Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Разработка методов определения и изучение содержания некоторых фикотоксинов в морепродуктах

На правах рукописи

00316857 1

Мохова Юлия Андреевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НЕКОТОРЫХ ФИКОТОКСИНОВ В МОРЕПРОДУКТАХ

14 00 07 - гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 8 М \ Г| 2Ш

Москва - 2008

003168571

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт питания Российской академии медицинских наук

Научный руководитель.

доктор медицинских наук, профессор

Хотимченко Сергей Анатольевич

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

Капцов Валерий Александрович

доктор медицинских наук, профессор

Королев Алексей Анатольевич

Ведущая организация.

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России

Защита состоится «26» мая 2008 г в 1400 ч на заседании Диссертационного совета Д 001 002 01 при ГУ Научно-исследовательский институт питания РАМН по адресу 109240, Москва, Устьинский проезд, д 2/14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт питания РАМН (109240, Москва, Устьинский проезд, д 2/14)

Автореферат разослан «25» апреля 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор Г^ия^-"-4^'*' ® ^ Коденцова

Актуальность темы

В последние годы в питании населения России все большее место занимают рыба и морепродукты В соответствии с разработанными в Минэкономразвития России макроэкономическими показателями развития экономики страны и повышения благосостояния населения, рост среднедушевого потребления рыбных товаров по оптимистическому сценарию может составить за 2003-2010 годы около 35% При этом в структуре океанического рыболовства более быстрыми темпами будет возрастать объем добычи нерыбных объектов промысла, удельный вес которых увеличится с 4,2% в 2003 г до 10,6% в 2010 г [Ильясов СВ, 2004] По данным маркетингового исследования компании "АМИКО" рынок морепродуктов является сегодня одним из самых динамично растущих среди всех сегментов продовольственного рынка России Ежегодный рост рынка морепродуктов составляет 30-40% [Маркетинговое исследование рынка морепродуктов и морских деликатесов, 2007] Являясь источником высококачественного белка и микроэлементов [Тутельян В А с соавт , 2002], морепродукты одновременно могут содержать и опасные вещества, одними из которых являются фикотоксины Фикотоксины представляют собой группу токсинов, продуцируемых некоторыми видами водорослей, микроводорослей и цианобактериями, многие из которых являются начальным звеном пищевой цепи и служат источником пищи для многих морских животных, в том числе моллюсков и некоторых видов рыб и ракообразных, часть из которых имеет промысловое значение [FAO, 2004, Орлова Т Ю 2005]

Среди фикотоксипов, приоритетными продуцентами которых являются микроводоросли, выделены несколько групп, объединенных по синдромам отравления, которые они вызывают В настоящее время, различают следующие группы токсинов амнестические (ASP - амнестический яд моллюсков), паралитические (PSP -паралитический яд моллюсков), диарейные (DSP - диарейный яд моллюсков), а также нейротоксины, азаспнрацнды, сигуатоксины и другие [FAO, 2004] Из них к наиболее токсичным веществам, риск отравпения которыми может быть достаточно высоким, относятся паралитические токсины (ПТ) (сакситоксин и его производные), единственный представитель группы амнестических токсинов - домоевая кистота (ДК) и диарейные токсины (ДТ) (окадаиковая кислота и динофизистоксины) [Lueger A et al, 1999] Все эта вещества могут вызывать как острые отравления, сопровождающиеся специфичной для различных групп фнкотоксинов клинической картиной, так и отдаленные эффекты, в том числе канцерогенез [White J , et al 2003, White J , et al 2003, FAO, 2004, Foodborne Poisonings and Toxicity , 2006]

Ежегодно во всем мире регистрируются отравления фикотоксинами, некоторые из которых заканчиваются летальным исходом [Van Dolah F М, 2000] Наиболее часто отравления происходят при употреблении в пищу двустворчатых моллюсков - мидий, гребешков, устриц и различных ракушек [Stewart J Е , Subba Rao D V, 1997, FAO, 2004] При этом установлено, что технологическая обработка не приводит к полной деконтаминации продукта [Lawrence JF et al, 1994, Indiasena W M , Gill T A , 2000, FAO, 2004, Stommel E W , Watteis M R 2004]

Отсутствие официально зафиксированных случаев отравления в нашей стране, по-видимому, связано с неосведомленностью медицинского персонала о возможности отравления фикотоксинами при употреблении в пищу морепродуктов, неспецифичностыо клинической картины отравления, а также отсутствием лабораторных методов исследования, позволяющих провести дифференциальную диагностику интоксикации

