Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунохимическая диагностика пневмококковой инфекции

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК ИМЕНИ И.И.МЕЧНИКОВА

РГБ ОД

; ' На прзклх рукописи

ПАДЮКОВ Леонид Николаевич

ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПНЕВМОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Диссертация в »лае научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Моек и 1994

/>• /

-Л О

Работа выполнена ■ Научно-исследовательском институте вакцин к сывороток имени И.И.Мечникова Российской Академии медицинских наук.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор

Л-А.ВИШНЯКОВА

доктор медицинских наук, профессор

Б.В.ПИНЕГИН

доктор биологических наук, профессор

КЛ.ШАХАНИНА

Ведущая организация - Институт экспериментальной медицины РАМН. г.Санхт-Петербург.

Защита диссертации состоится 26 октября 1994 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д074.09.01 при Институте иммунологам Мшцдрадмсдпроыа РФ по Адресу: 115478 г.Москва, Каширское шоссе, д. 24, кора-2

С диссертацией можно ознакомиться а библиотеке Института иммунология Минздравмедпрома РФ.

Диссертация разослана -^'О сентября 1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета.

доктор медицинских наук

Л.С.С«сяа«11на

ВВЕДЕНИЕ

АКТуаЛЬНОСТЬ Проблемы. Streptococcus pneumoniae -пневмококк - является широко распространенным условнопатогешшм микроорганизмом, вызывавшим различные формы заболеваний у ллдей: острую пневмонию, бронхит, отит, гнойный менингит и др. Благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей установлено, что пневмококк является ведущим этиологическим агентом при этих заболеваниях (Випнякова Л.л.и др., 1981, Катосова Л.К., 1987, В.Gray, Н.Dllion, 1986, P.Geslln et al., 1994). В ПОСЛвДНее

десятилетие наблюдается резкое увеличение удельного веса антабиотакоустойчивых штаммов пневмококка (Катосова JI.K., 1990, p.Berche et ai.,i994). в связи с этим актуальной является разработка адекватных методов специфической этиологической диагностики при респираторных заболеваниях,- направленных не своевременное и надежное выявление пневмококковой инфекции с целью проведения соответствующей терапии.

Для диагностики пневмококковой инфекции используют некоторые методы иммунохимичэского анализа, т.е. анализа, основанного на взаимодействии антител с антигенами. При бактериологическом обследований с помощью антисывороткл возможна идентификация пневмококков методом набухания капсулы (E.Lund, j.iienrlckBen, 1978), а также методом прямой или непрямой пммунофлуоресценции (Л.А.Вишнякова и др. 1981). Кроме этого известен способ идентификации капсульных форм пневмококков и соотвотствущих антигеноэ с помощью коагглютинации и латекс-агглютинации (Р.Oleen, 1973, К.Leinenen, 1980), ОДНЭКО BC6 ЭТИ методы основаны на р акции антител только с капсульнымя полисахаридами пневмококка. Имееются также сведения о методах обнаружения антител к пневмококку, . которые основаны на специфически капсульных полисахаридах, входящих в состав пневмококковой вакцины (H.Russei et ai, 1980). При использовании дпагностикумов такого пша не могут быть выявлены бескапсульные (шероховатые) формы пнемококка, которые, по данным ряда авторов, играют значительную роль в патогенезе пневмококковой инфекции (Л.А.Вишнякова и др. 1981). Кроме того, полученные ранее сведения об го.мупном ответе на капсулышв полисахариды пневмококке свидетельствуют о незначительных серологических сдвигах в ходе инфекции или вакцинации в отношении таких антигенов. Эти данные не позволяют однозначно оценить Интенсивности иммунного ответа к пневмококку.

г -

Капсульные полисахарида пневмококка, представленные у этого микроорганизма 90 серотипаыи (л.непг!.схавп, 1993), являются основой единственной известной иммунохимической классификации 8того вида. Усовершенствование методов, идентификации пневмококков по свойствам их капсулы такга остается актуальным. Вместе с тем, в современной отечественной и заруйеашой литературе отсутствуют сведения о разработке систем диагностики, позволяющих охарактеризовать развитие пневмококковой инфекции на разных уровнях взаимодействия макро- и микроорганизма: путай выявления как ююток пневмококка и его антигенов, так и антител к нему. Постоянные поиски взаимосвязи между серотипом и вирулентностью штаммов пневмококка до сих пор но дали однозначного ответа, хотя известны некоторые закономерности, связанные с выделением у Сольных наиболее часто встречающихся серогшюв пневмококка. В связи с этим актуальной является разработка системы субтипирования по антигенным маркерам, отличным от капсульных антигенов, а такко иоиск альтернативной системы типовой или субтиповой классификации пневмококков, позволяющей не только произвести субтипированке известных капсульных форм, но и осуществлять мониторинг за Свскапсулышми формами этого микроба.

Цель работа - выявление иммунохимически активных белков пневмококка и создание на основе различных антигенов этого микроорганизма диагностических средств, позволяющих осуществлять сммунохимическую диагностик пневмококковой инфекции.

ЭШЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Цровэсти анализ антигенной гетерогенности штаммов пневмококка, как основы для их ладовой иммунохимической идентификации. Проанализировать возмокность построения классификационной схемы на основа вновь выявленных штаммовых признаков пневмококке.

2. Оценить иммунологические свойства искусственных антигенов, синтезированных по аналогии с природным полисахаридом пневмококка серотипа 3, для использования га в диагностических целях.

3. Разработать едекватные методы иммунохимической диагностики для идентификации бактериальных клеток пневмококка, его онтигеноа н антител к ним.

4. Разработать метод быстрой диагностики для выявления ьнтигенов пневмококка независимо от серотале.

5. Определить диагностические возможности кммунофермонтшх систем на основе белковых и полисахаридных антигенов оне?мококка,

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

На основе сочетания основных иммунохимически активных белков пневмококка предлокена система субтитрования, позволяющая классифзцировать штаммы пневмококка независимо от га серотипа.

Доказана иммунологическая активность искусственных антигенов, синтезированных химическим путем по аналогии с капсульшм полисахаридом пневмококка серотипа 3.

Нау'то обоснован и разработан способ иммунохкмическоЯ идентификации пневмококков независимо от наличия капсулы, который позволяет одновременно выявлять нетипируемые и оОычше капсулькые ПТ8МШ.

Установлено, что у пневмококка имеется несколько видов белковых антигенов, к которым происходит выработка антител при ютевмококовой инфекции у животных и человека. Динемиха появления антител индивидуальна и может зависить от исходного уровня антител в крови.

Обнарунено, что у взрослы! здоровых людей уровень антител к белковым антигенам пневмокока и его тейхоевым кислотам в средней вше, чем у здоровых детей и близок к уровни антител у детей спнеамококковой инфекцей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ Предложено использование препаратов белковых антигенов для иммунохимической диагностики пяевмококовой инфекции и показаны возможности системы для определения антител к пневмококку с помощью иммуноферментного анализа.

Разработана универсальная методика приготовления латексных диагностикумов для определения различных антигенов на основа эпоксидированных латексов.

Разрэботашше диагностикумы» домунофермэнтная система для определения антител к пневмококку (Фармакопейная статья 42-380ВС-91, Производственный регламент Я 359-92) набор ПНЕВМО-ТЕСТ для коагглютинации (Лабораторный регламент утверждай Ученым Советом НИИ ВС 14.11.1991 г.)- внедрены в производство и используются в различных учреждениях Российской Федерации п Республики Украина. Эти технологические решс.шя защищены патентами на "Способ диагностики пневмококковой инфекции" (положительное

решение о выдаче патента от 23.01.92 на заявку н 4937427/14-41611 от 1?.05.91.) и на "Способ приготовления диагностикума для определения антигенов в реакции коагглютинащш" N 1762242.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОХЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Разработана система имыунохимической диагностики пневмококковой инфекции, вклячаодвя препараты для выявления векториальных клеток пневмококка или его антигенов и антител к нём, н поэволяшая выявлять антигены и антитела независимо от серотипа пневмококка-возбудителя.

2. Белки пневмококка с м.ы. 50 , 74 . 60 и 94 ко являются иымунологически активными, так как антитела к ниы образуются у детей и взрослых при возникновении пневмококковой инфекции, 8 также у взрослых здоровых ладей.

3. Полностью искусственный антиген, содержащий олигомеры, идентичные участкам природного полисахарида пневмококка серотипа Э, обладает активностью природного полисахарида и может быть использован для качественной и количественной оценки активности ентительншс и антигенных препаратов пневмококка в реакциях, основанных на РПГА и ИФА.

4. К особенностям гуморального иммунологического ответа цри пневмококковой инфекции у человека и животных относится возможность различных типов реагирования: постепенного нарастания количества антител, сохранение относительно низких концентраций и сохранение относительно высоких концентраций антител. В единичных случаях наблюдается снижение первоначально высокого уровня антител К пневмококку.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации обсуждались на научной конференции отдела иммунохиинческой диагностики НИИ ВС, заседании Ученого Совета НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова (Протокол N 5 от 19.05.94), на 16-ой конференции Федерации европейских Оюишических обществ (Москва, 1964), и-ой Всесоюзной конференции ■Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике" (Москва. 1968), региональной научной конференции "Актуальные проблемы педиатрии в Сибире и на Дальнем Востоке" (Хабаровск, 1988). хи-ом Всесоюзном съезде детских врачей (Москва, 1988), Всесоюзных конференциях «Современные направления создания медицинских диагиостикумов" (Москва, 1988 и 1990 К

Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1989), Научно-практической конференции "Актуальные вопросы реабилитация больных с патологией органов дыхания" (Барнаул, 1989), xv-om Международном симпозиуме по проблеме детской пульмонологии (Киев,

1989),' XVII—ом Съезде Всесоюзного общества микробиологов и паразитологов им.И.И.Мечникова (Алма-Ата, 1989), х-ом Всесоюзном иммунологическом Съезда (Дагомыс, 1989). х-ом Всесоюзном Конгрессе по болезням органов дыхания (Киев, 1990), Всесоюзной научной конференции "Проблемы медицинской биотехнологии" (Ленинград,

1990), 6-ом Меядународном Конгрессе по быстрым методам п автоматизации в микробиологии и иммунологии (Хельсинки, 1990), 14-ом заседании немецкого Общества педиатров- пульмонологов (Ганновер, 1992), 7-ом международном Конгрессе по местному Ешунптету (Прага, 1992), xxiv-om ежегодном заседании скандинавского Общества иммунологов (Орхус, 1993), хи-ом Международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковой рфекции (Санкт-Петербург, 1993), 28-ом Всемирном Конгрессе по легким (Майнц, 1994),xv Меядународном Конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Стокгольм, 1994), Международном симпозиума "Педиатрическая неделя Голландии" (Роттердам, 1994).

ПУБЛИКАЦИИ

Основные положения диссертационной работа опубликованы в 68 научных работах, из которых 2 - главы в монографиях, 2 - в зарубевных яурналах, 20 - в центральных изданиях, 2 патента.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Источником для выделения антигенов пневмококка служили эталонные итаммы Streptococcus pneumoniae ИЗ КОЛЛеКЦИИ НИИ ВС ем.И.И.Мечникова. Штаммы пневмококка лэба и спс получены от j.Henricksen, (Институт сывороток, Дания). Штаммы выращивали в стационарных условиях с использованием питательных сред bhi ("Difco", США) или среды "25 вариант" с добавлением 10» инактпвироваЕной бычей сыворотки. Культивирование и контроль бактериологической чистоты проводили сотрудники лаборатории микробиологии условнопатогенных бактерий НИЬ ВС им.Мечникова.

Выделение капгул^нчх полисахаридов пневмококка проводив

путай ацетонового осавдения (Н.В.Цветкова и др., 1981). Препарат ■шйхоавых кислот пневмококка выделяли на основе методики v.eor«n»«n and j.Htinricicsen (1984) в нашей модификации.

Били использованы антисыворотки к различным серотипам, серргруппам, тейхоевым кислотам пневмококка, поливалентные и омни-сыворотка, полученные в лаборатории микробиологии условнопатогенных бактерий НИИ ВС им.И.И.Мечникова. Антисыворотка к пневмолизину любезно предоставлена M.Lainonen (Институт здравоохранения, Фшшшдия).

Кроличья внтисыворотка к белковым антигенам пневмококка была получена пятикратной иммунизацией кроликов антигенным препаратом с полный адъювантом фрайнда в дозах от 0,5 до 3 мг общего белка при введении в несколько точек подко! ю. Кровь забирали из ушной вены ц отделяли сыворотку общепринятым методом. Активность ентисывсротки предварительно определяли в реакции двойной иммунодиффузии. В результате иммунизации антигеном, выделенным цвтавлоновой экстракцией, были получены антисыворотки с титром на ниже Is16.

