Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Эпидемиологические аспекты пневмококковых инфекций и молекулярно-генетическая характеристика Streptoroccus pneumoniae

На правах рукописи

МАРТЫНОВА Алина Викторовна

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПНЕВМОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

14 00 30 - эпидемиология 03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

^^шшштшш

003164804

Санкт-Петербург - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор доктор медицинских наук профессор

Огарков Павел Иванович Турку гюков Вячеслав Борисович

Жоголев Сергей Дмитриевич Б ал аса'Шщ Гоар Сисаковна Королюк Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доцент доктор медицинских наук профессор доктор медицинских наук профессор

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский институт гриппа РАМН

Защита состоится S0 bAtAji 2008 года в часов на заседа-

нии совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215 002 12 при ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С М Кирова МО РФ» по адресу 194044, г Санкт-Петербург, ул Академика Лебедева, д 6

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С М Кирова МО РФ»

Автореферат разослан " ¡? " _^ _ 2008 года

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

Иванов В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пневмококковые инфекции несмотря на длительное изучение, до сих пор остаются одной из наиболее актуальных проблем внутренних болезней Streptococcus pneumoniae, возбудитель пневмококковых инфекций, вызывает не только отиты и синуситы (неинвазив-ные формы), но и пневмонию, менингит и бактериемию (инвазивные формы) Заболеваемость в Европе до сих пор составляет 16-20 человек на 100 тысяч населения, в США - пневмококковая инфекция ежегодно вызывает 20 тыс случаев менингиюв и бактериемий По данным российских исследований ПеГАС-1 (фаза «А» и ф^1за «В» проводились НИИ антимикробной химиотерапии и Научно-методическим центром по мониторингу антибиотико-резистентности), заболеваемость пневмококковыми инфекциями в России колеблется от 5-6 до 16-20 случаев на 100 тысяч насетения, встречаясь практически во всех социальных группах населения [JIC Страчунский, 2001, PC Козлов, 2004]

Особую тревогу вызывает увеличение среди населения инвазивных форм пневмококковых инфекций (менингит и бактериемия) практически во всех возрастных группах Это во многом связано с увеличением в структуре населения удельного веса больных с такими сопутствующими заболеваниями в анамнезе как туберкулез, гематологическая или онкологическая патология, ВИЧ и т п , приводящими к выраженному снижению иммунного статуса До сих пор отсутствуют достоверные результаты эпидемиологических исследований пневмококковых инфекций в различных группах населения с учетом сопутствующих заболеваний в анамнезе (ко-морбидности), несмотря на то, что предложенные в настоящее время эпидемиологические методики с вычислением интегративного показателя, в частности, индексов ко-морбидности [ME Charleson, 1989, М Liu, 1993, Н Johns, 1996] позволяют оценить выживаемость (отсу) ствие летальных исходов в группах пациентов с различными сопутствующими заболеваниями)

Кроме того, практически не исследуются региональные особенности се^отипового состава популяции штаммов пневмококков, уровень устойчивости к антибактериальным химиопрепратам штаммов, выделенных у больных с различной ко-морбидностью, условия и характер циркуляции, а также генотипические и фенотипические особенности штаммов Streptococcus pneumoniae, что важно для определения эпидемиологической значимости пневмококковых инфекций

Отсутствие достоверных данных го этим аспектам снижает возможности рациональной коррекции эмпирической антибактериальной химиотерапии и назначения антибиотш ов с учетом индивидуальных особенностей пациента в каждом конкретном регионе, что ведет к необоснованным экономическим потерям

Во многом сложность изучения эпидемиологии пневмококковых инфекций обусловлена несовершенством применяемых в настоящее время в России классических методоз диагностики и серотипирования Предложен-

ные методы молекулярно-генетической диагностики, такие как пульс-электрофорез (PFGE), полимеразяа? цепная реакция (ПЦР) повторяющихся ВОХ-последовательностей (BOX-PCR), случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD), при потенциально высокой по сравнению с классическим культуральным методом разрешающей способности, не могут одновременно обеспечить задач микробиологической диагностики и эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями и требуют последовательного применения, что не всегда доступно и экономически обоснованно [Р С Козлов, 2004, PWM Hermans, et al ,1995]

Достаточно популярным методом в молекулярной эпидемиологии является метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) геномной ДНК с использованием различных гибридизационных зондов RFLP обладает высокой воспроизводимостью и дискриминирующей способностью, однако требует подращиванич материала сама процедура длительна, требует сложного оснащения и высокой квалификации персонала Кроме того, в случае диагностики пневмококковых инфекций отсутствует однозначное мнение не только по поводу характера гибридизационных зондов, но и по поводу достаточно информативного видо-, а тем более и штаммоспецифического молекулярного маркера Это обусловлено пластичностью генома Spneumoniae, позволяющей ему осуществлять как внутри-, так и межвидовые взаимодействия в микробной ассоциации, что ведет к трудностям микробиологической диагностики данной инфекции Вследствие этого значительно осложняются проведение эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями и рациональная организация противоэпидемических мероприятий

Все выше сказанное объективно обосновывает необходимость дальнейшего совершенствования, а также поиска и разработки новых экспресс-методов диагностики и мониторинга пневмококковых инфекций прежде всего с применением генетического маркирования штаммов для решения задач эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями, включая и проведение клинического микробиологического мониторинга

Цель работы — изучить проявления эпидемического процесса при пневмококковых инфекциях для оптимизации профилактических и противоэпидемических мероприятий, повышения эффективности диагностики, а также рационализации региональных стандартов антимикробной химиотерапии на основании результатов исследования эпидемических и молекуляр-но-генетических характеристик штаммов S pneumoniae

Задачи исследования.

1) Провести ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости пневмококковыми инфекциями среди населения субъекта РФ на примере Приморского края (1998-2005) на основе данных, полученных общепринятыми методами микробиологической диагностики 5 pneumoniae

2) Изучить роль факторов риска развития пневмококковых инфекций, оценить значение сопутствующих заболеваний в развитии пневмококковых инфекций при помощи современных эпидемиологических методик

3) Провести клинико-микробиологический мониторинг пневмококковых инфекций с изучением особенностей формирования резистентности к антибиотикам штаммов S pneumoniae, а также особенностей серотипового состава штаммов пневмококков, выделенных от больных с различными клиническими формами пневмок окковых инфекций и от носителей

4) Разработать метод выявления и дифференциации штаммов пневмококка на основе метоца анализа полиморфизма длин концевых рест-рикционных фрагментов некодируемого участка ДНК S pneumoniae, провести апробацию метода, выявить его возможности и перспективы в клинической практике для диагностики пневмококковой инфекции, оценив его чувствительность и специфичность

5) Изучить структуру популяции эпидемически опасных штаммов S pneumoniae, оценить их эпидемиологическую роль с изучением генетических особенностей факторов вирулентности и механизмов резистентности к антибактериальным химиопрепаратам, при помощи предложенного варианта методики изучить клональное родство штаммов пневмококков, циркулирующих среди пациентов и носителей, с целью проведения эпидемиологического мониторинга

Научная новизна.

Проведено ретроспективное эпидемиологическое исследование заболеваемости инвазивными (пневмониями, менингитами, бактериемиями) и неинвазивными пневмококковыми инфекциями (отигами, синуситами) с учетом всех нозологических форм данной этиологии, отраженными в различных разделах МКБ-10 Исследована заболеваемость пневмококковыми инфекциями с учетом наличия сопутствующих заболеваний (с применением индекса ко-морбидности [Charleson ME et al, 1989] и их влияния на развитие инфекционного процесса при пневмококковых заболеваниях, определены факторы риска развития различных форм пневмококковых инфекций, а также оценен риск формирования носительства

Впервые экспериментально обоснован метод молекулярно-тенетической диагностики пневмококковой инфекции, основанный на принципе анализа концевого полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (TRFLP)

В качестве перспективного диагностического и молекулярно-эпидемиологического маркера штаммов S pneumoniae изучен некодирую-щий участок ДНК SP_1922 и SP_1923, обозначенный как NCR (non-codmg region) Охарактеризованы такие молекулярно-генетические особенности этого участка, как фланкированность видоспецифичным геном (ген ply), приемлемый размер ампликона, а такхе наличие статистически значимой вариабельности рестрицируемых фрагментов

Разработанный алгоритм применения метода анализа полиморфизма длин концевых рестрикционых фрагментов с предложенным праймером NCR позволил выделить 11 групп пневмококков, объединенных по результатам рестрикции NCR участка ДНК S pneumoniae, что обеспечило позволя-

ет проведение эпидемиологических исследований по выявлению источника инфекции и путей передачи

Изучены молекулярно-биологические свойства штаммов пневмококка с оценкой вирулентности и устойчивости к антибактериальным химиопре-паратам, оценена возможность формирования и распространения эпидемических геновариантов S pneumoniae Оценено генетическое родство выделенных штаммов, изучены эволюционные изменения популяции штаммов пневмококка с учетом генотипа и фенотипа выделенных изолятов, приводящие к формированию эпидемического варианта Практическая значимость.

На основании ретроспективного эпидемиологического анализа пневмококковых инфекций с учетом всех нозологических форм пневмококковой инфекции, отраженной в МКБ-10, на примере субъекта Российской Федерации (Приморского края), установлены доминирующие нозологические формы инфекции, оценена тенденция заболеваемости пневмококковыми инфекциями, изучены факторы риска развития заболевания пневмококковыми инфекциями и носительства

Так, в структуре инвазивных пневмококковых инфекций лидирующее место занимает пневмококковая пневмония Среди всех неинвазивных пневмококковых инфекций чаще регистрируются острые синуситы (или обострения хронических синуситов), острые отиты с различными осложнениями Выраженный подъем заболеваемости, как и при инвазивных формах инфекций, отмечается у детей до 14 лет и у лиц старше 55 лет

Уровень носительства S pneumoniae при наличии хронической патологии увеличивается в 3 раза у детей и в 5 раз - у взрослых, что является важным фактором риска в развитии инфекционного процесса любой локализации, т е как инвазивных, так и неинвазивных форм пневмококковых инфекций В группе носителей с сопутствующей заболеваниями в анамнезе так же выявлен подъем заболеваемости у детей до 14 лет и у лиц старше 55 лет

Полученные данные исследования эпидемиологических особенностей пневмококковых инфекций позволяют оценивать эффективность, прогнозировать и корригировать лечение больных с пневмококковыми инфекциями, в том числе и с различными сопутствующими заболеваниями

Впервые был исследован серотиповой состав популяции пневмококков, выделенных при различных формах пневмококковых инфекций Установлено, что в группе штаммов, вызвавших инвазивные формы инфекции, преобладают нетипируемые 20,5% (61/298) и редкотипируемые 11,4% (34/298) изоляты Это составляет больше половины исследуемой популяции, вызвавшей инвазивные формы инфекции В группе штаммов, выделенных от носителей, также наблюдается преобладание нетипируемых и редкотипи-руемых штаммов - соответственно 20,4 % (17/83) и 15,6 % (13/83).

Вместе с тем, при анализе серотипового состава популяции полирезистентных штаммов пневмококка, вызвавших инвазивные формы пневмококковых инфекций, отмечается несколько случаев повторного выделения штаммов серотипов 6А, 9V, 14, 19F, 23F В группе штаммов, вызвавших не-

инвазивные случаи заболевания, были выделены штаммы серотипов 6А, 23F У носителей так же были выделены штаммы 9V, 19F серотипов

Среди штаммов S pneumoniae, вызвавших различные нозологические формы пневмококковых инфекций, развивались сходные тенденции формирования антибиотикоустойчивости, характеризовавшиеся значительной долей штаммов, резистентных к препаратам группы макролидов и фюрхино-лонов, а также к тетрациклину, клиндамицину, триметоприм-сульфаметоксазолу, что требует коррекции стандартов проведения антибактериальной химиотерапии

Оценен уровень устойчивости к антимикробным химиопрепарат£1М штаммов S pneumoniae различных серотипов, выделенных у больных пневмококковыми инфекциями

Создана региональная коллекция штаммов пневмококка, позволяющая проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг за пневмококковыми инфекциями

Анализ генетической последовательности NCR фрагмента позволил применить данный участок ДНК пневмококка в качестве диагностической мишени для обнаружения S pneumoniae

На основе метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов ДНК S pneumoniae стало возможным организовать эпидемиологический надзор за пневмококковыми инфекциями Применение этого метода для исследования различного лабораторного биологического материала, позволило выявить тенденцию идентифицируемых штаммов пневмококка к клонально-поликлональному распространению, что продемонстрировало важность изучения особенностей эпидемического геноварианта для организации эпидемиологического надзора.

Выявленные различия в фрагменте NCR позволили адаптировать метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов для диагностики пневмококковых инфекций на основе применения данною фрагмента, исключив ложноположительные/ложноотрицательные результаты, а также диагностировать ассоциацию нескольких штаммов пневмококка в одном клиническом образце

Основные положения, выносимые на защиту.

1) В исследуемом субъекте Российской Федерации (Приморском крае) отмечен высокий уровень заболеваемости пневмококковыми инфекциями В структуре заболеваемости инвазивных форм превалируют пневмококковые пневмонии, доминирующие у детей до 14 лет и у лиц старше 55 лет, при этом отмечается гиподиагностика менингитов пневмококковой этиологии В структуре неинвазивных пневмококковых инфекций чаще встречаются синуситы и отиты, преобладающие в группе детей младше 14 лет и у взрослых старше 55 лет

2) Основньм фактором риска развития пневмококковых инфекций является наличие сопутствующих заболеваний, что увеличивает риск носи-тельства S pneumoniae Выживаемость больных инвазивными пневмококковыми инфекциями с сопутствующей патологией, оцениваемой индексом ко-

морбидности около «10», составляет 55,5%, а выживаемость больных с индексом более «18» —- 42,3%

3) Особенности формирования устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, и высокий удельный вес в серотиполом составе популяции выделенных штаммов пневмококка нетипируемых изолятов обусловливают необходимость проведения регулярного молекулярно-эпидемиологического мониторинга за циркуляцией штаммов 5 pneumoniae

4) Проведение генотипирования с использованием метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S pneumoniae позволяет выявить особенности распространения генетических детерминант устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам и детерминант основных факторов вирулентности в штаммах пневмококка, принадлежащих к одному генотипу, что дает возможность выявлять эпидемический геновариант

5) Применение метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S pneumoniae позволяет решить проблему микробиологической диагностики штаммов пневмококка в разнообразном клиническом материале, диагностировать пневмококк как в монокультуре, так и в ассоциации, что обусловливает возможность рациональной организации диагностического процесса в интересах эпидемиологического надзора

Личный вклад автора в проведенное ис следование. Сбор материала производился лично диссертантом Самостоятельно проводился ретроспективный эпидемиологический анали! заболеваемости анализировались отчетные формы и микробиологические журналы ЛПУ г Владивостока, проводилось анкетирование и обработка полученных данных для выявления роли факторов риска у пациентов и носителей осуществлялось выделение штаммов S pneumoniae, формирование исследуемой коллекции, исследование выделенных штаммов на устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам диско-диффузионным методом и методом серийных разведений Молекулярно-эпидемиолошческие исследования, отраженные в исследовании так же были проведены авторам самостоятельно постановка реакции ПЦР, подбор необходимого прайме ра, постановка анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов как с референтными штаммами, так и с клиническими образцами Статистическая обработка полученного материала, включая построение дендрограмм и матриц соответствия, была произведена лично автором

Апробация результатов работы. Материалы научно-исследовательской работы доложены на Зальцбургских семинарах по инфекционным болезням (Зальцбург, Австрия, 2003, 2004), на Международном симпозиуме по изучению проблем устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам (ISAAR, Сеул, Южная Корея, 2003, Манила, Филлипины, 2005), на Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (ECCMID, Прага, Чехия, 2004, Копенгаген, Дания, 2005), на Международном симпозиуме по изучению пневмококков и пнев-

мококковых инфекций (ISPPD, Анкоридж, США, 2002, Хельсинки, Финляндия, 2004, Элис Спрингс, Австралия, 2006), на Международной конференции по созданию коллекций культур (ICCC, Токио-Цукуба, Япония, 2004), на Международном Конгрессе по антимикробной химиотерапии (ICAAC, Вашингтон, США, 2004), не Международном семинаре по инфекционным заболеваниям Фонда Гаслини (Генуя, Италия, 2004, 2005), на Европейском симпозиуме по изучению молекулярной биологии пневмококков (Браун-швайг, Германия, 2005,Флоренция, Италия, 2006, Оейрас, Португалия, 2007), на Европейском Респираторном Конгрессе (ERS, Стокгольм, Швеция, 2003, Копенгаген, Дания, 2005, Мюнхен, Германия, 2006), на Международном симпозиуме по изучению патогенных нейссерий (Кейрнс, Австралия, 2006), на Семинаре по Молекулярно-биологическим основам эпидемиологического контроля (ITEC, Де.г:и-Чандигарх, Индия, 2006), на международном конгрессе по детским инфекциям (WSPJD, Бангкок, Таиланд, 2007)