Обращает на себя внимание тот факт, что в ряде случаев опасны не только острые отравления фикотоксинами, но и хроническое поступление малых доз данных контаминантов, что связано наличием у некоторых из них (ДТ) канцерогенных свойств [MaynesJT et al ,2001]

Не смотря на то, что во многих странах мира уже организован мониторинг за загрязнением гидробионтов фикотоксинами [FAO , 2004], в России еще не сформирована нормативная и методическая база в отношении этих контаминанов

В целях обеспечения безопасности морепродуктов необходимо всестороннее изучение проблемы контаминации их фикотоксинами, а также оценка риска поступления этих веществ с рационом Обязательным элементом системы контроля контаминации фикотоксинами морепродуктов является методическая база Таким образом, актуальным и необходимым является разработка методов обнаружения, идентификации и количественного определения фикотоксинов

Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы является модификация и унификация метода обнаружения, идентификации и количественного определения ДК в морепродуктах и оценка риска для здоровья населения, связанного с загрязнением некоторыми фикотоксинами морепродуктов

В соответствии с поставленной целью были поставлены следующие задачи

1) Оптимизировать основанный на ВЭЖХ метод обнаружения, идентификации и количественного определения ДК и апробировать и адаптировать основанные на ИФА скрининговые методы определения ПТ и ДТ в морепродуктах

2) Изучить содержание фикотоксинов групп ПТ и ДТ, а также ДК в морепродуктах

3) Рассчитать нагрузку и оценить риск для здоровья населения, связанный с загрязнением ПТ, ДТ и ДК морепродуктов, с целью обоснования гигиенических нармативов

Исследование проводили в соответствии с планом НИР ГУ НИИ питания РАМН по теме № 041 «Оценка риска для здоровья населения токсинов морепродуктов и их токсикологическая оценка» (2004-2006)

Научная новизна работы

Разработан метод обнаружения, идентификации и количественного определения ДК в моллюсках с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, характеризующийся хорошей воспроизводимостью и надежностью (предел обнаружения 0,5 мкг/г)

Впервые в России изучено содержание ДК, ПТ и ДК в морепродуктах как промыш пенного вылова (отечественного и импортного производства), так и любительского вылова (отечественные) Установлена высокая частота контаминации исследованных образцов ПТ (83,8%) Частота загрязнения морепродуктов токсинами ДТ и ДК была значительно ниже (5,67% и 24,3% соответственно), однако, уровни содержания ДТ в ряде образцов превышали пороговые значения

Проведены расчет нагрузки и оценка риска для здоровья населения, связанного с загрязнением ПТ, ДТ и ДК морепродуктов промышленного и любительского вылова

Практическая значимость

1) Разработаны МУК 4 I 2229-07 «Определение домоевой кислоты в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» - М Роспотребнадзор, 2007

2) Разработаны MP 01 015-07 «Экспресс-определение сакситоксина в моллюсках с помощью тест-системы «RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)», производства фирмы «R-Biophaim AG, Германия » - М ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007

3) Разработаны MP 01 016-07 «Экспресс-определение окадаиковой кислоты в моллюсках с помощью тест-системы «DSP-Check», производства фирмы «Paraphaim Laboratories Со, Ltd, Япония» - М ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007

4) Разработан допустимый уровень содержания ПТ, ДТ и ДК в нерыбных объектах промысла (моллюски, ракообразные) Дополнение в СанПиН 23 2 1078-01 - М

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2008

Апробация работы

Результаты работы доложены на 111 и IV конференциях «Питание здорового и больного человека», (Санкт-Петербург, 2005, 2006), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005), VIII Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание - здоровье нации» (Москва, 2005),, IV международной конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва 2006), научно-практическом Конгрессе III всероссийского форума «Здоровье нации - основа процветания России» (Москва 2007), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» Рязань 2007

Публикации

По результатам работы опубликованы 14 работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ, 10 публикаций в сборниках научных трудов

Объем ц структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глава материалы и методы, трех глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 135 страницах текста, содержит 22 таблицы и 24 рисунка Список литературы включает 219 источников, из которых 201 - иностранных авторов