Донорские сыворотки анализировали предварительно в ИФА с препаратом белковых антигенов пневмококка. Сыворотки, дававшие ярко положительные реакции в диагностическом титре (более 0,6 ед. оптической плотности в разведении I¡1600), объединяли для создания контрольной пуловой сыворотки. Полученная сыворотка была использована далее как препарат положительной контрольной шьоротки в ИФА и для исследований в иммуноблоте белковых антигенных препаратов пневмококка.

Препараты моноклональных антител получены из НИИ 0Ш1 (г.Тарту, Эстония).

Суспензии полистироловых латексов получены в НИИ синтетического каучука (г.Санкт-Петербург). Электрофоретнческую подвижность частиц латекса измеряли с помощью прибора z«ta>izer ("Malvern", Великобритания) и выражали в значениях с-потенциала. Средний размер частиц определяли на приборе Autoai*« (Malvern, Великобритания) (работа проведена совместно с кафедрой высокомолекулярных соединений Химфака ИГУ).

Очистку иммуноглобулинов осаждением сульфатом ашония и аффинной хроматографией на протеин А-сефарозе проводили по методике, рекомендуемой фирмой-производителем.

Хроиатографическую очистку антигенов проводили методом гель-фильтрации низкого давления на гелях Сефарозы <"Phar»acia-

LKB", Швеция).

Изоэлектрофокусирование в гелэ агарозн проводили на приборе Muitiphor ("pharnacia-LKB", Швеция) по методике, рекомендуемой фирмой.

Электрофорез в полизкриламидном гелэ проводили по известной методике (u.K.baenmii, 1970) при концентрации геля от 6 до 10%. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли пассивным методом. Дальнейшее проявление иммунохимически активных компонентов проводили с помощью пуловой человеческой или иммунной кроличьей сыворотки. Для денситометрии были использованы позитивные фотоснимки, полученные на фотопластинке с масштабом 1:1. Денситомегрия проведена на приборе uitroscanXL ("pharBacia-LXBH, Швеция).

Диагностикумы для реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) готовили сенсибилизацией фиксированных эритроцитов барана в растворе антигена различных концентраций в физиологическом растворе, забуфереином фосфатами, pH 8,6. Реакцию проводили в круглодонных планшетах для иммунологического анализа (Ленполимер.РФ).

Иммуноферментный анализ проводили в стандартных условиях в 96-луночных полистироловых планшетах ("Nunc", Дания ИЛИ "Llnbro", США), активность реакции определяли на многоканальном фотометре Hultiakan ("Labsystems Oy", ФИНЛЯНДИЯ).

Обработку данных иммуноферментного анализа проводили для получения сопоставимых результатов, независимо от активности компонентов иммуноферментной реакции. Результаты ИФА выраяалп в условных единицах (Elisa units, eu), рассчитанных по формуле (Pedersen Р.К., Henrichsen J.,1982 В Нашей модификации):

ODon х 00ср.ст.

eu - -x 100

ODOn.CT.

,где eu - значение скорректированной активности в ИФА;

ODon - оптическая плотность в лунке с исследуемым образцом в данном опыте;

ODon ст ~ оптическая плотность в лунке с положительной контрольной сывороткой в данном опыте;

0Dcp ст ~ средняя оптическая плотность в лунках с положительной контрольной сывороткой в серии из 10 независимых опытов.

Математическую и графическую обработку полученных результатов проводили с ПОМОЩЬЮ программ Quattro Pro !' Axum. Для ОфОрМЛвКИЯ

pa00ТЫ использовали программы ChiWriter, Graph-in-the-Box, Picture lUücer И Xerox Ventura Publisher.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Получение и анализ антигенов пневмококка I.I. Синтетические антигены Метода выделения капсульных полисахаридов пневмококка разработаны на основе фракционирования бактериальной массы органическими растворителями. Такой подход позволяет получить препараты полисахаридов с минимальными примесями других антигенов. Однако, даже высокоочшценные препараты капсульных полисахаридов могут содержать некоторые иммунохимически активные примеси, ватрудняодие интерпретацию получаемых данных серологического анализа. В связи с зтим, перспективным является исследование ишу нохимиче ской активности синтетических антигенов, то есть антигенов, полученных полностью химическим путем, без использования микробных продуктов или природных носителей и олигомеров. С этой целью нами был исследован ряд полимерных синтетических продуктов, приготовленных в ИОХ им. Зелинского РАН на основе известных данных о структуре мономеров капсульного полисахарида серотипа 3. (Этот раздел работы был выполнен совместно с к.х.н. А.Я.Черняком.)

В состав исследованных препаратов (рис.1) входили высокомолекулярные полиакриламидные цепи, в разной степени насыщенные одним из типов олигомеров: дисахаридами, трисахаридами или тетрасахаридами, содержащими известную для капсульного полисахарида пневмококка серотипа 3 последовательность из глюкуроновой кислоты и глюкозы - его основную антигенную детерминанту (M.How et аХ, 1964). В отличие от природного полисахарида, эти структуры в изученных синтетических антигенах чередуются не в линейной последовательности, а размещены в виде заместителей на цепочке полиакриламида, что существенно изменяет конформацию антигена в сравнении с природным.

Мы изучили активность этих антигенов в реакции преципитации, РИГА и ИФА с кроличьими антисыворотками, полученными из различных источников. Нам удалось экспериментально доказать, что полностьо синтетический полимер обладает антигенной активностью полисахарида пневмококка серотипа 3. Эта активность проявлялась в икмуноферментнои анализе г в РИГА с гомотшшчвсккш еатисквороткама (Табл.1). Кэ проанализированных гетеротипичаекнх

- о -

А - природный полисахарид типа 3 (ПСЗ)

- -вкЛ - 01с-В - синтетический антиген

один из следующих Обозначение препарата

олигосахаридов в таблице 1

-01сА-С1с- П4

-С1с-С1сА-С1с- П6

-С1сА-С1с-С1сА- П7

-С1сА-С1с-С1сА-01с- П8

Рисунок I. Схема строения нативногси (природного) и синтетических антигенов, обладающих специфичностью капсульного полисахарида S.pneumoniae СеротиПЭ 3

Табл.1 Активность реакции синтетических антигенов в РПГА и ИФА в сравнении с природным полисахаридом серотипа 3

Специфичность ентисывороткн

Препараты антигенов П4 П6 П7 П8

ПСЗ

РПГА:

Серотип 3 (НИИ ВС)

Серотип 3 (Difco)

Серо тип 8 (НИИ ВС)

(активность реакции - обратное разведение) 160 40 640 2560 10240 10 10 40 160 2560 160 320 320 320 320

ор антигена

№6А (активность реакции - отношение оц псз )

Серотип 3 (НИИ ВС) 0,57 0,39 0,47 0,31 I Серотип 3 (01Ссо) 0,19 0,21 0,17 0,62 0,70 Серотип 8 (ОХГсо) 0,20 0,28 0,20 0,29 0.21

Обозначения:П4, П6. П7, П8. ПСЗ - см. рис.1

НИИ ВС - получена в НИИ ВС им.И.И.Мечникова с1Гсо - получена от фирмы иоИсо", США оо антигена - оптическая плотность в ИФА реакции сыворотки в разведении 1:400 с исследуемым антигеном ор ПСЗ - оптическая плотность в ИФА реакции сыворотки в разведении 1:400 с природным полисахаридом серотипа 3

антнсывороток дшь антисывороткв к пневмококку серотипа 8 дала перекрестную реакцию, иллюстрируя известный перекрест между серотипами 3 и 8 (н.йи8ве1 «с а1. 1980). Аналогичной активности с гомотщшческнш антисыворотками в реакции двойной кммунодиффузии нами выявлено не было. Взаимодействие искусственных антигенов с антисыворотками в РПГА проявлялось как при непосредственной реакции с антмсывороткой эритроцитов, нагруженных антигенами, так а при перекрестной реакции нейтрализации РПГА натавным полисахаридом серотипа 3. При этом наблюдалась полная нейтрализация ентисывороткн относительно низкой концентрацией нативного полисахарида и неполная нейтрализация относительно высокой концентрацией искусственных антигенов. Активность реакции Б Ш>А препаратов, содержащих дисахарида, трисахариды и тетрасахарид, позволяет предположить, что для проявления указанных антигенных свойств достаточно дкмерной части нативного полисахарида, однако выраженность реакции с антисывороткой у полимера с теграсахарадом выше в приближается к выраженности решшн с натавным полисахаридом (Табл.1). Относительная

- го -

активность реакции пативного полисахарида с сыворотками из разных источников различается, что, на нал взгляд, свидетельствует о различии в концентрации и аффинности антител в этих сыворотках. Однако некоторое несовпадение реакций искусственных полимеров на основе да-, три- и тетрасахаридов с двумя типами использованных антисывороток к пневмококку серотшоз 3 и 8 указывает на различие п специфичности этих антительных препаратов, которое новозмопно было бы идентифицировать с помощью препарата натлвного полисахарида.

Папе исследование показало, что полностью искусственный антиген обладает активпостью природного полисахарида и мотах Опть попользован для качественной и количественной оценки активности антительних н антигенных препаратов пневмококка в реакциях, основанных па РПГА и ИФА. Более интенсивное развитие химической основы для синтеза полисахаридов пневмококка другой специфичности, возможно, позволит перейти к практическому использованию таких антигенов для иммунохимической Диагностики. Большим достоинством использования искусственных антигенов с полиакриламидом в качестве носителя является практически полное отсутствие неспецлфических (Фоновых) реакций с сыворотками'.

1.2. Белковые антигены.

Особое внимашю ш уделили разработке метода выделения белковых антигенов пневмококка. Кроме единственной публикации R.Austrian и с.м.MacLeod (1949) мы не нзпгли в доступной литературе данных о белковых антигенах различных штаммов пневмококка. Прн исследовании этих антигенов было вакно получить препараты, свободные от капсулышх полисахаридов. Поскольку в контрольных сыворотках против цельных клеток пневмококка такие доминируют антитела к кзпеульным полисахаридам, было важно полностью очистить белковые препараты от примеси капсулыюго антигена. Для этого нами был разработан оригинальный метод, основанный на экстракции белков положительно заряженным детергентом - цатавлоном. При действии этого агента происходит солюбализация белковых структур, тогда как отрицательно заряженные капсульшо полисахариды и нуклеиновые кислоты агрегируются и выпадам1 в осадок. Дальнейшее разделение экстракта методом гель-фильтрации позволяет освободиться от примэсп тейхоевых кислот, обладзщих положительным зарядом, п самого детергента. Препараты, полученные „аким методом, были п дальнейшем использовать для создания пммуноф?рментной системы д.тя

определения антител к пневмококку.

Наин бил проведен алектрофоретиче екай анализ белковых препаратов, выделенных из 35 пташов пневмококка из коллекции НИИ вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова. Получение белковых препаратов проводили двумя способами: цетавлоновой экстракцией или методом замораживания - оттаивания. Мы сравнили состав препаратов, выделенных из нескольких штаммов обоими методами, в электрофорезе в ш активности в ИФА. Оказалось, что метод замораживания -оттаивания дает сходный по белковому составу продукт в сравнении с продуктом, полученным методом цетавлоновой экстракции, но ве позволяет освободиться от примеси специфического капсульяого полисахарида. Препараты, подученные по нашей методике, содержали Солее 20 компонентов, выявляема в электрофорезе в полиакрилаыидном геле с додецилсульфатои натрия. Для выявления юидунохимически активных компонентов ш использовали методику жодунопроявления антигенов, перенесенных на нитроцеллюлозную мембрану (вестерн-Олот) в двух вариантах: с проявлением кроличьей антисывороткой в с проявлением пудовой человеческой сывороткой, содержащей, по данным ИФА, антитела к пневмококку.

