Ф свидетельствуют об ускорении восстановления стромального компартмента ГИМ (Дыгай A.M. и др., 2009), что представляется особенно важным при миелосупрессии, вызванной введением антиметаболита, спецификой действия которого является повреждение элементов ГИМ (Гольдберг Е.Д. и др., 1999).

Согласно современным представлениям, ГИМ, представляющее собой локальную систему регуляции гемопоэза (Дыгай A.M. и др., 1992; Натан Д.Г. и др., 1994; Гольдберг Е.Д. и др., 1999), во многом определяет состояние пула кроветворных клеток, в том числе и трансплантированных гемопоэтических предшественников (Дыгай A.M. и др., 2009). При этом важная роль принадлежит продуцируемым клетками ГИМ гуморальным гемопоэтическим факторам - цитокинам (Гольдберг Е.Д. и др., 1999; Gordon M.Y., 1988).

Последние участвуют в управлении процессами пролиферации и дифференцировки родоначальных элементов и являются наиболее мощными, среди гормоноподобных веществ, регуляторами гемопоэза (Натан Д.Г. и др., 1994; Lau A.S. et al., 1996; Гольдберг Е.Д. и др., 2000), суммарный эффект

которых регистрируется в качестве эритропоэтической и колониестимулирующей активностей (Гольдберг Е.Д. и др., 1992). Исследование роли гуморальных факторов в регенерации кроветворной ткани при проведении КТ позволило выявить ряд феноменов. В частности, отмечалось значительное повышение продукции ЭПА и КСА адгезирующими нуклеарами костного мозга, достигающее максимальных значений после применения материала от мышей, которым для мобилизации СК вводили Г-КСФ и гиалуронидазу. В то же время имело место снижение выработки гемопоэтически активных субстанций неприлипающими миелокариоцитами (представленными преимущественно лимфоидными элементами (Гольдберг Е.Д. и др., 1992), вероятно, связанное с лимфотропным иммуносупрессирующим (Chen Y. et al., 2006; Haniffa M.A. et al., 2007) влиянием КТ из-за значительного содержания мезенхимальных предшественников в трансплантатах (Гольдберг Е.Д. и др., 2007).

Рис. 2. Содержание КОЕ-Ф (А) и МСК (Б) в костном мозге, КОЕ-Ф (В) и МСК (Г) в периферической крови мышей линии СВА/СаЬас при введении гранулоцитарного колониестимулнрующего фактора (Г-КСФ) (белые столбики), совместного назначения Г-КСФ и гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг (серые столбики) и 5000 ЕД/кг (заштрихованные столбики). По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: А - на 2,5 х 10 миелокариоцитов; В - на 2,5 х 105 мононуклеаров; Б - на 106 миелокариоцитов , Г - на 106 мононуклеаров. Область межпунктирного пространства - область доверительного интервала значения показателя у интактных мышей при р<0,05.

Кроме того, проведение клеточной терапии сопровождалось возрастанием концентрации ЭПА и КСА в сыворотке крови, вызванным, по-видимому, непосредственным увеличением в организме количества элементов, способных продуцировать гуморальные факторы роста. В то же время повышение уровня ЭПА в отдаленном периоде после введения мононуклеаров от животных, получавших Г-КСФ и гиалуронидазу, могло явиться следствием восстановления функционального состояния структур (почек и печени), ответственных за образование ЭП (Дыгай A.M. и др., 2011). Известно, что 5-фторурацил оказывает повреждающее действие на зрелые клетки организма и приводит к нарушению продукции биологически полноценного ЭП на фоне усиления выработки его неактивных форм (Rich I.N., 1991).

Таким образом, ускорение регенерации кроветворной ткани при миелосупрессии на фоне введения мононуклеаров периферической крови, максимально обогащенных СК (вследствие использования дополнительно к Г-КСФ гиалуронидазы) (Гольдберг Е.Д. и др., 2007), осуществлялось как за счет прямого увеличения количества кроветворных предшественников в костном мозге, связанного с их тарнсплантацией, так и в результате восстановления структурно-функционального состояния ГИМ и возрастания содержания гемопоэтинов в сыворотке крови.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о важной роли гиалуроновой кислоты в регуляции функций прогениторных клеток различных классов. При этом модификация свойств данного гликозаминогликана с помощью гиалуронидазы позволяет эффективно управлять их регенераторным потенциалом и, тем самым, значительно влиять на течение репаративных процессов в тканях (Зюзьков Г.Н. и др., 2007).