Материалы и методы исследования

Для определения загрязнения фикотоксинами морепродуктов в качестве объектов исследования были выбраны различные образцы морепродуктов промышленного вылова (отечественного и импортного производства), отобранные в торговой сети, и гидробионты любительского вылова, отобранные в прибрежных водах Японского моря Всего изучен 21 морских гидробионтов промышленный вылов - 10 видов, из числа кошрых 81,0% представлены двустворчатыми моллюсками, любительский - 14 видов из которых наибольший процент составляли двустворчатые моллюски (гребешки, мидии, съедобные ракушки) -37,5% и ракообразные-20%, 42,5% - брюхоногие и головоногие моллюски, иглокожие и оболочники

Фикотоксины группы ПТ определяли с помощью тест-системы «RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)», производства фирмы «R-Biopharm AG», Германия Фикотоксины группы ДТ определяли с помощью тест-ситемы «DSP-Check», производства фирмы

«Parapharm Laboiatories Co , Ltd», Япония Принцип работы данных тест-систем основан на методе конкурентного иммуноферчептного анализа (ИФА)

Для изучения содержания ДК в образцах морепродуктов был разработан метод определения данного токсина в моллюсках, основанный на ВЭЖХ с УФ-детектированием, который в дальнейшем бьп использован в настоящей работе

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы «SPSS 12 0 for Windows» (Statistical Package foi Social Sciences, США) Для статистической обработки были использованы методы описательной статистики (среднее арифметическое, медиана, стандартное отклонение и 95%-й процентиль) Расчет проводился в соответствии с принятыми международными подходами в случаях, когда в значительном количестве образцов тот или иной контаминант не определяется, используется схема оценки «missing value» («пропущенных значений»), то есть результатов ниже предела чувствительности метода, предложенная ВОЗ [WHO, 1995] При этом, если общее количество «пропущенных значений» составляет менее 60% от объема выборки, в качестве замены используется число, равное половине предела чувствительности метода определения, если общее количество «пропущенных значении» составляет от 60 до 80% объема выборки, но при этом в выборке находится как минимум 25 количественных значений или если общее количество пропущенных значений более 80%, то проводится два типа расчетов - замена «пропущенных значений» на ноль и замена на число, соответствующее пределу чувствительности метода [WHO, 1995, Hecht H, Honikel KO 1995, Vlachonicolis IG, Marriott F H С 1995, Джатдоева А А , 2006]

Достоверность различий определяли по непараметрическому критерию Манна-Уитни Коэффициенты опасности были рассчитаны согласно «Руководству по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду» [Р 2 1 10 1920-04]

В эксперименте на животных использовали крыс Вистар с исходной массой тела 120±30 г В ходе исследования животные были разделены на две группы (1 и II), каждая из которых была разделена на 5 подгрупп Одна из подгрупп в каждой группе была контрольной Крысам обеих групп раствор ДК вводили однократно внутрибрюшинно в дозах 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 мг/кг массы тела Животных группы I после введения токсина забивали через 5 дней Животных группы II после введения токсина забивали через 3 часа В качестве объектов исследования использовали головной мозг Изучение токсического действия ДК на клетки проводили методом проточной цитофлуориметрии Для определения уровня экспрессии антигенов CD95 использовали иммунофлуоресцентное окрашивание соответствующими антителами, меченными F1TC, с дальнейшим

определением уровня флуоресценции в образце Для определения количества и степени фрагментации ДНК использовали окрашивание пропидия йодидом Данные, полученные в эксперименте на животных, обрабатывали по программе Biostat и анализировали непараметрическим методом множественных сравнений Ньюмена-Кейлса

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Модификация и унификация методов обнаружения, идентификации н количественного определения фнкотоксинов в морепродуктах

Оптимизация метода обнаружения, идентификации и количественного определения ДК в морепродуктах

В предварительной серии экспериментов были проведены сравнительные исследования четырех схем определения ДК в морепродуктах с использованием ВЭЖХ, основанных на методиках Hatfield С L et al, 1994, Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach ij 35 LMBG , 2002, Quilliam M A , 2003, AOAC Official Method 991 26, 1999 Для достижения максимальной степени извлечения токсина из образцов, эффективной очистки экстракта, а также разработки наиболее подходящих условий ВЭЖХ-анализа, были изучены и оптимизированы три этапа метода экстракция токсина, очистка экстракта и определение токсина в очищенном экстракте с использованием ВЭЖХ

На этапе экстракции в результате проведенных исследований была установлена степень извлечения ДК из контаминированных образцов при использовании различных экстрагирующих растворов (табл 1)