Материалы диссертационной работы были представлены на краевом семинаре «Госпитальная эпидемиология» при департаменте здравоохранения Администрации Приморского края (2004, 2005, 2006, 2007), а также на заседании Дальневосточного отделения Конгресса «Человек и лекарство» в 2007 году в г Втадивостоке Работа обсуждена на заседании проблемной комиссии по микробиологи-I, иммуночогии, эпидемиотогии Владивостокского государственного медицинского университета (июнь, 2007)

Внедрение результатов работы По материалам исследования были изданы Методические рекомендации «Метод анализа полиморфизма концевых фрагментов, полученных при рестрикции некодирующего участка ДНК в диагностике пневмококковых инфекций», утвержденные Президиумом СО РАМН «Дальневосточный научный центр» (27 06 2007) Опубликованы информационные письма, утвержденные Департаментом здравоохранения Приморского края «Об эпидемиологических особенностях заболеваемости пневмококковыми инфекциями» (Владивосток, 2007), «Молекулярно-генетические особенности формирования резистентности при пневмококковых инфекциях» (Владивосток, 2007), < О молекулярно-эпидемиологических методах диагностики пневмококковой инфекции» (Владивосток, 2007), внедренные в работу лечебно-профилактических и медико-профилактических учреждений Дальневосточного Федерального округа

Результаты исследования использованы при создании формуляров Центра фармако-технической информации и клинической фармакологии Департамента здравоохранения Приморского края и были внедрены в работу лечебно-профилактических учреждений края

Получены удостоверения на рационализаторские предложения «Способ улучшения статистичесьой отчетности по регистрации различных форм пневмококковых инфекций) (№ 2689, ВГМУ), «Способ анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов для диагностики пневмококковых инфекций» (№ 2688, ВГМУ), ((Способ опенки роли сопутствующих заболеваний при пневмококковых инфекциях» (№ 2690, ВГМУ)

Материалы диссертации используются в учебном процессе при подго-

товке врачей на кафедре терапии ФПК, кафедре госпитальной терапии, кафедре микробиологии, кафедре эпидемиологии и военной эпидемиологии Владивостокского государственного медицинского университета, на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии Дальневосточного государственного медицинского университета, на кафедре микробиологии и вирусологии Амурской государственной медицинской академии

По материалам диссертации опубликовано 45 печатных работ, в том числе в российских и иностранных журналах, рекомендуемых ВАК России — 15 статей

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 354 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы Диссертация иллюстрирована 43 таблицами, 86 рисунками, 10 схемами Список литературы содержит 422 литературного источника, из них 90 принадлежат отечественным и 332 зарубежным авторам

Научно-исследовательская работа по теме диссертации зарегистрирована во Всероссийском Научно-Техническом Информационном Центре, регистрационный номер 01 20 03 02174

План научно-исследовательской работы был утвержден Этическим комитетом ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава»

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Объем, материалы и методы исследования.

Обоснованием цели проведенного исследования послужили данные ретроспективного эпидемиологического анализа заболеваемости пневмониями, менингитами, отитами и синуситами на примере субъекта Российской Федерации (Приморского края), где было установлено, что данные заболевания преимущественно вызваны пневмококковой этиологией Ретроспективные данные о заболеваемости за период с 1998 по 2005 год, а также медико-демографические показатели были предоставлены нам Медицинским информационно-аналитическим центром (МИАЦ) Приморского края ф 12 «Сведения о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения», Статистический справочник «Здоровье населения г Владивостока Ресурсы здравоохранения и их использование 1996-2000 гг, 2001-2005 гг», «Анализ статистических материалов по годовым отчетам о деятельности МЛПУ» Анализ этиологической структуры изучаемых нозологических форм проводился при выкопи-ровке данных из форм № 254/у «Журнал регистрации исследований и результатов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапев-тическим препаратам» (8 750 результатов лабораторных исследований) и из амбулаторных карт больных и за период 01 12 1998 по 31 12 2005 (1500 амбулаторных карт) Методической основой работы послужила система эпи-

демиологической диагностики ретроспективный эпидемиологический анализ частоты выявления пневмококковых инфекций по результатам микробиологического и клинического обследования [Дегтярев А А , 1982] Ретроспективный анализ проводился по традиционной схеме с расчетом инцидентного и превалентного показателей и включал изучение многолетней динамики заболеваемости, структуры заболеваемости с распределением пациентов по полу и возрасту Влияние сопутствующих заболеваний на развитие пневмококковых инфекций оценивалось при помощи коэффициента Charle-son ME (1987) Проведенное исследование позволило оценить заболеваемость различными формами пневмококковых инфекций, выявить преобладающие факторы риска

Нозологическая структура пневмококковых инфекций, а также микробиологические свойства штаммов S pneumoniae, выделенных у больных пневмококковыми инфекциями проводились в период с 20 12 2003 по 31 12 2004 года в стационарах г Владивостока Основным контингентом ис-следованЬя были 378 больных ведущими формами пневмококковой инфекции (пациенты учреждений здравоохранения г Владивостока), находившихся на стационарном лечении с диагнозами «пневмококковая пневмония» (J13), «бактериальный менингит, вызванный S pneumoniae» (G00 1), «пневмококковая бактериемия» (А40 3), «отит» (Н67 8), «синусит» (132 0-32 9) и с другими нозологическими формами пневмококковой инфекции (М00 1, М13 0,М01 8.Н66 0,Н75 8)

Для исследования явления носительства возбудителя и для выявления роли носительства возбудителя в формировании заболеваемости у так называемых «групп риска» по пневмококковой инфекции, нами был проведен поисковый скрининг среди групп населения, обратившихся за медицинской помощью в ЛПУ г Владивостока Участники данного обследования (413 человек), являвшиеся носителями S pneumoniae составили группу, в которой затем согласно целям и задачам исследования были выделены 2 подгруппы носители с сопутствующей хронической заболеваемостью (275 человек) и полностью здоровые (138 человек)

Всего в исследование были вовлечены пациенты, лечившиеся в учреждениях г Владивостока и Приморского края, обслуживающие больных пневмониями Взрослые пациенты (старше 18 лет) были обследованы в ГКБ № 1, ГКБ № 2, ГКБ № 3, инфекционном отделении медсанчасти рыбаков, медсанчасти «Больница строителей» Данные о выделяемое™ пневмококка у пациентов детского возраста (младше 18 лет) были получены из педиатрических стационаров г Владивостока (ГКБ № 1 ГКБ № 2, ГКБ № 3) Данные о носительстве пневмококка у пациентов с различной сопутствующей патологией получены у пациентов вышеуказанных клиник, получающих лечение в дневных стационарах, в отделениях медико-социальной помощи, в онкогематологическом отделении

Проведение исследования было одобрено Независимым Этическим комитетом ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава», а при проведении исследования были получены информированное согласие пациентов и обследуемых на

проведение исследования взятого от них клинического материала и использования анамнестических данных для настоящего исследования

Выделенные у больных и носителей штаммы S pneumoniae (п=378 от больных и 83 штамма от носителей) были выращены в чистой культуре согласно Приказу № 535 «Об унификации микробиологических методов исследования в лечебно-профилактичес ких учреждениях», серотипированы согласно методике Quellmg с соответствующими серотиповыми сыворотками Устойчивость к антибактериальным шмиопрепзратам диско-диффузионным методом и методом серийных разведений определялась согласно стандартам NCCLS (среда Muller-Hmton, National Clmical Committee Laboratory Standards, CDC) В исследуемой коллекции штаммов была определена группа полирезистентных штаммов пневмококка (п=34), выделявшихся как при ин-вазивных формах пневмококковых инфекций, так и у больных с неинвазив-ными формами и у носителей Изучены молек/лярно-генетические особенности вирулентности (праймеры к основным генам вирулентности ply, lytA, pspÄ, pspC) и устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам (праймеры к генам mefE, ermB, par С, gyi А, ртгА, Тп1545, Тп917)

Различия в формах инфекционного процесса, серотиповом составе и сходные особенности в формировании антибиотикорезистентности обосновали

необходимость разработки метода эпидемиоло1 ического надзора, позволившего дентифицировать штаммы, вызывающие сходный патогенетический процесс, обладающие идентичными особенностями факторов вирулентности и антибактериальной устойчивости, то есть идентифицировать эпидемические геноварианты Для разработки такого метода нами был выбран принцип анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов После анализа генома (база данных GenBank), выбран участок SP_1923 и SP_1922 ДНК 5 pneumoniae, на основе которой был написан праймер NCR (поп-codmg région)

5'-CCG-ATT-TGC-CAC-TAG-TGC-GTA-AGC-3 , обратный праймер к нему 5'-AAA-GGC-TGC-ACG-GAC- ATTG-3'

Контролем служил праймер к гену GAPDH глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 5 '-GG A-TCC-TTG-CTT-GC А-С AC-TTG-TTG-ААА-ТАС-3',

обратный праймер 5'-AAG-CTT-TTA-TTT-AGC-AAT-TTT-TGC-GAA-GTATT-3'

В лабораторных условиях была доказана специфичность выбранной намч диагностической мишени с референтными и клиническими штаммами пневмококка (п=100), стрептококка (п=100), различными видами моракселл и гемофил, контрольными методами служили (п=100) серотипирование (L J Chandler, В S Reisner,2000), (n-30) мультялокусное сиквенстипирова-ние(МС Enright, 1987), (п=100) пульс-электрофорез (A Whatemore,2000)

Подобрана последовательность рестриктаз, включавшая последовательное применение Alu], Ddel и Miel Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов участка NCR с применением предло-

женной нами схемы рестриктаз испытан на 100 клинических образцах лабораторного материала, контрольным методом служил бактериологический метод, проведенный на тех же образцах лабораторного материала При проведении анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов образцы клинического материала 3 раза о гмывали в 0,02 M фосфатном буфере, затем обрабатывали раствором для гомогенизации мокроты «Sutasol» (производитель фирма Oxoid) согласно инструкции производителя, затем центрифугировались в течение 5 минут со скоростью 12 ООО об/мин Осадок ре-суспендировался в 1,5 мл фосфатного буфера и центрифугировался в течение 5 минут со скоростью 1? ООО об/мин 3 раза ДНК выделяли при помощи быстрого фенольного метода, затем проводили ПЦР идентификацию с предложенным нами NCR прайм ером и рестрицировали полученный ампликон Условия амплификации (GeneAtnp PCR System 2400, Perkin-Elmer) были следующие первоначально денатурация шла в течение 3 мин при 94 °С, последующие этапы денатурации (29 циклов) проводились по 1 мин при 94 °С Отжиг шел в течение 30 циклов по 1 минуте при температуре 45 °С, воссоединение полученных цепей ДНК длилось в течение 30 циклов по 3 минуты при температуре 72 °С, с конечным этапом синтеза по 10 минут при 72 °С в течение 30 циклов, затем-инкубация при 10°С Условия рестрикции готовили реакционную смесь в объеме 14 мкл, содержащей 2 мкл буфера NE 2, 0,2 мкл BS А, 11,3 бидистиллирсванной воды, 0,5 мкл рестрикционного фермента Alu] («NewBioLabs», Великобритания), к которой добавляли 6 мкл ПЦР продукта Рестрикцию проводили в течение 1-2 часов при температуре 37 °С, инактивировали рестрикицонный фермент при 65 °С в течение 20 минут Для выявления нескольких штаммов S pneumoniae рестрикцию проводили несколько раз, применяя последовательно рестрикционные ферменты Alul, Ddel и Msel

Регистрация полиморфизма рестрицированных фрагментов проводилась при помощи капиллярного электрофореза (Agilent 2100 Bioanalyzer, производитель Agilent Technologies, Калифорния, США) с использованием микрочипа (LabChip 7500, Caliper Technologies, Mountain View, Калифорния,США}, что согласно методу, позволяет определить даже минимальный полиморфизм исследуемых образцов, и повышает, в целом, чувствительность данного метода Результаты молекулярно-генетических исследований были проанализированы методами вариационной статистики с применением программного обеспечения Bionumerics 2 0

Группа (п=34) полире:.истентных штаммов 5 pneumoniae, выделенная у больных инвазивными формами пневмококковых инфекций, неинвазив-ными формами и у носителей, была проанализирована предложенным нами методом анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов, также было проведено мультилокусное сиквенстипирование по семи локу-сам и пульс-электрофорез Полученные результаты были обработаны методами вариационной статистики и представлены при помощи программного обеспечения MEGA 3 1, Agilent Bioanalzyer 2 5, LIAN 3 5 При исследовании данным методом различного клинического материала (155 образцов) уда-

лось установить преобладание монокультур и ассоциаций, идентифицировать принадлежность штаммов пневмококка к определенному эпидемически значимому генотипу и определить характер распространения данного эпидемического геноварианта Полученные результаты также анализировались методами вариационной статистики и предстаьлены при помощи программного обеспечения MEGA 3 1, Agilent Bioanalzyer 2 5

В ходе статистической обработки материалов главными показателями служили средняя арифметическая (М), ее средняя ошибка (± т), ошибка к проценту относительной величины, кроме того, указывались точки экстремумов исследуемых величин (А тах и А тт), рассчитывался доверительный интервал (ДИ) с достоверностью 95% Совокупность полученных данных проверялась на нормальность распределения (и. i = ц. 2 ц i ^ Ц 2) с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (K-S), критерия Лилиефорса (L) и критерия Шапиро-Вилкса (Sh-W), а также графическим методом с построением ожидаемой кривой распределения величин Статистическая достоверность различий параметрических вегшчин подтверждалась парным критерием Стьюдента (Т) для изучения различий между связанными совокупностями, критерием Стьюдента (t) — для одной совокупности

Для исследования непараметрических величин рассчитывались - уД критерий (F) Фишера (для малых выборок) С целью изучения различий множественных выборок проводился дисперсионный анализ варианта ANO VA (для сравнения по одному признаку! и MANOVA (для изучения многофакторного влияния)

Для изучения вопроса о степени риска отношение шансов (ОШ), а также корреляционный критерий Пирсона для изучения вопроса о наличии связей между исследуемыми величинами Кроме того, исследовались чувствительность (Se) и специфичность (Sp) диагностических манипуляций, рассчитывалась прогностическая ценность положительного результата (ПЦПР) и прогностическая ценность отрицательного результата (ПЦОР) Дискриминирующая способность теста рассчитывалась при помощи коэффициента Симпсона с расчетом корреляции т Кендалла Все статистические данные считались достоверными при уровне статистической значимости a менее 5%

Обработка данных и оформление резучы атов исследования осуществлялась на персональном компьютере при помощи пакета MS Office, MS Excel 2000

Подробнее объем, материалы и методы указаны в таблице 1

Таблица 1- Материалы и методы исследования

№ л/11 Направления исследований Методы исследования Объем исследований

1 Эпидемиологические исследования 1 Ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости [А А Дегтярев, 1982] (указаны результаты лаб иссл) 8750

Эпидемиологиче- 2 Изучение амбулаторных карт больных 1850

ские исстедования пневмококковыми инфекциями,

3 Ведение журнала микробиологических исследований 960

4 Опрос носителей 5 pneumoniae из групп с сопутствующей заболеваемостью и без, 413 (275 и 138)

5 Изучение сопутствующей заболеваемости по методу Chaileson ME (1986) 378

2 Микробиологические исстедования 1 Экспресс- диагностика (микроскопия мазка с окрас кои по Граму) 378

2 Выделение I ультур пневмококков их идентификапия,серотиппрование [PC Козлов,2004] 378

3 Разработка этиологической диагностики пневмо- 1 Подбор и характеристика участка ДНК S pneumoniae для создания специфичного и чувствительного праймера 10

кокковой инфек- 2 Постановка реакции ПЦР с репрезен- 136

ции на основе ме- тативной выборкой штаммов

тода анализа кон- S pneumoniae и бпизкородственными

цевого полимор- видами

физма длин рест- 3 Постановка метода (TRFLP) анализа 136

риктов NCR фраг- концевого полиморфизма длин рест-

ментов рнктов NCR фрагмента ДНК

S pneumoniae S pneumoniae

4 Подбор оптимальных праймеров для постановки метода TRFLP 100

5 Постановка метода анализа концевого полиморфизма длин рестриктов NCR фрагмента с использованием праймера NCRspan3 в репрезентативной выборке ктиничесг и\ образцов 60

4 Молекулярно-эпидемиологические исследования 1 Метод анализа полиморфизма рест-рикционных фрагментов NCR участка S pneumoniae 134

- 2 Мультилокугное сиквенстипирование (MLST) [МС Ennghi 2001] 64

3 Пульс-электрофорез, PFGE [D R Murdoch,2003] 134

4 Серотипироиание [Serum Statens] 134

5 Построение дендрограмм, оценка формирования эпидемического клона 134

5 Исследование устойчивости к ан- 1 Изучение устойчивости к антибиотикам [NCCLS 2004], 378

тибиотикам 2 Гибридизация с праймерами к генам устойчивости к антибиотикам, сикве-нирование 378 34

6 Статистические 1 Методы варианионнои статистики Все числовые

исследования 2 [А А Лукьянова, 2002] программа компьютерной обработки изображении Statistica 6 0, MEGA 3 1, Agilent Bioa'ialzver 2 5, LIAN 3 5 показатели

Результаты исследоиания и их обсуждение

В Приморском крае постоянно регистрируется высокий уровень заболеваемости пневмониями 57,0б±2,32 %<ю, отитами 42,06 ± 4,51 %оо, и синуситами 90,57± 2,6 %оо. В г. Владивостоке постоянно регистрируется высокий уровень заболеваемости пневмококковыми инфекциями: за исследуемый период (1998-2005) заболеваемость' пневмококковыми инфекциями составляет 6,13±0,29, при этом минимальный уровень был z-,5 на 10 ООО населения, максимальный уровень заболеваемости достигал 6,6 на 10 000 населения (рисунок 1). Наблюдается достоверно выраженная тенденция к повышению заболеваемости пневмококковыми инфекциями с темпом прироста 6,3 % в год. Согласно литературным данным как российских [P.C. Козлов, 2005; JI.C. Страчунский, 2003], так и зарубежных специалистов [A.Tomasz, 2006; D.Musser, 2003], средний показатель заболеваемости пневмококковыми пневмониями с учетом данных о заболеваемости пневмониями, отитами и синуситами — заболеваниями, где пневмококк является ведущим этиологическим агентом должен составить 32.73±1,58 %о0, отитами - 12,13±0,54 %оо, синуситами 36,2±1,04 %оо, что подтверждает предположение о недостаточном качестве диагностики и наличии сложностей в организации эпидемиологического надзора в отношении пневмококковых инфекций.

