Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Разработка новых методов ИФА для диагностики пневмококковой инфекции

На правах рукописи

ш

ПУГ

НИНА ЛЕОНИДОВНА

РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ ИФА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

14.00.Зб*Аллерголопш и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация

Защита состоится 17 апреля 1997 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.38.01. при НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской Академии медицинских наук по адресу: 103064, г.Москва, Малый Казенный пер.,5а.

Автореферат разослан 17 марта 1997г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сыворото» им.И.И.Мечникова РАМН.

- доктор медицинских наук Л.Н.Падюков

- доктор медицинских наук, профессор Л.И.Краснопрошина

- доктор медицинских наук, профессор Б.В.Пинегин

- НИИ физико-химической медицины

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В последние десятилетия значение пневмококка, как этиологического фактора ряда распространенных заболеваний недооценивается российским здравоохранением.

Благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей установлено, что несмотря на большое значение некоторых других бактерий, именно пневмококк является ведущим возбудителем бактериальных инфекционных заболеваний ортанов дыхания. По данным различных исследователей от 40 до 90% острых пневмоний. 40-60% отитов и до 30% менингитов вызывается пневмококом (Вишнякова Л.А., 1984, Катосова Л.К., 1990, Уланова М.А., 1992). Следует отметить, что эти заболевания часто приводят к тяжелым осложнениям и даже гибели больных. Острой проблемой становится развитие пневмококковой инфекции у больных с иммунодефицитными состояниями. Чаще всего именно пневмония приводит к гибели больных после иммуносупрессии, связанной с трансплантацией органов. Антибиотикоустойчивосгь, прежде всего устойчивость к пенициллину, некоторых штаммов пневмококка создает дополнительную опасность при распространении пневмококковой инфекции (Уланова М.А., 1992). Последние эпидемиологические исследования показали, что в ряде случаев % пеницнллинрезистентных штаммов пневмококка достигает 60%.

В связи с этим, актуальной является разработка адекватных ' методов специфической этиологической диагностики при бактериальных респираторных заболеваниях, направленных на своевременное и надежное выявление этиологии инфекции с целью проведения соответствующей терапии.

Вместе с тем, существуют определенные трудности при лабораторной диагностике пневмококковой инфекции. При бактериологическом анализе из-за особенностей идентификации пневмококка не всегда удается выявить его как этиологический -агент. Раннее применение антибиотиков существенно снижает эффективность бактериологического исследования. Поэтому особенно перспективно использовать методы иммунохи-

мической диагностики пневмококковой инфекции, позволяющие определять антитела к пневмококку, как результат развития инфекции. Для разработки препаратов для диагностики пневмококковой инфекции необходима определить, какие из бактериальных антигенов играют ведущую роль в ходе патологического процесса. В многочисленных исследованиях, посвященных этому вопросу, ранее было показано, что капсульные полисахариды пневмококка играют основную роль в стимуляции иммунного ответа и создании иммунитета к пневмококку гомологичного серотипа. В настоящее время выявлено 90 серотипов пневмококка. Несмотря на то, что некоторые из этих серотипов дают перекрестные реакции, процесс выявления пневмококка по этому признаку является сложным и требует нескольких типов, антисывороток. Выявление антител к капсульным полисахаридам затруднено по сходным причинам.

Вместе с тем, у пневмококка имеются белковые компоненты, участвующие в стимуляции выработки антител. Однако, в отличие от полисахаридных, белковые антигены пневмококка изучены недостаточно. Исследование этих антигенов позволило бы решить вопрос о возможности выявления антител к некапсульным формам пневмококка и идентификации пневмококка независимо от серотипа.

Острая пневмония, бронхит, отит являются полиэтиологическими заболеваниями, где наряду с пневмококком большую роль играют некапсульные формы Н.influenzae, B.catarrhalis (Колмогорова О.В., 1996). Однако, до сих пор не описано простого метода одновременного определения антител к этим возбудителям. Вместе с тем, применение принципа ИФА в сочетании с использованием иитроцеллюлозной мембраны в качестве носителя (иммуноблот, дот-блот) позволяет конструктировать простой и надежный препарат для серологической диагностики.