Вместе с тем достаточно высокая токсичность гиалуронидазы (Дыгай A.M. и др., 2011), связанная с ее белковой природой, а также значительное содержание в сыворотке крови и тканях специфических и неспецифических ингибиторов фермента (Максименко А.В. и др., 2000; Максименко А.В. и др., 2001; Afify A.M. et al., 1993; Camaioni A. et al., 1993; Chen L. et al„ 1996), предопределяющих его быструю инактивацию в организме, делает практически невозможным получение выраженных системных эффектов, в том числе и в отношении СК, при введении безопасных доз ГД. В связи с этим представляется маловероятным использование препаратов нативной ГД в качестве средств для регенеративной медицины, когда предполагается длительное многократно повторяющимися курсами введение фармакологического агента (Дыгай A.M. и др., 2009; Зюзьков Г.Н. и др. 2011).

В то же время в связи с развитием нанотехнологий и их внедрением в фармакологию появилась уникальная возможность создания принципиально новых лекарственных средств. При этом одним из наиболее перспективных нанотехнологичных подходов конструирования препаратов на сегодняшний день является электронно-лучевой синтез пегилированных аналогов регуляторов физиологических функций. Показано, что получаемые при этом вещества обладают повышенной стабильностью, растворимостью, более длительным периодом полувыведения, а также являются практически

нетоксичными и неиммуногенными соединениями (Дыгай A.M. и др. 2011; Vereschagin E.I. et al., 2001).

С целью повышения эффективности и безопасности управления регенераторным потенциалом прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы, на ее основе путем электронно-лучевого воздействия была создана пегилированная (иммобилизированная) форма данного фермента (Пэг-ГД) (Дыгай A.M. и др. 2009). Однако, как известно, процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться существенными изменениями стереохимической структуры исходных веществ и зачастую приводить к непредсказуемой модификации их свойств (Дурнев А.Д., 2008; Caliceti P. et al., 2003; Medina С. et al., 2007; Ryan S.M. et al., 2008). В то же время показано, что полученные с использованием ионизирующей радиации субстанции оказываются в значительной степени защищенными от воздействия протеолитических ферментов, что делает возможным их эффективное применение per OS (Дыгай A.M. и др., 2009, 2011, 2012).

В связи с вышеизложенным было проведено исследование специфической активности Пэг-ГД в отношении прогениторных клеток различных классов при ее парентеральном и пероральном использовании. В ходе эксперимента было установлено, что введение пегилированной гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг приводило к значительному увеличению числа мезенхимальных и кроветворных предшественников различных классов в гемопоэтической ткани. При этом влияние конъюгированной с полиэтиленгликолем формы фермента как при внутрибрюшинном, так и при пероральном приеме существенно превосходила таковое у препарата нативной гиалуронидазы. Имело место более выраженное и продолжительное возрастание количества КОЕ-Э, КОЕ-ГМ, КОЕ-Ф и МСК в костном мозге (рис. 3). Причем достоверного различия между группами мышей, получавших конъюгированный фермент парентерально и внутрижелудочно, не регистрировалось. В то же время данное средство, также как и препарат нативной гиалуронидазы, не вызывало изменений со стороны пула циркулирующих в периферической крови регенераторно-компетентных клеток.