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005

годы

» заболеваемость -тенденция ^_j

Рисунок 1 -Заболеваемость пневмококковыми инфекциями в г. Владивостоке (1998-2005 гг.), %оо

Объективно существует проблема гиподиагностики заболеваемости, вызванной S. pneumoniae, что ведет к отсутствию регулярного учета заболеваемости и отсутствию системы мер противоэпидемических мероприятий в отношении пневмококковой инфекции.

Изучив структуру пневмококковых инфекций методом ретроспективного анализа заболеваемости, мы обнаружили, что в структуре инвазивных пневмококковых инфекций (рис. 2), лидирующее место занимает пневмококковая пневмония (78,8 %), заболеваемость которой преобладает у детей

до 14 лет (в 2004 году заболеваемость составила 2,74 на 10 тысяч) и у взрослых старше 55 лет (по данным 2004 года заболеваемость была 10,66 на 10 тысяч). Пневмококковые бактериемии чаще всего регистрируются у детей младше 14 лет (2,23 на 10 тысяч), вместе с тем, они отмечаются и у взрослых (18-55 лет) —0,29 на 10 тысяч, а также у лиц старше 55 лет— 0,42 на 10 тысяч. Заболеваемость пневмококковыми менингитами у детей составляет 0,11 на 10 тысяч, при том, что пневмококковые менингиты не были отмечены ни в какой другой возрастной группе (рис. 3).

Рисунок 2 - Нозологическая структура инвазивных пневмококковых

инфекций

I

я

______________ =а_Л1..

0-14 14-18 18-55 55<

возраст

j Щ пневмонии El бактериемии ■ менингит □ другие формы |

Рисунок 3 - Заболеваемость инвазивными формами пневмококковых инфекций в различных возрастных группах (по данным 2004 года)

Основным фактором риска развития заболевания инвазивными формами пневмококковых инфекций является курение (0111=4,45), не менее важным является и учет информации о перенесенном остром отите (ОШ=8,4) и пневмонии (ОШ=5,9). Регулярное употребление алкоголя увеличивает вероятность развития инвазивных форм пневмококковых инфекций в 2,57 раз, наличие хронического тонзиллита в анамнезе — в 2,29 раз, неконтролируемого применения антибактериальных химиопрепаратов — в 2,11 раз. При

этом сочетание 2-х факторов риска отмечалось у 136 (45,63 %) пациентов, 3-х и более - у 82 (27,8 %) пациентов. Отмечена особая роль в развитии пневмококковых инфекций наличия в анамнезе хронической патологии и снижения иммунного статуса: при хронических сопутствующих заболеваний вероятность развития инвазивных пневмококковых инфекций увеличивается в 14,4 раз.

При анализе эпидемической ситуации по неинвазивным пневмококковым инфекциям, было установлено, что в структуре заболеваемости лидирует острый синусит (или обострения хронических синуситов) с различными осложнениями в 52,5 % случаев; в 47,5 % •— зарегистрирован острый отит. Несмотря на проблему гиподиагностики неинвазивных форм (когда существующий показатель регистрируемых, к примеру, пневмококковых отитов у детей в десятки раз ниже регистрируемых показателей в других регионах России и зарубежья), в возрастной структуре заболеваемости можно отметить не только преобладание заболевших детей младше 14-ти лет, но и подъем заболеваемости в возрастной группе старше 55 лет, с дальнейшим формированием достаточно постоянного уровня заболеваемости в других старших возрастных группах (рис. 4).

6

жж_

0-14 14-18 18-55 55<

возрастные группы

@ отиты П синуситы щ всего

Рисунок 4 - Заболеваемость неинвазивными формами пневмококковых инфекций

Наиболее актуальным фактором риска развития неинвазивных форм пневмококковых инфекций является наличие в анамнезе пневмонии (ОШ=6,83), различной хронической соматической патологии с нарушением иммунного статуса (ОШ=5,45); также актуальны и указания на перенесенный острый отит (ОШ=1.6) и острый синусит (ОШ=2,3).

При оценке носительства штаммов S. pneumoniae в группах обследуемых без сопутствующих заболеваний и в группах обследуемых с сопутствующими заболеваниями оказалось, что наличие сопутствующих заболеваний действительно влияет на возможность развития пневмококковой инфекции, причем в большей мере, чем возрастной фактор, что подтверждается результатами наших исследований. Так, частота носительства S. pneumoniae у людей с сопутствующей заболеваемостью составляет 56,48±3,07 %, тогда

.

как у обследуемых любого возраста без сопутствующих заболеваний частота носительсгва возбудителя: у взрослых — 10,13±3,61 %, а у детей -18,72±3,61 %. При этом у взрослых с сопутствующими заболеваниями она в среднем составляет 51,9±б,17%, а у детей - 52,75±6,77 %. Таким образом, уровень носительства при наличии хронической патологии увеличивается в 3 раза у детей и в 5 раз - у взрослых. Сопутствующие заболевания являются важным фактором риска в развитии пневмококковых инфекций любой локализации, т.е. как инвазивных, так и неинвазивных форм пневмококковой инфекции, что подтверждается наличием подъема заболеваемости в группе носителей S. pneumoniae с наличием сопутствующих заболеваний (ко-морбидного фона) в анамнезе.

Несмотря на актуальность проблемы, до сих пор эпидемиологические особенности инфекционной патологии не рассматривались в связи с анамнезом больного и состоянием его иммунного статуса, что, являясь немаловажным критерием для оценки течения инфекционного процесса, не позволяло прогнозировать исход тех или иных форм пневмококковой инфекции. Применив для проспективной оценки заболеваемости метод Charleson ME (1987), мы провели прогностический анализ выживаемости больных инва-зивными пневмококковыми инфекциями, согласно которому больные с сопутствующей патологией, оцениваемой индексом ко-морбидности около 10 имеют выживаемость в случаев инвазивных пневмококковых инфекций 55,5 %; больных с индексом ко-морбидности 18-42,3 % (рис. 5).

; { ! 1 h г ft Hi л ... ..j. .j. : М : М ; , ; 1 : ■■.}'. '. \ \ J ! Г'"

• I-

1 i ■ ;

<1 1 2 3 Л S 6 7 8 S Ю 11 12 13 14 15 10 17 1а 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 коэффициент Чарльсоха

Рисунок 5 - Прогностический анализ выживаемости больных инвазивными пневмококковыми инфекциями по методу Charleson ME (1989)

При анализе исследуемой популяции штаммов пневмококка, был обнаружен ряд особенностей развития процессов устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам в зависимости от формы инфекционного процесса.

В популяции штаммов S. pneumoniae, вызвавших инвазивные формы пневмококковых инфекций, значительную часть составляют штаммы, нечувствительные к ТМП-сульфаметоксазолу (52,34 %), к препаратам ряда тет-рациклинов (58,04 %), к клиндамицину (32,88 %); к препаратам ряда макро-

лидов — устойчивостью к эритромицину обладают 12,08 % (при этом умеренно устойчиво всего 11,4 %); к препаратам ряда фторхинолонов—■ к ци-профлоксацину устойчиво 12,75 %, тогда как к левофлоксацину— всего 4,02 %; к пенициллину: устойчиво всего 4,36 %, а умеренно устойчиво — 7,04 %. В целом, полученные данные позволяют предположить, что в популяции штаммов S. pneumoniae, вызывающих инвазивные формы пневмококковых инфекций, развиваются процессы формирования устойчивости к препаратам ряда макролидов и фторхинолонов.

Среди штаммов пневмококка, выделенных от носителей, при отсутствии пенициллинустойчивых штаммов, достаточно высок удельный вес штаммов, устойчивых к триметоприм-сульфаметоксазолу (22,89 %), тетрациклину (12,04 %), к эритромицину (18,07 %).

В популяции штаммов, вызвавших неинвазивные пневмококковые инфекции, при низком содержании в изучаемой популяции штаммов, устойчивых к пенициллину (5 %), отмечается высокий удельный вес штаммов, устойчивых к триметприм-сульфаметоксазолу (30 %), тетрациклину (30 %) и клиндамицину (22,5 %), выражена устойчивость к эритромицину (17,5 %); к препаратам ряда фторхинолонов — ципрофлоксацину (10 %) и левофлоксацину (7,5 %) (рис. 6).

шш Ш

S ■в Bill ill 83 Щ

II Й ......■

л II . I

инвазивные штаммы неинвазивные штаммы штаммы от носителей

пенициллин ■ эритромицин Шципр Плевофлокс Я тетрациклин

Рисунок 6 -Устойчивость к антиабактериальным химиопрепаратам штаммов, выделенных от больных инвазивными, неинвазивными формами пневмококковых инфекций и от носителей

В целом, во всех трех группах, наблюдается тенденция к увеличению числа штаммов пневмококка, нечувствительных к препаратам ряда бета-лактамов (рис. 7), так к пенициллину нечувствительны 11,4 % штаммов, выделенных от больных инвазивными формами инфекции, 8,75 % штаммов, выделенных от больных с неинвазивными заболеваниями, и 3,61 % штаммов, выделенных от носителей. Также отмечается снижение чувствительно-

сти к макролидам штаммов, вызвавших инвазивные формы инфекции, среди них нечувствительных к эритромицину было выделено 23,49 %, среди штаммов, выделенных от больных с неинвазивными формами пневмококковых инфекций - 32,5 %; а у носителей - 38,5 %. Регистрируется также снижение чувствительности к фторхинолонам, среди инвазивных штаммов выделено 29,86 % нечувствительных к ципрофлоксацину; а среди неинвазивных -27,5 %, у штаммов, выделенных от носителей, — 21,64 %. Отмечается явление полирезистентности, связанное со снижением чувствительности к пенициллину отмечаемое, прежде всего, в отношении штаммов, нечувствительных к эритромицину и фторхинолонам.

Несмотря на различное эпидемиологическое значение (инвазивная инфекция, неинвазивная, или носительство), отсутствуют различия в частоте выделения устойчивых и умеренно-устойчивых штаммов пневмококка в зависимости от клинического материала в популяции штаммов, выделенных от больных с инвазивными формами инфекций (12,08 %), неинвазивными формами инфекций (17,5 %) и от носителей (18,07 %). Тем не менее, отме^ чаемые различия в чувствительности к антибактериальным химиопрепара-там внутри группы штаммов S. pneumoniae, вызвавших инвазивные формы пневмококковых инфекций, могут быть объяснены сосуществованием в макроорганизме нескольких штаммов возбудителя с различным паттерном устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам. Это обеспечивает ге-нотипические и фенотипические различия в антибактериальной чувствительности у этиологически значимых штаммов одного вида, выделенных из разных источников у больного с одной нозологической формой пневмококковой инфекции.

¡¡Шйл

инвазивные штаммы неинвазивиыс штаммы штаммы от носителей

Щпенициллин ■ эритромицин Ш ципрофлоксацин i

Рисунок 7 - Распределение устойчивых и умеренно-устойчивых к антибактериальным химиопрепаратам штаммов пневмококка

в различных группах

Наиболее часто (рис. 8) среди выделенных S. pneumoniae, вызывающих инвазивные формы инфекций, встречаются нетипируемые штаммы (22,81 %). При этом распределение штаммов различных серотипов внутри возрастных групп пациентов инвазивными формами пневмококковых инфекций подтверждает полученный вывод о том, что среди штаммов пневмококка, вызывающих инвазивные заболевания, лидируют нетипируемые

штаммы (у детей - 22,22 %, у взрослых-16,9 %, у пациентов старше 65 лет-23,33 %).Рассматривая серотиповой состав штаммов S. pneumoniae, вызвавших неинвазивные формы заболеваний, можно отметить, что при значительной роли 6, 23 и 35 серотипов (8,75%, 7,5 % и 7,5 %, соответственно), не представляется возможным выделить преобладание какого-либо серотипа. При анализе серотипового состава штаммов, выделенных у здоровых лиц, также можно отметить роль штаммов пневмококка 6 серотипа (13,25 %), а также нетигшруемых штаммов (20,73 %).

Распределение штаммов S. pneumoniae в разных возрастных группах носителей также характеризуется значительной ролью редко встречающихся и нетипируемых штаммов (так, у детей такие штаммы выделяются в 14,07 % и 20,73 % случаев).

50 ^45

а40

я35 |зо

инвазнвныс штаммы нсиывазивные штаммы штаммы от носителей

■ метилируемые В редкотипяруемые

Рисунок 8 - Распределение нетипируемых штаммов в исследуемых

группах

Таким образом, при исследовании популяции штаммов пневмококка, выделенной у больных инвазивными формами, неинвазивными формами пневмококковых инфекций, а также у носителей., оказалось, что при различной эпидемиологической значимости, к которой относится и возможность вызывать различные проявления эпидемического процесса, все три исследуемые группы характеризуются сходными тенденциями в формировании устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, обладая, при этом, различным серотиповым составом. Изученные популяции штаммов S. pneumoniae не могут характеризоваться преобладанием штаммов какого-либо серотипа. Полученные данные подтверждают, с одной стороны, взаимосвязь исследуемых популяций, однако дают минимальную информацию в плане эпидемиологического надзора. Штаммы S. pneumoniae одного и того же серотипа из групп, выделенных от больных инвазивными формами, неинвазивными и от носителей, различаются по устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам (включая и изменения минимальной ингибирую-щей концентрации), обладают различным генотипом. Для характеристики предпочитаемого эпидемического геноварианта S. pneumoniae был проведен мониторинг популяции полирезистентных штаммов пневмококка, выделен-

1

1

^тшшШт

--- ------ ---1

-- -------— ----;

--

~ "" SSM«® ----

ных в группах больных инвазивными, неинвазивными формами инфекции, а также - у носителей, методом анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов в предложенном нами варианте с рестрикцией NCR участка ДНК.

Методика анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов позволила выделить в исследуемой популяции 11 генотипов пневмококка, индивидуальность которых была подтверждена данными мультилокусного сик-венстипирования, а также серотиповьши различиями и различиями в генотипах, выделенных методом пульс-электрофореза (рис. 9).