В связи с этим ЦЕЛЬЮ настоящего исследования явилось изучение состава и свойств некапсульных антигенов пневмококка и создание на их основе иммунофермент-ных систем, позволяющих осуществить иммунохимическую диагностику инфекции, вызываемой этим микроорганизмом.

Для выполнения поставленной цели нами были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Выделение и сравнительная иммунохимическая характеристика антигенных препаратов из различных штаммов S.pneumoniae.

2. Отработка условий проведения ИФА для определения антител к белковым антигенам пневмококка с использованием полистироловых Планшетов.

3. Создание системы ИФА на основе дот-блота.

4. Сравнительный анализ активности реакции сывороток больных и здоровых . людей с помощью разработанных систем.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведения исследований впервые дана сравнительная характеристика белковых антигенных препаратов, выделенных из различных штаммов пневмококка. Показано, что наиболее выражен антительный ответ у больных к белкам с молекулярной массой 50, 80 и 94 kD. Впервые показано, что антитела к трем различным возбудителям бактериальной респираторной инфекции -. S.pneumoniae, H.influenzae и B.catarrhalis, можно определить одновременно методом дот-блот.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Штаммы S.pneumoniae неоднородны по своему белковому антигенному составу. Наиболее выражена реакция у больных с пневмококковой инфекцией на белки с молекулярной массой 50,80 и 94 lcD,

2. Для более эффективного приготовления диагностической иммуноферментной системы для определения антител к S.pneumoniae необходимо проводить экстракцию антигенов с использованием ингибиторов протеаз, а в качестве индикатора применять ОФД.

3. ИФА на основе дот-блота может быть использован для скрининга антител к пневмококку вместо традиционного ИФА, как более простой и не менее чувствительный метод.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработана простая методика разрушения бактериальных клеток S.pneumoniae, позволяющая получить препараты для скрининга штаммов на наличие антигенов. Оптимизирована иммуноферментная система для определения антител к S.pneumoniae на основе его белковых антигенов. Система применяется в практическом здравоохранении РФ. Разработана новая диагностическая система на основе точечного иммуноферментного анализа (дот-блот) для одновременного определения антител к S.pneumoniae, H.influenzae и B.catarrhalis в сыворотке крови пациентов с респираторной инфекцией.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Отдельные фрагменты диссертационной работы были изложены на конференции " Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций" (Оболенск, 1990), XV международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Стокгольм, 1994), конференциях молодых ученых НИИВС им.И.И.Мечникова (Москва 1989, 1990). Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунохимической диагностики НИИ ВС им.И.И.Мечникова РАМН (31.10.1996).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертаця состоит из введения, обзора литературы (I глава), главы "Материалы и методы" и собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 110 страниц машинописного текста, 10 таблиц и 14 рисунков. Список литературы содержит 150 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы физико-химические, иммунохимические, серологические, статистические методы.

Для получения препаратов антигенов были использованы: эталонные штаммы З.рпеитошае, дифференцированные по К-антигенам из коллекции лаборатории микробиологии условно-патогенных бактерий НИИ ВС им. ИИ Мечникова, штамм 11/99 Н.шПиепгае (клинический изолят от больного пневмонией), штамм 36321 В. са1аггНаНз из коллекции ГИСК им.Тарасевича.

Для иммунохимических исследований применяли коммерческие антисыворотки кроличьи к шести известным серотипам Э-рпеитошае (Б^Гсо, США), кроличьи антисыворотки к препарату диагностически значимых антигенов пневмококка штамма 11/56, полученные в ходе выполнения настоящего исследования, антисыворотки мышиные к препарату дезинтеграта гемофильной палочки, антисыворотки мышиные к препарату дезннтеграта В.саШггЬаПя, а также сыворотки взрослых с респираторными заболеваниями и заболеваниями не респираторного характера, сыворотки детей с респираторными заболеваниями, сыворотки доноров.

Препараты антигенов НлпПиепгае и В.са1аггЬа1Ь, были получены сходным образом с помощью ультразвукового разрушения (Колмогорова О.В., 1996). Препараты антигенов Б.рпеитогиае получали с помощью экстракции цетавлоном и методом замораживания-оттаивания.