При анализе сложных белковых смесей методом электрофореза большое значение имеет точность и воспроизводимость методики. Наличие существенных смещений напряженности электромагнитного шля Б пределах одной пластины с гелем может привести к ошибке при определении молекулярной массы до 30%, что весьма существенно, особенно для высокомолекулярных соединений (и-Рвхитав, р.бпвп^ 1»7»). Сравнение не результатов, полученных в независимых акешриментах. может увеличить ошибку измерения еще на 10-20%. Использование процедуры переноса антигенов на нитроцеллюлозкый ©Шитр, их иымунопроявленне, а затем - денситометрирование результатов реакции также вносит дополнительную ошибку измерения. Поскольку нами было проведено денситометрирование с позитивной фотограммаской пластины, разброс данных йог быть еще более высокш. фактически невозможно взбежать существенных искажений результатов ашктрофореэа» выявляемых таким многоступенчатым шторм, так как езшбка. измерения на каждом этапе суммируется. В связи» с атм* ми использовали методику с введением на каждую пластину, так называемого, "внутреннего стандарта", близкого по свойствам-к исследуедам- образцам. Внутренним стандартным образцом был избран прапэрат иа штампа 11/56 серотина 3, который, по данным предварительшш экспериментов, давал относительно четкие, хорошо

WMfll I ■•C3'i0

Рисунок 2. Иммуноблот и денситограмма белкового антигенного препарата, выделенного из я.pneumoniae, штамм 11/56

Рисунок 3. Иммуноблот белковых антигенов, выделенные из различных щтамдав пневмококка: Пштамм 77/64(серотип 22А), 2)штамм 51/57 (серотип 34). 3)птамм 44/62 (серотип I8C), 4)штамм 75/64 (серотип IIC), 5)штамм 11/56 (серотип 3), 6)штэмм 12/56 (серотип I4A), 7)ит8мм 36/57 (серотип 27), 8)штамм 76/64 (серотип I9C), 9)птамч 32/57 (серотип 24А )

12 3456789

Табл.2 Наличие имыунохимическн активных балков в иташах пневмококка с различными сероетшама по результатам иммунопроявлешш

(Молекулярная масса белков (кялодальтон) ' 110 102 94 80 74 66 63 50 серотип | | I I I I I I штамм

1 4 + 4 44 44 - 4 — 1Т1

2 - 44 - 44 44 — — — • 2/56

3 4 - 4 44 44 44 — 44 11/56

4 44 - — 44 44 4 4 - 1/56

5 + 4 44 44 - — — 44 2/56Т5

7А — — ++ + 44 44 44 — 74/57

7F 4 - - 44 4 - - - 5/56

ЗА 4 44 + 44 4 44 — 4 7/56

10F - - 4 44 - — 44 4 в/56

12F 44 +4 + 44 44 4 — 44 10/56

ISA 4 - + 4+ 44 44 - - 58/57

16 - - — 44 - — - - 14/56

17А - - - 44 44 — — — 61/57

1GC — 4 44 44 4 4 - - 44/62

19С 4 4 44 44 44 - — 4 76/64

19F 4 - 44 4 44 4 - - 23/57

22h - - 44 44 4 - — - 77/64

23В - - 4 44 44 — - 4 31/57

24А 44 - ++ 44 44 - - - 32/57

28А 4 - 44 44 — 4 - 4 37/57

28F 4 - + 44 - - 4 - 38/57

2S - — 44 44 44 - - — 38/57

31 — - + 44 4 - — — 46/57

32F - + 44 - — 4 4 47/57

ЗЗА 4 - 44 ++ 44 - - 44 49/57

33D ' 4 44 - - — - - 50/57

ззк. - 4 44 4 4 - - - 40/57

35С 4 — 44 +4 44 4 — 4 55/57

35F 4 - 44 44 4+ 4 - 4 52/57

за 44 - - 44 - - - - 1874/39

39 - 44 - 44 44 4 - - 4S71/39

40 - 44 ' — 44 44 44 - 4 1162/41

41 4 - 4 44 - - - - 66/57

42 + — 44 44 44 - — 4 7471/40

44А 4 4 4 44 - - - - 69/57

Обозначения: - линия отсутствует;

"+" - линия от 1до 10 усл.ед.; "++" - более 10 усл.од.

вдонифщнруб'ше полоса во Есех потенциально информативных интервалах молекулярной шссы' (рис.2). Для этого препарата ш щюезли опрадэлгшю молекулярной ь;ассы основных коглхонентов, вшшлязшх в к-ууноблоте. Такии путем ш нивелировали ошибку катода до уровня разброса данных в прздзлах одной пластины и

ошибки денситометрировання.

Анализ полученных данных (табл.2, рис.3) показал, что наиболее характерными иммунохимнчески активными компонентами белковых препаратов пневмококка являются белки с м.м. 74, 80 и 94 килодальтон. Относительная частота встречаемости этих компонентов среди проанализированных штаммов составила 71,4%, 100* и 74,3*, соответственно. Следует особо отметать характерный для всех исследованных штаммов компонент с м.м. около 80 килодальтон, который составляет центр перечисленной выше триады - группы белковых полос, близких по своей электрофоретической подвижности (рас.2). Два других компонента практически во всех исследованных штаммах представлены ярко выраженными пиками, причем лишь у грех штаммов (8,6*) эти два компонента отсутствуют одновременно. Эта штаммы относятся к относительно редко встречающимся серотипам пневмококка 16, 33В и 38 (штаммы 14/56, 50/57 и 1874/39, соответственно).

В препаратах, полученных из разных штаммов, выявлены также компоненты с м.м. 50 и 66 килодальтон, которые характерны для 42,9% н 37,1% изученных штаммов, соответственно. Компонент с м.м. 66 килодальтон у 5 из 13 штаммов, которые его содержали, . был представлен в виде ярко выраженного характерного пика. Шли выявлены и антигены с менее высокой частотой встречаемости. К ним можно отнести белок с м.м. около 63 килодальтон, встречавшийся у 17,4% исследованных штаммов. По данным ь.мсоап!е1 с соавт. (1986) выделенный им белок Рврг, обладающий высокой степенью полиморфизма, дает при электрофорезе полосы с м.м. 76 и 84' килодальтон. Эти данные хорошо согласуются с нашими, так как указывают на присутствие в других штаммах пневмококка сходных по молекулярной массе иммунохимически активных компонентов. Вероятно, этот белок часто, если не всегда, представлен у пневмококка. Подобные антигены, представляющие собой общие для вида компоненты, могут служить основой для диагностики, а также быть перспективными препаратами для иммунопрофилактики инфекционного заболевания.

Нами было проведено также прямое иммунохимическое определение пнввмолизина, как одного из возможных иммунохимически активных белков пневмококка (рис.4). Пммунопроявление белков из препарата, полученного экстракцией цетавлоном, с помощью ангисывороткп к пневмолизину показало лишь незначительную примесь пневмолизина в препарате.

12 3 4 5

Ри.унок 4. Иммуноблот препарата белковых антигенов, пневмолизина и неирамшшдазы пневмококка с проявлением антисывороткой к пневмолизину: I) белковый препарата из штамма 11/56; 2) и 3) пневмодизин I мг/мл и 0,2 мг/мл; 4) и 5) нейраминвдаза I мг/мл и 0,2 мг/мл

Обнаружение стабильных, повторяющихся признаков, сочетание которых характерно для различных штаммов пневмококка, является, на наш взгляд, объективной основой для белкового субтипирования пневмококка. До сих пор такой системы не существовало, поэтому мы в настоящей работе мы предлагаем следующие признаки для проведения субтипирования, как основы для нового типа внутривидовой дифференциации пневмококка, отличной и независимой от классического полисахарвдного типирования. Этими признаками являются сочетание в составе препарата белковых антигенов (полученного методом экстракции детергентом или замораживанием -оттаиванием) высокомолекулярных белковых антигенов с м.м. 50, 63, 66, 74, и 94 килодальтон. Сочетание такого числа признаков потенциально дает 120 вариантов субтипов (ш при п-5). Однако реально мы столкнулись с достаточно высокой степенью совпадения некоторых из этих признаков, что приводит к 29 различным субтшам. При использовании для даКерекцировкн пташов четырех белков было выявлено II сочетаний, а при учете только трех белков - 6 субтипов. Вероятно из практических соображений необходимо учитывать 3 шш 4 из выявленных белков, сократив прогозируемое число субяшов до 6 или 24 (31 и «i, соответственно).

Полученные данные, которые мы рассматриваем как основу новой серотнповой классификации пневмококке являются практически важными s двух аспектах. Во-первых, в результате сравнительного анализа белковых компонентов мы выявили белковый антиген пневмококка с

м.м. 80 килодальтон, который может оказаться общим для всего вида, так как встречается во всех исследованных штаммах. Дальнейший анализ этого белка с помощью моноклональных антител или путем секвенирования и сравнение с белками микроорганизмов рода streptococcus могут решить вопрос о его видовой специфичности. Во-вторых, определение субтипов по иммунохимически активным белкам пневмококка даст возможность дифференцировать между собой некапсульные штаммы пневмококка и определить их эпидемиологическую значимость.

Анализ сочетания обнаруженных нами признаков и серотипов соответствущих штаммов (табл.2) показал следующие закономерности. Как правило, штаммы, пренадлежаше к одной серогруппе, но розным серотипэм и различающиеся по полисахаридннм парциальным факторам, различаются также и по составу белковых антигенов. В то же время нз?ли обнаружено, что оба проанализированных штамма серогруппы 35 (штамм 55/57 с/т 35С и штамм 52/57 с/т 35г) обладают идентичным составом белковых антигенов. С другой стороны, такие далекие по антигенной структуре штаммы, как 77/64 (с/т 22А) и 39/57 (с/т 29) идентичны по составу указанных белковых компонентов. Штаммы 2/56 (с/т 5), 37/57 (с/т 28А) и 47/57 (с/т 32г) одновременно имеют компоненты с м.м. 50 , 80 и 94 килодальтон, но различаются по присутствию компонентов с м.м. 63, 66 и 102 килодальтон.

Из сказанного можно сделать вывод об особой роля белков пневмококка с м.м. 50, 80 и 94 килодальтон, которые обладают серологической активностью и требуют дальнейшего изучения. Следует также отметить необходимость дальнейшего исследования общих для различных штаммов пневмококка белков с м.м. 63 и 74 килодальтон. При анализе активности сывороток больных с пневмококковой инфекцией (см. раздел 3.3.) мы показали наличие антител к некоторым из выявленных белковых антигенов, прежде всего - к компонентам с м.м. 50, 80 и 94 килодальтон.

Таким образом, наш был получен и исследован ряд белковых антигенов пневмококка, обладающих, выраженной иммунохимической активностью. Мы доказали иммунохимическую активность полностью искусственного антигена со специфичностью капсульного полисахарида пневмококка ceponma 3. В нашей работе впервые выявлена икмунохпмическая активность нескольких пневмококковых белковых аптигенов п показана возможность разработки на их основе новой серологической классификации этого микроорп..шзмз, не зависящей от серотипа штамма и выработки кппсульных антигенов.

Г- 17 -

2. Разработка методов иммунохимической диагностики пневмококковой инфекции Набор методов, направленных на этиологическую диагностику пневмококковой инфекции, на наш взгляд, должен включать методы трех уровней:

-методы выявления микробных клеток; -методы определения антигенов; -методы определения антител. Возможности иммунохимического .анализа позволяют найти методическое решение для кавдого из этих уровней. В связи с этим, в ходе выполнения настоящего исследования нами были разработаны следующие препараты для диагностики пневмококковой инфекции:

-коаггллтинационные диагностику ма для выявления микробных клеток пневмококка и определения его антигенов: капсулышх полисахаридов различных серотипов и С-полисахарида;

-латексагглх)Т1шационный диагностикум .¡уш определения антигенов пневмококка (кавсульных полисахаридов различных серотипов);

-иммуноферментная система для определения антител к капсульным полисахаридам пневмококка;

-иммуноферментная система дяа определения антител к тейхоевым кислотам пневмококка;

. -иммуноферментная система для определения антител к белковым антигенам пкевыококко;

-иммуноферментная система для определения 1«*-антатед к пневмококку.

2.1. Коагглютанационные диагностикумы Использование ревкции коагглютанацаи до сих пор не получило долкного распространения при диагностике пневмококковой инфекции. Основной проблемой, снижающей диагностическую ценность метода, является невозможность выявления с его помощью вташов пневмококка со слабой или неразвитой капсулой.

Цри разработке коагглютинациокных диагностикумов нами Сило решено три методические задачи:

1. Повышение чувствительности диагностикума в сравнении с известными аналогами с помощью обработка исходных клеток носителя.

2. Повшвние специ$ичности диагностикума за счет использования препарата очищенных антител.

3. Увеличение диагностических вогмзжностей путем применения

двух типов диагностикумов - к капсулышм и некапсульным антигенам.

Наш Оыл воспроизведен известный метод приготовления коагглютшационных _ диапюстнкумов на шдели поливалентной антиснворотки к пневмококку. Полученные серии диагностикума сравшшали по чувствительности с коммерческим диагностикумом аналогичной спещфгшостп, ПРОИЗВОДИ!.™ фирмой Pharmacia-LKB (ШВОЦЦЯ) ПОД торговой маркой Phadebact-Pneuraococcua Test. Оказалось, что первоначально приготовленные нами серия диагностикумов уступали по чувствительности коммерческим в 5-10 раз.

В целях совершенствования коагглютинационных диагностикумов ш модернизировали известный метод сенсибилизации фиксированных клеток стафилококка. Комбинацией воздействия ультразвука и буферной система растворителя нам удалось значительно повысить чувствительность диагностикума, так что в конечном счете он работал в 10-15 раз чувствительнее, чем рефзренс-днагностикум

Phadebact-Pneunococcue Test. ЭфЗЕвКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВаННОГО МеТОДО

была показана наш такке и на других моделях: н.influenzae, в.pertussis, H.neningitidia. На способ приготовления диагностикума получен патент РФ н 1762242.