_I ©-nun

_ _I I г

С

I ST1U2

— ЗТ11-3 —- STCI-3

— ST1I-22 I STII-4

■ S-ril-12

- STII-5

- S5TII-2-Í-

-d

- STll-21

IS "Til-© s-ni-r sni-B

STGI-1

- STII-23

- STTNJ»--7

. STII-17

- STNI-1

- STNI-2 ST1I-9 STII-IO STII-T 1 STCI-2 STfMi-4 3~ТГМ 1-5 sTii-ч о STII-19 STII-20 STII-14 ST1I-1 s STI1-1 <5 STIMl-3 stínji-B

Рисунок 9 - Молекулярно- эпидемиологический анализ 34 лолирезистентных штаммов S.pneumoniae г выделенных от больных инвазивными пневмококковыми инфекциями (ST-ÍI), неинвазивными пневмококковыми инфекциями (ST-NI) и носителей (ST-CT) (22 RPLP типа, анализ полиморфизма рестрик-ционых фрагментов) ( Программы Agilent Bioanalzyer 2.5; MEGA 3.1)

Среди возбудителей пневмококковых инфекций, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными фомрами пневмококковых инфекций, а также от носителей, методом мультилокусного сиквенс-типирования, выявлено, что все штаммы, выделенные во всех трех популяциях, представляют собой родственные изоляты вида S. pneumoniae, большинство из которых обладают уникальным генотипом, определяющим наличие одного сиквенс-типа для каждого штамма. При этом определено 6 кластерных групп, кото-

рые содержат штаммы, выделенные от разных больных, обладающие различными молекулярно - эпидемическими характеристиками (серотип, устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам), которые, являясь генетически близкородственными, вызвали различные проявления пневмококковых инфекций

При количественном анализе генетических особенностей выделенных штаммов выявлено, что, их популяция является достаточно вариабельной, коэффициент генетического разнообразия составил 0,808 ± 0,02) Наиболее вариабельными являются штаммы, выделенные от носителей коэффициент вариабельности по большинству локусов (gdh, gki, spi, xpt, ddl) составляет 1, за исключением локусов гесР (0,6667) и локуса агоЕ (0,6667)

Коэффициент ассоциации с учетом всех исследованных локусов ДНК штаммов пневмококка, выделенных от носителей, составляет 0,904 ± 0,06, что выше, чем в ДНК штаммов, выделенных от больных неинвазивными формами инфекций (0,802 ± 0,03) и больных инвазивными формами инфекций (0,789 ± 0,03), что подтверждает тот факт, что штаммы, вызвавшие ин-вазивные формы инфекций, обладают определенным фено- и генотипиче-ским сходством

Таким образом, выявленные нами особенности гибридизации с прай-мерами к основным генетическим детерминантам устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, позволяют предположить, что существует преобладание определенных механизмов устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам в штаммах S pneumoniae различных TRFLP-rpynnax, что и было подтверждено нами результатами сиквенирования

Из вышеприведенных данных следует, что ведущим механизмом выработки устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам ряда макро-лидов является активация mef- оперона, а именно, гена mefiZ (64,7 %), до 20,5 % исследуемых нами штаммов обладают коньюгативным транспозоном Тп1545, являющимся маркером устойчивости к макролидам и тетрациклину и способным только к горизонтальному переносу, причем следует отметить, чго его могут содержать от 30 до 50% штаммов в отдельных TRFLP-rpynnax (группа Н) Устойчивость к фторхинолонам, распространенная в отдельных TRFLP-типах, в целом обусловлена индуцибельной активацией генов устойчивости к фторхинолонам, что установлено у 23,88 ± 11,91 % штаммов

Несмотря на значимость пневмококковых инфекций эпидемическая ситуация в отношении данной инфекции обусловлена во многом объективной сложностью микробиологической диагностики S pneumoniae, не позволяющей до настоящего времени создать так называемый «золотой» стандарт диагностики, а также проводить мониторинг пневмококковых инфекций Для решения данной задач был применен метод анализа полиморфизма ре-стрикционных фрагментов NCR участка ДНК S pneumoniae, где в качестве диагностической мишени был использован некодирующий фрагмент геномной ДНК S pneumoniae, ранее не применявшийся в таком качестве (рис 10)

адом

дада

Рисунок 10 - Схематическое изображение некодирующего фрагмента ДНК' (штамм TIGR4, GenBank)

Некодирующий фрагмент (NCR) геномной ДНК S. pneumoniae является видоспецифичным участком и обладает свойствами, объясняющими его использование в качестве оптимальной диагностической мишени для диагностики пневмококка, в связи с техническими преимуществами выполнения полимеразной цепной реакции, которые не были достигнуты при использовании других участков генома S. pneumoniae, такие как локализация изучаемого фрагмента в непосредственной близости от гена, кодирующего видос-пецифический фактор вирулентности пневмококка- пневмолизин; консервативность фланкирующих их участков (SP 1922 (гипотетический протеин) и SP 1923 (пневмолизин)); наиболее приемлемый размер (1182 Ьр) выбранного ампликона; амплификация вариабельного участка генома.

В связи с применением для создания праймера новой диагностической мишени была изменена схема ПЦР реакции для оптимизации параметров ренатурации с целью увеличения выхода конечного ПЦР-продукта. В частности, мы пришли к выводу, что оптимальным числом циклов, обеспечивающих максимально возможный выход амплифицированного продукта, является 30; другие параметры не нуждались в оптимизации и были проведены согласно общепринятым правилам.

В результате серии проведенных опытов с использованием предложенного нами варианта ПЦР реакции праймер, созданный на основе последовательности NCR фрагмента, действительно оказался высокочувствительным и высокоспецифичным видовым маркером. Реакция была положительна как с контрольными, так и с референтными штаммами (R6, TIGR4), и она была отрицательна с близкородственными штаммами семейства стрептоко-кокков, а также была отрицательна со штаммами, неродственными S. pneumoniae, но наиболее часто выделяемыми вместе с ним в составе ассоциаций микроорганизмов из клинических образцов (рис. 11).

Кроме того, чувствительность NCR фрагмента S. pneumoniae не связана с серотиповой принадлежностью выделенного штамма. Проведенный количественный анализ ПЦР продукта показал отсутствие взаимосвязи, и вне зависимости от серотипа средний размер амплифицированного фрагмента составлял 1268 ± 6,57 пар оснований [1254,997-1281,603].

Для проведения предложенного нами варианта метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК пневмококка были выбраны рестриктазы - Alul, Ddel, Msel- и охарактеризован полиморфизм фрагментов, являющийся фактически уникальным для каждого штамма.

Рисунок 11 - ГТЦР реакция с NCR фрагментом: 1- 4- ПЦР с праймером NCR; 5- отрицательный контроль с праймером NCR; 6-9- реакция ПЦР с праймером к гену GAPDH; 10- маркер молекулярного веса X; 11-отрицательный контроль с праймером к гену GAPDH; 12-не занято.

1281 bp 514 bp

12216 3054 1018 517V506

Изучение характера полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов при применении данных рестриктаз позволило создать оптимальную схему и последовательность их применения в предложенном нами варианте метода для диагностики пневмококковых инфекций. Кроме того, были обнаружены характерные особенности полиморфизма рестрикционных фрагментов, свидетельствующие о возможности дифференцировать несколько штаммоЕ» пневмококка в одном клиническом образце (рис. 12).

Генотипирование штаммов S.pneumoniae

Генотип штамма

Генотип штамма

Генотип штамма

Клинический материал

Установление диагноза пневмококковой инфекции методом анализа полиморфизма рестриктов NCR участка ДНК

Инфицированность одним штаммом S.pnenmoniae

Инфицированность двумя

штаммами S.pneumoniae

+ - -

Инфицированность тремя и более штаммами S.pneumoniae

Рисунок 12 - Метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов в диагностике пневмоккковых инфекций

При исследовании клинического образца, было выяснено, что макси-

мальная вероятность идентификации монокультуры при рестрицировании ДНК только одной рестриктазой не превышает 69 % (Alul), а максимальная вероятность выделения ассоциации при использовании одной рестриктазы не превышает 42 % (Msel) Тем не менее, при применении последовательного рестрицирования по предложенной нами схеме вероятность идентификации монокультуры возрастает до 95 %, при этом «не идентифицированными» штаммами, то есть штаммами, входящими в состав ассоциаций штаммов пневмококка, для идентификации которых может потребоваться дополнительная рестрикция, явчяются только 5 %

Чувствительность и специфичность метода составили 98,98 % и 97,09 %, при этом ПЦГТР (прогностическая ценность положительного результата) и ПЦОР (прогностическая ценность отрицательного результата) соответственно 97 % и 99,01 % При применении метода для исследования различных клинических образцов было выяснено, что она фактически является 100 %-ной, что в сравнении с чувствительностью и специфичностью применения рутинного бактериологического метода, позволяет считать предлагаемый нами вариант метода анализа полиморфизма концевых рест-рикционных фрагментов ПЦР продукта NCR фрагмента более перспективным (табл 2)

Таблица 2 - Чувствительность и специфичность в различных клинических образцах

Вид клинического материала TRFLP 1 Бактериологический метод

А/А+В Se А/А+В Se

Мокрота 30/30 100% 13/20 65%

С/м жидкость 10/10 100% 7/10 70%

Назофаринге-альный мазок 29/30 (29/1, 0/30) 100% 18/30 60%

Se(M±m) 23±5,4 100% 12,66±3,17 65±2,88

Примечание А- истинноположительные результаты выделения Spneumoniae, подтвержденные методикой,В- ложноположительные результаты

Разрешающая способность предлагаемого нами варианта метода достаточно высока 0,97 [0,96-0,98], при том, что разрешающая способность наиболее популярного метода эпидемиологического исследования - сероти-пирования - составляет всего 0,93 [0,92-0,94], пульс-электрофорез способен идентифицировать внутривидовые различия в 95 % случаев Это подтверждает вывод о том, что разрешающая способность варианта метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов ПЦР продукта NCR фрагмента превышает разрешающую способность других методов, направленных на решение аналогичных задач, обладая при этом в лабораторных условиях идентифицировать 42 типа пневмококка из 100 штаммов с максимальным возможным пределом допустимых межтиповых различий 5 %

Результаты, полученные при проведении метода анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S pneumoniae TRFLP-группах, выявили особенности распространения генетических детерминант (а также механизмов их обусловливающих) в популяциях штаммов, вызвавших инвазивные и неинвазивные формы пневмококковых инфекций, а также выделенных от носителей, что было подтверждено выявлением коньюгатив-ных и неконьюгативных транспозонов и что доказало возможность распространения в определенных TRFLP-группах полирезистентных штаммов пневмококка, что может привести к формированию эпидемического варианта

Представленные результаты подтверждают эпидемиологическую значимость TRFLP-типирования как метода, позволяющего оценить вирулентность исследуемых штаммов штаммы TRFLP-групп (С, F, I, К) имеют уникальный паттерн геновариантов исследованных нами факторов вирулентности, группы А, В, Е, Н, J обладают геновариабельностыо в пределах двух аллелей (за исключением генов ply и lytA в группах Н и А, соответственно), что также может иметь как эпидемиологическое, так и микробиологическое значение (табл 3)

Таблица 3 - Гено-фенотипическая характеристика вирулентности штаммов

пневмококка из различных TRFLP-групп (указано число аллелей)

№ п/п TRFLP Факторы вирулентности Фенотип

группы ply* lytA pspA pspC прозрачный матовый

1 А 22 4 5 2 2 9 (40,9) 13 (59,09)

2 В 23 1 8 1 2 8(34,7) 15(65,3)

3 С 11 1 1 1 2 2(18,2) 9(81,8)

4 D 66 2 8 3 2 32 (48,5) 34(51,5)

5 Е 15 6 7 2 1 2(13,1) 13(86,9)

б F 10 1 2 1 2 3(30) 7(70)

7 G 28 5 7 2 1 7(25) 21(75)

8 Н 26 3 5 1 2 8(30,7) 18(69,23)

9 I 38 1 9 1 1 5(13,1) 31(81,57)

10 J 33 5 6 1 1 6(18,2) 27(81,8)

11 К 16 2 8 2 1 3(18,75) 13(81,25)

Примечание * в скобках указан % от исследуемой группы

Изучение генетических взаимосвязей между штаммами, выделенными в различном клиническом материале, позволило выявить, что несмотря на то, что в целом, характер распространения пневмококка в популяции носит поликлональный характер, штаммы определенных TRFLP-гpyпп, как например, групп В и Н, обладают способностью к клонально-поликлональному распространению, а в некоторых случаях (как было обнаружено на примере исследования крови и ликвора), и к клональному распространению Это позволяет говорить об особой роли штаммов данных групп и позволяет считать их эпидемическими геновариантами

ST-K ST-A

ST-J 6% S% ST-B

SST-A fflST-B BST-C BST-ü BST-EDST-F BST-G UST-H HST-I Ш ST-J И ST-K

Рисунок 13.- Распределение штаммов S. pneumoniae различных TRFL.P-групп в популяции (п=378 штаммов) из различного лабораторного материала, выделенного от больных инвазивными, неинвазивными формами пневмококковых инфекций и от носителей

На основании вышесказанного можно сделать вывод, что TRFLP-типирование, проведенное с применением метода анализа полиморфизма ре-стрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae позволяет оценить распространение основных генетических детерминант не только анти-биотикорезистентности, но и наиболее значимых в патогенезе пневмококковой инфекции факторов вирулентности, определяющих развитие различных форм пневмококковых инфекций, анализ эпидемических особенностей которых позволяет обосновать проведение противоэпидемических мероприятий при пневмококковых инфекциях (рис. 13).

Кроме того, применение метода анализа полиморфизма концевых ре-стрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae позволяет решить проблему микробиологической диагностики штаммов пневмококка в разнообразном клиническом материале, диагностировать пневмококки, как в монокультуре, так и в ассоциации, что обусловливает возможность рациональной организации диагностического процесса и определяет адекватную диагностику инвазивных и неинвазивных форм пневмококковых инфекций.

Таким образом, метод анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae служит адекватной современной методикой при организации и проведении противоэпидемических мероприятий при пневмококковой инфекции. Это дает возможность не только ретроспективно изучать эпидемические свойства возбудителя пневмококковых инфекций, S. pneumoniae, но и возможность прогнозировать появление эпидемических вариантов на основе изучения фазовых генетических изменений.

Из вышесказанного следует, что принципиальная схема эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями должна включать эле-

менты как молекулярно-эпидемнологического мониторинга, так и эпидемиологических исследований за пневмококковой инфекцией

ВЫВОДЫ

1 В исследуемом субъекте РФ регистрируется высокая заболеваемость пневмококковыми инфекциями средний уровень которой за период с 1998 по 2005 составлял 6,13 ± 0,29 на 10 тысяч населения с достоверно выраженной тенденцией к повышению и средним темпом прироста 6,3 % в год В структуре инвазивных пневмококювых инфекций чаще всего (78,8 %) регистрируется пневмококковая пневмония, среди неинвазивных пневмококковых инфекций преобладает острый синусит или обострение хронических синуситов — в 52,5 % случаев

2 При различных формах пневмококковых инфекций особенностей факторов риска не выявлено, ведущими из них были курение (ОШ=4,45 при инвазивных формах и ОШ=1,69 при неинвазивных формах) и перенесенная пневмония в анамнезе (ОШ=5,98 при инвазивных формах и ОШ=6,83 при неинвазивных формах), получение антибактериальных химиопрепара-тов в предыдущие 3 месяца (ОШ=2,11 при инвазивных формах и ОШ=1,58 при неинвазивных формах) Наличие сопутствующей патологии и снижение иммунного статуса является ведущим фактором риска по развитию инвазивных форм пневмококковых инфекций (ОШ=14 4) Выживаемость больных с инвазивными пневмококковыми инфекциями, с сопутствующей патологией, оцениваемой индексом ко-морбидносги около «10», составляет 55,5%, а выживаемость больных с индексом «18» и более — 42,3%)

3 Клинико-микробиологический мониторинг позволил идентифицировать выделенную популяцию штаммов следующим образом Штаммы пневмококка, выделенные у больных с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковых инфекций, а также у носителей, характеризуются сходными тенденциями в формировании устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам При этом, они обладают различным серотиповьм составом Установлен рост числа штаммов пневмококка, нечувствительных к тетрациклину, клиндамицину, ТМП-сульфаметоксазолу, макролидам и фторхи-нолонам Популяция штаммов пневмококков, вызвавших инвазивные формы инфекции, представлена 6A, 9V, 19F, 23F серотипами В группе штаммов, вызвавших неинвазивные случаи заболевания, доминируют 6А, 6В, 23F, а у носителей 9V, 19F серотипы 51 pneumoniae, что подтверждает как взаимосвязь выделенной популяции, так и свидетельс гвует о наличии выраженных генотиповых различий

4 Рост числа нетипируемых штаммов в структуре популяции штаммов 5 pneumoniae, вызвавших различные формы пневмококковых инфекций, а также распространенность полирезистентных штаммов, позволяет обосновать актуальность применения новых молекулярно-эпидемиологических методов, наиболее перспеетивным из которых является

метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов для проведения эпидемиологического надзора

5 Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S pneumoniae является чувствительной и специфичной методикой, которая позволяет проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг в инте ресах эпидемиологического надзора и оценить распространение основных генетических детерминант по анти-биотикорезистентности и наиболее значимым в патогенезе пневмококковых инфекций факторам вирулентности

6 Некодирующий сэрагмент (NCR) геномной ДНК S pneumoniae является видоспецифичным участком и обладает свойствами, позволившими на его основе создать видоспецифичный и высокочувствительный маркер, на основе которого можно проводить генотипйрование, дискриминирующая способность которого подтверждена данными мультилокусного сиквенсти-пирования, а также серотиповыми различиями и различиями в генотипах, выделенных методом пульс электрофореза Применение этого фрагмента позволяет решить проблему микробиологической диагностики штаммов пневмококка в разнообразном клиническом материале, диагностировать пневмококки как в монокуль гуре, так и в ассоциации, что дает возможность рациональной организации и повышения эффективности диагностического процесса

7 Для проведения варианта метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагме ггов ПЦР продукта NCR фрагмента при исследовании пневмококковых инфекций оптимальными являются рестриктазы -Alul, Ddel, Msel Охарактеризован полиморфизм фрагментов, являющийся фактически уникальным для каждого штамма

8 Изучение структуры популяции эпидемически опасных шгаммов пневмококка, выделенных при различных клинических формах методом анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК штаммов S pneumoniae, обосновывает тот факт, что идентификация штаммов генотипов групп D и Н S pneumoniae служит критерием эпидемического геноварианта, в связи с тем, что у них помимо маркеров конститутивной устойчивости чаще других штаммов выделяются генетические Маркеры, кодирующие индуцибельную устойчивость к антибактериальным хи-миопрепаратам Формирование устойчивости штаммов S pneumoniae к макролидам осуществляется путем активации mef- оперона, а именно, гена те)Е (64,7 %) До 20,5 % исследуемых штаммов обладают коньюгативным транс-позоном Тп1545, а 8,8 % штаммов обладают неконьюгативным транспозо-ном Тп917 (8,8%) Резистентность к фторхинолонам в исследованной популяции обусловлена как инд> цибельной, так и конститутивной активацией генов к фторхинолонам рагС (47 %), gyrA (23,5 %),pmrA (17,6 %)

9 Кроме того, несмотря на выявленный поликлональный характер распространения штаммов пневмококка, штаммы D и Н групп обладают способностью к клональному распространению, что дает возможность на их основе прогнозировать появление эпидемических геновариантов и прово-

дить молекулярно-эпидемиологический мониторинг в рамках эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 В связи с распространением нетипируемых штаммов пневмококков в инетерсах эпидемиологического надзора рекомендуется применять метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S pneumoniae Сочетание данных генотипирования по NCR фрагменту с данными об антибиотикорезистентности позволяет прогнозировать появление эпидемических вариантов возбудителя

2 Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S pneumoniae рекомендуется для диагностики монокультуры и ассоциации штаммов пневмококка в различных образцах клинического материала в эпидемической ситуации, когда выделение возбудителя классическим методом затруднено

3 Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов позволяет выявлять распространение эпидемических геновариантов пневмококка, идентифицировать клональный или поликлональный характер распространения, что обеспечивает выбор противоэпидемических мероприятий в отношении пневмококковых инфекций

4 Для рационализации и повышения эффективности эмпирической антимикробной химиотерапии пневмококковых инфекций целесообразно использовать антибактериальные химиопрепараты ряда бета-лактамов, ограничив применение макролидов и фторхинолонов, что связано не только с распространением их полирезистентных изолятов практически во всех возрастных группах, но и с выработкой полирезистентности к этим трем препаратам

5 С целью совершенствования системы регистрации заболеваемости пневмококковыми инфекциями назрела необходимость введения в отчетную форму 12 «Сведения о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения», данных об этиологической характеристике пневмоний и отитов

6 При клиническом обследовании и ведении пациентов с различными формами пневмококковых инфекций необходимо оценивать у них роль сопутствующих заболеваний путем интегративной оценки и прогнозирования исхода основного заболевания с использованием коэффициента ко-морбидности Charleson М Е (1987)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Martynova А V Macrolide Resistance in Streptococcus pneumoniae Strams Collected m the Far East of Russia from 2000 to 2002 / А V Martynova and V В Turcutyuicov // J Clm Microbiol - 2003 -Vol 41, № 10-P 4906

2 Мартынова А В Антибиотикорезистентность культур S pneumoniae, выделенных у лиц с внебольничной пневмонией /А В Мартынова, В Б Туркутюков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии -2004 - № 2 -С 81-83

3 Martynova А V Analysis of macrohde -resistant isolates of Streptococcus pneumoniae gamed at the Far East of Russia / A V Martynova, V В Tur-cutyucov // Clinical Microbiology and Infection - 2004 - Vol 10, Suppl 3 -P 316

4 Мартынова А В Заболеваемость болезнями органов дыхания у жителей Приморского края в 2002-2003 гг / А В Мартынова, А А Шепарев, Ю Б Скурихина, Э В Слабенко // Вестник РГМУ -М -2005 -Т 42,№3 -С 31

5 Мартынова А В Проблемы идентификации Spneumoniae при формировании устойчивых к оптохину штаммов возбудителя / А В Мартынова, В Б Туркутюков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2005 - №6 -С 65-69

6 Martynova А V Fluoroqumolone-resistant strains of Streptococcus pneumonaie at the Far East of Russia / A V Martynova, A A Sheparyov, V В Turkutjukov // European Respiratory Journal - 2005 -Vol 26, Suppl 49 - P 639

7 Martynova A V Epidemiology of COPD in the Far East of Russia m 1990-2004 years / A V Martynova, A A Sheparyov, V В Turkutjukov // European Respiratory Journal - 2005 -Vol 26, Suppl 49 - P 593

8 Martynova A V Emergence of fluoroquionolone-resistant clones of Streptococcus pnetcmomae m far eastern Russia / A V Martynova, V В Turkutyukov, Y E Scunchina, A A Scheparyov, E V Slabenko // Clinical Microbiology and Infection - 2005 -Vol 11, Suppl 2 - P 663

9 Martynova A V Epidemiological aspects of hospital-acquired pneumonia in intensive care units m the far east of Russia / A V Martynova, E V Slabenko, VB Turkutyukov // Clinical Microbiology and Infection-2005 -Vol 11, Suppl 2 -P 677

10 Мартынова А В Анализ заболеваемости взрослого населения г Владивостока и Приморского края в 2002-2003 гг / А В Мартынова, Ю Е Скурихина, А А Шепарев, С Н Чуриков // Вестник РГМУ -2005 -Т 42, № 5 -С 149

11 Мартынова А В. Аспекты диагностики устойчивости к фторхи-нолонам штаммов S pneumoniae, выделенных в 2002—2003 гт / А В Мартынова, В Б Туркутюков // Клиническая лабораторная диагностика -2004 -№9 - С 34

12 Лучанинов Э В Эпидемиологическая оценка заболеваемости внебольничных пневмоний молодых людей в условиях закрытого коллектива / Э В Лучанинов, А М Балябин, А В Мартынова // Бюллетень национального НИИ общественного здоровья -2005 -Вест 7 -с 129

13 Turkutjukov V В Peculiarities of community-acquired pneumonia course, caused by multiresistant strains of S pneumoniae / V В Turkutjukov, V A Nevzorova, I M Martynenko, A V Martynova // Eur Respir J - 2006 - Vol 28, Suppl 50 -P 165

14 Hathaway L J Use of the Agilent 2100 Bioanalyzer for Rapid and Reproducible Molecular Typing of Streptococcus pneumoniae / L J Hathaway, S Brugger, A V Martynova, S Aebi, К Muhlemann // Journal of Clinical Microbiology - 2007 - Vol 45, №3 -P 803-809

15 Мартынова А В Оценка эпидемиологическои значимости инва-зивных форм пневмококковых инфекций / А В Мартынова // Казанский медицинский журнал -2007 - Т 88, № 3 -С 294-29 5

16 Мартынова А В Молекулярно-эпидемиологический мониторинг неинвазивных штаммов Spneumoniae / AB Мартынова, В Б Туркутюков // Вестник новых медицинских технологий -2007 Т 14, №2 -С 143

17 Мартынова А В Эпидемиологический анализ заболеваемости инвазивными и неинвазивными формами пневмококковых инфекций в различных группах населения / А В Мартынова, В Б Туркупоков // Вестник Российской АМН — 2007 - № 9 - С 12-16

18 Мартынова А В Особенности молекулярно-эпидемиологической диагностики неинвазивных штаммов Spneumoniae / А В Мартынова, В Б Туркутюков // Российская оториноларингология -2007 -№3 -С 88-90

19 Martynova А V Serotype distribution and antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae causing invasive and o .her infection in the Far East of Russia (Vladivostok) / A V Martynova, VВ Turcutiyucov, IV Strizhak, NM Kondrashova // Proceeding of the 1st FEMS Congress of European Microbiologists Ljubljana,(Slovenia)June 29 - July 3, 2003 -Ljubljana, 2003 - P 6-9

20 Martynova A V Pattern of resistance to erythromycin m Streptococcus pneumoniae isolates gained at the Far Eastern isolates of Russia (Vladivostok, Russia) / A Martynova, V Turcutyiukov // Proceedings of the 23rd International Congress of Chemotherapy (Duiban, South Africa July 7-9, 2003)-Durban, 2003 -P 193

21 Martynova A V Antimicrobial agents resistance of Streptococcus pneumoniae at the far East of Russia results of investigation / A V Martynova, V В Turcutiycov, I V Strrzhak, В G Andryukov // Program and Abstarct Book ISAAR 2003 - Seoul, South Korea -P 14

22 Martynova A V Antibiotic Resistance and Serotype Composition of Carnage and Invasive Isolates of Streptococcus Pneumoniae among Young Adults at the Far East of Russ / A V Martynova, V В Turcutiycov // General ASM 103d Meeting Abstract Book - Waslungthon, the USA- P 106-107

23 Martynova A V Serotype distribution m Streptococcus Pneumoniae strains, gamed at the Far East of Russia / A V Martynova, V В Turcutiycov // Abstract Book of Society for General Microbiology -11 April 2003,152nd Meeting - University of Edinburgh, the UK - P 7

24 Martynova A V Moleculai Epidemiology of Erythiomycm-resistant Isolates of Streptococcus pneumoniae from Young Adults at the Far East of Russia / A V Martynova // International Journal of Infectious Diseases - 2004 - Vol 8, Suppl 1-P97

25 Мартынова А В Клиническое течение внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста / А В Мартынова // Сборник тезисов 4 Съезд врачей-инфекционистов, 29-31 октября Санкт-Петербург - СПб, 2004 - С 422

26 Martynova А V Molecular aspects of Macrolide-Resistance in Streptococcus pneumoniae isolated at the Far East of Russia / A V Martynova // The Proceedings of the 4th International Symposia of Pneumococcal Diseases, 9-16 May,2004 -Helsinki, Finland, 2004 - P 131

27 Martynova A V Epidemiology Analysis of Enterococci Species and its Impact in Hospital Antibiotic Resistance / A V Martynova, IV Strizhak, V В Turcutyuicov, В G Andryuko^, E V Slabenko // «JRME NIIGATA'04» The Proceedings of the Eleventh International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange -Nugata, Japan, 2004 -P 462

28 Martynova A V Clinical Aspects of Pneumococcal infection in immunocompromised patients / A V Martynova, V В Turcutyuicov // «JRME NIIGATA'04» The Proceedings of the Eleventh International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange Nugata, Japan, 2004 -P 417

29 Martynova A V Fluoroquinolones resistance of Streptococcus pneumoniae isolates gained at the Far East of Russia / A V Martynova, V В Turcutyuicov // Proceedings of the- Tenth International Congress for Culture Collections and Innovative Roles of Biological Resource Centers 10-15 October 2004/ed Makoto Watanabe -Tsukuba,2004 -P 657

30 Martynova A V Genomic analysis of diversity of macrolide resistant genes m Streptococcus pneumoniae isolates at the Far East of Russia / A V Martynova, V В Turcutyuicov // Proceedings of the Tenth International Congress for Culture Collections and Innovative Roles of Biological Resource Centers 10-15 October 2004/ed Makoto Watanabe -Tsukuba,2004 -P 658

31 Martynova A V Esidemiology of antibiotic-resistant strains of Streptococcus pneumomae in the Fai East of Russia / A V Martynova, V В Turcutyuicov // International Journal of Antimicrobial Agents -2004 -Vol 23, №2 -P 641643

32 Мартынова А В Факторы патогенности штаммов пневмококков различных серотипов, выделгнные у лиц молодого возраста закрытых коллективов /А В Мартынова, В Б Туркутюков // Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиолоигя- 21 век» (Саратов, 28-30 сент, 2004)-Саратов, 2004 -С 149-151

33 Мартынова А В Генотипирование эритромицин-резистентных штаммов пневмококка, выделенных от больных внебольничными пневмониями / А В Мартынова, В Б Туркутюков // Труды научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, им-мунно- и экстренная профилактика актуальных инфекций», Санкт-Петербург, 2004 -СПб,2004 - С 246-247

34 Martynova А V Epidemiology of Fluoroquionolone-Resistant Isolates of Streptococcus pneumoniae Gained at the Far East of Russia /А V Mar-

tyiiova // Program and Abstract Book of the 44,hICAAC Conference, Washington -Washington( the USA),2004-P 1728

35 MartynovaAV Opthochme -resistant strains of Spneumoniae gamed at the Far of Russia / A V Martynova // The Proceedings of the 2nd International Symposium Resistant Gram-Positive Infections, Berlin - 12 Dec 2004 -Berlin, 2004-P 248

36 Мартынова А В Анализ макролидрезистентности штаммов пневмококка, выделенных в закрытых коллективах / А В Мартынова // Инфекционная патология в Приморском крае тезисы докл 4-й науч-практ конф -Владивосток,2004 - С 14

37 MartynovaAV Fluoroqumoloneresistance of Spneumoniae at the Far East of Russia in 2003-2004 years / A V Martynova, A A Shepaiyov, Yu E Skurihma, V В Turkutyukov // Abstract Book of the 24th ICC m Manila (Phillip-pms), June 2005 -Manila, 2005 -P 225-226

38 Мартынова А В Серотиповая характеристика и выраженность факторов патогенности у штаммов пневмококков, возбудителей внеболь-ничных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах / А В Мартынова, В Б Туркутюков // Тихоокеанский медицинский журнал -Владивосток-2004 - №3 - С 49-51

39 Martynova А V Emergence of antimicrobial resistance at the Eastern part of Russia / A V Martynova // Program and Abstract Book, Europneumo 2005, 7th European Meeting on the Molecular Biology of Pneumococcus, Braunschweig, Germany 9-16 May,2005 -Braunschweig, 2005 -P 40

40 Martynova A V Epidemiology of community-acquired pneumoniae caused by Streptococcus pneumoniae / A V Martynova, V В Turkutjukov, Ju E Skurihma, A A Sheparjov // The Proceedmgs of the 5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases -Alice Springs (Australia), 2006 -P 192

41 Martynova A V Evaluation of co-rnorbidity on the incidence of pneumococcal infection m the Far East of Russia / A V Martynova, V В Turkutjukov, Ju E Skurihma, A A Sheparjov // The Proceedings of the 5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases -Alice Springs (Australia), 2006 - P 180

42 Martynova A V Antimicrobial Susceptibility of Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis and Streptococcus pneumoniae Isolates Causing Meningitis at the Far East of Russia in 2003-2004 / A V Martynova // The Proceedings of the ISPN, 10-15 September Cairns (Australia) - Cairns,2006 - P 42

43 Мартынова А В Эпидемиологические аспекты заболеваемости внебольничными пневмониями лиц молодого возраста в закрытых коллективах/А В Мартынова // Тихоокеанский медицинский журнал - 2006 - №3 -С 73-76

44 Мартынова А В Анализ эпидемиологических особенностей пневмококковой инфекции у больных с коморбидным фоном / А В Мартынова //Здоровье населения и среда обитания ЗНиСО - 2007 -Т 168, №3 - С 15

45 Мартынова А В Оценка роли сопутствующей заболеваемости при пневмококковых инфекциях / А В Мартынова // Дальневосточный журнал инф патол -2007 -№10-С 79-83

Подписано в печать 8 02 08 Формат 60x84 '/|ь

Объем 2 п.л_Тираж юо экз_Заказ № 116__

Типография ВМедА, 194044, СПб , ул Академика Лебедева, 6

Актуальность: несмотря на длительное изучение, пневмококковая инфекция до сих пор остается одной из наиболее актуальных проблем внутренних болезней, являясь причиной не только отитов и синуситов, но и таких тяжелых заболеваний как пневмония, бронхит, менингит и бактериемия. Заболеваемость в Европе до сих пор составляет 16-20 человек на 100 тысяч населения, в США - пневмококковая инфекция ежегодно вызывает 5 млн. отитов, 20 тыс. случаев менингитов и бактериемий. По данным российских исследований ПеГАС-1 (фаза «А» и фаза «В» проводились НИИ антимикробной химиотерапии и Научно-методическим центром по мониторингу антибиотикорезистентности), заболеваемость пневмококковыми инфекциями колеблется от 5-6 до 16-20 случаев на 100 тысяч населения, встречаясь практически во всех социальных группах населения [38,40].