В полученных препаратах определяли содержание белка по методу Лоури (1951) и методу Бредфорд (1960), нуклеиновых кислот по методу Спирина (1958), углеводов по методу Дюбуа (1984).

Иммунохимическую активность антигенных препаратов определяли с помощью методов двойной иммунодиффузии по Оухтерлони, методом твердофазного иммуно-ферментного анализа и методом иммуноблотинга.

При разработке иммуноферментных систем был использован твердофазный непрямой вариант ИФА с применением полистироловых планшетов и точечный вариант ИФА (дот-блот) с применением нитроцеллюлозной мембраны в качестве твердой фазы. В качестве коньюгата применяли антитела против иммуноглобулинов в человека, меченные Пероксидазой. Субстратом для пероксидазы служила перекись водорода, а индикатором ферментативной реакции - ортофенилендиамин.

Результаты дот-блота были представлены в соответствии с условной шкалой, а результаты ИФА с применением полистироловых планшетов были представлены как в условных единицах, так и в виде величины оптической плотности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В ходе выполнения работы были выделены препараты белковых антигенов из нескольких штаммов пневмококка, и на их основе отработаны оптимальные условия проведения ИФА для определения антител к Б.рпеитошае с использованием полистироловых планшетов а также разработана новая система ИФА на основе дот-блота для определения антител к Б.рпеитошае, Н.тПиепгае и В.са1агг|1аНз.

1. Выделение и сравнительная иммунохимическая характеристика антигенных препаратов из различных штаммов З.рпеитошае.

Для изучения антигенного состава нами было использовано более 80 штаммов Б.рпештюгнае. Одним из первых этапов а процедуре выделения АГ из микроорганизма является воздействие на его структуру с целью разрушения или частичной экстракции. Метод выделения белковых антигенов пневмококка: разработанный нами ранее был положен в основу раздела по выделению и анализу некапсульных антигенов пневмококка. Данный метод заключается в экстракции белков (+) заряженным детергентом - це-тавлоном. При действии этого агента происходит солюбилизация белковых структур: тогда как (-) заряженные капсульные полисахариды и нуклеиновые кислоты агрегируют и выпадают в осадок. Дальнейшее разделение экстракта методом гель-фильтрации позволяет освободиться от примеси гейхоевых кислот, и частично - от самого детергента.

Рис. I Графики элвдии при гель-фильтрация экстрактов различных штаммов пневмококка. По оси аОцисс - порядковый номер фракций; по оси ординат - оптическая плотность при длине волны 280 нм. А - 11/56, В - 35 /57, с - 74/64

Препараты, полученные таким методом были получены как препараты сравнения трех штаммов пневмококка: 11/56,35/57 и 74/64. В результате последующего разделения экстрактов методом гель-фильтрации нами было получено 9 препаратов, которые содержали высокомолекулярные и низкомолекулятрые фракции. Графики элюции после проведения гель-фильтрации представлены на рис.1.

Для оценки результатов экстракции нами сначала был использован анализ на наличие белков, углеводов и нуклеиновых кислот, который показал, что препараты из низкомолекулярных фракций пневмококка (III 11/56, II 35/57, III 74/64, IV 74/64) содержат наибольшее количество белка, небольшое количество углеводов и практически не содержит нуклеиновых кислот. Эти данные позволили нам рассматривать указанные образцы как белковые препараты пневмококка. Эти же препараты имели высокую ак тивность в РДД с антисывороткой к препарату диагностически значимых белковы; антигенов пневмококка, причем характер полос преципитации свидетельствовал о го мологичности их состава и наличии в них идентичных, либо сходных антигенных ком понентов.

Иммуноферментный анализ позволяет с более высокой чувствительностью, че! РДД определять антитела. Поэтому дополнительный анализ антигенов был проведен помощью ИФА. Наибольшей активностью в реакции с положительной контрольно сывороткой обладали препараты III 11/56, II 35/57, 11174/64, IV 74/64, что позволяе предположить возможность их применения в качестве препаратов белковых антигено пневмококка.

