Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка новых методов ИФА для диагностики пневмококковой инфекции

г А На правах рукописи

' '' лЛ

ОС" V

<л

v л,

N

ПУГАЧЕВА НИНА ЛЕОНИДОВНА

РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ ИФА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

14.00.3 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация

Защита состоится 17 апреля 1997 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.38.01. при НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской Академии медицинских наук по адресу: 103064, г.Москва, Малый Казенный пер.,5а.

Автореферат разослан 17 марта 1997г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН.

- доктор медицинских наук Л.Н.Падюков

- доктор медицинских наук, профессор Л.И.Краснопрошина

- доктор медицинских наук, профессор Б.В.Пинегин

- НИИ физико-химической медицины

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В последние десятилетия значение пневмококка, как этиологического фактора ряда распространенных заболеваний недооценивается российским здравоохранением.

Благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей установлено, что несмотря на большое значение некоторых других бактерий, именно пневмококк является ведущим возбудителем бактериальных инфекционных заболеваний ортанов дыхания. По данным различных исследователей от 40 до 90% острых пневмоний. 40-60% отитов и до 30% ментнгитов вызывается пневмококом (Вишнякова Л.А., 1984, Катосова Л.К., 1990, Уланова М.А., 1992). Следует отметить, что эти заболевания часто приводят к тяжелым осложнениям и даже гибели больных. Острой проблемой становится развитие пневмококковой инфекции у больных с иммунодефицитными состояниями. Чаще всего именно пневмония приводит к гибели больных после иммуносупрессии, связанной с трансплантацией органов. Антибиотикоустойчивость, прежде всего устойчивость к пенициллину, некоторых штаммов пневмококка создает дополнительную опасность при распространении пневмококковой инфекции (Уланова М.А., 1992). Последние эпидемиологические исследования показали, что в ряде случаев % пенициллинрезистентных штаммов пневмококка достигает 60%.

В связи с этим, актуальной является разработка адекваатных методов специфической этиологической диагностики при бактериальных респираторных заболеваниях, направленных на своевременное и надежное выявление этиологии инфекции с целью проведения соответствующей терапии.

Вместе с тем, существуют определенные трудности при лабораторной диагностике пневмококковой инфекции. При бактериологическом анализе из-за особенностей идентификации пневмококка не всегда удается выявить его как этиологический -агент. Раннее применение антибиотиков существенно снижает эффективность бактериологического исследования. Поэтому особенно перспективно использовать методы иммунохи-

мической диагностики пневмококковой инфекции, позволяющие определять антитела к пневмококку, как результат развития инфекции. Для разработки препаратов для диагностики пневмококковой инфекции необходимо определить, какие из бактериальных антигенов играют ведущую роль в ходе патологического процесса. В многочисленных исследованиях, посвященных этому вопросу, ранее было показано, что капсульные полисахариды пневмококка играют основную роль в стимуляции иммунного ответа и создании иммунитета к пневмококку гомологичного серотипа. В настоящее время выявлено 90 серотипов пневмококка. Несмотря на то, что некоторые из этих серотипов дают перекрестные реакции, процесс выявления пневмококка по этому признаку является сложным и требует нескольких типов антисывороток. Выявление антител к капсульным полисахаридам затруднено по сходным причинам.

Вместе с тем, у пневмококка имеются белковые компоненты, участвующие в стимуляции выработки антител. Однако, в отличие от полисахаридных, белковые антигены пневмококка изучены недостаточно. Исследование этих антигенов позволило бы решить вопрос о возможности выявления антител к некапсульным формам пневмококка и идентификации пневмококка независимо от серотипа.

Острая пневмония, бронхит, отит являются полиэтиологическими заболеваниями, где наряду с пневмококком большую роль играют некапсульные формы Н.influenzae, B.catarrhalis (Колмогорова О.В., 1996). Однако, до сих пор не описано простого метода одновременного определения антител к этим возбудителям. Вместе с тем, применение принципа ИФА в сочетании с использованием нитроцеллюлозной мембраны в качестве носителя (иммуноблот, дот-блот) позволяет конструктировать простой и надежный препарат для серологической диагностики.