Особенную тревогу вызывает увеличение среди населения инвазив-ных форм пневмококковой инфекции, таких как менингит и бактериемия, практически во всех возрастных группах. Это во многом связано с увеличением в структуре населения удельного веса больных с такими сопутствующими заболеваниями (ко-морбидностью) в анамнезе как туберкулез, гематологическая или онкологическая патология, ВИЧ и т.п., приводящей к выраженному снижению иммунного статуса. Однако, до настоящего времени отсутствуют достоверные результаты эпидемиологических исследований пневмококковых инфекций в различных группах населения с учетом сопутствующих заболеваний в анамнезе (ко-морбидности), несмотря на то, что предложенные в настоящее время эпидемиологические методики с вычислением интегративного показателя, в частности, индексов ко-морбидности [М.Е. Charleson, 1989; М. Liu, 1993; Н. Johns, 1996] позволяют оценить выживаемость (удельный вес выживших в группах пациентов с различными сопутствующими заболеваниями).

Кроме того, практически не исследуются региональные особенности серотипового состава популяции штаммов пневмококков; уровень устойчивости к антибактериальным химиопрепратам штаммов, выделенных у больных с различной ко-морбидностью, условия и характер циркуляции, а также генотипические и фенотипические особенности штаммов Streptococcus pneumoniae, что определило бы эпидемиологическую значимость пневмококковых инфекций.

Отсутствие достоверных данных по этим аспектам снижает возможности рациональной коррекции эмпирической антибактериальной химиотерапии и назначения антибиотиков с учетом индивидуальных особенностей пациента в каждом конкретном регионе, что ведет к необоснованным экономическим потерям.

Во многом сложность изучения эпидемиологии пневмококковых инфекций обусловлена несовершенством применяемых в настоящее время в России классических методов диагностики и серотипирования [38]. Предложенные методы молекулярно-генетической диагностики, такие как пульс-электрофорез (PFGE), полимеразная цепная реакция (ПЦР) повторяющихся ВОХ-последовательностей (BOX-PCR), случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD), при потенциально высокой, по сравнению с классическим культуральным методом, разрешающей способности, не могут одновременно обеспечить задач микробиологической диагностики и эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями и требуют последовательного применения, что не всегда доступно и экономически обоснованно [Р.С. Козлов, 2004; P.W.M.Hermans et al., 1995].

Достаточно популярным методом в молекулярной эпидемиологии является метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) геномной ДНК с использованием различных гибридизационных зондов. RFLP обладает высокой воспроизводимостью и дискриминирующей способностью, однако требует подращивания материала, сама процедура длительна, требует сложного оснащения и высокой квалификации персонала. Кроме того, в случае диагностики пневмококковой инфекции отсутствует однозначное мнение не только по поводу характера гибридизацион-ных зондов, но и по поводу достаточно информативного видо-, а тем более и штаммоспецифического молекулярного маркера. Это обусловлено пластичностью генома S.pneumoniae, позволяющей ему осуществлять как внутри-, так и межвидовые взаимодействия в микробной ассоциации, что ведет к трудностям микробиологической диагностики данной инфекции. Вследствие этого значительно осложняются проведение эпидемиологического надзора данной инфекции и рациональная организация противоэпидемических мероприятий.

Все выше сказанное объективно обосновывает необходимость дальнейшего совершенствования, а также поиска и разработки новых экспресс-методов диагностики и мониторинга пневмококковой инфекции в различных группах населения, прежде всего с применением генетического маркирования штаммов для решения задач эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями, включая и проведение клинического микробиологического мониторинга.

Цель работы.

Изучить проявления эпидемического процесса при пневмококковых инфекциях для оптимизации профилактических и противоэпидемических мероприятий, повышения эффективности диагностики, а также рационализации региональных стандартов антимикробной химиотерапии на основании результатов исследования эпидемических и молекулярно-генетических характеристик штаммов S. pneumoniae.

Задачи исследования.

На основании поставленной цели были последовательно определены следующие задачи:

1) Провести ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости пневмококковыми инфекциями среди населения крупного субъекта Российской Федерации на примере Приморского края (1998-2005) на основе данных, полученных общепринятыми методами микробиологической диагностики S. pneumoniae.

2) Изучить роль факторов риска развития пневмококковых инфекций, оценить значение сопутствующих заболеваний в развитии пневмококковых инфекций при помощи современных эпидемиологических методик.

3) Провести клинико-микробиологический мониторинг пневмококковых инфекций с изучением особенностей формирования резистентности к антибиотикам штаммов S. pneumoniae, а также особенностей серотипового состава штаммов пневмококков, выделенных от больных с различными клиническими формами пневмококковых инфекций и от носителей.

4) Разработать метод выявления и дифференциации штаммов пневмококка на основе метода анализа полиморфизма длин концевых рестрикционных фрагментов некодируемого участка ДНК S. pneumoniae, провести апробацию метода, выявить его возможности и перспективы в клинической практике для диагностики пневмококковой инфекции, оценив его чувствительность и специфичность.

5) Изучить структуру популяции эпидемически опасных штаммов S. pneumoniae, оценить их эпидемиологическую роль с изучением генетических особенностей факторов вирулентности и механизмов резистентности к антибактериальным химиопрепаратам; при помощи предложенного варианта методики изучить клональное родство штаммов пневмококков, циркулирующих среди пациентов и носителей, с целью проведения эпидемиологического мониторинга.

Научная новизна и теоретическая значимость.

Проведено ретроспективное эпидемиологическое исследование заболеваемости инвазивными (пневмониями, менингитами, бактериемиями) и неинвазивными пневмококковыми инфекциями (отитами, синуситами) с учетом всех нозологических форм данной этиологии, отраженными в различных разделах МКБ-10.

Исследована заболеваемость пневмококковыми инфекциями с учетом наличия сопутствующих заболеваний с применением индекса ко-морбидности [Charleson ME et al., 1989] и их влияния на развитие инфекционного процесса при пневмококковых заболеваниях; определены факторы риска развития различных форм пневмококковых инфекций, а также оценен риск формирования носительства.

Впервые экспериментально обоснован метод молекулярно-генетической диагностики пневмококковой инфекции, основанный на принципе анализа концевого полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (TRFLP).

В качестве перспективного диагностического и молекулярно-эпидемиологического маркера штаммов S. pneumoniae изучен некодирующий участок ДНК SP1922 и SP1923, обозначенный как NCR (non-coding region). Охарактеризованы такие молекулярно-генетические особенности этого участка, как: фланкированность видоспецифичным геном (ген ply), приемлемый размер ампликона; а также наличие статистически значимой вариабельности рестрицируемых фрагментов.

Разработанный алгоритм применения метода анализа полиморфизма длин концевых рестрикционных фрагментов с предложенным праймером NCR позволил выделить 11 групп пневмококков, объединенных по результатам рестрикции NCR участка ДНК S. pneumoniae, что обеспечило позволяет проведение эпидемиологических исследований по выявлению источника инфекции и путей передачи.

Изучены молекулярно-биологические свойства штаммов пневмококка с оценкой вирулентности и устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, оценена возможность формирования и распространения эпидемических геновариантов S. pneumoniae. Оценено генетическое родство выделенных штаммов, изучены эволюционные изменения популяции штаммов пневмококка с учетом генотипа и фенотипа выделенных изолятов, приводящие к формированию эпидемического варианта.

Практическая значимость работы.

На основании ретроспективного эпидемиологического анализа пневмококковых инфекций с учетом всех нозологических форм пневмококковой инфекции, отраженной в МКБ-10, на примере субъекта Российской Федерации (Приморского края), установлены доминирующие нозологические формы инфекции; оценена тенденция заболеваемости пневмококковыми инфекциями; изучены факторы риска развития заболевания пневмококковыми инфекциями и носительства.

Так, в структуре инвазивных пневмококковых инфекций лидирующее место занимает пневмококковая пневмония. Среди всех неинвазивных пневмококковых инфекций чаще регистрируются острые синуситы (или обострения хронических синуситов), острые отиты с различными осложнениями. Выраженный подъем заболеваемости, как и при инвазивных формах инфекций, отмечается у детей до 14 лет и у лиц старше 55 лет.

Уровень носительства S. pneumoniae при наличии хронической патологии увеличивается в 3 раза у детей и в 5 раз - у взрослых, что является важным фактором риска в развитии инфекционного процесса любой локализации, т.е. как инвазивных, так и неинвазивных форм пневмококковых инфекций.

Полученные данные исследования эпидемиологических особенностей пневмококковых инфекций позволяют оценивать эффективность, прогнозировать и корригировать лечение больных с пневмококковыми инфекциями, в том числе и с различными сопутствующими заболеваниями.

Впервые был исследован серотиповой состав популяции пневмококков, выделенных при различных формах пневмококковых инфекций. Установлено, что в группе штаммов, вызвавших инвазивные формы инфекции, преобладают нетипируемые 20,5 % (61/298) и редкотипируемые 11,4% (34/298) изоляты. Это составляет больше половины исследуемой популяции, вызвавшей инвазивные формы инфекции. В группе штаммов, выделенных от носителей, также наблюдается преобладание нетипируемых и редкотипируемых штаммов -соответственно 20,4 % (17/83) и 15,6 % (13/83).

Вместе с тем, при анализе серотипового состава популяции полирезистентных штаммов пневмококка, вызвавших инвазивные формы пневмококковых инфекций, отмечается несколько случаев повторного выделения штаммов серотипов 6А, 9V, 14, 19F, 23F. В группе штаммов, вызвавших не-инвазивные случаи заболевания, были выделены штаммы серотипов 6А, 23F. У носителей так же были выделены штаммы 9V, 19F серотипов.

Оценен уровень устойчивости к антимикробным химиопрепаратам штаммов S. pneumoniae различных серотипов, выделенных у больных пневмококковыми инфекциями.

Среди штаммов S. pneumoniae, вызвавших различные нозологические формы пневмококковых инфекций, развивались сходные тенденции формирования антибиотикоустойчивости, характеризовавшиеся значительной долей штаммов, резистентных к препаратам группы макролидов и фторхи-нолонов, а также к тетрациклину, клиндамицину, триметопримсульфаметоксазолу, что требует коррекции стандартов проведения антибактериальной химиотерапии.

Создана региональная коллекция штаммов пневмококка, позволяющая проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг за пневмококковыми инфекциями.

Анализ генетической последовательности NCR фрагмента позволил применить данный участок ДНК пневмококка в качестве диагностической мишени для обнаружения S. pneumoniae.На основе метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов ДНК S. pneumoniae стало возможным организовать эпидемиологический надзор за пневмококковыми инфекциями. Применение этого метода для исследования различного лабораторного биологического материала, позволило выявить тенденцию идентифицируемых штаммов пневмококка к клонально-поликлональному распространению, что продемонстрировало важность изучения особенностей эпидемического геноварианта для организации эпидемиологического надзора.

Выявленные различия в фрагменте NCR позволили адаптировать метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов для диагностики пневмококковых инфекций на основе применения данного фрагмента, исключив ложноположительные/ложноотрицательные результаты, а также диагностировать ассоциацию нескольких штаммов пневмококка в одном клиническом образце.

Положения, выносимые на защиту.

1) В исследуемом субъекте Российской Федерации (Приморском крае) отмечен высокий уровень заболеваемости пневмококковыми инфекциями. В структуре заболеваемости инвазивных форм превалируют пневмококковые пневмонии, доминирующие у детей до 14 лет и у лиц старше 55 лет; при этом отмечается гиподиагностика менингитов пневмококковой этиологии. В структуре неинвазивных пневмококковых инфекций чаще встречаются синуситы и отиты, преобладающие в группе детей младше 14 лет и у взрослых старше 55 лет.

2) Основным фактором риска развития пневмококковых инфекций является наличие сопутствующих заболеваний, что увеличивает риск носительства S. pneumoniae. Выживаемость больных инвазивными пневмококковыми инфекциями с сопутствующей патологией, оцениваемой индексом ко-морбидности около «10», составляет 55,5%; а выживаемость больных с индексом более «18» — 42,3%.

3) Особенности формирования устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, и высокий удельный вес в серотиповом составе популяции выделенных штаммов пневмококка нетипируемых изолятов обусловливают необходимость проведения регулярного молекулярно-эпидемиологического мониторинга за циркуляцией штаммов S. pneumoniae.

4) Проведение генотипирования с использованием метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae позволяет выявить особенности распространения генетических детерминант устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам и детерминант основных факторов вирулентности в штаммах пневмококка, принадлежащих к одному генотипу, что дает возможность выявлять эпидемический геновариант.

5) Применение метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae позволяет решить проблему микробиологической диагностики штаммов пневмококка в разнообразном клиническом материале, диагностировать пневмококк как в монокультуре, так и в ассоциации, что обусловливает возможность рациональной организации диагностического процесса в интересах эпидемиологического надзора.

Внедрения в практическое здравоохранение.

Результаты исследования использованы при подготовке Государственного доклада «О состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2007 году»; а также при создании формуляров Центра фармако-технической информации и клинической фармакологии Департамента здравоохранения Приморского края и были внедрены в работу лечебно-профилактических учреждений края.

По материалам исследования были изданы Методические рекомендации «Метод анализа полиморфизма концевых фрагментов, полученных при рестрикции некодирующего участка ДНК в диагностике пневмококковых инфекций», утвержденные Президиумом СО РАМН «Дальневосточный научный центр» (27.06.2007). Опубликованы информационные письма, утвержденные Департаментом здравоохранения Приморского края: «Об эпидемиологических особенностях заболеваемости пневмококковыми инфекциями» (Владивосток, 2007); «Молекулярно-генетические особенности формирования резистентности при пневмококковых инфекциях» (Владивосток, 2007); «О молекулярно-эпидемиологических методах диагностики пневмококковой инфекции» (Владивосток, 2007), внедренные в работу лечебно-профилактических и медико-профилактических учреждений Дальневосточного Федерального округа.

Получены удостоверения на рационализаторские предложения: «Способ улучшения статистической отчетности по регистрации различных форм пневмококковых инфекций» (№ 2689, ВГМУ); «Способ анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов для диагностики пневмококковых инфекций» (№ 2688, ВГМУ); «Способ оценки роли сопутствующих заболеваний при пневмококковых инфекциях» (№ 2690, ВГМУ).

Материалы диссертации используются в учебном процессе при подготовке врачей на кафедре терапии ФПК; кафедре госпитальной терапии; кафедре микробиологии; кафедре эпидемиологии и военной эпидемиологии Владивостокского государственного медицинского университета; на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии Дальневосточного государственного медицинского университета; на кафедре микробиологии и вирусологии Амурской государственной медицинской академии; на кафедре эпидемиологии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко; на кафедре гигиены, эпидемиологии и организации госсан-эпидслужбы Ставропольской государственной медицинской академии; на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Дагестанской государственной медицинской академии.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 354 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами, 86 рисунками, 10 схемами. Список литературы содержит 422 литературного источника, из них 90 принадлежат отечественным и 332 зарубежным авторам.

ВЫВОДЫ

1. В исследуемом субъекте РФ, на примере Приморского края, регистрируется высокая заболеваемость пневмококковыми инфекциями: средний уровень которой за период с 1998 по 2005 составлял 6,13 ± 0,29 на 10 тысяч населения с достоверно выраженной тенденцией к повышению и средним темпом прироста 6,3 % в год. В структуре инвазивных пневмококковых инфекций чаще всего (78,8 %) регистрируется пневмококковая пневмония, среди неинвазивных пневмококковых инфекций преобладает острый синусит или обострение хронических синуситов — в 52,5 % случаев.