Анализ молекулярного состава изучаемых белковых компонентов пневмококк был проведен с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Это нам позволят определить гетерогенность спектра белковых компонентов препарата, а также молек; лярную массу этих компонентов для дальнейшего сравнения препаратов. Экстракт бактериальных белков детергентами редко приводит к выделению одного или небол;

м.м.(кД)

94 ко - = • 80 ко

•штамм П/5б(ш) штамм 74/64 (ш) серотип 3 ' серотип /к

50 ко -

¿2-

ЪЪ

штамм 74/64 (IV) серотип /А 1

штамм 35/57(ц) серотип 25

М

Рпр I,

Рпр II

Рпр III

Рис ,2 Электрофоратический профиль (I) и результаты иммунопроявления с кроличьей (2) и

человеческой (3) сыворотками белковых препаратов различных штаммов пневмококка

шого количества белков. Как правило, в препарате экстракта находятся белки с близкими биохимическими свойствами, Как мы и предполагали, белковые препараты, полученные экстракцией детергентом содержат большое число индивидуальных белковых компонентов: около 30 полос, соответствующих отдельным полипептидам с молекулярной массой от 10 до 100 кБ. Следует отметить, что в полученных препаратах содержится большое количество полипептидных цепей одинаковой массы (60, 50, 44, 40, 35, 22 ИЗ).

Для того, чтобы доказать, какие из выявленных белков являются серологически активными, были применены два способа иммунопроявления после переноса электро-форетически разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану: кроличьей сывороткой к суммарному белковому препарату пневмококка, использованной нами ранее в РДЦ, а также пуловой сывороткой больных с бактериологически подтвержденной пневмококковой инфекцией. Оказалось, что пудовая сыворотка больных с пневмококковой инфекцией выявляет значительно больше белков в препарате, чем иммунная кроличья сыворотка (Рис.2). Это может быть объяснено тем, что в ходе инфекции происходит контакт макроорганизма со всеми антигенами пневмококка, тогда как при иммунизации были использованы препараты фракционированных антигенов (экстрагированных детергентом и разделенных гель-фильтрацией).

Обладая антигенным препаратом с доказанной иммунохимической активностью, мы получили возможность проанализировать возможное диагностическое значение антител к компонентам препарата при пневмококковой инфекции. Для этого были использованы сыворотки крови 20 детей с пневмококковой инфекцией, подтвержденной бактериологически. В качестве препарата белковых антигенов пневмококка был использован препарат III 11/56, как наиболее серологически активный по данным ИФА Оказалось, что 18 из 20 проанализированных сывороток (90%) реагируют с белком < м.м. массой 80 кБ, 13 сывороток (65%) активны с белком с м.м. 50 кО, а 10 сыворото1 (50%) реагировали с белком пневмококка с м.м. 94 кО. (табл.2). Более редки реакции

N сыв-ки Величина сю М.М. Белков, активных в иммуноблоттинге

ко

1 0.713 94 80 50 44 40 17 14

2 0.656 80 50 44 17

3 0.404 94 80 50 49

4 0.482 80 63 50 49 44 40

5 0. 643 94 80 63 50 49 44 40 14

б 0.533 94 80 63 50 44 40 17 14

7 0.465 94 80 50

8 0.633 94 80 50 44 17 14

9 0.546 29

10 0.375 94 80

11 0.413 94 80 74 50

12 0.434 94

13 0.348 94 80

14 0.496 94 80 50

15 0.490 94 80 50

16 0.300 94 80

17 0.486 94 80 50 44

18 0.481 94 80

19 0.537 94 80 74 50 44

Таблица 2 .Активность реакции белковых антигенов пневмококка в ИФА

и иммуноОлотинге

компонентами препарата с м.м. 63, 49, 44 и 40 кО. Причем, увеличение активности реакции в ИФА в целом соответствует более широкому спектру реагирования сыворотки с белковым антигеном.

Анализ антигенных препаратов из четырех штаммов пневмококка показал возможность выделения иммунохимичсски активных белков этого микроорганизма. Для определения видового спектра этих антигенов мы проанализировали 74 штамма З.рпеитошае из коллекции НИИ ВС им.Мечникова (табл.3). Используя полученные на первых стадиях данного исследования антигенные препараты в качестве контроля, была предпринята попытка обнаружить и другие штаммы пневмококка, продуцирующие эти антигены, а также насколько характерно для пневмококка в целом наличие такого рода активности.