Таблица 1

Степень извлечения ДК из искусственно загрязненного образца мидий, содержащих токсин в концентрации 20 мкг/г, в различных системах растворителей_

Состав экстракционной смеси Обнаруженная концентрация ДК мкг/г Средняя степень экстракции, %

Метанол-вода 1 1 19,52±0,46 97,6

Метанол 8,31±0,53 41,6

Метанол-вода 1 1 (рН=2,5) 1=70°С 16,65±0,75 83,25

Соляная кислота (0,1Н) 10,8±1,50 54,0

Как показали проведенные исследования, наибольшая степень экстракции наблюдалась при использовании смеси метанол-вода (1 1), составляющая в среднем 97,6% Существенно более низкие величины извлечения были получены при использовании

смеси метанол-вода 1 1 (рН=2,5) с нагреванием до t=70°C и, особенно, при кипячении с соляной кислотой (0,1Н) и экстрагировании метанолом

Таким образом, на основании полученных результатов исследований, в качестве смеси, обеспечивающей наибольшую степень экстракции ДК из образцов моллюсков, была предложена смесь метанол-вода (1 1)

В ходе проведенной работы была изменена масса навески образца и объем экстракционной смеси, которые были уменьшены на 25%, что позволило сократить расход растворителя При этом степень извлечения ДК не изменилась Средняя степень извлечения (10 образцов) при экстракции ДК из 3,0 г измельченной навески путем гомогенизации с 12,0 мл смеси метанол-вода (1 1) составила 94,8%, а при экстракции из 4,0 г навески 16,0 мл смеси метанол-вода (1 1) - 97,6% Таким образом, обоснована и предложена экстракция ДК из 3,0 г измельченной навески путем гомогенизации с 12,0 мл смеси метанол-вода (1 1)

На следующем этапе в качестве метода очистки была использована твердофазная экстракция на патронах Необходимость данного этапа была обусловлена тем, что моллюски представляют собой достаточно сложную матрицу, компоненты которой могут оказать отрицательное влияние на качественное и количественное определение целевого вещества При подборе оптимальных условий, твердофазная экстракция может обеспечить максимально эффективную очистку экстракта при минимальных потерях

Очистку проводили на патронах с силикагелем с привитыми четвертичными аммониевыми группами Экстракт вводи пи в патроны в объеме 5 и 2 мл В качестве растворов, используемых при промывке патрона, была использована смесь ацетонитрил-вода (1 9) и 0,1М раствор хлорида натрия по методикам, предложенным Quilliam MA, 2003 и Hatfield С L et al, 1994, соответственно Дня элюирования токсина использовали цитратный буферный раствор и 0,5М раствор хлорида натрия Наименьший процент потерь (13%) наблюдался при введении образца в патрон в объеме 2 мл с последующим промыванием его смесью ацетонитрил-вода (1 9) и элюировании цитратным буфером

Определение содержания ДК в очищенном экстракте моллюсков определяли методом ВЭЖХ с УФ-детектированием (длина волны 242 нм) При подборе подвижной фазы были использованы вода, ацетонитрил и метанол в различных соотношениях и при разных значениях рН В результате проведенных исследований в качестве мобильной фазы было предложено использование смеси ацетонитрил-вода-метанол, рН=2,5 (трифторуксусная кислота), обеспечивающая минимальную степень размывания пика и оптимальное время удерживания, при использовании следующих градиентных изменений пропорций компонентов мобильной фазы

Время (мин) Соотношение компонентов мобильной фазы

Вода Ацетонитрил Метиловый спирт

0,0 89 10 1

15,0 85 14 1

20,0 89 10 1

25,0 89 10 1

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан метод определения ДК в моллюсках, включающий экстракцию токсина смесью метанол-вода (1 1) из 3 г образца, очистку экстракта на патронах твердофазной экстракции, идентификацию и количественное определение с использованием ВЭЖХ при градиентном элюировании с УФ-детектированием (рис 1)

5 М -

Дочоевая киспота

/

2 4

-I1 , г . ггр , г у т. ■ рп Г| гп-г, ИТ,- . Г,

8 10 22 14

Минуты

Рис 1 Хроматограмма контаминированного образца мидии, полученная при использовании разработанной методики

В ходе апробации метода были получены следующие метрологические характеристики предел обнаружения - 0,5 мкг/г, относительное стандартное отклонение -11,3%, средняя степень извлечения - 83,3%