2. При различных формах пневмококковых инфекций особенностей факторов риска не выявлено, ведущими из них были курение (ОШ=4,45 при инвазивных формах и ОШ=1,69 при неинвазивных формах) и перенесенная пневмония в анамнезе (ОШ=5,98 при инвазивных формах и ОШ=6,83 при неинвазивных формах); получение антибактериальных химиопрепаратов в предыдущие 3 месяца (ОШ=2,11 при инвазивных формах и ОИ1=1,58 при неинвазивных формах). Наличие сопутствующей патологии и снижение иммунного статуса является ведущим фактором риска по развитию инвазивных форм пневмококковых инфекций (ОШ=14,4). Выживаемость больных с инвазивными пневмококковыми инфекциями, с сопутствующей патологией, оцениваемой индексом ко-морбидности около «10», составляет 55,5 %; а выживаемость больных с индексом «18» и более — 42,3%).

3. Клинико-микробиологический мониторинг позволил идентифицировать выделенную популяцию штаммов следующим образом.

Штаммы пневмококка, выделенные у больных с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковых инфекций, а также у носителей, характеризуются сходными тенденциями в формировании устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам. При этом, они обладают различным серотиповым составом. Установлен рост числа штаммов пневмококка, нечувствительных к тетрациклину, клиндамицину, ТМП-сульфаметоксазолу, макролидам и фторхинолонам. Популяция штаммов пневмококков, вызвавших инвазивные формы инфекции, представлена 6А, 9V, 19F, 23F серотипами. В группе штаммов, вызвавших неинвазивные случаи заболевания, доминируют 6А, 6В, 23F, а у носителей 9V, 19F серотипы S. pneumoniae, что подтверждает как взаимосвязь выделенной популяции, так и свидетельствует о наличии выраженных генотиповых различий.

4. Рост числа нетипируемых штаммов в структуре популяции штаммов S. pneumoniae, вызвавших различные формы пневмококковых инфекций, а также распространенность полирезистентных штаммов, позволяет обосновать актуальность применения новых молекулярно-эпидемиологических методов, наиболее перспективным из которых является метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов для проведения эпидемиологического надзора.

5. Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae является чувствительной и специфичной методикой, которая позволяет проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг в интересах эпидемиологического надзора и оценить распространение основных генетических детерминант по антибиотикорезистентности и наиболее значимым в патогенезе пневмококковых инфекций факторам вирулентности.

6. Некодирующий фрагмент (NCR) геномной ДНК S. pneumoniae является видоспецифичным участком и обладает свойствами, позволившими на его основе создать видоспецифичный и высокочувствительный маркер, на основе которого можно проводить генотипирование, дискриминирующая способность которого подтверждена данными мультилокусного сиквенстипирования, а также серотиповыми различиями и различиями в генотипах, выделенных методом пульс-электрофореза. Применение этого фрагмента позволяет решить проблему микробиологической диагностики штаммов пневмококка в разнообразном клиническом материале, диагностировать пневмококки как в монокультуре, так и в ассоциации, что дает возможность рациональной организации и повышения эффективности диагностического процесса.

7. Изучение структуры популяции эпидемически опасных штаммов пневмококка, выделенных при различных клинических формах методом анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК штаммов S. pneumoniae, обосновывает тот факт, что идентификация штаммов генотипов групп D и Н S. pneumoniae служит критерием эпидемического геноварианта, в связи с тем, что у них помимо маркеров конститутивной устойчивости чаще других штаммов выделяются генетические маркеры, кодирующие индуцибельную устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам. Формирование устойчивости штаммов S. pneumoniae к макролидам осуществляется путем активации mef- оперона, а именно, гена mefE (64,7 %). До 20,5 % исследуемых штаммов обладают коньюгативным транспозоном Тп1545, а 8,8 % штаммов обладают неконьюгативным транспозоном Тп917 (8,8%). Резистентность к фторхинолонам в исследованной популяции обусловлена как индуцибельной, так и конститутивной активацией генов к фторхинолонам: рагС(Л1 %), gyrA (23,5 %),pmrA (17,6 %).

8. Кроме того, несмотря на выявленный поликлональный характер распространения штаммов пневмококка, штаммы D и Н групп обладают способностью к клональному распространению, что дает возможность на их основе прогнозировать появление эпидемических геновариантов и проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг в рамках эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ЗДРАВООХРАНЕНИЕ

1. В связи с распространением нетипируемых штаммов пневмококков в интересах эпидемиологического надзора рекомендуется применять метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae. Сочетание данных генотипирования по NCR фрагменту с данными об антибиотикорезистентности позволяет прогнозировать появление эпидемических вариантов возбудителя.

2. Метод анализа 'полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae рекомендуется для диагностики монокультуры и ассоциации штаммов пневмококка в различных образцах клинического материала в эпидемической ситуации, когда выделение возбудителя классическим методом затруднено.

3. Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов позволяет выявлять распространение эпидемических геновариантов пневмококка, идентифицировать клональный или поликлональный характер распространения, что обеспечивает выбор противоэпидемических мероприятий в отношении пневмококковых инфекций. Для проведения предложенного варианта метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов ПЦР продукта NCR фрагмента при исследовании пневмококковых инфекций оптимальными являются рестриктазы - Alul, Ddel, Msel. Охарактеризован полиморфизм фрагментов, являющийся фактически уникальным для каждого штамма.

4. Для рационализации и повышения эффективности эмпирической антимикробной химиотерапии пневмококковых инфекций целесообразно использовать антибактериальные химиопрепараты ряда бета-лактамов, ограничив применение макролидов и фторхинолонов, что связано не только с распространением их полирезистентных изолятов практически во всех возрастных группах, но и с выработкой полирезистентности к этим трем препаратам.

5. С целью совершенствования системы регистрации заболеваемости пневмококковыми инфекциями назрела необходимость введения в отчетную форму 12 «Сведения о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения», данных об этиологической характеристике пневмоний и отитов.

6. При клиническом обследовании и ведении пациентов с различными формами пневмококковых инфекций необходимо оценивать у них роль сопутствующих заболеваний путем интегративной оценки и прогнозирования исхода основного заболевания с использованием коэффициента ко-морбидности Charleson М.Е. (1987).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на всестороннее изучение, пневмококковая инфекция до настоящего времени остается актуальной проблемой медицины, являясь причиной различных форм инфекционного процесса.

В Приморском крае и г. Владивостоке постоянно регистрируется высокий уровень заболеваемости, ведущим этиологическим агентом которой является S.pneumoniae. В г. Владивостоке постоянно отмечается заболеваемость пневмококковыми инфекциями, средний уровень которой за исследуемый период (1998-2005) составляет 6,13±0,29 [5,44-6,81] на 10 ООО населения, при этом минимальный уровень составляет 4,5 на 10 ООО населения, максимальный уровень заболеваемости составляет 6,6 на 10 000 населения. Наблюдается достоверно выраженная тенденция к повышению заболеваемости пневмококковыми инфекциями с темпом прироста 6,3% в год. Согласно литературным данным как российских, так и зарубежных специалистов, средний показатель заболеваемости пневмококковыми пневмониями с учетом данных о заболеваемости пневмониями, отитами и синуситами — заболеваниями, где пневмококк является ведущим этиологическим агентом — должен составить 32,73±1,58 %оо [28,98-36,48], отитами 12,13±0,54 %оо [10,84-13,42], синуситами 36,2±1,04 %оо [33,76-38,69], что подтверждает предположение о недостаточном качестве диагностики и наличии сложностей в организации эпидемиологического надзора в отношении пневмококковых инфекций.

Объективно существует проблема гиподиагностики заболеваемости, вызванной S.pneumoniae, что ведет к отсутствию регулярного учета заболеваемости, и отсутствию системы мер противоэпидемических мероприятий в отношении пневмококковой инфекции.

Изучив структуру заболеваемости пневмококковыми инфекциями методом ретроспективного анализа заболеваемости, мы обнаружили, что в структуре инвазивных пневмококковых инфекций, лидирующее место занимает пневмококковая пневмония (78,8%). При этом заболеваемость у детей до 14 лет составила 2,74 на 10 тысяч (инцидентный показатель по данным 2004 года) и у взрослых старше 55 лет заболеваемость пневмококковыми пневмониями состав 10,66 на 10 тысяч (инцидентный показатель по данным 2004). Пневмококковые бактериемии чаще всего регистрируются у детей младше 14 лет (2,23 на 10 тысяч), вместе с тем, они отмечаются и у взрослых (18-55 лет) — 0,29 на 10 тысяч, а также у лиц старше 55 лет— 0,42 на 10 тысяч. Заболеваемость пневмококковыми менингитами у детей составляет 0,11 на 10 тысяч, при том, что пневмококковые менингиты не были отмечены ни в какой другой возрастной группе. Сравнив полученные показатели с данными мировой литературы и опытом российских специалистов, можно утверждать, что полученные данные, в целом, отражая характерные особенности заболеваемости инвазивными формами пневмококковых инфекций в различных возрастных группах, иллюстрируют проблему гиподиагностики пневмококковых инфекций как в педиатрической службе, так и в здравоохранении, обслуживающем взрослое население, что также неизбежно осложняет организацию медико-профилактических мероприятий.

Основными факторами риска развития заболевания инвазивными формами пневмококковых инфекций является курение (ОШ=4,45), не менее важным является и учет информации о перенесенном остром отите (ОШ=8,4) и пневмонии (0111=5,9). Регулярное употребление алкоголя увеличивает вероятность развития инвазивных форм пневмококковых инфекций в 2,57 раз, наличие хронического тонзиллита в анамнезе — в 2,29 раз, неконтролируемого применения антибактериальных химиопрепаратов— в 2,11 раз. При этом сочетание 2-х факторов риска отмечалось у 136 (45,63%) пациентов, 3-х и более - у 82 (27,8%) пациентов. Кроме того, отмечена особая роль для развития пневмококковых инфекций наличия в анамнезе хронической патологии и снижения иммунного статуса: при наличии хронических сопутствующих заболеваний вероятность развития инвазивными пневмококковыми инфекциями увеличивается в 14,4 раз.

При анализе эпидемической ситуации по неинвазивным пневмококковым инфекциям, было установлено, что в структуре заболеваемости лидирует острый синусит — в 52,5% случаев был отмечен синусит (или обострения хронических синуситов) с различными осложнениями; в 47,5% — зарегистрирован острый отит. Несмотря на показанную нами проблему гиподиагностики также и неинвазивных форм пневмококковых инфекций (когда существующий показатель регистрируемых, к примеру, пневмококковых отитов у детей в десятки раз ниже регистрируемых показателей в других регионах России и зарубежом), в возрастной структуре заболеваемости можно отметить не только преобладание заболевших детей младше 14-ти лет, но и подъем заболеваемости в возрастной группе старше 55 лет, с дальнейшим формированием достаточно постоянного уровня заболеваемости в старших возрастных группах.

Наиболее актуальным фактором риска по развитию неинвазивных форм пневмококковых инфекций является наличие в анамнезе пневмонии (0111=6,83), что косвенно является доказательством в обоих случаях этиологической роли S.pneumoniae. Наличие хронической соматической патологии с нарушением иммунного статуса также является фактором риска по развитию неинвазивных форм пневмококковых инфекций (ОШ=5,45); также актуальны и указания на перенесенный острый отит (0111=1,6) и острый синусит (ОШ=2,3).

При оценке носительства штаммов S.pneumoniae в группах обследуемых без сопутствующих заболеваний и в группах обследуемых с сопутствующими заболеваниями, оказалось, что наличие сопутствующих заболеваний действительно влияет на возможность развития пневмококковой инфекции, причем в большей мере, чем возрастной фактор, что подтверждается результатами наших исследований. Так частота носительства S.pneumoniae у людей с сопутствующей заболеваемостью составляет 56,48±3,07% [47,4-65,56], тогда как у обследуемых любого возраста без сопутствующих заболеваний, частота носительства возбудителя составляет у взрослых 10,13±3,61% [3,4323,7], и 18,72±3,61% [7,04-30,4]. у детей При этом у взрослых с сопутствующими заболеваниями она в среднем составляет 51,9±6,17%[25,33-48,36], а у детей с сопутствующими заболеваниями - 52,75±6,77%[31,19-74,3]. Таким образом, уровень носительства при наличии хронической патологии увеличивается в 3 раза у детей, и в 5 раз - у взрослых. Это, несомненно, является важным фактором риска в развитии инфекционного процесса любой локализации, т.е. как инвазивных, так и неинвазивных форм пневмококковой инфекции, что подтверждается наличием подъема заболеваемости в группе носителей S.pneumoniae с наличием сопутствующих заболеваний (ко-морбидного фона) в анамнезе.

Несмотря на актуальность проблемы, до сих пор не рассматривались эпидемиологические особенности инфекционной патологии не рассматривались в связи с анамнезом больного и состоянием его иммунного статуса, что, являясь немаловажным критерием для оценки течения инфекционного процесса, не позволяло прогнозировать исход тех или иных форм пневмококковой инфекции. Применив для проспективной оценки заболеваемости метод Charleson ME (1987), мы провели прогностический анализ выживаемости больных инвазивными пневмококковыми инфекциями, согласно которому больные с сопутствующей патологией, оцениваемой индексом ко-морбидности около 10 имели выживаемость в случаев инвазивных пневмококковых инфекций 55,5%; а больные с индексом ко-морбидности 18 и более - 42,3%.

При анализе исследуемой популяции штаммов пневмококка, был обнаружен ряд особенностей развития процессов устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам в зависимости от формы инфекционного процесса, вызываемого данной инфекцией.

В популяции штаммов S.pneumoniae, вызвавших инвазивные формы пневмококковых инфекций, значительную часть составляют штаммы, нечувствительные к ТМП-сульфаметоксазолу (52,34%), к препаратам ряда тетрацикли-нов (58,04%), к клиндамицину (32,88%); к препаратам ряда макролидов — устойчивостью к эритромицину обладают 12,08% (при этом умеренно устойчиво всего 11,4%), к кларитромицину —14,09% (умеренно устойчиво 12,41%); к препаратам ряда фторхинолонов— к ципрофлоксацину устойчиво 12,75%, тогда как к левофлоксацину— всего 4,02% выделенной популяции. При этом, популяция штаммов, выделенных при инвазивных формах пневмококковых инфекций, обладает достаточно низкой устойчивостью к пенициллину: устойчиво всего 4,36%, а умеренно устойчиво — 7,04%.

В целом, полученные данные позволяют предположить, что в популяции штаммов S.pneumoniae, вызывающих инвазивные формы пневмококковых инфекций, развиваются процессы формирования устойчивости к препаратам ряда макролидов и фторхинолонов.

Среди штаммов пневмококка, выделенных от носителей, развиваются сходные процессы по формированию устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам. Так, при отсутствии пенициллинустойчивых штаммов, достаточно высок удельный вес штаммов, устойчивых к триметоприм-сульфаметоксазолу (22,89%), тетрациклину (12,04%), при этом, в популяции штаммов пневмококка, выделенных от носителей, также можно отметить развитие устойчивости к эритромицину (18,07%).

В популяции штаммов, вызвавших неинвазивные пневмококковые инфекции, устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам развивается в том же направлении, что и в популяции штаммов, вызвавших инвазивные формы инфекции. При низком содержании в изучаемой популяции штаммов, устойчивых к пенициллину (5%), отмечается высокий удельный вес штаммов, устойчивых к триметприм-сульфаметоксазолу (30%) ,тетрациклину (30%) и клиндамицину (22,5%), выражена устойчивость к эритромицину (17,5%), кларитромицину (20%); а также к препаратам ряда фторхинолонов — ципрофлоксацину (10%) и левофлоксацину (7,5%).

Несмотря на различное эпидемиологическое значение (инвазивная инфекция, неинвазивная, или носительство), отсутствуют различия в частоте выделения устойчивых и умеренно-устойчивых штаммов пневмококка в зависимости от клинического материала в популяции штаммов, выделенных от больных с инвазивными формами инфекций (12,08%), неинвазивными формами инфекций (17,5%) и от носителей (18,07%). Тем не менее, отмечаемые различия в чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам внутри группы штаммов S.pneumoniae, вызвавших инвазивные формы пневмококковых инфекций, могут быть объяснены сосуществованием в макроорганизме нескольких штаммов возбудителя с различным паттерном устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам. Это обеспечивает генотипические и фенотипические различия в антибактериальной чувствительности у этиологически значимых штаммов одного вида, выделенных из разных источников у больного с одной нозологической формой пневмококковой инфекции.

Частота выделения штаммов пневмококка, нечувствительных к антибактериальным химиопрепаратам, выделенных у носителей увеличивается в возрастной категории детей от 5 до 18 лет; у больных неинвазивными инфекциями - количество штаммов, устойчивых к эритромицину увеличивается с возрастом пациента: при 0% у детей до 5 лет, данный показатель увеличивается до 4,6% у детей в возрасте до 18 лет, достигая показателя 29,2% у взрослых; в популяции микроорганизмов, выделенных от больных инвазивными формами пневмококковых инфекций, стоит отметить, что особенностью здесь является увеличение количества таких изолятов в группе детей от 5 до 18 лет, и некоторое снижение таких штаммов в группе взрослых и в группе пациентов старше 65 лет.