Для получения антигенных препаратов из большого количества штаммов мы применили более простой и быстрый метод приготовления препаратов: разрушение бактериальных клеток путем замораживания-оттаивания (экспресс-метод). Всего данным методом было получено 74 препарата из различных штаммов пневмококка (табл.3)

Для сравнительной характеристики полученные антигенные препараты были подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле с ЗОБ. Оказалось, что метод замораживания-опаивания дает сходные по белковому составу препараты в сравнении с методом цетавлоновой экстракции . Однако характерно, что в сравнении с препаратами, выделенными методом экстракции детергентом, бактериальные лизаты содержат большее количество индивидуальных белков. Вероятно, в состав этих препаратов попадают не только белковые компоненты клеточной стенки, но и большое количество внутриклеточных ферментов (рис.3).

Для выявления иммуйохимически активных компонентов в составе полученных методом замораживания-оттаивания препаратов, была использована методика имму-нопроявлепия антигенов, перенесенных после электрофореза на нитроцеллюлозную мембрану, человеческой сывороткой, содержащей по данным ИФА антитела к пневмо-

\

ТаОл.З Бактериальные штаммы пневмококка

штамм серотш штамм серотип штамм серотип

I I ' 28/57 22т 58/57 15А

1/56 4 30/57 23А 59/57 15В

2/56 2 31/57 23В 60/57 15С

3 3 32/57 24А 61/57 17А

3/79 6А 33/57 24В 62/57 32А

4/56 6В 35/57 25 ' 63/57 36

5/56 Ч? 36/57 27 66/57 41>

6/56 8 37/57 28А 69/57 44

7/56 9А 38/57 28р 70/57 К45

8/56. Юр 39/57 29 71/57 46

9/56 Ир 40/57 ззр 74/57 7А

10/56 12р 41/57 НА 7471/40 42

11/56 3 42/57 № 75/64 11с

12/56 14 43/57 18В 76/64 19С

14/56 16 44/62 18С 77/64 22А

15/56 Г/Т 46/57 31 78/57 41А

16/57 7В 47/57 32 г 79/64 47р

17/57 7С 48/57 ЗЗС 80/64 48

18/56 9ь 49/57 ЗЗА 84/64 47А

19/57 9и 50/57 33В 152 3

20/57 9у 51/57 34 1874/39 38

21/57 НА 52/57 35г 4963/42 43

22/58 18А 53/57 35А 1662/41 40

23/57 19р 54/57 35В 4971/39 39

24/57 19А 55/57 35С

кокку. Анализ полученных данных покачал, чт наиболее характерными иммунохими-ческн активными компонентами являются белки с м.м. 94, 80 к 50 кО (рис.3). В изученных препаратах достаточно часто встречаются компонены с м м. 74 и 44 кГ>. Эти данные указывают на присутствие в других штаммах пневмококка сходных по молекулярной массе иммунохимически активных компонентов н хорошо согласуются с данными, полученными нами ранее.

2. Усовершенствование метода получения препарата белков антигенов пневмококка и отработка условий ИФА на полистироловых планшетах.

На данном этапе работы были модифицированы некоторые условия проведения ИФА для определения антител к белковым антигенам пневмококка с использованием полистироловых планшетов. Для выделения новых серий антигенного препарата был

Рис. з. Результат электрофореза препаратов из различных штаммов пневмококка, полученных методом замораживания-оттаивания.

n препарат % от сухого веса

белок по углеводы нукл. к-ты реакция в ИФА

loury bredford

1 i 11/56 0 1 2 0 0,16

2 ii 11/56 0 9 3 0 0,20

3 illa 11/56 5 12 4 0 0,35

4 illb 11/56 20 40 7 1 0,91

Табл.4.Биохимический и иммунохимический анализ препаратов после гель-фильтрации цетавлонового экстракта S.pneumoniae, штамм 11/56.