В связи с этим ЦЕЛЬЮ настоящего исследования явилось изучение состава и свойств некапсульных антигенов пневмококка и создание на их основе иммунофермент-ных систем, позволяющих осуществить иммунохимическую диагностику инфекции, вызываемой этим микроорганизмом.

Для выполнения поставленной цели нами были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Выделение и сравнительная иммунохимическая характеристика антигенных препаратов из различных штаммов S.pneumoniae.

2. Отработка условий проведения ИФА для определения антител к белковым антигенам пневмококка с использованием полистироловых планшетов.

3. Создание системы ИФА на основе дот-блота.

4. Сравнительный анализ активности реакции сывороток больных и здоровых людей с помощью разработанных систем.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведения исследований впервые дана сравнительная характеристика белковых антигенных препаратов, выделенных из различных штаммов пневмококка. Показано, что наиболее выражен антительный ответу больных к белкам с молекулярной массой 50, 80 и 94 kD. Впервые показано, что антитела к трем различным возбудителям бактериальной респираторной инфекции -S.pneumoniae, Н.influenzae и В.catarrhaüs, можно определить одновременно методом дот-блот.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Штаммы S.pneumoniae неоднородны по своему белковому антигенному составу. Наиболее выражена реакция у больных с пневмококковой инфекцией на белки с молекулярной массой 50, 80 и 94 kD,

2. Для более эффективного приготовления диагностической иммуноферментной системы для определения антител к S.pneumoniae необходимо проводить экстракцию антигенов с использованием ингибиторов протеаз, а в качестве индикатора применять ОФД.

3. ИФА на основе дот-блота может быть использован для скрининга антител к пневмококку вместо традиционного ИФА, как более простой и не менее чувствительный метод.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработана простая методика разрушения бактериальных клеток S.pneumoniae, позволяющая получить препараты для скрининга штаммов на наличие антигенов. Оптимизирована иммуноферментная система для определения антител к S.pneumoniae на основе его белковых антигенов. Система применяется в практическом здравоохранении РФ. Разработана новая диагностическая система на основе точечного иммуноферментного анализа (дот-блот) для одновременного определения антител к S.pneumoniae, H.influenzae и B.catarrhalis в сыворотке крови пациентов с респираторной инфекцией.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Отдельные фрагменты диссертационной работы были изложены на конференции " Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций" (Оболенск, 1990), XV международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Стокгольм, 1994), конференциях молодых ученых НИИ ВС им.И.И.Мечникова (Москва 1989, 1990). Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунохимической диагностики НИИ ВС им.И.И.Мечниковг РАМН (31.10.1996).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертаця состоит из введения, об зора литературы (1 глава), главы "Материалы и методы" и собственных исследованш (4 главы), заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 110 страниц ма шинописного текста, 10 таблиц и 14 рисунков. Список литературы содержит 150 найме нованин работ отечественных и зарубежных авторов.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы физико-химические, иммунохимические, серологические, статистические методы.

Для получения препаратов антигенов были использованы: эталонные штаммы S.pneumoniae, дифференцированные по K-антигенам из коллекции лаборатории микробиологии условно-патогенных бактерий НИИ ВС им. ИИ Мечникова, штамм 11/99 Н.influenzae (клинический изолят от больного пневмонией), штамм 36321 В. catarrhalis из коллекции ГИСК им.Тарасевича.

Для иммунохимических исследований применяли коммерческие антисыворотки кроличьи к шести известным серотипам S.pneumoniae (Difco, США), кроличьи антисыворотки к препарату диагностически значимых антигенов пневмококка штамма 11/56, полученные в ходе выполнения настоящего исследования, антисыворотки мышиные к препарату дезинтеграта гемофильной палочки, антисыворотки мышиные к препарату дезинтеграта B.catarrhalis, а также сыворотки взрослых с респираторными заболеваниями и заболеваниями не респираторного характера, сыворотки детей с респираторными заболеваниями, сыворотки доноров.

Препараты антигенов Н.influenzae и B.catarrhalis, были получены сходным образом с помощью ультразвукового разрушения (Колмогорова О.В., 1996). Препараты антигенов S.pneumoniae получали с помощью экстракции цетавлоном и методом замораживания-оттаивания.