Наиболее часто среди выделенных S.pneumoniae, вызывающих инвазивные формы инфекций, встречаются нетипируемые штаммы (22,81%). При этом, распределение штаммов различных серотипов внутри возрастных групп пациентов инвазивными формами пневмококковых инфекций также подтверждает полученный вывод о том, что среди штаммов пневмококка, вызывающих инвазивные заболевания, лидируют нетипируемые штаммы (у детей — 22,22%, у взрослых-16,9%, у пациентов старше 65 лет- 23,33%).

Рассматривая серотиповой состав штаммов S.pneumoniae, вызвавших неинвазивные формы заболеваний, можно отметить, что при значительной роли 6, 23 и 35 серотипов (8,75%, 7,5% и 7,5% соответственно), не представляется возможным выделить преобладание какого-либо серотипа. При анализе серотипового состава штаммов, выделенных у здоровых лиц, также можно отметить роль штаммов пневмококка 6 серотипа (13,25%), а также нетипируемых штаммов (20,73%).

Распределение штаммов S.pneumoniae в разных возрастных группах носителей также характеризуется значительной ролью редко встречающихся и нетипируемых штаммов, так у детей такие штаммы выделяются в 14,07% и 20,73% случаев. При обследовании взрослых и пациентов старше 65 лет установлено, что у них носительство обусловлено выделением 5 и 16 серотипов, при этом носительство нетипируемых штаммов остается не менее актуальным.

Частота выделения штаммов одной и той же серогруппы в популяции микроорганизмов, выделенных от носителей, коррелирует прямыми сильными достоверными связями. Данный факт подтверждает обусловленность развития у населения из разных возрастных групп различных форм пневмококковых инфекций носительством возбудителя, а также позволяет сделать предположение о циркуляции одного или нескольких штаммов пневмококка определенных серогрупп, связанных с развитием инвазивных или неинвазивных форм инфекционного процесса.

Таким образом, при исследовании популяции штаммов пневмококка, выделенной у больных инвазивными формами, неинвазивными формами пневмококковой инфекции, а также у носителей, оказалось, что при различной эпидемиологической значимости, к которой относится и возможность вызывать различные проявления эпидемического процесса, все три исследуемые группы характеризуются сходными тенденциями в формировании устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, обладая, при этом, различным серотиповым составом.

При проведении анализа устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам в популяциях штаммов S.pneumoniae, вызвавших различные клинические формы пневмококковой инфекции, было выяснено, что в целом, наблюдается тенденция к увеличению числа штаммов пневмококка, нечувствительных к препаратам ряда бета-лактамов, так к пенициллину нечувствительны 11,4% штаммов, выделенных от больных инвазивными формами инфекции, 8,75% штаммов, выделенных от больных с неинвазивными заболеваниями и 3,61% штаммов, выделенных от носителей. Также, отмечается снижение чувствительности к макролидам штаммов, вызвавших инвазивные формы инфекции, среди них нечувствительных к эритромицину было выделено 23,49%, среди штаммов, выделенных от больных с неинвазивными формами пневмококковых инфекций - 32,5%; а у носителей - 38,5%. Регистрируется также снижение чувствительности к фторхинолонам, среди инвазивных штаммов выделено 29,86% нечувствительных к ципрофлоксацину и 10,06% нечувствительных к левофлоксацину; а среди неинвазивных - 27,5% и 16,25% соответственно. Среди штаммов, выделенных от носителей отмечается схожая тенденция: 21,64% и 8,42%. При этом, следует отметить явление полирезистентности, связанное со снижением чувствительности к пенициллину отмечаемое, прежде всего, в отношении штаммов, нечувствительных к эритромицину и фторхинолонам, так из 128 эритромицинечувствительных штаммов, выделенных у больных неинвазивными, инвазивными формами инфекций и у носителей, 44 были нечувствительны к пенициллину, и 19 - к фторхинолонам.

Для характеристики предполагаемого эпидемического геноварианта S. pneumoniae был проведен мониторинг популяции полирезистентных штаммов пневмококка, выделенных в группах больных инвазивными формами инфекции, неинвазивными формами, а также - у носителей, методом анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов в предложенном нами варианте с рестрикцией NCR участка ДНК.

Изученные популяции штаммов S.pneumoniae не могут характеризоваться преобладанием штаммов какого-либо серотипа. Полученные данные подтверждают, с одной стороны взаимосвязь исследуемых популяций, однако дают минимальную информацию в плане эпидемиологического надзора. Штаммы S.pneumoniae одного и того же серотипа из групп, выделенных от больных инвазивными формами, неинвазивными и от носителей, различаются по устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам (включая и изменения МИК), обладают различным генотипом.

Методика анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов позволила выделить в исследуемой популяции 11 генотипов пневмококка, индивидуальность которых была подтверждена данными мультилокусного сиквенстипирования, а также серотиповыми различиями и различиями в генотипах, выделенных методом гель-электрофореза в пульсирующем поле.

Среди возбудителей пневмококковых инфекций, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными фомрами пневмококковых инфекций, а также от носителей, методом мультилокусного сиквенс-типирования, выявлено, что все штаммы, выделенные во всех трех популяциях, представляют собой родственные изоляты вида S.pneumoniae, большинство из которых обладают уникальным генотипом, определяющим наличие одного сиквенс-типа для каждого штамма. При этом, определено 6 кластерных групп, которые содержат штаммы, выделенные от разных больных, обладающие различными молекулярно - эпидемическими характеристиками (серотип, устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам), которые, являясь генетически близкородственными, вызвали различные проявления пневмококковой инфекции.

При количественном анализе генетических особенностей выделенных штаммов, популяция выделенных штаммов является достаточно вариабельной, так коэффициент генетического разнообразия составил 0,808 ±0,02. Наиболее вариабельными из всех изученных нами штаммов, выделенных от больных инвазивными формами, неинвазивными формами, а также у носителей, являются штаммы, выделенные от носителей коэффициент вариабельности по большинству локусов (gdh, gki, spi, xpt, ddl) составляет 1; за исключением локусов гесР (0,6667) и локуса агоЕ (0,6667). Коэффициент ассоциации с учетом всех исследованных локусов ДНК штаммов пневмококка, выделенных от носителей, также выше и составляет 0,904±0,06, что выше, чем в ДНК штаммов, выделенных от больных неинвазивными формами инфекций (0,802. ±0,03) и больных инвазивными формами инфекций (0,789±0,03), что подтверждает тот фаю1, что штаммы, вызвавшие инвазивные формы инфекций, обладают определенным фено- и генотипическим сходством, обусловившим их способность вызывать инвазивные формы пневмококковых инфекций. При этом, полирезистентность в изучаемых нами штаммах обусловлена интенсивно происходящими процессами горизонтального обмена генетической информацией, что подтверждается анализом результатов гибридизации. Анализируя уровень устойчивости к антибиотикам, можно сделать вывод о преобладании тех или иных механизмов устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам. В первую очередь, они были обусловлены определенными генетическими детерминантами, преобладающими в различных TRFLP-rpynnax и выделенных при анализе полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК пневмококка.

Таким образом, выявленные нами особенности гибридизации с праймерами к основным генетическим детерминантам устойчивости к антибиотикам, позволяют предположить, что существует преобладание определенных механизмов устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам в штаммах S. pneumoniae различных TRFLP-группах, что и было подтверждено нами результатами сиквенирования.

Из вышеприведенных данных следует, что ведущим механизмом выработки устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам ряда макролидов является активация mef- оперона, а именно, гена mefE (64,7%); до 20,5% исследуемых нами штаммов обладают коньюгативным транспозоном Тп1545, являющимся маркером устойчивости к макролидам и тетрациклину и способным только к горизонтальному переносу, причем следует отметить, что его могут содержать от 30 до 50% штаммов в отдельных TRFLP-группах (группа Н). Неконьюгативный транспозон Тп917 (8,8%) также является маркером перекрестной устойчивости к макролидам, и эпидемиологически в силу своей неконьюгативности, распространяется в популяции как горизонтально, так и клонально. Устойчивость к фторхинолонам, распространенная в отдельных TRFLP-типах, в целом обусловлена индуцибельной активацией генов устойчивости к фторхинолонам, что установлено у 23,88±11,91% штаммов. Исключение составляет преобладание (47%) в изучаемой популяции мутации в гене parC, вызывающей замену аденина на гуанин в 83 позиции, приводя к замене в топоизмомеразе 4 аспарагина на глицин.

Несмотря на значимость пневмококковой инфекции, эпидемическая ситуация в отношении данной инфекции обусловлена во многом объективной сложностью микробиологической диагностики S.pneumoniae, не позволяющей до настоящего времени создать так называемый «золотой» стандарт диагностики пневмококковой инфекции, а также проводить мониторинг пневмококковой инфекции. Для решения данной задач был применен метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S.pneumoniae, где в качестве диагностической мишени был использован некодирующий фрагмент (NCR) геномной ДНК S.pneumoniae, ранее не применявшийся в таком качестве.

Некодирующий фрагмент (NCR) геномной ДНК S.pneumoniae является видоспецифичным участком, и обладает свойствами, объясняющими его использование в качестве оптимальной диагностической мишени для диагностики пневмококка, в связи с техническими преимуществами выполнения полимеразной цепной реакции, которые не были достигнуты при использовании других участков генома S.pneumoniae, такие как локализация изучаемого фрагмента в непосредственной близости от гена, кодирующего видоспецифический фактор вирулентности пневмококка- пневмолизин; консервативность фланкирующих их участков (SP1922 (гипотетический протеин) и SP1923 (пневмолизин)); наиболее приемлемый размер (1182 bp) выбранного ампликона; амплификация вариабельного участка генома.

В связи с применением для создания праймера новой диагностической мишени была оптимизирована схема ПЦР реакции для оптимизации параметров ренатурации с целью увеличения выхода конечного ПЦР-продукта. В частности, мы пришли к выводу, что оптимальным числом циклов, обеспечивающих максимально возможный выход амплифицированного продукта, является 30; другие параметры не нуждались в оптимизации, и были проведены согласно общепринятым правилам.

В результате серии проведенных опытов с использованием предложенного нами варианта ПЦР реакции, праймер, созданный на основе последовательности NCR фрагмента, действительно оказался высокочувствительным и высокоспецифичным видовым маркером. Реакция была положительна как с контрольными, так и с референтными штаммами (R6, TIGR4), и она была отрицательна с близкородственными штаммами семейства стрептокококков, а также была отрицательна со штаммами, неродственными S.pneumoniae, но наиболее часто выделяемыми вместе с ним в составе ассоциаций микроорганизмов из клинических образцов.

Кроме того, чувствительность NCR фрагмента для диагностики S. pneumoniae не связана с серотиповой принадлежностью выделенного штамма. Проведенный количественный анализ ПЦР продукта показал отсутствие какой-либо взаимосвязи, и вне зависимости от серотипа средний размер амплифицированного фрагмента составлял 1268±6,57 bp [1254,997-1281,603].

Для проведения предложенного нами варианта метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК пневмококка были выбраны рестриктазы —Alul, Ddel, Msel- и охарактеризован полиморфизм фрагментов, являющийся фактически уникальным для каждого штамма.

Изучение характера полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов при примении данных рестриктаз позволило создать оптимальную схему и последовательность их применения в предложенном нами варианте метода для диагностики пневмококковой инфекции. Кроме того, были обнаружены характерные особенности полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов, свидетельствующие о возможности дифференцировать несколько штаммов пневмококка в одном клиническом образце.

При исследовании клинического образца, было выяснено, что максимальная вероятность идентификации монокультуры при рестрицировании ДНК только одной рестриктазой не превышает 69% {Alul), а максимальная вероятность выделения ассоциации при использовании одной рестриктазы не превышает 42% {Msel). Тем не менее, при применении последовательного рестрицирования по предложенной нами схеме, вероятность идентификации монокультуры возрастает до 95%, при этом «не идентифицированными» штаммами, то есть штаммами, входящими в состав ассоциаций штаммов пневмококка, для идентификации которых может потребоваться дополнительная рестрикция, являются только 5%.

Чувствительность и специфичность метода составили 98,98% и 97,09%, при этом ПЦПР (прогностическая ценность положительного результата) и ПЦОР (прогностическая ценность отрицательного результата) соответственно 97% и 99,01%. При применении метода для исследования различных клинических образцов было выяснено, что она фактически является 100%-ной, что в сравнении с чувствительностью и специфичностью применения рутинного бактериологического метода, позволяет считать предлагаемый нами вариант метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов ПЦР продукта NCR фрагмента более перспективным.

Разрешающая способность предлагаемого нами варианта метода достаточно высока 0,97 [0,96-0,98,ДИ 95%], при том, что разрешающая способность наиболее популярного метода эпидемиологического исследования - серотипирования - составляет всего 0,93 [0,92-0,94, ДИ 95%], пульс-электрофорез способен идентифицировать внутривидовые различия в 95% случаев (0,95 [0,96-0,97, ДИ95%]). Это подтверждает вывод о том, что разрешающая способность варианта метода анализа полиморфизма конечных рестрикционных фрагментов ПЦР продукта NCR фрагмента превышает разрешающую способность других методов, направленных на решение аналогичных задач, обладая при этом в лабораторных условиях идентифицировать 42 типа пневмококка из 100 штаммов с максимальным возможным пределом допустимых межтиповых различий 5%.

Таким образом, результаты, полученные при проведении метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S.pneumoniae TRFLP-группах, позволяют сделать вывод о существовании особенностей распространения генетических детерминант устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, а также развития механизмов, их обусловливающих; что подтверждает эпидемиологическую значимость проведенного нами исследования. Кроме того, полученные результаты выявили особенности распространения генетических детерминант в популяциях штаммов, вызвавших инвазивные и неинвазивные формы пневмококковых инфекций, а также выделенных от носителей, что было подтверждено выявлением коньюгативных и неконьюгативных транспозонов и что доказало возможность распространения в определенных TRFLP-группах полирезистентных штаммов пневмококка, что может привести к формированию эпидемического варианта.

Представленные результаты подтверждают эпидемиологическую значимость TRFLP-типирования как метода, позволяющего оценить вирулентность исследуемых штаммов: штаммы TRFLP-групп (C,F,I,K) имеют уникальный паттерн геновариантов исследованных нами факторов вирулентности; группы А, В, Е, Н, J обладают геновариабельностью в пределах двух аллелей (за исключением генов ply и lytA в группах Н и А соответственно), что также может иметь как эпидемиологическое, так и микробиологическое значение. Изучение генетических взаимосвязей между штаммами, выделенными в различном клиническом материале, позволило выявить, что несмотря на то, что в целом, характер распространения пневмококка в популяции носит поликлональный характер, штаммы определенных TRFLP-групп, как например, групп D и Н, обладают способностью к клонально-поликлональному распространению, а в некоторых случаях (как было обнаружено на примере исследования крови и ликвора), и к клональному распространению. Это позволяет говорить об особой роли штаммов данных групп и позволяет считать их эпидемическими геновариантами.

На основании вышесказанного можно сделать вывод, что TRFLP-типирование, проведенное с применением метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S.pneumoniae, является эффективным методом. Он позволяет оценить распространение основных генетических детерминант не только антибиотикорезистентности, но и наиболее значимых в патогенезе пневмококковой инфекции факторов вирулентности, определяющих развитие различных форм пневмококковых инфекций, анализ эпидемических особенностей которых позволяет обосновать проведение противоэпидемических мероприятий при пневмококковых инфекциях.

Кроме того, применение метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S.pneumoniae позволяет решить проблему микробиологической диагностики штаммов пневмококка в разнообразном клиническом материале, диагностировать пневмококки, как в монокультуре, так и в ассоциации, что обусловливает возможность рациональной организации диагностического процесса, и определяет адекватную диагностику инвазивных и неинвазивных форм пневмококковых инфекций. Из вышесказанного следует, что принципиальная схема эпидемиологического надзора за пневмококковой инфекцией должна включать элементы как молекулярно-эпидемиологического мониторинга, так и эпидемиологических исследований за пневмококковой инфекцией.

Таким образом, метод анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S.pneumoniae служит адекватной современной методикой при организации и проведении противоэпидемических мероприятий при пневмококковой инфекции. Это дает возможность не только ретроспективно изучать эпидемические свойства возбудителя пневмококковых инфекций, S.pneumoniae, но и возможность прогнозировать появление эпидемических вариантов на основе изучения фазовых генетических изменений.