Следующим этапом работ явилось определение максимально эффективной дозы Пэг-ГД при ее пероральном введении, представляющем собой наиболее комплаентный в регенеративной медицине способ применения лекарственных средств (Дыгай A.M. и др., 2011). Учитывая тот факт, что увеличение дозы нативной гиалуронидазы выше 1000 ЕД/кг сопровождается нарушением функционирования СК (Гольдберг Е.Д. и др., 2007), а процесс пегилирования фермента в ряде случаев приводит к повышению специфической активности исходных веществ (Дыгай A.M. и др., 2011), было принято решение использовать в эксперименте дозы Пэг-ГД от 1000 ЕД/кг и менее (1000, 500, 250 и 50 ЕД/кг). При этом важным представлялось исследование не только возможности увеличения «резерва» СК в организме (Гольдберг Е.Д. и др., 2007), но и способности средства стимулировать их рекруитирование в кровь, что определило проведение исследований на модели мобилизации СК Г-КСФ (Дыгай A.M. и др., 2010). Для регистрации эффектов

' Пэг-ГД были выбраны клетки-предшественники типа КОЕ-Ф, содержащие в своем составе и мультипотентные элементы (Зюзьков Г.Н. и др., 2005; Дыгай A.M. и др. 2011), представляющие наибольший интерес для регенеративной медицины. Курсовое введение Г-КСФ приводило к возрастанию числа КОЕ-Ф в периферической крови (на 3, 5-е сут исследования до 475,0% и 167,2% от контрольных значений соответственно) на фоне увеличения количества данных предшественников в гемопоэтической ткани (на 3-й сут до 181,4% от контроля). При этом дополнительное введение Пэг-ГД в большинстве случаев оказывало значительное влияние на динамику изменений исследуемых показателей.

Рис. 3. Изменение уровней эритропоэтической (А) и колониестимулирующей (Б) активностей кондиционных сред прилипающих (индекс 1), неприлипающих миелокариоцитов (индекс 2), сыворотки крови (индекс 3) мышей линии СВА/СаЬас при проведении клеточной терапии миелосупрессии, вызванной однократным введением 5-ФУ в У2 МПД, мононуклеарами, полученными от мышей, которым вводили физиологический раствор (белые столбики), Г-КСФ (серые столбики) и Г-КСФ совместно с гиалуронидазой (заштрихованные столбики). По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: на 10 миелокариоцитов. Область межпунктирного пространства - область доверительного интервала значения показателя у интактных мышей при р<0,05.

Так, использование дозы 1000 ЕД/кг сопровождалось снижением числа КОЕ-Ф в костном мозге на 5-е сут опыта.

В то же время применение остальных доз приводило к противоположным изменениям. Отмечалось в разной мере выраженное повышение числа мезенхимальных предшественников как в гемопоэтической ткани, так и в периферической крови. Наименее существенные сдвиги регистрировались при введении 500 ЕД/кг Пэг-ГД, а наиболее значимое возрастание содержания КОЕ-Ф в исследуемом материале отмечалось при применении 50 ЕД/кг вещества. Количество КОЕ-Ф у данных животных составляло 174,2%, 202,8%, 128,7% и 138,7%, 1213,4%, 187,1% на 3, 5, 8-е сут в кроветворной ткани и периферической крови соответственно от аналогичных показателей у мышей, получавших только Г-КСФ. При этом выраженность изменений в сравнении с использованием 1000 ЕД/кг нативной гиалуронидазы на 5-е сут опыта достигала 270,5% и 910,8% в отношении костномозговых и циркулирующих КОЕ-Ф соответственно.

Полученные результаты позволили определить в качестве максимально эффективной для управления функциями родоначальных клеток в дальнейших экспериментах на мышах дозу Пэг-ГД в 50 ЕД/кг.

Специфика функционирования кроветворной ткани, заключающаяся в непрерывном быстром обновлении клеточных элементов в единицу времени, обеспечивающимся прогениторными клетками (Гольдберг Е.Д. и др., 1992; Гейл Р.П. и др., 1994; Владимирская Е.Б. и др., 1997), на фоне общности механизмов регенерации разных тканей (Бабаева А.Г., 2009), делает систему крови удобной моделью для изучения репаративных процессов.

В связи с этим было проведено исследование гемостимулирующих свойств пегилированной гиалуронидазы в условиях моделирования цитостатической миелосупрессии.