В полученных препаратах определяли содержание белка по методу Лоури (1951) и методу Бредфорд (1960), нуклеиновых кислот по методу Спирина (1958), углеводов по методу Дюбуа (1984).

Иммунохимическую активность антигенных препаратов определяли с помощью методов двойной иммунодифф>чии по Оухтерлони, методом твердофазною иммуно-ферментною анализа и методом иммуноблотиш а.

При разработке иммуноферментных систем был использован твердофазный непрямой вариант ИФА с применением полистироловых планшетов и точечный вариант ИФА (дот-блот) с применением нитроцеллюлозной мембраны в качестве твердой фазы. В качестве коньюгата применяли антитела против иммуноглобулинов G человека, меченные перокелдазой. Субстратом для пероксидазы служила перекись водорода, а индикатором ферментативной реакции - ортофенилендиамин.

Результаты дот-блота были представлены в соответствии с условной шкалой, а результаты ИФА с применением полистироловых планшетов были представлены как в условных единицах, так и в виде величины оптической плотности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В ходе выполнения работы были выделены препараты белковых антигенов из нескольких штаммов пневмококка, и на их основе отработаны оптимальные условия проведения ИФА для определения антител к S.pneumoniac с использованием полистироловых планшетов а также разработана новая система ИФА на основе дот-блота для определения антител к S.pneumoniae, Н.influenzae и B.catarrhalis.

1. Выделение и сравнительная иммунохимическая характеристика антигенных препаратов из различных штаммов S.pneumoniae.

Для изучения антигенного состава нами было использовано более 80 штаммов S.pneumoniae. Одним из первых этапов а процедуре выделения АГ из микроорганизма является воздействие на его структуру с целью разрушения или частичной экстракции. Метод выделения белковых антигенов пневмококка: разработанный нами ранее был положен в основу раздела по выделению и анализу некапсульных антигенов пневмококка. Данный метод заключается в экстракции белков ( + ) заряженным детергентом - це-тавлоном. При действии этого агента происходит солюбилизация белковых структур: тогда как (-) заряженные капсульные полисахариды и нуклеиновые кислоты агрегируют и выпадают в осадок. Дальнейшее разделение экстракта методом гель-фильтрации позволяет освободи i ься ol примеси 1сйчоевы\ kiic.iui. и 'i.riii'Uio - 01 самого дегерюнта.

Рис.1 Графики элвдии при гель-фильтрации экстрактов различных штаммов шевмококка. По оси абцисс - порядковый номер фракций; по оси ординат - оптическая плотность при длине волны 280 нм. А - 11/56, В - 35 /57, с - 74/64

Препараты, полученные таким методом были получены как препараты сравнения трех штаммов пневмококка: 11/56, 35/57 и 74/64. В результате последующего разделения экстрактов методом гель-фильтрации нами было получено 9 препаратов, которые содержали высокомолекулярные и низкомолекулятрые фракции. Графики элюции после проведения гель-фильтрации представлены на рис.1.

Для оценки результатов экстракции нами сначала был использован анализ на наличие белков, углеводов и нуклеиновых кислот, который показал, что препараты из низкомолекулярных фракций пневмококка (III 11/56, II 35/57, III 74/64, IV 74/64) содержат наибольшее количество белка, небольшое количество углеводов и практически не содержит нуклеиновых кислот. Эти данные позволили нам рассматривать указанные образцы как белковые препараты пневмококка. Эти же препараты имели высокую активность в РДД с антисывороткой к препарату диагностически значимых белковых антигенов пневмококка, причем характер полос преципитации свидетельствовал о гомологичное™ их состава и наличии в них идентичных, либо сходных антигенных компонентов.

Иммуноферментный анализ позволяет с более высокой чувствительностью, чем РДД определять антитела. Поэтому дополнительный анализ антигенов был проведен с помощью ИФА. Наибольшей активностью в реакции с положительной контрольной сывороткой обладали препараты III 11/56, II 35/57, 11174/64, IV 74/64, что позволяет предположить возможность их применения в качестве препаратов белковых антигенов пневмококка.