использован штамм 11/56 пневмококка (серотип 3). Препарат был получен методом це-тавлоновой экстракции, но для предотвращения гидролитических процессов белковых препаратов дополнительно к применявшейся ранее методике мы внесли в экстрагирующий раствор ингибитор протеиназ - PMSF. Далее, в процессе гель-фильтрации компоненты, выходящие в составе третьего пика были разделены на две части по номерам фракций: с 20 по 25 фракцию - препарат Illa 11/56, с 26 по 30 фракцию - препарат Illb 11/56.

По результатам химического анализа новых серий препарата (табл.4), препарат Illb 11/56, соответствующий более низкомолекулярной части третьего пика содержит наибольшее количество белка, а также этот препарат обладает наибольшей серологической активностью в ИФА.

В последующих экспериментах мы использовали препарат ШЬ 11/56, т.к, он оказалс наиболее диагностически значимым при определении антител к пневмококку.

На стадии подбора индикаторной смеси мы сравнили действие ' аминосалициловой кислоты (5-АС) и ортофенилендиамина (ОФД). Применение ОФ, повышает чувствительность анализа в 1,5 раза и снижает время постановки реакции н I час.

Разработка критериев иммунохимической диагностики значительно облегчаЕ получение положительных и отрицательных контрольных образцов. Такими образцам могут служить сыворотки крови людей, удовлетворяющие условиям диагностически критерия. Нами было обнаружено, что до 25% здоровых людей имеют высокие титр антипневмококковых антител в сыворотке. Целенаправленный отбор таких сыворотс может обеспечить производство ИФА-систем достаточным количеством контрольнь образцов. При выборе отрицательной контрольной сыворотки были проанализировав сыворотки пациентов, имеющих заболевание не пневмококковой этиологии и друг заболевания. Оказалось, что наиболее оптимально в качестве отрицательного контро использовать сыворотки людей, имеющих заболевания не инфекционного характера также сыворотки доноров с низким уровнем антител к пневмококку.

3. Разработка условий проведения ИФА на основе дот-блота.

Следует отметить, что преимуществом ИФА является возможность массовс скрининга, но при этом в обычном ИФА с применением полистироловых планшет необходима система детекции - фотометр, что резко ограничивает возможности испо зования этого анализа в обычных условиях. В связи с этим перспективным является р работка метода ИФА типа дот-блот. Следует также учитывать, что сходные по св клинической картине заболевания респираторного тракта могут быть вызваны разл ными бактериями. Результаты эпидемиологического анализа за последние годы пок: ли большое значение для этиологии острой пневмонии, бронхита и отита среднего

таких микроорганизмов, как 8.рпеитоп1ае, НлпЯиепгае и В.са(агг1)а1|'з. Мы провели разработку системы ИФА на основе дот-анализа с использованием прераратов антигенов этих бактерий для определения антител в сыворотке крови у людей. Для удобства анализа каждой сыворотки одновременно с несколькими антигенами мы разработали систему дот-анализа, включающую 3 антигена на одной нитроцеллюлозной мембране (диаметр пор 0,45 мкм).

i ? Ш

i о в

-J2

Г]- 13 <6 __

3 в

©

3:iTö I

9 O"© J 2o <0 I _ 21 1 22

•И

.•j.

□

J

1

П

23 # e

2 A •

25

■ 26

0 u" j

©

27 Ö

' 4 ■ _ .

28."

О

Q

■29 •

3

3o. f'

Рис.4 Анализ сывороток методом дот-блота.

I - место нанесения антигенного препарата S.pneumoniae

II - место нанесения антигенного препарата Н.influenzae

III - место нанесения антигенного препарата B.catarrhalis

Предварительно в модельных экспериментах была подобрана концентрация а тигенных препаратов в условиях их сорбции на нитроцеллюлозную мембрану. Оказ лось, что для антигенного препарата З.рпеитошае оптимальной является концентрац! 1мг/мл, для дезинтегратов НлпПеипгае и В.са1аггЬаИ5 - 50 мкг/мл и 370 мкг/мл соотве ственно. Сорбция антигенных препаратов на мембрану происходила автоматически фосфатном буфере (рН 7,5).