Следующим этапом усовершенствования диагностикума была очистка исходного антительного препарата. За счет повышения абсолютной и относительной концентрация антител в нем нам удалось увеличить специфичность диагностикума. Дополнительное повышение качества диагностикума было достигнуто путем получения препарата антител, еффяшо очищенных от других белков сыворотки крови с помощью протеин-А-Сефарозы. Аффшная хроматография с использованием сорбента на основе белков бычей сыворотки позволила получить препарат антител, который по данным йммуноэлектрофореза не содержал антител к сывороточным белкам.

Специфичность полученных диагносашумов была проверена в реакции с различными пневмотропными бактериями или с их антигенными препаратами: бактериальными клетками рода

Streptococcus, K.pnaunoniae, В.pertussis; аНТИГвНЗМИ З.аигоиа, II.influenzae, В.pertussis.

Возникновение некапсульных форд (R-фсрм) пневмококка является хорошо известным фактом (R.Austrian, 1953). Особенно это характерно при хроническом течении пневмококковой инфекции. Такие штаммы практически невозможно иденпфлировать с помощью препаратов, специфичных в отношении кзпсульяых антигенов, иначе

ТиОл.З Использование двух типов коагглютинационшх диагностикумиь для идентификации штаммов - клинических изолятов пневмококка

Капсульные свойства Кол-во Положительные реакции коагглютинационшд. щтеымов штаммов даагшстикумов с специфичность»!

полисахаридный ТХК контроль сумма

Капсульные штаммы 29 25 4 0 29

Бескаисульше штаммы 34 ю 24 0 34

Всего 63 35 28 0 63

(56%) (44*) (100*)

как после длительной процедуры пассирования через животных, которое приводит, к восстановлению способности микроба продуцировать капсульный материал. Мы разработали метод получения диагвостикушБ, способных выявлять все штаммы пневмококка, независимо от наличия и размера капсулы. Для атих целей ш использовали антисывдротку к тейхоевцм кислотам пневмококка, которые являются видовым антигеном этого микроба и локализованы в его клеточной стенке (s.sorensen et ai, 1984). Параллельный анализ с помощью двух диагностикумов (против капсульных полисахаридов и против тейхоевых кислот) более 60 штаммов, выделенных от больных, поквзал, что 100* исследованных штаммов идентифицируются как пневмококк при использовании одновременно двух диагностикумов (табл.3). При этом 56* давали положительную реакцию с диагностикумом против капсульных антигенов и 44* - с диагностикумом против тейхоевых кислот пневмококка. Поскольку пневмококк, как микроорганизм, характеризуется присутствием на поверхности клетки хотя бы одного из указанных антигенов, из этого мы сделали вывод о том, что комбинация двух диагностикумов позволяет идентифицировать все штаммы без исключения. Такого рода методический подход был применен впервые нами.

Применение разработанных нами коагглютинациошш диагностикумов нового типа позволит не только увеличить число правильно идентифицированных штаммов пневмококка, но и более точно оценить вклад некапсульных штаммов этого микроорганизма в структуру заболеваний, в сравнении с капсулъными. Аналогичный подход, на наш взгляд, можно использовать при разработке средств диагностики других заболеваний, вызываемых инкапсулированными

микроорганизмами.

2.2. Диагностикумы для латексагглютинации

Использование частиц латекса для создания диагностикумов несет некоторые существенные преимущества, связанные с Апологической инертностью полистиролыюго досителя. Латексные диагностикумы обладают более низким уровнем неспецифических реакций, особенно при анализе патологического материала, взятого ОТ больного - сыворотки ИЛИ плазмы крови, СМЖ и Т.П. (М.Ьа1попеп,

1980).

Наш был разработан латексный диагностикум, основа!шый на препарате монодисперсных полистироловых микросфер, обладающих особыми свойствами поверхности. Мы установили, что описанный в литературе метод сенсибилизации полимерной поверхности латексных частиц (и.веувг1п, 1972), или схожий с ним метод активации полимерного носителя для ИФА (т.е. процесс адсорбции белков на поверхности полистирола) не во всех случаях позволяет получать диагностикумы с высокой чувствительностью. Исходя из теории устойчивости суспензионных систем, суспензия частиц латекса (обычно это частицы с размерами 0,5-1,0 гакрон) кроме оптимальных сорбцпонных условий должна находиться в среде, стабилизирующей ее как коллоидную систему. Для подбора оптимальных условий приготовления диагностикумов первоначально нами была исследована модельная система сорбщш иммуноглобулинов на частицы полистиролового латекса (эта часть работы была проделана совместно с кафедрой высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ им.Ы.В.Ломоносова). В качестве модельного препарата иммуноглобулинов мы использовали препарат моноклональных антител к шоглобипу. Нами были исследованы следующие параметры, характеризующие частицы латекса и состояние коллоидной системы» средний размер частиц до сенсибилизации (адсорбции), после сенсибилизации и после добавления антигена; ^-потенциал частиц до и после сенсибилизации. Главным_ параметром, характеризующим сорбцпопше свойства латексных частиц, являлась для нас величина концентрации белка, соответствующая предельному уровню адсорбции его из раствора. Ее можно приблизительно принять за минимальную концентрацию белка, необходимую для создания мономолекулярного белкового слоя на поверхности полистироловых частиц. Анализ сорбционных свойств латексных частиц проводился по оценке концентрации несорбированного белка (методом определения его

собственной флуоресценции). Было проанализировано влияние изменения концентрации модельного белкового препарата, значения рН и ионного состава сроды (Рис 5). При переходе к системе с поликлоналышми кроличьими антителами наш была использована методика, разработанная для модельной системы, с учетом сеойств поликлональншс иммуноглобулинов. Варьируя концвнтрацш) антител в свойства буферного раствора ш определила, что оатшашюв сочетание этих параметров лежит в узкой зона Евлачиа, созволящих поддерживать приготовленный диагносшсуц в виде матастабальдай суспензии, обладание» свойством быстро- флокулировать в'присутствии антигена. Этот процесс по аналогии с другими ишудологическиш методами традиционно называется! агглютинацией.

Вместе с тем, проанализировав процессы, которые могут происходить в латексной суспензии, мы сделали вывод, что флокуляция суспензии происходит, вероятно, на за счет многоточечного, взаимодействия ыеадщ антигеном е ейскодыозй частицами, а за счет изменения поверхностных свойств часиЩ даагностикуыа, прежде всего - нейтрализации поверхностаого зарадй частицы, с-потенциал сенсибилизированных частиц латекса настолько близок к нули (Рис.6), что дальнейшее его умшщцзяие аа счаз нейтрализации антигеном, может привести с выходу систеш к» равновесия и флокуляции (агглютинации)..

Методические аспекты этой работа & настоящее, время оформляются в вида заявка на иазеш.

Использование высокоочивешла аатителыш препаратов для приготовления латексШл днагностикуыаа позволяет взбежать параллельной адсорбции балластных сиворотачшг белков,, свшшщвх специфическую активность диагностикуыа. Особенно- важно выпоишь вто условие дяя поливалентных сывороток, в частности - при использовании поливалентной пуловой антисыворотки против всех серотипов пневмококка. На основе оригинальной методики, разработанной наш, были получены моно- и полиспецифические в отношении капсульных антигенов пневмококка диагностикуыы.

Имевшиеся в нашем распоряжении частицы латексов исходно обладали отрицательный поверхностным зарядом, что предполагалось, всходя из -химических свойств поверхности модифицированных латексншс частиц, и было ваш показано путем измерения их влактрофоре гиче ской подвижности (рис.6). В процессе сорбции антител различного происхождения общий заряд частиц становится близок к нейтральному. При этом мы наблюдали изменение равновесия

концентрация белка (мкг/ил).

Рисунок 5. Изотермы адсорбции эпоксидированных латексов при различных значениях рН среды.

га

Ц о1----'->

О 15 30 45

концентрация бепка(ыкг/мл)

Рисунок 6. Изменение поверхностного заряда эпоксидированшх частиц латекса в процессе сорбции препарата антител при увеличении концентрации бёлка в растворе

коллоидной системы и как следствие - неслещфичьокую фюкуляцши частиц в условиях сорбции из раствора с высокой концентрацией белка. Кроме того, устойчивость системы зависила и от ионного состава использованного буферного раствора, что вполне согласуется с известными представлениями в этой области. Наш! были определены вид, концентрация и значение рН буферного раствора, позволявшие сохранять нативные частицы латекса в стабильном состоянии с небольшим суммарным отрицательным зарядом частиц. Поскольку процесс сорбции белков (иммуноглобулинов) снижал этот заряд, то для поддержания стабильности системы ш проводили сорбцию в условиях очень низкой концентрации белка. Анализируя изотермы вдсороции моно- и поликловалышх антител на поверхность частиц латекса в таких условиях, мы обнаружили (рис.5), что одновременно эффективный и устойчивый диагкостикум можно получить только в условиях, соответствующих образованию мономолекулярного слоя не поверхности полимера. Чувствительность диагностикумов, полученных этим методом, в зависимости от типа антител и антигена варьировала в интервале от 30 до 240 нг/мл. Эти значения соответствуют уровню циркуляции капсульных антигенов при пневмококковой инфекции.

Таким образом, на основе анализа физико-химических факторов устойчивости коллоидной системы, состоящей из частиц латекса, нами разработан способ приготовления латексных диагностикумов, несущих на поверхности частиц антитела. Полученные этим методом диагностикума предназначены для иммунохимической детекции капсульных антигенов пневмококка. Следует отметить, что, хотя эмпирическое использование латексагглютинационных диагностикумов известно уже давно', до олх пор не было проделано систематического исследования процесса сорбции антител на поверхности латексных чэстиц и стабильности получаемой коллоидной системы со специфической активностью по отношению к соответствующему антигену. Такого рода исследование нами было проделано впервые.

2.3. Диагностикум для РИГА

Реакция пассивной гемагглютинации является широко распространенным методом иммунохимической диагностики. Для отделения . антител к полисахаридам пневмококка нами был уьарлйотан эритроцитарный диагностикум на модели полисахарида серсткт 3. Однако даке при реакции с кроличьими антисыворотками этот диагностику« давал относительно невысокие титры (не более 1:1024*). измеыедая условий сенсибилизации эритроцитов или условий

проведения реакции не дали существенного увеличат!« чувствительности диагнос-тикума, что свидетельствует о низкой эффективности использования РЩ'А на модели пневмококковой инфекции. Анализ сывороток крови больных людей с помощью такого диагностикума давал еще более низкие титры, срэгшмыэ с титрами реакции с контрольным диьгностикумом. Вероятно, в сравнении с МОЛ, активность взэимодействия антител с капсульныш полисехаридамп не MOSBT быть адекватно отражена в результатах реакции, т.к. в РИГА положительную реакцию дочг только антитела класса 1дм и некоторые формы агрегированных иммуноглобулинов.

В связи с полученными данными, ко тоще также косвенно подтверждаются сведениям! из извзстной литературы, мы не рекомендуем использовать РИГА как основу для иммунохимической диагностики пневмококковой инфекции.

2.4. Системы иммуноферментного анализа для опрэделения антител к полясзхаридтшм антигенам

Иммунофэрмсн'тннй анализ используется з медицине около 20 лет, однако до сих пор не было известно ни одной коммерческой системы для опрэделения антител к пневмококку с помощью ИОЛ. Были опубликованы данные некоторых исследователей о применении ИФА на основе капсулькых полисахаридов пневмококка для оценки уровня антитольного ответа при вакцинации полшалентной гиевмококковой

БаКЦИНОЙ (H.Rugrel et al, 1980, М.Helville-Smith, F.Shaffild,

19зо). Имеются е>лшгпшо наблюдения об уровне антител к капсульшм полисахаридам при острой пневмонии, вызванной пневмококком (е.Berntsson et al, 197а). в последние голы появились сообщения об использовании пновмолизлнз, как антигенной основч ИФА в эксперименте (2.Jalonen, 1990). Ми решили задачу создания иммуно$врмоиТ1Шх систем для диагностики пневмококковой инфекции на основе трех и шов антигенов - капсульных полисахаридов, тейхоевых кислот л белковых антигенов пневмококка.

Одной из основных проблем, решенных нами при приготовлении ишуиофзрментшх систем на основе полис ах аридных препаратов, являлось повышение уровня сорбции очищенных полисахаридов на поверхности полистирола. Как известно,'этот феномен связан с более выраженным проявлением гидрофильных свойств полисахаридов при очистке пх от гидрофобных белковых молекул. Кы применили известный метод конъюпфования полисахаридов с имму.-охимически неактивным П0ЛИП9ПТПД0М - полп-ь-лизином (B.Gray et al, 1982). Использование

00 в ИФЙ

1000

500

1- антисыворотка с/т 3

2- внтисыворотка с/г 6

3- антисыворотка с/г 9 <

4- антисыворотка к

штамму сис 5- контрольная

О

кроличья сыворотка

12345678 РАЗВЕДЕНИЕ СЫВОРОТКИ

Рисунок 7. Кривые титрования кроличьих антисывороток к пневмококку различных серотипов и к мутантному штамму в разработанных системах иммунофермантного анализа с гомотипическими полисахаридами.