Анализ молекулярного состава изучаемых белковых компонентов пневмококка был проведен с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Это нам позволило определить гетерогенность спектра белковых компонентов препарата, а также молекулярную массу этих компонентов для дальнейшего сравнения препаратов. Экстракция бактериальных белкоп детергентами редко приводит к выделению одного или неболь-

м.м.^кД)

94 кй - г ■ 80 ко

штамм П/5б(Ш) серотип 3

50 кэ -

штамм 74/64 (ш) серотип 7А

79

Г

2

3

2Ъ

штамм 74/64 (IV) серотип 7А *

штамм серотип

35^7(11)

Рпр I. .>.;

Рпр II

Рпр III

I

2 3

Рис.: Электрофоретический профиль (I) и результаты иммунопроявления с кроличьей (2) и

человеческой (3) сыворотками белковых препаратов различных штаммов пневмококка

шого количества белков. Как правило, в препарате экстракта находятся белки с близкими биохимическими свойствами. Как мы и предполагали, белковые препараты, полученные экстракцией детергентом содержат большое число индивидуальных белковых компонентов: около 30 полос, соответствующих отдельным полипептидам с молекулярной массой от 10 до 100 кЭ. Следует отметить, что в полученных препаратах содержится большое количество полипептидных цепей одинаковой массы (60, 50, 44, 40, 35, 22 кЬ).

Для того, чтобы доказать, какие из выявленных белков являются серологически активными, были применены два способа иммунопроявления после переноса электро-форетически разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану: кроличьей сывороткой к суммарному белковому препарату пневмококка, использованной нами ранее в РДД, а также пуловой сывороткой больных с бактериологически подтвержденной пневмококковой инфекцией. Оказалось, что пуловая сыворотка больных с пневмококковой инфекцией выявляет значительно больше белков в препарате, чем иммунная кроличья сыворотка (Рис.2). Это может быть объяснено тем, что в ходе инфекции происходит контакт макроорганизма со всеми антигенами пневмококка, тогда как при иммунизации были использованы препараты фракционированных антигенов (экстрагированных детергентом и разделенных гель-фильтрацией).

Обладая антигенным препаратом с доказанной иммунохимической активностью, мы получили возможность проанализировать возможное диаг ностическое значение антител к компонентам препарата при пневмококковой инфекции. Для этого были использованы сыворотки крови 20 детей с пневмококковой инфекцией, подтвержденной бактериологически. В качестве препарата белковых антигенов пневмококка был использован препарат 111 11/56, как наиболее серологически активный по данным ИФА. Оказалось, что 18 из 20 проанализированных сывороток (90%) реагируют с белком с м.м массой 80 кО, 13 сывороток (65%) активны с белком с м м 50 к Г), а 10 сывороток (50"м) речи провали с белком пневмококка с м.м. 94 к[). (табл.2) Ьолее редки реакции с

К)

N сыв-ки Величина сю М.М. Белков, активных в иммуноблоттинге

ко

1 0.713 94 80 50 44 40 17 14

2 0.656 80 50 44 17

3 0.404 94 80 50 49

4 0.482 80 63 50 49 44 40

5 0.643 94 80 63 50 49 44 40 14

6 0.533 94 80 63 50 44 40 17 14

7 0.465 94 80 50

8 0.633 94 80 50 44 17 14

9 0.546 29

10 0.375 94 80

11 0.413 94 80 74 50

12 0.434 94

13 0.348 94 80

14 0.496 94 80 50

15 0.490 94 80 50

16 0.300 94 80

17 0.486 94 80 50 44

18 0.481 94 80

19 0.537 94 80 74 50 44

Таблица 2 .Активность реакции белковых антигенов пневмококка в ИФА

и иммуяоблотинге

компонентами препарата с м.м. 63, 49, 44 и 40 кО. Примем, увеличение активности реакции в ИФА в целом соответствует более широкому спектру реагирования сыворотки с белковым антигеном.

Анализ антигенных препаратов из четырех штаммов пневмококка показал возможность выделения иммунохнмически активных белков этого микроорганизма. Для определения видового спектра этих антигенов мы проанализировали 74 штамма Б.рпсшпотае из коллекции НИИ ВС им.Мечникова (табл.3). Используя полученные на первых стадиях данного исследования антигенные препараты в качестве контроля, была предпринята попытка обнаружить и другие штаммы пневмококка, продуцирующие эти антигены, а также насколько характерно для пневмококка в целом наличие такого рода активности.