В ходе эксперимента применение циклофосфана в МПД приводило к закономерному угнетению кроветворения (Гольдберг Е.Д. и др., 1999), проявляющемуся в уменьшении содержания морфологически распознаваемых клеточных элементов гранулоцитарного, лимфоцитарного и эритроидного ростков гемопоэтической ткани и снижением количества палочко- и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, эритроцитов и концентрации гемоглобина в периферической крови. При этом имело место компенсаторное (Гольдберг Е.Д. и др., 1999) возрастание содержания КОЕ-ГМ и КОЕ-Э в костном мозге на фоне повышения секреторной активности как адгезирующих, так и неадгезирующих элементов ГИМ.

Двукратное пероральное введение Пэг-ГД в дозе 50 ЕД/кг на фоне моделирования миелосупрессии сопровождалось увеличением количества циркулирующих эритроцитов (5, 10-е сут), тромбоцитов (3, 5-е сут), палочко-(5-е сут) и сегментоядерных (7-е сут) нейтрофилов. При этом изменения количества клеток красной крови приводили к возрастанию уровня гемоглобина и гематокрита (достигающему на 5-е сут опыта 110,2% и 115,3% от контроля), а степень подъема содержания указанных нейтрофильных

гранулоцитов составляла 256,3% и 144,6% от аналогичных значений в цитостатическом контроле соответственно.

Описанная картина периферической крови явилась закономерным отражением динамики показателей костномозгового гемопоэза. Пэг-ГД увеличивал количество эритрокариоцитов в кроветворной ткани по сравнению с аналогичными параметрами у животных, получавших дистиллированную воду на 5-е и 10-е сутки эксперимента в 1,9 и 3,7 раз соответственно. При этом с 3-х по 5-е сут опыта имело место также достоверное возрастание числа ННГ под влиянием исследуемого препарата (с максимумом до 325,0% от контроля), а на 7-е сут - зрелых нейтрофильных элементов (до 123,7% от контроля).

Изучение механизмов гемостимулирующих эффектов

иммобилизированного фермента выявило их зависимость от колониеобразующей способности костного мозга. В частности, двукратное введение исследуемой формы ГД приводило к увеличению числа КОЕ-Э (5-е сут) и КОЕ-ГМ (3, 5 и 10-е сут). При этом отмечалось повышение пролиферативной активности КОЕ-Э на 3-й сут (до 171,8%), КОЕ-ГМ на 3-й и 7-е сут (до 117,8% и 127,9% соответственно) и интенсивности их созревания на 5, 7-е сут и 7, 10-е сут соответственно.

Исследование роли ГИМ в формировании гематологических сдвигов выявило, что состояние пула кроветворных клеток во многом определялось функциональной активностью клеточных элементов костного мозга. Имело место значительное увеличение выработки ЭПА на 3-й сут (до 153,0%) и КСА на 3, 7-е сут (до 217,8% и 359,3% соответственно) прилипающими миелокариоцитами, а также возрастание секреции ЭПА неприлипающими нуклеарами гемопоэтической ткани (3, 5, 7-е сут) по сравнению с группой цитостатического контроля. Кроме того, деградация гиалуроновой кислоты в организме приводила к увеличению содержания эритропоэтически активных субстанций в сыворотке крови.

В то же время известно, что ГК представляет собой не только один из основных компонентов межклеточного матрикса гемопоэтической ткани, в котором она составляет до 40% от всех гликозаминогликанов, и является важной составляющей ГИМ (Гольдберг Е.Д. и др., 1999), но и входит в состав гликокаликса клеток и их рецепторов к биологически активным веществам (Дыгай A.M. и др., 2011, 2012; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003). При этом модификация свойств ГК мембранных структур может сопровождаться изменением аффинности воспринимающего аппарата клеток (Зюзьков Г.Н., 2011 ; Дыгай A.M. и др., 2011).

Для изучения прямого действия Пэг-ГД на кроветворные предшественники было исследовано влияние их преинкубации в растворе фермента в условиях in vitro на чувствительность к регуляторным стимулам. Предварительная обработка миелокариоцитов Пэг-ГД сопровождалась значительным усилением выхода КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в метилцеллюлозной среде, не содержащей дополнительных ростовых факторов. В данном случае колониестимулирующая активность питательной среды, очевидно,

определялась совокупностью биологически активных веществ эмбриональной телячьей сыворотки (Дыгай A.M. и др., 2011). Кроме того, клеточные элементы, полученные после воздействия на них фермента, обладали существенно более выраженной восприимчивостью к ответу (чем интактные нуклеары) на специфические факторы роста. Так, способность КОЕ-Э и КОЕ-ГМ костного мозга реагировать на эритропоэтин и Г-КСФ увеличивалась на 48,1% и 86,9% соответственно.