созданного конъюгата и подобранные условия проведения сенсибилизации планшетов позволили добиться создания системы, в которой определятся антитела к капсульным полисахаридам пневмококка, в зависимости от серотипа выбранного антигенного препарата: I, 3, 6В, 8, 9н, 15г, 19В и 23г. Отработка условий проведения ИФА проводилась с помощью кроличьих тшоспецифических сывороток соответствующего серотша. При этом был показан высокий уровень специфичности при использовании выделанных наш полисахаридвых препаратов (Рис. 7).

При разработке иммуноферментной системы для определения антител к тейхоевым кислотам пневмококка был применен аналогичный подход. В этом случве для отработки условий сенсибилизации была приманена внтисыворотка к мутантному штамму пневмококка, который является суперпродуцентом тейхоевых кислот. Также, как и для капсульных полисахаридов, была показана высокая специфическая активность разработанной системы. При анализе соотношения специфической и не спа цифиче с кой активности зтой системы мы установили отсутствие антител к тейхоевым кислотам в использованных типоспецифичэскиг кроличьих антисыворотках, что, вероятно, отражает высокий уровень адсорбции гетеротипических

езтител при приготовлении пневмококковых сывороток.

2.5. Системы иммуноферментного анализа для определения ангттел к белковым антигенам Если попытки приготовления шмуноферментных систем на основе шлисахаридных антигенов пневмококка в литературе все-таки описаны, использование для этих целей белковых антигенов этого микроба было впервые предложено и осуществлено нами. Для определения оптимальных условий проведения реакции ИФА нами были проанализированы различные препараты белковых антигенов, выделенные по оригинальной методике (раздел 1.2.). Оказалось, что экстракция цетавлоном различных штаммов ■пневмококка дает непдентичные препараты. Кы показали, что из всех иммунохимически активных препаратов, содержащих различные белковые компоненты, наибольшей специфической активность!) обладал штамм 11/56 серо типа 3. Именно этот штамм используется при производстве шгыунофврментной системы для определения антител к пневмококку. Анализ состава белковых антигенов из этого штамма, проведешшй нага д отчасти описанный выше, указывает на высокую концентрацию общих серологически активных белков, что, видимо, и составляет основу его активности. Система основана на принципах твердофазного пглуЕОферментного анализа в стандартных 56-луночных планшетах. Для

Табл.4 Реакция в ИФА с белковым антигеном сывороток при различных разведениях

Группа Кол-во Положительные реакции Отрицательные реакции

сывороток в разведениях: в разведениях:

3200 6400 12800 3200 6400 12800

Больные с 121 109 85 71 12 36 50

пневмококковой

инфекцией .

Больные с 45 17 0 0 28 45 45

инфекцией, вызываемой гемофальной палочкой

Здоровые доноры 185 35 12 9 150 173 176

подтверждения специфической активности и чувствительности системы использоваг) специально подобранные контрольные сыворотки с высоким и низким уровнем антител к пневмококку. Критерии положительной реакштк расчитанн по енализу двух групп больных с хроническим бронхитом, вызванным пневмококком (опытная группа) и гемофяльной палочкой (контрольная группа) (табл.4). Данные, представленные в таблице. соответствуют выбору критерия положительной реакции б виде величины значения Еи при определегагом разведении сыворотки 'диагностическое разведение). Определение чувствительности и специфичности реакции, проведенное последовательно для разных рпвздений сывороток, позволило нам установить, что оптимальные значения этих величин (67% и 93*, соответственно) достигаются в разработанной нами системе при разлздении 1:6400, если в расчет принимаются значения с величиной не кьнее 400 кн. Именно эти значения выбраны нами, как критерий положительной реакции в данной иммунофврмзнтной системе. В связи с тем, что антитела к пневмококку являются нормальными антителами практически для всех здоровых людей, критерии положительной реакции для других клинических групп или для оценки иммукодефицитных состояний необходимо подбирать на основании анализа гетерогенности реакции в пределах исследуемой группы и использования специальных контрольных групп.

К настоящему времени нами накоплен обширный опыт по использованию этой системы при анализе антител к пневмококку в различных возрастных, географических и клинических группах. Результата использования иммуноферментной системы в экспериментальных условиях и для анализа клинического материала представлены в следующем разделе.

На спосоо диагностики пневмококковой инфекции, в основе которого лежит иммуноферментный анализ с использованием белкового антигенного препарата, имеется положительное решение о выдаче патента. На основа этой разработки утверждена Фармакопейная статья 42-380ВС-91 и Производственный регламент В 359-92. Выпуск системы освоен в 19В8 г, предпгиятием "Антиген" (ныне ФЛО "Ферейн, Г.Электрогорск), в В 1992 г, - фирмой "Илья Мечников" (Москва).

3. Использование средств иммунохимической диагностики пневмококковой инфекции 3.1. Классификация методов иммунохимической диагностики Достижения иммунологической науки в области изучения

взаимодействия антител с антигенэш привели к возникновению нескольких основных направлений иммунохимического анализа, которые ш предложили классифицировать по характеру проявления реакции антиген-антитело (табл.5):

ТаОл.5 Методы имму нохкжчз ской диагностики

Тип

Метода

Применение твердой фазч

Наличие Чув-ть Время метки г/мл аь.лиза

-_ь _7—

нет 10 -10 Секунды-часы

Прямые

Преципитация, агглютинация

нет

Пассивно РПГА, РИГА, нет

агглю- РТПГА, ко- и ткнационные латексагглютинация,

-6 -9

Эритроциты, 10 -10 Секунды-бактерии, минуты

латекс

Индикаторные РИА. ИФА, полимеш, РШФ стекло

-7 -9

изотопы, 10 -10 0,5-24

ферменты,

фпуорохромы

час.

Иымуносенсоры .Электрохимические ферментный различные Секунда-

оптические, электрод, типы шшуты

-6 -9

пьезокристаллические транзистор, 10 -10 пьезокристалл

-прямые метода анализа, основанные ни простом взаимодействии антител непосредственно с корпускулярными шш растворимыми антигенами, - методы агглютинации и преципитации;

-пассивноагглютинациошше метода, основашыа на агглютинации частиц, сенсиОилизированных- антигенами или антитела!®, - РПГА, РИГА, методы агрегатГе^ахч-дш 1\н эцгы, коагглютинации, латексагглютинации к т.п.

-индикаторные метода, с цспогьаовгние^ специальных молекулярных структур, дающих- опосредованную информацию оО образовании комплекса. антигвн-аниг.-гло, - радиоикоЛунологическпЛ, и-мунофлуорв сцентныИ, иммуиофер*'Л!г.-':на';. хамуйсхекшлш: несцэнтшй анализ;

-иммукосенсорц, игл- метода, о«?-''ватага на объединения биологически- чувствателыкн-о материала с системой передачи и

трансформации физического сигнала, сопрововдащего реакцию.

Каждое из этих направлений, обладая собственными достоинствами и недостатками, может быть использовано как основа для разработки того или иного средства иммунохимической диагностики, в зависимости от целей проводимого анализа и особенностей диагностируемого патологического состояния. При анализе имеющихся данных об использовании даагностикумов, соответствующих перечисленным направлениям иммунохимического анализа, мы пришли к вывода о необходимости применения для диагностики возможно большего числа методов, рекомендованных к использованию при данной патологии, с целью получения максимально достоверной информации о состоянии внутренней среды организма и функционировании его защитных механизмов. В связи с этим, на наш взгляд, для кавдого из видов инфекции необходима разработка средегв диагностики, позволяющих работать на каждом из перечисленных в начале предыдущей главы уровней: для определения возбудителя, его антигенов и антител к ним. Этот подход отражает механизм развития большинства инфекционных заболеваний и основан на классических принципах Кохе о взаимосвязи, возбудителя и возникшего заболевания.

Классификация, основанная не механизме проявления взаимодействия антигенов с антителами позволяет при разработке новых средств иммунохимической диагностики предопределить роль диагностикума в иерархии методов, уже разработанных для данного патологического состояния. Как правило, усовершенствование методе в пределах одного из перечисленных направлений не дает существенных преимуществ в получении дополнительной информации. Лишь переход к следующему, как правило более чувствительному и специфичному уровню дает качественно новый подход в диагностике.

Иммунохимическая диагностика пневмококковой инфекции, на наш взгляд, может быть основана на свойствах трех групп антигенов: квпсульвых полисахаридов, тейхоевых кислот (С-полисахарида) и белковых антигенов пневмококка. В силу различий в локализации и функционального значения эти антигенов, они имеют и неодинаковое значение в процессе развития пневмококковой инфекции. Нами была высказана гипотеза о возможности использования для иммунохимической диагностики пневмококковой инфекции кроме полисахаридных маркеров также и белковых антигенов этого микроба. Для подтверждения этой гипотезы мы предложили оригинальный подход, заключ&жядайся в получении препаратов белковых антигенов

- зо -

пневмококка, свободных от капсульных полисахаридов и тейхоевых кислот, из разных штаммов микроорганизма. При этом оценку их пммунохЕМЛческой активности мы предложили проводить с помощью пуловой человеческой сыворотку, содержащей антитела к пневмококку (сыворотки крови больных с подтвержденной пневмококковой инфекцией, или здоровых доноров с высоким уровнем нормальных снтител). Этот подход позволил нам выявить доминантные и специфические компоненты в составе белковых препаратов и доказать наличке серологических сдвигов у пациентов в ответ на эти компонента при тфэкционном процессе, вызванном пневмококком.

Следует подчеркнуть, что особенности использования маркеров, связанных с полисахаридами или белковыми антигенам, определяются, кромз всего прочего, биохимическими свойствами этих структур. Известка, что колекулы полисахаридов обладают С'олее сысокоО устойчивость© к действию гидролаз плазмы крови, в среаЕЭШЯ с белквга. Б связи с этим логично предположить пзодкпазсовуэ азэчгя>сть определения разных типов антигенов в крови в процессе рззеятпя ппэекококкот'оЯ инфекции. С другой стороны, на прггдзро забодекш^З, Еызхгззвки другими инкапсулированными бактериям, нзвзстпо, что антитела к капсульным полисахаридам пырсбатываятся в. огласительно невысоких титрах. Предложенный нами подход в- определении антител к белковым антигенам пневмококка позволяет преодолеть эту трудность в ишунохимической диагностике пиеЕмококхоЕой инфекщп.

Для шшзатрации возможностей разработанных нами методов пялунохпмической диагностики мы представляем данные, полученные при исследовании экспериментального материала и сывороток больных и здоровых людей разного возраста, полученные из различных клиник Российской Федерации и Республики Украина. Кроме этого мы провали иодельные эксперименты по исследованию уровня сывороточных антител у штатных с пневмококковой инфекцией.

3.2. Определение серологических сдвигов при пневмококковой инфекции у морских свинок

Воспроизведение пневмококовой инфекции у животных представляет собой неразрешенную до сегодняшнего дня проблему. Шмщиеся данные о течении инфекции у некоторых видов животных (мыш, крысы, пшшпшы, морские свинки), как правило, не несут прямой связи с особенностями течения инфекции у людей. Есть сведения о возмонности воспроизведения пневмококковой инфекции у

0() в ИФЯ '«"> 1500

1000 500 0

✓н

Н-1-1-1

12 3 4

•н-и

1

НЕДЕЛИ БОЛЕЗНИ

00 в ИФЯ <ЕЮ1500

1000 500 О

1

НЕДЕЛИ БОЛЕЗНИ

ч

ч

Н-1-1

2 3 4

3

Рисунок 8. Основные типы изменения уровня антител к белковым антигепм пневмококка у морских свинок при пневмококковой инфекции

кроликов. Общепринятая иодель пневмококковой инфекции у лабораторных животных не разработана, что затрудняет возможности интерпретации данных серологического анализа у больных ладей.

С целью воспроизведения пневмококковой инфекции у животных в настоящей работе мы использовали морских свинок. Анализируя возможности ишунохшических методов диагностики, мы оценивали лишь гуморальное звено ответа при воспроизведении инфекционного процесса па шрских свинках (работа осуществлена при участии с.н.с., к.и.н. С.И.Елкшюй). Морских свинок интраназально заражали вирулентной культурой пневмококка и определяли активность в ИФА с белковыми антигенами индивидуальных сывороток крови животных после интракардиальной пункции с интервалом в неделю.-

Оказалось (Рис. 8), что до введения культуры часть животных виэла антитела к белковый антигенам пневмококка. В процессе развития инфекционного процесса, выражавиегося в появлении признаков респираторного заболевания, у одних животных отмечено изменение уровня антител в сыворотке, а у других этот уровень нанялся незначительно. По типу реакции можно было выделить три основные группы:

. I. Кивотныэ имели относительно невысокий или средний уровень антител до заболевания и в процессе болезни он значимо повысился. К этой группе относилось 12/30 животных (40*).