Для получения антигенных препаратов из большого количества штаммов мы применили более простой и быстрый метод приготовления препаратов: разрушение бактериальных клеток путем замораживания-оттаивания (экспресс-метод). Всего данным методом было получено 74 препарата из различных штаммов пневмококка (табл.3)

Для сравнительной характеристики полученные антигенные препараты были подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле с БОБ. Оказалось, что метод за-моражинания-оттаивания дает сходные по белковому составу препараты в сравнении с методом цетавлононой экстракции . Однако характерно, что в сравнении с препаратами, выделенными методом экстракции детергентом, бактериальные лизаты содержат большее количество индивидуальных белков. Вероятно, в состав этих препаратов попадают не только белковые компоненты клеточной стенки, но и большое количество внутриклеточных ферментов (рис.3).

Для выявления иммунохимически активных компонентов в составе полученных методом замораживания-оттаивания препаратов, была использована методика имму-нопроявления антигенов, перенесенных после элекфофореза на нитроцел.тюлозную мембран\, человеческой и.нюроткпи. содержащей н>> ииним ИФА апмме.ы к ппеимо-

1.1

Табл.3 Бактериальные z

пневмококка

штамм серотип nusv :зротш - серотип

i I 28/5 22F 15а

1/56 4 30/5 23а 15в

2/56 2 31/5 23В 15с

3 3 32/5' 24А 17а

3/79 6а 33/5" 24В 32а

4/56 6в 35/5 25 36

5/56 7F 36/5 ' 27 4if

6/56 8 37/5 ' 28А 44

7/56 9а 38/5' 28f к45

8/56 IOF 39/5" 39 46

9/56 iif 40/5 . jjf 7 а

10/56 i2f 41/5 :ia 3 42

11/56 3 42/5 :8f нс

12/56 14 43' "8В 19с

14/56 16 <14 ' ' - 8C 22А

15/56 i7f 46/5" il 4ia

16/57 7в 47/5 32F 47f

17/57 7с 48/5" •зс 48

18/56 9L 49/5" ■ЗА 47А

19/57 9n 50/5" :зв 3

20/57 9v 5Г/5 ' ■4 • 38

21/57 iia 52/5 ' '5f 43

22/58 i8a 53- -ЗА 40

23/57 i9f 54 '' ■В 39

24/57 I9A г.- -

кокку. Анализ полученных данных инка и 1. 'по наиболее характерными иммунохими-чески активными компонентами являются белки с м.м. 94. 80 н 50 кЭ (рис.3). В изученных препаратах достаточно часто встречаются кочпонепы с м.м. 74 и 44 кО. Эти данные указывают на присутствие в дрм их штаммах пневмококка сходных по молекулярной массе иммунохимически активных компонентов и хорошо согласуются с данными, полученными нами ранее.

2. Усовершенствование метла получения препарата белков антигенов пневмококка и отработка условий ИФА на полистироловых планшетах.

На данном этапе рабопп были модифицированы некоторые условия проведения ИФА для определения анппел к белковым антигенам пневмококка с использованием полистироловых планшетов. Для выделения новых серий антигенного препарата был

Рис. 3. Результат электрофореза препаратов из различных штаммов пневмококка, полученных методом замораживания-оттаивания.

n препарат % от сухого веса реакция в ИФА

белок по углевода нукл. к-ты

loury bredford

1 i 11/56 0 1 2 0 0,16

2 ii 11/56 0 9 3 0 0,20

3 illa 11/56 5 12 4 0 0,35

4 illb 11/56 20 40 7 1 0,91

Табл.4. Биохимический и иммунохимический анализ препаратов после гель-фильтрации цетавлонового экстракта S.pneumoniae, штамм 11/56.

использован штамм 11/56 пневмококка (серотип 3). Препарат был получен методом це-тавлоновой экстракции, но для предотвращения гидролитических процессов белковых препаратов дополнительно к применявшейся ранее методике мы внесли в экстрагирующий раствор ингибитор протеиназ - PMSF. Далее, в процессе гель-фильтрации компоненты, выходящие в составе третьего пика были разделены на две части по номерам фракций: с 20 по 25 фракцию - препарат Illa 11/56, с 26 по 30 фракцию - препарат Illb 11/56.