В процессе работы были решены такие задачи, как подбор экстракционной смеси, позволяющей селективно извлекать ДК из образца, выбор способа очистки экстракта, позволяющий эффективно изолировать токсин от фоновых примесей, оптимизация условий проведения ВЭЖХ для обеспечения точного определения ДК в малых количествах

Разработанная методика утверждена Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благосостояния человека - МУК 4 1 2229-07 «Определение домоевой кислоты в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» М Роспотребнадзор, 2007

Апробация и адаптация методов обнаружения, идентификации и кошчссгвсшюго оппслсдспия ПТ и ДТ в морепродуктах

Для проведения скрининговых исследований, направленных на обнаружение и количественное определение ПТ н ДТ в морепродуктах, были адаптированы основанные па ИФА методы, с испотьзованиеи тест-системы «R1DASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)», производства фирмы «R-Biopharm AG», Германия и тест-сптемы «DSP-Check», производства фирмы «Parapharm Laboiatories Со, Ltd», Япония Диапазон определяемых концентраций для ПТ составляет 50-800 мкг/кг Диапазон определяемых концентраций для ДТ составляет 100 - 1000 мкг/кг

2 И »учение содержания фикотоксипов в морепродуктах Паралитические токсины

В целях изучения содержания ПТ были исследованы 173 образца морепродуктов промышленного и любительского вылова ПТ в количестве, превышающем порог чувствительности метода (50 мкг/кг), быт обнаружены в 145 образцах, что составляет 83,8% от общего количества исследованных гидробионтов (табл 2)

Таблица 2

Содержание ПТ во всех исследованных образцах_

образец Количество образцов Содержание ПТ в образцах, мкг/кг*

Мах М Me Sd 95-й процен-тиль

Всего Содержащих ПТ

Все 173 145 757,9 157,4 123,6 132,3 413,3

Мышечная ткань 150 123 536,8 140,0 118,0 110,4 386,7

Внутренние органы 23 22 757,9 276,2 236,8 193,0 755,8

*) Здесь и далее Мах - максимум, М - среднее арифметическое, Эё - стандартное отклонение, Ме - медиана

Среднее содержание ПТ составило 157,4±132,3 мкг/кг, медиана 123,6 мкг/кг Содержание ПТ на уровне от 50 до 200 мкг/кг продукта было обнаружено в 59,5% образцов, от 200 до 400 мкг/кг - в 19,1% образцов, от 400 до 800 мкг/кг - в 5,2% образцов

Следует отметить, что уровни свыше 600 мкг/кг продукта были обнаружены только в образцах внутренних органов, что согласуется с данными других исследователей [Morse Е V 1977, Lu Y Н, Hwang D F 2002] Одновременно следует указать на то, что в ряде образцов морепродуктов, в том числе полученных из торговой сети, наблюдаются достаточно высокие уровни содержания ПТ (300-600 мкг/кг), однако они не превышали

гигиенического регламента, установленного в ряде зарубежных стран (800 мкг/кг продукта)

При сравнении уровней содержания ПТ во внутренних органах и в мышечной ткани всех изученных образцов, было выявлено, что ПТ обнаруживались в 95,7% исследованных образцов внутренних органов среднее содержание ПТ при этом составило 276,2 мкг/кг, а медиана - 236,8 мкг/кг В тоже время в мышечной ткани морепродуктов ПТ обнаруживались в 82% случаев при средней концентрации 140,0 мкг/кг и медиане -118,0 мкг/кг, то есть в концентрации в 2 раза ниже, чем во внутренних органах (рис 2)

1

...........т.....

Мышечная ткань

Внутренние органы

Рис 2 Среднее содержание ПТ во внутренних органах и мышечной ткани образцов морепродуктов (среднее значение и доверительный интервал для среднего)

При анализе содержания ПТ в образцах промышленного вылова импортного и отечественного производства было установлено отсутствие статистически значимых различий между этими группами (р>0,5) (табл 3)

Таблица 3

Образцы Количество образцов Содержание ПТ в образцах, мкг/кг

Мах М Ме ЭсЗ

Всего

Отечественные 26 270,0 130,0 118,4 63,05

Импорт 114 524,0 140,7 112,0 112,38

Таким образом, полученный результат позволил объединить данные по содержанию ПТ, полученные для этих двух групп, для проведения дальнейшего анализа

В образцах промышленного вылова ПТ были обнаружены в 118 из 140 исследованных (84,3%) образцов (табл 4)