2. Животные имели высокий уровень антител до начала заболевания и этот уровень существенно не изменился - 9/30 (30*).

3. Низкий- уровень антител до начала заболевания практически на изменился во время болезни и после нее - 8/30 (27*).

Крош того у одного животного зарегистрирован высокий уровень антител до начала -заболевания, со снижением его в процессе выздоровления до среднего уровня (3*).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о Еысома гетерогенности иммунного ответа при пневмококковой инфекция. Тип реакции, вероятно, зависит от исхо.-юго уровня антител у животного, а таксе от индивидуальной реактивности особи. Подобная зав схема реагирования была выявлена нами в дальнейшем, при анализе динамики гаялунного ответа у людей.

3.3. Анализ сывороток детей и взрослых больных

Для подтверждения специфической активности шмунооерментного анализа необходимо использовать рэференс-метод, позволяющий определять тот пз маркер, что п анализируемый метод. Однако до

настоящего времени не известно ни одной коммерческой системы для определения антител к пневмококку на основе нммуноферментного анализа или иного метода. Были опубликованы результата исследовательских работ по определению антител после введения пневмококковой вакцины с помощью ИФА. В качестве антигенных препаратов была использована полисахаридная вакцина, содержащая 23 капсульных полисахарида, и индивидуальные полисахарида, входящие в состав вакцины (H.Rusael, 1980, A.Freijd et al, 1984). ДЛЯ ТОГО, чтобы составить гомоге-ную группу сравнения из больных с более гетерогенным спектром 'птаммов-возбудителей, необходимо иметь сыворотки крови больных с подтвержденным диагнозом пневмококковой пневмонии с известным серотипом пневмококка. При анализе имевшейся в нашем распоряжении выборки в 139 больных из клиники Института педиатрии РАМН (данные д.б.н. Л.К.Катосовой) наиболее часто были высенаы пневмококки серогрупп и серотипов I (10 случаев - 7,2%), 3 (10 случаев - 7,2%), 6 (15 случаев - 10,8%), 14 (20 случаев -14,4%), 19 (15 случаев - 10,8%). В 38 случаях серотип пневмококка не был определен (нетипируемые штаммы, 27,3%). Кроме того, внутри к8»дой из этих групп больные различались по возрасту, диагнозу и характеру протекания патологического процесса. Для сравнительного внализа нами были преднамеренно выбраны сыворотки крови детей, так как данные предварительного исследования показали относительно высокий уровень антител у здоровых взрослых (более 400 eu).Проведенный анализ серологических сдвигов у больных детей показал, что иммунный ответ на капсульные полисахариды пневмококка в таких группах проходит неоднородно (работа осуществлена совместно со с.н.с. Института педиатрии РАМН, д.м.н.М.А.Улановой).

МЫ обнаружили, что у здоровых детей активность реакции в ИФА меньше, чем у взрослых, что, вероятно, связано с постепенным нарастанием уровня нормальных антител с возрастом. В то se время, у детей с подтвержденной пневмококковой инфекцией уровень антител к белковым антигенам значительно выше, чем у здоровых дотей и статистически не отличается от уровня антител у взрослых здоровых доноров (рис.9). Минимальное содержание антител выявлено в период от нескольких недель после рождения до трех лет (значения активности реакции в диагностическом титре составляют от 100 до 400 eu). У новорожденных в период нескольких первых недель жизни определяется относительно высокий уровень антител, что связано с наличием в крови новорожденных материнских igg-антител в результате их трансплацентарной передачи.

ОО.ЕУ

1200 900 600 300 О

п=32 »

I

I

1

п=15 I

I

п=89.

А

—гЦг

•а? £

Т

Рисунок 9. Средний уровень и распределение активности реакции сывороток в ИФА с белковыми ант..генами! I) здоровые дети, 2) дети с пизпиококковой инфзкцией, 3) взрослые доноры

Ч X

а

«о х

«3 о я с:

0 с

1

и.

1600

1200

800

400

ОО.ЕУ

Оо °° О 8 оо О о <юо<ьо оо „

<Р

о °о 8 о

•Г о'

ооо

<?

о

о о

о

о •

: Л

400

800 1200 белок

г=+0.80 г= Ю.76

>600

СЮ.ЕУ

Рисунок 10. йэррэлацш» результатов НЗА у детей с осложненной пнеклонией при определении антител к белковый антигвнем п тойховЕШ кислотам пневмококка

о

о

о

о

о

о

Сравнительный анализ данных, полученных при ИФА с различными антигенами пневмококка - капсульными полисахаридами, тейхоевыми кислотами и белковыми антигенами, показал однотипность происходящих серологических сдвигов. При анализе корреляции между данными иммуноферментного анализа с использованием различных антигенов нами выявлено следущее. Сравнение двух типов ИФА - на основе белковых антигенов и тейхоевых кислот - указывает на высокий уровень взаимосвязи этих показателей (рис.10). Коэффициент корреляции для разных г^упп исследованных этими методами составил: для здоровых детей (п= 23) +0,72, для взрослых доноров (п= 89) +0,58, для детей с острой неос."ожненной пневмонией (п= 91) +0,61 и для детей с осложненной пневмонией (n= 114) +0,76. При анализе группы детей с бактериологически подтвержденной пневмонией этот коэффициент составил +0,80. Коэффициенты корреляции для резу.)шТатов ИФА с белковыми антигенами и капсульным полисахаридом серо'лота 3 для перечисленных групп составляли от +0,45 до +0,56, а коэффициент корреляция ИФА с тейхоевыми кислотами и полисахаридом серотипа 3 оказался равным +0,37. Таким образом, мы доказали высокую частоту совпадений при анализе содержания антител к известному видовому антигену пневмококка - твйхоевым кислотам и антител к исследованным белковым антигенам. Это обстоятельство позволяет нам сделать вывод о возможности использования разработанной нами системы для определения антител к пневмококку для анализа гуморального ответа при пневмококковой инфекции.

При этих условиях болев информативным и методически простым является определение антител к видоспецифическим антигенам пневмококка. Ранее уже было показано, что при пневмококковой инфекции вырабатываются антитела к общему видовому антигену пневмококка - тейхоевым кислотам (С-полисахариду) (Jotter et ai, 1982, B.Gray et ai, 1983). На основании выводов, сделанных нами при изучении антигенной вариабильности белков пневмококка, мы предложили использовать препараты белковых антигенов, как антигенов, не связанных, с серотипом этих бактерий. Б связи с этим мы сравнили результаты, пг пученные при анализе сывороток больных детей и взрослых и сывороток здоровых лиц в ИФА на основ" тейхоевых кислот и белковых антигенов пневмококка (рис.9 и 10).

Более подробный анализ полученных показал, что среднее значение активности реакции в ИФА как с тейхоевыми кислотами, так и с белковыми антигенами у детей с пневмококковой инфекцией выше, чем у здоровых детей. Однако хотя бы в небольшом количестве эти

антитела выявляются у оольшинства здоровых детей. Очевидно, что уже в раннем возрасте происходит выработка антител к условнонатогенным микроорганизмам, широко распространенным в окрунаицей среде. При ана"изе изменения уровня антител к пневмококку у детей наш были получены данные о постепенном его увеличении с возрастом, с достижением к 10-14 годам уровня антител, характерного для взрослых. При анализе сывороток взрослых оказалось, что средняя активность в ИФА с тейхоевьмн кислотами и белковыми антигенами выше, чем для детских сывороток. Одновременно ш обнаружили, что у взрослых больных средний уровень даже несколько ниже, чем у здоровых доноров (588±143 и 380±160, соответственно). Хотя эти различия, сторого говоря, не являются статистически значимыми, тем не менее эта тенденция была выявлена наш при анализе с помощью двух химически противоьлложеных и независимых антигенов (методом преципитации в геле со специфическими ангисыворотками доказано отсутствие их взаимной примеси). В связи с эта.!, уместно предположить что тленно снысение уровня антител к пневмококку '-чжет являться фактором риска для развития пневмококковой инфекции. Нами было показано на нескольких группах здоровых доноров, что уровень антител у них является стабильно высоким и дополнительно характеризует исследуемые группы, как группы с пониженным уровнем риска в отношении инфекционных заболеваний, вызываемых условнопатогенными микроорганизмами.

Большое значение при анализе иммунного ответа на белковые антигены пневмококка мы придавали изменению его динамики. Анализ индивидуальных реакций был затруднен отсутствием сведений об уровне антител к пневмококку в период, предшествовавший заболеванию. Однако и в этом случае мы обнаружили разные типы ответа на антигены пневмокока, сходные с типом ответа при моделировании пневмококковой инфекции на морских свинках (рис.II).

С точки зрения интерпретации роли белковых е"тигенов, мы проанализировали индивидуальные сыворотки пациентов с бактериологически подтвержденной пневмококковой инфекцией в кыыуноблоте с белковыми антигенными препаратами пневмококка. Для этой цели мы использовали препарат белковых антигенов, выделенный цетавлоновой экстракцией из штамма 11/56. Одновременно сыворотки анализировала в ИФА с препаратом белковых антигенов. Данные представлены в (табл.6). 18 из 20 исследованных сывороток были позитивными в реакции с белком с м.м. 80 килодальтон, 13 - с

Рисунок II. Основные типы динамика антител к пневмококку в сыворотке крови у больных с пневмококковой инфекцией.

Табл.6 Активность белковых антигенов пневмококка с индивидуальными сывороткаш! большее с пневмококковой инфекцией в ИФА и нммуноблоте

н сыв-кп Величина Молекулг-ная масса белков,-проявляемых оп (си) в ишуноблоте (килодальтон)

I 713 94 80 50 44 40 17

2 656 80 50 44 17

3 404 94 80 50 49

4 482 80 63 50 49 44 40

б' 643 94 80 63 50 49 44 40

6 533 94 ВО 63 50 44 40 17

7 465 94 80 50

0 633 94 80 50 44 17

9 546 29

10 375 94 80

II- 413 94 80 74 50

12 434 94

13 348 94 ВО

14 496 94 ео 50

15 490 94 ВО 50

16 300 . 94 ВО

17 486 94 80 50 44 •

10 401 94 80

19 537 • 94 80 74 50 44

20 327 94 80

белком 50 кило да ль тон и II - с белком 9-4 кило дальтон. Реакции с белками с м.м. 40, 44 и 63 килодальтон наблюдались реет. Присутствие выявленной нами ранее триады белков с м.м. 74, 80 и 94 кплодальтоп у индивидуальных больных не било столь ха: жтерно, как для пуловой сыворотки - всего у двух больных, что, вероятно, связано с особенностью анализируемой выборки. Однако антитела к двум компонентам из этой триады - белкам с м.м. 80 и 94 килодальтон одновременна присутствовал! у 16 Сольных (80$). Обращает на себя внимание появление антител к пневмококковым ентигепси с м.м. шгаз 50 килодальтон у большинства больных с гксокш значением оптической плотности реакции КОА. Вместе с тем, у одного больпого выявлен высокий уровень антител в ИФА при

отсутствии антител к высокомолекулярным белкам и наличии антител к белку с м.)!. 29 килодальтон (больной 9 в табл.6).

3.3. Иммуноферментная система для определения 1дА-антител

Выработка антител, относящихся к определенным изотипам иммуноглобулинов, привлекает внимание исследователей при анализе закономерностей иммунного ответа при различных видах инфекционного процесса. Мы разработали иммунофэрментные системы для определения 1дА-антител к пневмококку в слхне и других биологических жидкостях организма на основа пр-паратов белковых антигенов, а также -капсульного полисахарида серопна 3 и на основе тейхоевых кислот. Для проявления реакции использовали кроличью антисыворотку к о-цепи (РЬаппас1а, Швецкя) или конъюгат против тдА человека ("ввуас", Чехословакия).

При определении хдА-антител у детей с подтвержденной пневмококозой инфекцией в некоторых случаях мы обнаружили существенные отличия в активности реакции в сравнении со здоровыми детьми (табл.7,8).

Как показывают полученные данные, при определении 1дА-антител к пневмококку иммуноферментнкй анализ на основе белковых антигенов пневмококка дает результаты, сходные с показателями для тейхоевых кислот и капсульных полисахаридов. Это дополнительно подтверждает возможность использования ИФА на основе белковых антигенов пцевмококкэ для оценки антительного ответа к этому микрорганизму.

Наибольшие различия в активности реакции между здоровыми и больными детьми были выявлены при хроническом течении процесса (Табл.8). Использование систем для определения внтител в слюне весьма рерспективно, так как позволяет избежать получения крови у пациента, сокращает процедуру анализа из-за отсутствия неоСходиадсти получать сыворотоку крови.

Разработанные системы были также использованы для определения ХдА-антител в молоэд кормящих матерей, При этом средние показатели антител к тейхоевыад щрлртам в группе из 45 женщин составили 730±70 Ей, тогда как ^тртел к белковым антигенам этот показатель составил 360±30 рн.