По результатам химического анализа новых серий препарата (табл.4), препарат Illb 11/56, соответствующий более низкомолекулярной части третьего пика содержит наибольшее количество белка, а также этот препарат обладает наибольшей серологической цкшвностыо в ИФД.

В последующих экспериментах мы использовали препарат ШЬ 11/56, т.к. он оказался наиболее диагностически значимым при определении антител к пневмококку.

На стадии подбора индикаторной смеси мы сравнили действие 5-аминосалнциловой кислоты (5-АС) и ортофенилендиамнна (ОФД). Применение ОФД повышает чувствительность анализа в 1,5 раза и снижает время постановки реакции на 1 час.

Разработка критериев иммунохимической диагностики значительно облегчает получение положительных и отрицательных контрольных образцов. Такими образцами могут служить сыворотки крови людей, удовлетворяющие условиям диагностического критерия. Нами было обнаружено, что до 25% здоровых людей имеют высокие титры антипневмококковых антител в сыворотке. Целенаправленный отбор таких сывороток может обеспечить производство ИФА-систем достаточным количеством контрольных образцов. При выборе отрицательной контрольной сыворотки были проанализированы сыворотки пациентов, имеющих заболевание не пневмококковой этиологии и другие заболевания. Оказалось, что наиболее оптимально в качестве отрицательного контроля использовать сыворотки людей, имеющих заболевания не инфекционного характера, а также сыворотки доноров с низким уровнем антител к пневмококку.

3. ['а (работка условий проведения ИФА на основе дот-блота.

Следует отметить, что преимуществом ИФА является возможность массового скриншна, по при этом в обычном ИФА с применением полистироловых планшетов необходима система детекции - фотометр, что резко ограничивает возможности использования этого анализа в обычных условиях. В связи с этим перспективным является раз-работа меюда ИФА типа дот-блот. Следует также учитывать, что сходные по своей клинической картине заболевания респираторного тракта могут быть вызваны различными бактериями. Результаты эпидемиологического анализа за последние годы показали большое значение для этиологии острой пневмонии, бронхита и отита среднего уха

таких микроорганизмов, как З.рпеитошае, Н.тЛиепгае и В.са1агтИа1|'5. Мы провели разработку системы ИФА на основе дот-анализа с использованием прераратов антигенов этих бактерий для определения антител в сыворотке крови у людей. Для удобства анализа каждой сыворотки одновременно с несколькими антигенами мы разработали систему дот-анализа, включающую 3 антигена на одной нитроцеллюлозной мембране (диаметр пор 0,45 мкм).

i i7 ш

I о в

2 «'

3-

.3 в

4 • ©

б' ■ ■ 7

"j

8 0 Q

1С 11

I - 21 ] 22

М 23- Ф с

13 О « | ■ 24 • •1

/4 • О и J

-

и _1 .26 @

-

16 ----- if 4 2? ч • О .21

С? © . 28

- ^__"_ - — •

16 1 • 29 • sJ

.Ъ J 3 О а:4 .1

20 1 1. .

Рис.4 Анализ сывороток методом дот-блота.

I - место нанесения антшенного препарата S.pneumoniae

II - место нанесения антигенного препарата Н.influenzae

III - место нанесения антшенного препарата B.catarrhalis

Предварительно в модельных экспериментах была подобрана концентрация а тигенных препаратов в условиях их сорбции на нитроцеллюлозную мембрану. Оказ лось, что для антигенного препарата 5.рпештюшае оптимальной является концентрац1 1мг/мл, для дезинтегратов НлпЛеипгае и В.с^аггЬаПэ - 50 мкг/мл и 370 мкг/мл соотве ственно. Сорбция антигенных препаратов на мембрану происходила автоматически фосфатном буфере (рН 7,5).