Таким образом, пегилированная гиалуронидаза обладала выраженными гемопоэстимулирующими эффектами. При этом механизмом действия препарата являлось возрастание функциональной активности кроветворных предшественников, связанное с повышением их чувствительности к гемопоэтинам и репарацией ГИМ, вероятно, определяемой стимуляцией процессов пролиферации и дифференцировки мезенхимальных прогениторных клеток костного мозга (Гольдберг Е.Д. и др., 2007). Причем, выявленная согласованность изменений со стороны пула прогениторных элементов с формированием соответствующей картины костного мозга и периферической крови указывают на высокую сопряженность всех этапов развития клеточных типов под влиянием иммобилизированного фермента (от выхода прогениторной клетки из фазы G0 до образования зрелых элементов) (Дыгай A.M. и др., 2010).

В то же время, учитывая способность ГД повышать специфическую активность Г-КСФ в отношении гранулоцитарных предшественников на фоне потенцирования данным цитокином стимулирующего эритроидные прекурсоры влияния фермента, наиболее целесообразным представляется создание комплексного препарата для гематологической практики, содержащего Г-КСФ и Пэг-ГД.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что соотношение различных молекулярных форм ГК в тканях, определяемое уровнем гиалуронидазной активности in situ, играет важную роль в регуляции функций родоначальных клеток (Дыгай A.M. и др., 2011; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003). При этом данные исследований указывают не только на принципиальную возможность управления регенераторным потенциалом стволовых клеток путем введения гиалуронидазы in vivo (Дыгай A.M. и др., 2009) (рис. 4), но и на высокую перспективу разработки на ее основе с использованием нанотехнологии электронно-лучевого синтеза средства для регенеративной медицины.

Рис. 4. Схема механизмов действия гиалуронидазы на прогениторные клетки (на примере системы крови).

МКМ - межклеточный матрикс; ГК - гиалуроновая кислота; МСК -мезенхимальная стволовая клетка; ПСКК - полипотентная стволовая клетка крови; КОЕ-ГМ, КОЕ-Э - коммитированные кроветворные клетки-предшественники (грануломоноцито- и эритропоэза соответственно). Широкими стрелками указаны мишени воздействия.

Гуморальные гемоггоэтчгские факторы

Костный мозг

Стромзяьные элементе

Строглая&ные элементы

МКМ

МСК

Периферия« екая кровь

ВЫВОДЫ

1. Введение нативной гиалуронидазы в относительно низкой дозе (1000 ЕД/кг) приводит к повышению функциональной активности мезенхимальных и кроветворных предшественников костного мозга и их накоплению в гемопоэтической ткани. Увеличение дозы фермента (5000 ЕД/кг) сопровождается разобщением процессов пролиферации и дифференцировки прогениторных клеток.

2. Средства на основе гиалуронидазы не обладают самостоятельной мобилизующей стволовые клетки активностью. Однако их введение (в относительно низких дозах) на фоне стимуляции выхода предшественников в кровь с помощью Г-КСФ значительно увеличивает пул циркулирующих регенераторно-компетентных клеток.

3. Потенцирование мобилизующей прогениторные клетки активности Г-КСФ под действием гиалуронидазы связано с воздействием фермента на элементы микроокружения костного мозга. При этом наблюдается возрастание адгезивных свойств клеток-предшественников.

4. Эффективность терапии цитостатической миелосупрессии, проводимой путем внутривенного введения сингенных мононуклеаров периферической крови, существенно выше при трансплантации клеточного материала, полученного от доноров после применения Г-КСФ совместно с гиалуронидазой, чем при использовании такового после введения только Г-КСФ. При этом ускорение регенерации кроветворной ткани происходит на фоне увеличения количества кроветворных и мезенхимальных клеток-предшественников в костном мозге, повышения продукции ЭПА и КСА прилипающими элементами ГИМ и возрастания содержания гемопоэтинов в сыворотке крови.