Разработанные системы мог^т Аргрдь.зсфатьдя щда мониторинге хстА-антител к пневмококку как у больных, так $ $ группах риска. Применение этих систем предполагает наличие специальных показаний и подтверждения пневмококковой инфекции другими методами иммунохимической и бактериологической диагностики .

ТаОл.7 Содержание антител к антигенам пневмококка в слюне у детей в ИФА с различными антигенами пневмококка (в скобках - объем изученной группы)

Активность реакции в ИФА (Еи)

Антиген острая пневмония ОРЗ,острый ОРЗ, острый контроль

бронхит бронхит с

высевом эр

полисахарид 450 ± 30 480 1 10 520 * 30 420 ± 30

с/тЗ (45) (III) (42) (57)

тейхоевые 440 ± 30 380 ± 10 370 ± 20 350 ± 40

гаслоты (45) (III) (42) (60)

белковые 520 ± 40 520 ± 20 530 ± 30 49С I 40

антигены (43) (114) (45) (60)

Табл.8 Содержание 1дА-ангител к антигенам пневмококке в ротоглоточном секрете (слюне) здоровых детей и больных хронической ппешонпей (возраст 1-6 лет)

Активность реакции в ИФА (Еи)

Вид антигена Больные Здоровые

(количество) (количество)

полисахарид с/тЗ 610 ± 40 460 * ЗО

(36) (72)

тейхоевые кислоты . 640 ± 70 360 ±

(35) (70)1

белковые антигены 540 ± 30 4.Ш г. 30-

(36,). (&)')>

3.4. Использование; дизгносгшсуеоа для' кбй^лйййгйцкн и латексагглвтизэцлд'' Для проверка чувствительностл'1 а специфичности коагглютинащюшюго диагностику^» аа- основа оини-адворотки наци были нспользованм следу щиа препараты: контрольные штвнш пневмококка' пз< коллекции ШИ ьзкгшг и' сывороток им.И.И.Мечникова.

- И'-

контрольные штамма пневмококка из коллекции Института сывороток (г.Копенгаген) и капсульше полисахарида, выделенные в ходе выполнения настоящей работы. Результаты испытаний представлены в табл.9.

Как видно из -этой таблицы, чувствительность созданного диагностикума была достаточной для выявления пневмококка- любого серотипа, независимо от происхождения контрольной -панели антигенов. Это позволяет использовать данный диагностикум для выявления пневмококка независимо от серотипа, что является основной задачей при идентификации этиологии инфекционного заболевания. Существенным дополнением к его возможностям является способность диагностикума на основе антисыворотки к тейхоевым кислотам пневмококка выявлять некапсульные штаммы пневмококка, как это было показано нами выше (см. табл.3).

Для оценки возможностей использования полученного диагностикума для определения антигенов пневмококка в клиническом материале нами было проанализировано 70 сывороток взрослых больных с подозрением на пневкококовую инфекцию. Для сравнения использован диагностикум для определения антигенов пневмококка фирмы пв1окег1вих" (Франция).(Табл.10)

Как видно из полученных данных, разработанный диагностикум с высокой частотой выявляет антигены пневмококка в сыворотке крови и может быть использован при подтверждении этиологии пневмококковой пневмонии.

Диагностикум был испытан в - лаборатории микробиологии п иммунологии НИИ педиатрии РАМН и лаборатори острых менингитов НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалея РАМН. Серийный выпуск диагностикума освоен с 1992 г. Фирмой "Илья Мечников".

Полученный диагностикум для латексагглютинации испытан в аналогичных условиях. Показана его высокая чувствительность и специфичность. (Табл.11).

и результате выполнения нашей работы были созданы диагностикумы, позволяющие получать шгформацию о развитии пневмококковой инфекции ~о определению бактериальных клеток, капсульных и некапсульных антигенов, антител к белковым антигенам пневмококка в сыворотке крови и 1дд-антител в слюне у больных пациентов или в молоке кормящих женщин. Получение комплексной информации о развитии инфекционного процесса, включая возникновение антигенемии, развитие системного гуморального иммунного ответа и местного иммунитета позволяет всесторонне

Табл.9 Специфическая активность коагглвтинацнонного диагностикуыа на основе пуловой антисыворотки (ошщ-сыворотка)

Контрольный антигенный Реакция опытного Реакция контрольного препарат диагностикуыа диагностикума

Фиксированные клетки пневмококка различных серотипов (62 штамма, Копенгаген) Сиксированные клетки пневмококка различных серотипов (90 штаммов, tfccKBa, НИИ ВС) Капсульные полисахариды пневмококка (5 серотипов) Тёйхоевые кислоты Препараты антигенов Других микроорганизмов

(Ь.pertussis, И.influenzae, 3.aureus, E.coli, Streptococcus)

Положительная 82/82

Положительная

90/90 Положительная 5/5

Положительная Отрицательная

Отрицательная 0/82

Отрицательная

С 90 Отрицательная 0/5

Отрицательная Отрицательная

Табл.Ю Соотношение реакции при выявлении антигенов пневмококка разрабОТаННЫМ ДИаГНОСТИКуМОМ И ДИЬГНОСТНКУМОЫ BieMerieux в

сыворотке взрослых больных с острой пневмонией, вызванной пневмококком.

Реакция диагностикума BloMerieux

позитивная негативная всего

Реакция нового позитивная 40 0 40

диагностикуыа

(коагглютинация) негатгвная 3 27 30

всего 43 27 70

Табл.II Чувствительность латексных диагностикумов

Специфичность Антигенный Чувствительность

диагностикума препарат (нг/мл)

к полисахариду I9B капсульный полисахарид 30 - 120

I9B

к тейхоевым кислотам тейхоевые кислоты 120 - 240

поливалентный -апсулыше полисахариды 120 - 240

3, 6В, I9B

описать развитие патологического состояния с точки зрения современных представлений об иммунном ответе при инфекционном заболевании. Для практического здравоохранения нами разработаны и внедрены в производство современные препараты для экспресс диагностики пневмококковой инфекции. Впервые в мире предложена иммуноферментная система для определения антител к белковым внтигенам пневмококка. Доказан высокий уровень корреляции между результатами анализа антител к белковым антигенам и к тейхоевым кислотам пневмококка.

вывода

1. Разработана система иммунохимической диагностики пневмококковой инфекции, включающая препараты для выявления бактериальных клеток пневмококка или его антигенов и антител к ним, и позволяющая выявлять антигены и антитела независимо от серотипа пневмококка-возбудителя.

2. Белки пневмококка с м.м. 50, 74, ВО и 94 ко являются иммунологически активными, так как антитела к ним образуются у детей и взрослых при возникновении пневмококковбй инфекции, 8 также у взрослых здоровых людей, как нормальные антитела к условнопатогенным микроорганизмам. У морских свинок при моделировании пневмококков й инфекции возникает антительный ответ на пневмококковые белки, определяемый в ИФА.

3. В результате анализа кммунохкмичэски активных белков предложено субтипирование пневмококка на основе выявления белков с м.м. 50 , 63 , 66 , 74, и 94 ко. Показано, что такое субтипирование не зависит от серотипа пневмококка, определяемого его капсульным полисахаридом.

4. Разработанная система экспресс-диагностики на основе двух типов коагглютинационных диагноетикумов против капсульных и накапсульных антигенов пневмококка позволяет быстро выявлять этот цикроорганизм и его антигены независимо от серотипа и наличия капсулы без использования специальной аппаратуры.

5. Полностью искусственный антиген, содержащий олигомьры, идентичные участкам природного полисахарида пневмококка серотипа 3, обладает активностью природного полисахарида и может быть использован для качественной и количественной оценки активности антительных и антигенных препаратов пневмококка в реакциях, основанных на РПГА и ИФА.

6. Определены основные принципы приготовления латексных диагностикумов для определения антигенов пневмококка (капсульных полисахаридов или тейхоевых кислот), позволяющие контролировать как процесс сорбции антител на поверхность носителя, так и стабильность суспензии готового диагностикума на основе физико-химических свойств латексных частиц.

7. Иммуноферментная система на основе белковых антигенов пневмококка позволяет определить индивидуальные и групповые изменения в уровне и в динамике выработки антител к пневмококку.

8. Разработаны иммуноферментные системы для определения 1дА-ентител в слюне больных с пневмококковой инфекцией, а также -в молоке кормящих матера.

9. К особенностям гуморального иммунологического ответа при пневмококковой ■ инфекции • у человека и животных относится возможность различных типов реагирования! постепенного нарастания количества антител, сохранение относительно низких концентраций и сохранение относительно высоких концентраций антител. В единичных случаях наблюдается снижение первоначально еысокого уровня энтитвл к пневмококку.

- -

Список работ Л.Н.Падюкова, опубликованных по теме диссертации

1. Изучение некоторых биологических свойств антигенов, выделенных из пневмококка с/т 3 ц ®МЭИ, 1981, 12, с.60-62 (соавт.:Елкина С.И. Цветкова Н.Б, Ванеева Н.П. Винник А.Л. Шагам Н.Л. Калина Н.Г.)

2. Изучение некоторых антигенов пневмококка // Сборник тезисов Семинара молодых ученых, Иосква, 1981, с.36-37 (соавт. Кузнецова Е.М.)

3. Эритроцитзрный диагностикум к пневмококку //В сб. Этиология и патогенез инфекционного процесса при острых и хронических воспалительных заболеваниях легких, сборник трудов, Ленинград, 1982, С.154-155

4. Характеристике ряда белковых компонентов пневмококка // ЖМЭИ, 1983, 9, с.113-114 (соавт.«Цветкова Н.В.)

5. Пневмококковая инфекция (эпидемиология, микробиология, профилактика). Обзор литературы. // Экспресс-информация. Новости медицины и медицинской техники 1983, N6, с. 39-59 (соавт.:Цветкова Н.В., Грубер И.М., Жданова Л.Г., Масловская Г.Я.).

6. Изучение некоторых компонентов пневмококка // Результаты и достижения в облвсти контроля, стандартизации и усовершенствования иммунных препаратов. Тезисы конференции молодых ученых, Геделе, Венгрия, 1983, с.15

7. Комплексные антигены пневмококка // Тезисы докладов 16-ой конференции Федерации европейских биохимических обществ, Москва, 1984, с.370 (соавт.:ЦветкоВа Н.В.)

8. Изучение типоспецифаческих агглютинирующих пневмококковых сывороток в реакциях преципитации // ЖМЭИ, 1984, 8, с.69-72 (соавт.:Цветкоиа Н.В.)

9. Углеводсодерхащий сополимер со специфичностью капсулярного полисахарида пневмококка, тип 3 // Биоорганическая химия. 1984, т.10, с. 76-1384 (соавт..'Черняк А.Я. Антонов К.В. Дмитриев Б.А. Кочетков Н.К. Цветкова Н.В.)

10. Иммуноферментны* анализ при пневмококковой инфекции // ЖМЭИ, 1985, I, с.40-45 (соавт.:Ершов И.В. Цветкова Н.В.)

11. Высокомолекулярный антигенный комплекс пневмококка: некоторые свойства // КМЭИ, 1985, 3, с.23-28 (соавт.:Родионычев В.А. Краснопрошина Л.И. Цветкова Н.В.)

12. Структурная организация бактериальной клетки пневмококка // ЖМЭИ, 1985, 3, с.96-99

13. Выявление некапсулышх антигенов пневмококка // ЖМЭИ 1965, II, с.43-46 (соавт.¡Тарасова Н.Л.)

14. Two synthetic antigens related to type 3 capsulai polysaccharide // Carbohydrate Research, 1985, 141, pp.199-212 (соавт.» Черняк А.Я. Антонов K.B. Кочепсоз H.K. Цвегкова H.B.)

15. Использование иммуноферментного метода для серологического анализа при пневмококковой инфекции // Препараты для диагностики и профилактики пневмококковых заболеваний. Сборник трудов, Москва,1985, с.63-74 (соавт.:Ершоз И.В.)

16. Выявление антител к пневмококку у детей с острой пневмонией и плевритом иммуноферментным методом // ШЭИД986, 7, с.79-83 (соавт. .-Кешикбаева A.A. Тарасова Н.Л. Катосова Л.К. Цветкова Н.В.)

17. Сравнительный анализ антигенных прегчратов из вокапсульных штаммов пневмококке // ЖМЭИ, 1986, 6, с.102-103 (соавт.¡Нисилезич В.Ф. Пугачева Н.Л. Грубер И.М. Решилов Л.Н.)

18. Использование иммуноферментного анализа для изучения пневмококковой инфекции // ШЗИ, 1986 , 6, с.102-10« (соавт.:Цветкова Н.В. Кузнецова ü.M. Ванеева Н.П.)

19. Определение антител к пневмококку в секретах при острой пневмонии // ИШ, 1987 , 9, с.112-115 (соавт. s Уланова М.Н. Катосова Л.К. Толкачев A.M.)