После того, как нами были отработаны условия проведения дот-анализа, мы пр ступили к анализу сывороток больных с помощью разработанных нами систе (методом ИФА на полистироловых планшетах и методом дот-блота). На рис.4 пре, ставлены результаты анализа методом дот-блот сывороток больных детей в возрасте < 8 до 14 лет с заболеваниями бактериальной этиологии. Сыворотки крови этих пацие тов мы предварительно исследовали разработанными ранее методами ИФА для опред ления антител к пневмококку и для определения антител к гемофильной палочке. Пр анализировать сыворотки на наличие антител к В.са(аггЬа115 методом ИФА не пре ставлялось возможным, т.к. такая система ИФА еще не разработана.

В табл.5 представлены данные, которые были получены в результате анализа а вороток двумя методами. Результаты дот-блота представлены в соответствии с уело ной шкалой, а данные ИФА представлены как в условных единицах, так и в виде вел чины оптической плотности. Оказалось, что при анализе сывороток двумя методам число положительных и отрицательных реакций различается незначительно. В случ; определения антител к пневмококку, сыворотки, активно реагирующие в обычне ИФА, как правило, дают яркую реакцию в дот-блоте. Совпадение результатов по дву методам составило 83% (при определении антител к пневмококку). В тоже время, щ параллельном определении антител к гемофильной палочке, уровень совпадения р зультатов составил 87%.

S.pneumoniae

H.influenzae

B.catarrhalis

CUB

результат в ИФА дот-блот

результат в ИФА дот-блот

дот-бл

7

8

9 Ю

0.597

0.539

0.469

0.399 0.418

++

0.700 ++

0.294

1.031

1.032 0.105

+++ +++

15

16

18

19

20 21

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

1 .258 +++

0 .397 • +

0 .362 +

0 .581 ++

0 .453 ++

0 .132 -

0 .524 ++

0 .292 -

0 .614 ++

1 910 +++

0 473 ++

0 749 +++

0 488 ++

1 308 +++

0 304 -

0 625 ++

0 431 +

++ ++ +++ +++ ++

+ +++

+++ +

+++ ++

++ + ++ +++ +++ +++ +++

+++ ++

0 .930 +++

0 .320 -

0 .890 +++

1° .820 +++

0 .900 +++

1 .300 +++

0 .700 ++

1 .320 +++

0 .850. +++

0 535 ++ 1

0 677 ++

0 450 +

0 890 +++

1 450 +++

0 400 +

0 560 ++

0. 440 +

0. 622 ++

0. 860 +++

0. 780 +++

0. 710 ++

1. ооо +++

0. 980 +++

0. 680 ++

0. 700 ++

1. 532 +++

0. 350 -

0. 860 +++

0. 740 ++

0. 990 +++

+++ ++

+ ++ ++ +++ +++

++ +

++ ++

+ ++ ++ ++ ++ ++ + +++ ++ +++ ++ + ++ ++ +++

++ ++

++ ++ +++ +++ + ++ +++

+++ +++

+++ +++

ТаблЗ Результат анализа сывороток больных с p.i пичиымм бактериальными антигенами годим ИФА на иолистироловых " кшшетах и метолом лот-блота.

Таким образом, на наш взгляд, метод дот-блота может быть использован для скрининга сывороток на наличие антител к пневмококку. В то же время, использование реакции типа дот-блот позволила нам создать систему, в которой одновременно можно оценить уровень антител к пневмококку, гемофильной папочке и B.catarrhalis при изучении бактериальной инфекции в клинике или экспериментальных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Препараты белковых антигенов, полученные из различных штаммов пневмококка обладают неодинаковой иммунохимической активностью. Использование экстракции цетавлоном позволило получить препарат с наибольшим содержанием белковых антигенов из штамма 11/56.

2. Доказано, что для белков, обладающих серологической активностью для разных штаммов наиболее характерны белки с молекулярной массой 50, 80, и 94 kD.

3. Отработаны оптимальные условия проведения ИФА для определения анител к S. pneumoniae на полистироловом носителе. В связи со сложным характером иммунного ответа при пневмококковой инфекции в качестве положительного контроля предложено использовать сыворотки здоровых людей с высоким содержанием антител к пневмококку.

4. Разработана новая система ИФА на основе дот-блота для одновременного определения антител к S.pneumoniae, Н.influenzae и B.catarrhalis, которая может быть использована для анализа сывороток крови больных в условиях скрининга большого количества образцов.