После того, как нами были отработаны условия проведения дот-анализа, мы пр ступили к анализу сывороток больных с помощью разработанных нами сист< (методом ИФА на полистироловых планшетах и методом дот-блота). На рис.4 пре ставлены результаты анализа методом дот-блот сывороток больных детей в возрасте 8 до 14 лет с заболеваниями бактериальной этиологии. Сыворотки крови этих пацие тов мы предварительно исследовали разработанными ранее методами ИФА для опред ления антител к пневмококку и для определения антител к гемофильной палочке. Пр анализировать сыворотки на наличие антител к В.са1аггЬаН5 методом ИФА не пр< ставлялось возможным, т.к. такая система ИФА еще не разработана.

В табл.5 представлены данные, которые были получены в результате анализа с вороток двумя методами. Результаты дот-блота представлены в соответствии с усл< ной шкалой, а данные ИФА представлены как в условных единицах, так и в виде во чины оптической плотности. Оказалось, что при анализе сывороток двумя метода» число положительных и отрицательных реакций различается незначительно. В слу1 определения антител к пневмококку, сыворотки, активно реагирующие в обычн ИФА, как правило, дают яркую реакцию в дот-блоте. Совпадение результатов по де методам составило 83% (при определении антител к пневмококку). В тоже время, г параллельном определении антител к гемофильной палочке, уровень совпадения зультатов составил 87%.

J6

S.pneumoniae

H.influenzae

CHB

результат в ИФА дот-<Злот

результат в ИФА дот-0лог

1

2

3

4

5

7

8

0.597

0.539

0.469

0.399 0.418

++ ++ ++ + +

0.700 ++

9

ю

0.294

1.031

1.032 0.105

+++ +++

15

16

18

19

20 21

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

0.397

0.362

0.581 0.453

0.132

0.524

0.292

о. 614

1.910

0.473 0.749 0.488

1.308

0.304

0.625

0.431

++ ++

++ +++ ++ +++ ++ +++

++ +

++ +++

+++ ++

++

+ +++

+++ +

+++ ++

++ + ++ +++ +++ +++ +++ +++

+++ ++

0 930 +++

0. 320 -

0. 890 +++

0. 820 +++

0. 900 +++

1. 300 +++

0. 1. 700 320 ++-+++

0. 850 +++

0. 535 ++ 1

0. 0. 677 450 ++ +

0. 1, 890 450 +++ +++

0. 400

0. 560 ++

0. 0. 440 622 + ++

0. 860 +++

0. 780 +++

0. 710 ++

1. ооо +++

0. 980 +++

0. 0. 1. 680 700 532 ++ ++ +++

0. 350 -

0. 860 +++

0. 740 ++

0. 990

+++

+ ++

++ +++

+++

++ ++

+ ++ ++ ++ ++ ++ + +++ ++ +++ ++ + ++ ++ +++

+

6

+

+

Табл5. Результат анализа сывороток больных с различными бактериальными антигенами методом ИФА на полистироловых планшетах и методом дот-блота.

Таким образом, на наш взгляд, метод дот-блота может быть использован для скрининга сывороток на наличие антител к пневмококку. В то же время, использование реакции типа дот-блот позволила нам создать систему, в которой одновременно можно оценить уровень антител к пневмококку, гемофильной папочке и B.catarrhalis при изучении бактериальной инфекции в клинике или экспериментальных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Препараты белковых антигенов, полученные из различных штаммов пневмококка обладают неодинаковой иммунохимической активностью. Использование экстракции цетавлоном позволило получить препарат с наибольшим содержанием белковых антигенов из штамма 11/56.

2. Доказано, что для белков, обладающих серологической активностью для разных штаммов наиболее характерны белки с молекулярной массой 50,80, и 94 kD.

3. Отработаны оптимальные условия проведения ИФА для определения анител к S. pneumoniae на полистироловом носителе. В связи со сложным характером иммунного ответа при пневмококковой инфекции в качестве положительного контроля предложено использовать сыворотки здоровых людей с высоким содержанием антител к пнев мококку.

4. Разработана новая система ИФА на основе дот-блота для одновременной определения антител к S.pneumoniae, H.influenzae и B.catarrhalis, которая может бьгг использована для анализа сывороток крови больных в условиях скрининга большол количества образцов.