20. Идентификация пневмококков и клебсиелл методой коагглютинации // Актуальные вопросы клинической микробиологии в веинфзкционной клинике. Тезисы докладов и Всесоюзной конференции, Москва, 1988, 4.1. с.58-59 (соавт.(Таранов В.А. Батуро А.П. Асеева В.Г.)

21. Оценка гуморального иммунитета к пневмококку у новорожденных детей п Ыедико-социалышэ проблемы охраны здоровья датей. Материалы и съезда педиатров Киргизии, Фрунзе, 1988, с.176-178 (соавт. «Уланова U.A. Михайлова 3.11. Афонина Л.Г. □зрапова М.Х.)

22. Секреторные антитела к пневмококку при острой пневмонии у детей // Актуальные проблемы педиатрии в Сибири и на Дальнем Востоке. Тезисы докладов региональной науч. конф., 1988, Хабаровск, с.190-191 (соавт.!Уланова И.А. Тарасова Н.Л. Толкачев A.M. Кулак D.B.)

23. Спецефический иммунный ответ на пневмококковую инфекцию у детей и XII Всесоюзный съезд детских врачей, Тезисы докладов, Москва, 1988, с.181-182 (соавт.«Уланова М.А. Кулак D.B. Катосова

Л.К. Новикова Т.Ф. Федоров A.M. Толкачев A.M. Подтело Д.А.)

24. Иммуноферыентный анализ с синтетическими антигенами; выявление антител к пневмококку // Современные направления создания медицинских диагностикумов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции, Москва, 1988, с.91 (соавт.¡Черняк А.Я.)

25. Разработка методов ишунохимической диагностики пневмококковой инфекции // Иммуноферыентный анализ в диагностике заболеваний, Москва, 1989, с.90-94

26. Уровень нтител к пневмококку при различных заболеваниях и у здоровых людей // Иммуноферыентный анализ в диагностике заболеваний, Москгч, 1989, с.70- 82 (соавт.гЦветкова Н.В. Пугачева Н.Л. Корякин Е.В.)

27. Оценка состояния защитных механизмов при острой пневмококковой пневмонии у детей // Актуальные вопросы реабилитации больных с патологией органов дыхания. Тезисы научно-практической конфер., Барнаул, 1989, с.161-162 (соавт.:Уланова М.А. Кулак Ю.В. Николаев A.C.)

28. Иммунный ответ у Детей с острой пневмококковой пневмонией, клинически резистентной к антибиотикотерапии // Материалы xv Симпозиума социалистических стран по проблеме детской пульмонологии, Киев, 1989, с.86-87 (соавт.•• Уланова М.А. Кулак D.B. Николаев A.C.)

29. Перспективы развития средств ишунохимической диагностики бактериальных инфекций Журнал Всесоюзного химического общества им.Д.И.Менделеева, 1989, т.34, н1, с.11-17 (соавт.: Семенов Б.Ф.)

30. Агглютина ционные методы в иммунодиагностика инфекционных заболеваний // Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии, Материалы Всесоюзной конференции, Тарту, 1989, с.15-23 {соавт.¡Таранов В.А.)

31. Метод коагглютинации в диагностике бронхолегочных заболеваний // Тезисы xvii съезда Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им.И.И.Мечнт'кова, Москва,1989, т.и, C.I26-.27 (соавт.:Таранов В.А. Асеева В.Г. Колмогорова О.В. Батуро А.П. Каверина К.Г.)

32. Формирование противопневмококкового иммунитета у детей // Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Сборник научных работ Кишиневского мединститута, Кишинев, 1989, с.307 'ооавт.:Уланова М.А. Шарапова М.Х.)

33. Антитола к пневмококку у детей разного возраста //

Тезисы докладов i Всесоюзного иммунологического съезда, Москва,

1989, T.i, C.II9 (соавт.¡Уланова М.А. Кулак D.B. Шарапова М.Х.)

34. Особенности гуморального иммунного ответа на пневмококк у детей; определение внтитет в сыворотке крови, плевральной жидкости п слюне // ЕМЭИ, 1990, м 2, с.55-62 (соавт.«Уланова М.А. Таточенко В.К. Кулак D.B. Катосова Л.К. Пугачева Н.Л. Асеева В.Г.)

35. Иымуноферментная система для определения антител к полисахаридам streptococcus pneumoniae в биологических жидкостях // ЕМЭИ, 1990, и 7, с.59-65 (соавт.¡Уланова U.A. Кузнецова E.H. Ксенофонтова М.К. Кулак D.B. Шарапова М.Х. Батуро А.П.)

36. Показатели противопневмококкового иммунитета у детей, больных хронической пневмонией // НМЭИ, 1990, н 8, с.88-93 (соавт.¡Уланова U.A. Волков И.К., Катосова Л.К. Сидорина Т.Н. Сапаргельдыев А.)

37. Антитела К Некоторым 8НТИГвН8и Streptococcus pneumoniae у новорожденных детей // ЕМЭИ, 1990, н 7, с.65-71 (соавт.¡Уланова И.А. Шарапова М.Х. Михайлова 3.U. Афонина Л.Г.)

38. Закономерности сорлции моноклональных антител на полистироловых латексных частицах // В сб. Современные направления создания медицинских диагностикумов, Москва, 1990, с.83 (соавт.¡Асеева В.Г. Сухшшили С.А. Ярославов A.A.)

39. Увеличение чувствительности реакции коагглютшации для Идентификации пневмококков // В сб. Современные направления создания медицинских диагностикумов, Москва, 1990, с.129 (соавт. «Таранов В.А. Силина И.Л. Асеева В.Г. Ксенофонтова М.К. Батуро А.П.)

40. Взаимосвязь особенностей течения острой пневмонии у детей с динамикой специфических антител к пневмококку // В сб."1-ый Всесоюзный Конгресс по болезням органов дыхания", Киев,

1990, н 682 (соавт.¡Уланова М.А. Кулак Ю.В. Николаев A.C.)

41. Гуморальный иммунитет к пневмококку у новорожденных дэтей // В сб. Иммунология репродукции. Тезисы до'спадов 4-го Всесоюзного симпозиума с международным участием Киев, 1990, с.290-291 (соавт.¡Уланова U.A. Шарапова М.Х.)

42. Применение коэгглютинации для определения антигенов бактерий - возбудителей бронхолегочных заболеваний // В сб. Материалы Всесоюзной научной конференции Проблемы медицинской сшунобштехнолопш, Ленинград, 1990, с.93-94 (соавт.«Таранов В.А. Асеева В.Г. Батуро А.П.)

43. Особенности гуморального иммунитета к пневмококку у

детей и подходы к специфической иммунотерапии острой пневмонии // В сб. С' временные методы иммунотерапии при бронхолегочной патологии, Ленинград, IS90, с.40-44 (соавт.:Михайлова З.М. Уланова М.А. Катосона Л.К. Кулак D.B.)

44. Synthetic pneumococcal antigens for ELISA // In Abstracts of 6th International Congress on Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology, Helsinki-Espoo, Finland, 1990, p.76 (C03BT.:ЧврнЯК А.Я.)

45. Latex eg-lutination for the determination of pneumococcal antigens I- acute pneumonia // In Abstracts of 6th International Congress on P^pid Methods and Automation in Microbiology and Immunology, Helsinki-Espoo, Finland, 1990, p.148.

(соавт.:Асеева В.Г. Пугачева Н.Л Таранов В.А. Батуро А.П.)

46. Quality control of latex diagnosticum // In Abstracts of 6ih International Congress on Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology, Helsinki-Espoo, Finland, 1990, p.77

(соавт.¡Асеева В.Г.)

47. Пенициллинсвязывапцие белки пневмококков в составе антигенных препаратов // Получение, исследование и применение антибиотиков и биологически активных веществ. Тезисы международной конференции молодых ученых, Москва, 1990, с.10-11 (соавт.:Тихонов А.О.)

48. Иммуноферментная система для определения антител к полисахаридам пневмококка у детей // Материалы рабочего совещания "Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций", Оболенск, 1990, с.47 (соавт.: Уланова М.А. Пугачева Н.Л. Ксенофонтова М.К.)

49. Опыт внедрения новой иммуноферментной системы // Материалы рабочего совещания "Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций",, Оболенск, 1990, с.49 (соавт.:Дветкова Н.В. Кузнецова Е.М. Пугачева Н.Л.)

50. Способ приготовления диагностикума для определения антигенов в реакции коагглютинации // Патент н 1762242, приоритет Ii.10.1989 г. (соавт.tTapiHOB В.А., Асеева В.Г., Батуро А.П., Цветкова Н.В., Каверина К.Г., Колмогорова О.В.)

51. Влияние бронхомунала на заболеваемость острыми респираторными инфекциями и иммунологические. показатели у детей раннего возраста // Пульмонология, приложение, 1992, с.49-53 (соавт.:Уланова М.А. Горелова Ж.Ю. Резник И.Б. Воронов А.В.)

¿2. Иммунохимическиа методы диагностики // В сб.

Современные методы ишунохимической и нолекулярнобиологической диагностики в медицине, Москва, 1992, с.3-6

53. Способ диагностики пневмококковой инфекции // Положительное решение о выдаче патента от 23.01.92 на заявку н 4937427/I4-4I6II от 17.05.91. (соавт.: Н.Л.Пугачева, Н.В.Цветкова, В.М.Кузнецова, А.П.Батуро).

54. Идентификация бактерий - возбудителей бронхолегочной пнфетпп! методом коагглюпшации // В сб. Современные метода иммунохимической и молекулярнобиологической диагностики ь медицине, Москва, 1992, с.96-103 (соавт.:Таранов В.А., Пугачева Н.Л. Ксенофонтова Н.К. Цветкова Н.В. Нилина И.Л. Батуро А.П.)

55. Получение латексных диагностякумов // В сб. Современные методы иммунохшической и мслекулярнобиологической диагностики в медицине, Москва, 1992, с.103-109 (соавт.¡Асеева В.Г.)

56. Современная иммунохимическая экспресс-диагностика бактериальных бронхолегочных заболеваний // В сб. "Микробиологические аспекты кммунобиотехнологки", Москва, 1992, с.54-61 (соавт. Таранов В.А.)

57. Iamuno response to Streptococcus pneumoniae antigens in children with pneumonia // 14 Jahrestagung der Gesellschaft fur Padiatrischa Pneunologie, Hannover, 1992, N8 (С0ЭВТ.:УЛЗНОВа М.А.)

58. Occurrence of IgA antibodies to Streptococcus pneumoniae antigens in colostrua and breast nllk // 7th International Congress of Mucosal Immunology, Abstracts, Prague

1992, p.343. (соавт.«Уланова M.A.)

59. Pneumococcal proteins for inasunodiagnosls // Abstracts of XXIVth Annual Meeting of Scandinavian Society for Immunology, Aarhus, 1993, p.39.

60. Return to pneumococcal proteins? // Abstracts of XII Lancafiold International Symposiua on Streptococci and Streptococcal diseases,1993, St.Peterburg, p.132 (СОЭВТ.«Пугачева Н.Л.)

61. Периодические и географические изменения серотипового пейзажа streptococcus pneumoniae у детей с заболеваниями органов дыхания п здоровых носителей в бывсаи СССР // ШЭИ, 1994, н 3, с.3-10 (соавт.: В.К.таточенко, Л.К.Катосова, М.А.Уланова, А.П.Батуро, A.U.Федоров, В.И.Шилко).

62. Иммунодиагностика инфекций // в кн. к*ддунология инфекций, Под ред. акад.РАМН В.И.Покровского и др. 1994, стр. 222-249 (соазт.: Н.Г.Харатспенков).

- si -

63. Пневмококковая инфекция // в кн. Иммунология бактериальных инфекций, Под ред. акад.РАМН В.И.Покровского и др. 1994, (принято к печати).

64. Return to pneumococcal proteins? //Ins"Pathogenic Streptococci i Present and Future" Ed.A.Totolian, Lancer Publication, st.Petersburg, p.426-<27 (соавт.'.Пугачева Н.Л.)

65. Antibacterial antibodies In pulmonary diseases // Abstr. of XV International Congress of Allergology and Clinical Immunology. Stockholm, Sweden, 1994, p.701 (соавт.:Пугачева Н.Л., Колмогорова O.B.).

66. Rapid identification of pneuraococci on the basis of lastimo blotting of protein antigens // Tubercle and Lung Disease, 1994, V.75, SI, p.141.

67. Antibacterial antibodies in children with pulmonary diseases // Pediatric Week Holland, Add.Abstracts, Rotterdam,

1994, p.A34.

68. Белковые антигены Streptococcus pneumoniae // ШЭИ,

1995, * Z (соавт: Пугачева Н.Л.) (принято к печати).

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ БОНЦ АМН СССР

........

П0ДП..К ПЕ1АТИ19.9.94 п- JAKAI 46 7 ТИРАЖ Ю0 «i.