5. Анализ сывороток больных с помощью ИФА на полистироловых планшетах и методом дот-блота показал высокую степень совпадения результатов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Особенности выделения пневмококковых полисахаридов с помощью ацетона /Кузнецова Е.М., Пугачева H.JI. //В сб. "Препараты для диагностики и профилактики пневмококковых заболеваний". 1985, Москва, стр 131-138

2. Выявление капсульных антигенов пневмококка /Пугачева Н.Л., Падюков Л.Н.//ЖМЭИ, 1985 г.,№ II, стр.43-46

3. Выявление антител к пневмококку у детей острой пневмонией и плевритом иммуноферментным методом /Падюков Л.Н., Пугачева Н.Л., Кешикбаева А.А., Катосова Л.К.// ЖМЭИ, 1986г., стр79-83

4. Сравнительный анализ антигенных препаратов из некапсульных штаммов пневмококка /Ниснлевич В.Ф., Падюков Л.Н., Пугачева Н.Л.// ЖМЭИ, 1987г., № 1, стр.8-12

5. Секреторные антитела к пневмококку при острой пневмонии у детей / Уланова М.А., Пугачева Н.Л. // Тезисы докладов научной конференции "Актуальные проблемы педиатрии в Сибири и на Дальнем Востоке", 1988 г., Хабаровск, стр. 190.

6. Уровень антител к пневмококку при различных заболеваниях и у здоровых людей /Падюков Л.Н., Цветкова Н.В., Пугачева Н.Л.//В сб. "Иммуноферментный анализ в диагностике заболеваний", Москва, 1989 г., стр.9095.

7. Latex agglutination for determination of pneumococcal antigens in acute pneumonia // In Abstracts of 6th International Congress on Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology, Helsinki-Espoo, Finland, 1990, p. 77 (соавт. Асеева В.Г.)

8. Особенности гуморального ответа на пневмококк у детей / Уланова М.А., Падюков Л.Н., Таточенко В.К., Пугачева Н.Л.//ЖМЭИ, 1990 г., №2, стр.55-61.

9. Иммуноферментная система для определения антител к полисахаридам пневмококка у детей II Материалы рабочего совещания "Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций", Оболенск, 1990, с.47 (соавт. Уланова М.А., Ксенофонтова М.К., Падюков Л.Н.)

10. Опыт внедрения новой иммуноферментной системы // Материалы рабочего совещания " Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций", Оболенск, 1990, с.49 (соавт. Цветкова Н.В., Кузнецова Е.М.)

11. Способ диагностики пневмококковой инфекции // Положительное решение о выдаче патента от 23.01.92 на заявку N 4937427/14-41611 от 17.05.91. (соавт. Цветкова Н.В., Кузнецова Е.М., Падюков Л.Н., Батуро А.П.)

12. Идентификация бактерий- возбудителей бронхолегочной инфекции методом коагглютинации // В сб. Современные методы иммунохимической и молекулярной диагностики в медицине, Москва, 1992, с.96-103 (соавт. Таранов В.А., Ксенофонтова М.К., Цветкова Н.В., Жилина И.Л., Батуро А.П.)

13. Return to pneumococcal proteins? II Abstracts of XII Lancefield International Simposium on Streptococci and Streptococcal diseases, 1993, St.Peterburg, p. 132 (соавт. Падюков Л.Н.)

14. Return to pneumococcal proteins? II In: Pathogenic Streptococci: Present and Future" Ed. A.Totolian, Lancer Publication, St.Peterburg, p.426-427 (соавт. Падюков Л.Н.)

15. Antibacterial antibodies in pulmonary diseases // Abstr. of XV International Congress of Allergology and Clinical Immunology, Stockholm, Sweden, 1994, p.70I (соавт. Падюков Л.Н., Колмогорова O.B.)

16. Antibacterial antibodies in children with pulmonary diseases // XII European Immunol.Meeting, Barselona, Spein , 1994 (соавт. Падюков Л.Н.)

17. Белковые антигены Streptococcus pneumoniae // ЖМЭИ, 1995, № 2 (соавт. Падюков Л.Н.)

18. Antibodies to C-polysacharide and antigens of streptococcus pneumonia" // International Symposium on Clinical Lmmunology, San Francisco, CalifFornia, July 2023,1995 (соавт. Падюков Л.Н.)