5. Анализ сывороток больных с помощью ИФА на полистироловых планшетах методом дот-блота показал высокую степень совпадения результатов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Особенности выделения пневмококковых полисахаридов с помощью ацетона /Кузнецова Е.М., Пугачева Н.Л. //В сб. "Препараты для диагностики и профилактики пневмококковых заболеваний". 1985, Москва, стр 131-138

2. Выявление капсульных антигенов пневмококка /Пугачева Н.Л., Падюков Л.Н.//ЖМЭИ, 1985 г., № 11,стр,43-46

3. Выявление антител к пневмококку у детей острой пневмонией и плевритом иммуноферментным методом /Падюков Л.Н., Пугачева Н.Л., Кешикбаева А. А., Катосова Л.К.//ЖМЭИ, 1986г., стр79-83

4. Сравнительный анализ антигенных препаратов из некапсульных штаммов пневмококка /Нисилевич В.Ф., Падюков Л.Н., Пугачева Н.Л.// ЖМЭИ, 1987г., № 1, стр. 8-12

5. Секреторные антитела к пневмококку при острой пневмонии у детей / Уланова М.А., Пугачева Н.Л. // Тезисы докладов научной конференции "Актуальные проблемы педиатрии в Сибири и на Дальнем Востоке", 1988 г., Хабаровск, стр. 190.

6. Уровень антител к пневмококку при различных заболеваниях и у здоровых людей /Падюков Л.Н., Цветкова Н.В., Пугачева Н.Л.//В сб. "Иммуноферментный анализ в диагностике заболеваний", Москва, 1989 г., стр.9095.

7. Latex agglutination for determination of pneumococcal antigens in acute pneumonia II In Abstracts of 6th International Congress on Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology, Helsinki-Espoo, Finland, 1990, p. 77 (соавт. Асеева В.Г.)

8. Особенности гуморального ответа на пневмококк у детей / Уланова М.А., Падюков Л.Н., Таточенко В.К., Пугачева Н.Л.// ЖМЭИ, 1990 г., №2, стр.55-61.

9. Иммуноферменгная система для определения антител к полисахаридам пневмококка у детей // Материалы рабочего совещания "Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций", Оболенск, 1990, с.47 (соавт. Уланова М.А., Ксенофонтова М.К., Падюков Л.Н.)

10. Опыт внедрения новой иммуноферментной системы // Материалы рабочего совещания " Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций", Оболенск, 1990, с.49 (соавт. Цветкова Н.В., Кузнецова Е.М.)

11. Способ диагностики пневмококковой инфекции П Положительное решение о выдаче патента от 23.01.92 на заявку N 4937427/14-41611 от 17.05.91. (соавт. Цветкова Н.В., Кузнецова Е.М., Падюков Л.Н., Батуро А.П.)

12. Идентификация бактерий- возбудителей бронхолегочной инфекции методом коагглютинации II В сб. Современные методы иммунохимической и молекулярной диагностики в медицине, Москва, 1992, с.96-103 (соавт. Таранов В.А., Ксенофонтова М.К., Цветкова Н.В., Жилина И.Л., Батуро А.П.)

13. Return to pneumococcal proteins? II Abstracts of XII Lancefield International Simposium on Streptococci and Streptococcal diseases, 1993, St.Peterburg, p. 132 (соавт. Падюков Л.Н.)

14. Return to pneumococcal proteins? H In: Pathogenic Streptococci: Present and Future" Ed. A.Totolian, Lancer Publication, St.Peterburg, p.426-427 (соавт. Падюков Л.Н.)

15. Antibacterial antibodies in pulmonary diseases // Abstr. of XV International Congress of Allergology and Clinical Immunology, Stockholm, Sweden, 1994, p.701 (соавт. Падюков Л.Н., Колмогорова O.B.)

16. Antibacterial antibodies in children with pulmonary diseases // XII European Immunol.Meeting, Barselona.Spein , 1994 (соавт. Падюков Л.Н.)

17. Белковые антигены Streptococcus pneumoniae IIЖМЭИ, 1995, № 2 (соавт. Падюков Л.Н.)

18. Antibodies to C-polysacharide and antigens of streptococcus pneumonia" // International Symposium on Clinical Lmmunology, San Francisco, CalifTornia, July 2023,1995 (соавт. Падюков Л.Н.)