5. Пегилирование гиалуронидазы с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза приводит к повышению специфической активности фермента в отношении прогениторных клеток, сопровождаемому значительным снижением его максимально эффективной дозы, и к появлению возможности перорального использования фермента.

6. Пегилированная гиалуронидаза обладает выраженными гемопоэстимулирующими эффектами. Механизмом действия Пэг-ГД является возрастание функциональной активности кроветворных предшественников на фоне повышения их восприимчивости к регуляторным стимулам при увеличении секреции гемопоэтических факторов клеточными элементами ГИМ и повышении содержания стромальных прекурсоров в костном мозге.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мобилизация стволовых клеток, пегилированным с помощью нанотехнологии гранулоцитарным колониестимулирующим фактором как модель изучения процессов миграции прогениторных элементов // Биомедицина - 2010. - №1. - С. 17-23 (соавторы A.M. Дыгай, Г.Н. Зюзьков,

В.В. Жданов и др.)

2. Перспективы использования нанотехнологии в регенеративной медицине // Сборник материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 12-16 апреля 2010. - С. 623 (соавторы Г.Н.

Зюзьков, Е.В. У дут)

3. Гемостимулирующие эффекты иммобилизированной гйалуронидазы и механизмы их развития при цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2010. - Т. 149, № 5 - С. 528-531 (соавторы A.M. Дыгай, A.B. Артамонов, A.A. Бекарев и др.)

4. Механизмы гемостимулирующих эффектов иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы // Сибирский онкологический журнал (материалы V Региональной конференции молодых ученых им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 2010) - 2010. - прил. №1. — С. 108-109 (соавторы Г.Н. Зюзьков)

5. Теоретические основы дифференцированного применения гемостимуляторов при анемиях // Вестник Уральской медицинской академической науки (материалы Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы», Екатеринбург, 2010). - 2010. - №4, Выпуск 32. - С. 101-104. (соавторы Е.В. Удут, Л.А. Мирошниченко, Зюзьков Г.Н. и др.)

6. Фундаментальные аспекты перспектив использования препаратов гиалуронидазы в регенеративной медицине и гематологии // Сибирский онкологический журнал (материалы VI Региональной конференции молодых ученых им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», Томск, 2011) - 2011. - прил. №1. - С. 119 (соавторы Г.Н. Зюзьков)

7. Гепатопротекторные эффекты иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы и механизмы их развития // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2011. - Т. 151., №1. - С. 86-90 (соавторы A.M. Дыгай, Г.Н. Зюзьков, В.В. Жданов и др.)

8. Влияние иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы на чувствительность прогениторных клеток к регуляторным факторам // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - №1. - С. 47-51 (соавторы A.M. Дыгай, Г.Н. Зюзьков, В.В. Жданов и др.)

9. Модуляция иммобилизированной гиалуронидазой гемостимулирующего действия иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора//Бюл. эксперим. биол. и медицины. -2011. - Т. 151, №3, - С. 298-303 (соавторы A.M. Дыгай, В.В. Жданов, Г.Н. Зюзьков и

ДР-)

10. Гипогликемические свойства иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронат-эндо-P-N-ацетилгексозаминидазы // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2012. - Т. 153, № 1, - С. 106-110 (соавторы A.M. Дыгай, Г.Н. Зюзьков, В.В. Жданов и др.)

11. Гепатопротекторные эффекты иммобилизированных препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы и механизмы их развития // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2012. -№1. - С. 14-18 (соавторы A.M. Дыгай, В.В. Жданов, Г.Н. Зюзьков и др.)

Подписано к печати 17.03.2011. Тираж 100 экз. Кол-во стр. 25. Заказ №23-12 Бумага офсетная. Формат А-5. Печать RISO Отпечатано в типографии ООО «РауШ мбх» Лицензия Серия ПД №12-0092 от 03.05.2001г. 634034, г. Томск, ул. Усова 7, ком. 046 тел. (3822) 56-44-54