Таблица 4

Содержание ПТ в образцах морепродуктов промышленного вылова_

Образцы Количество образцов Содержание ПТ в образцах, мкг/кг

Мах М Ме 8(1

Всего Содержащих ПТ

Все 140 118 524,0 133,9 115,6 99,9

Все (мышечная ткань) 129 108 524,0 126,9 110,4 91,7

В среднем, по группе морепродуктов промышленного вылова содержание ПТ составило 133,9 мкг/кг (разброс от менее 50 до 524,0 мкг/кг) При этом основная масса образцов содержала токсины в концентрации до 200 мкг/кг ПТ не обнаружены в 15,8% образцов (менее 50 мкг/кг), 68,6 % образцов содержали токсины в концентрации от 50 до 200 мкг/кг, 12,9 % - в концентрации от 200 до 400 мкг/кг, 2,7 % образцов - в концентрации 400-600 мкг/кг

Среднее содержание ПТ в мышечной ткани в образцах промышленного вылова составило 126,9±91,7 мкг/кг, при этом максимальное их содержание было обнаружено в образце филе морского гребешка импортного производства (524,0 мкг/кг)

Статистически значимых различий в содержании ПТ в отдельных группах морепродуктов промышленного вылова - двустворчатые моллюски (суммарно), двустворчатые, употребляемые в пищу целиком (мидии, устрицы, ракушки), двустворчатые, у которых в пищу употребляется мышечная ткань (гребешки, Хоккигай) и другие морепродукты (креветки, крабы, осьминоги, кальмар, лобстер, каракатица), не выявлено

Так как содержание ПТ было определено в различных образцах продуктов, как промышленного вылова, в ряде случаев прошедших определенную кулинарную и термическую обработку, так и свежезамороженных (любительский вылов), то представляло интерес сравнить эти две группы морепродуктов по уровням содержания в них ПТ

В образцах гидробионтов, полученных любительским выловом, токсины обнаружены в 27 пробах из 33, что составляет 81,3%, при этом максимальное содержание ПТ было выявлено во внутренних органах креветки медведки и составило 757,9 мкг/кг Среднее содержание токсинов во всех образцах составило 257,5± 194,9 мкг/кг При исследовании мышечной ткани образцов было установлено, что максимальное содержание ПТ составтяет 536,8 мкг/кг (мышечная ткань гребешка), а среднее -229,5±172,9 мкг/кг (табл 5)

Таблица 5

Содержание ПТ в образцах морепродуктов любительского вылова_

Образцы Количество образцов Содержание ПТ в образцах, мкг/кг

Мах М Ме Бс1

Всего Содержащих ПТ

Все 33 27 757,9 257,5 248,0 194 9

Мышечная ткань 23 17 536,8 229,5 263,2 172,9

Содержание ПТ в концентрации от 50 до 200 мкг/кг определено в 21,2% образцов, от 200 до 400 мкг/кг - в 45,5% образцов, от 400 до 800 мкг/кг - в 15,1% образцов

Изучение содержания ПТ в отдельных группах гидробионтов любительского вылова двустворчатые моллюски (суммарно), отдельно - двустворчатые, которых употребляют в пищу целиком (мидии, анадара, спизула, корбикула и модиолус), гребешки целые, мышечная ткань гребешков и другие гидробпонты (кукумарня, трепанг, креветки, асцидия, морской еж, трубач) показало, что статистически значимых различий между данными, полученными в исследуемых группах морепродуктов выявлено не было

При сравнении содержания ПТ в образцах промышленного вылова (отечественного и импортного производства), концентрация ПТ как в целом, так и в мышечной ткани была ниже, чем в отечественных образцах любительского вылова (рис 3)

Промышленный Любительский вьпов вылов

Обшее солегокание ПТ в обиазиах

Промышленный Любительский вылов вылов

Солеожание ПТ в мышечной ткани

Рис 3 Содержание ПТ в образцах (среднее значение и доверительный интервал для среднего)

Данное различие можно объяснить, по крайней мере, двумя причинами во-первых, тем, что в процессе технологической обработки морепродуктов часть токсина может элиминироваться, в том числе с водой, во-вторых, тем, что основная масса морепродуктов промышленного вылова, находящихся в торговой сети, представлена продукцией

импортного производства и поступает на российский рынок из тех стран, где проводится постоянный мониторинг за содержанием фикотоксинов

Однако, в отдельных образцах морепродуктов промышленного вылова, содержание ПТ было сравнительно высоким (в морском гребешке импортного производства их концентрация доходила до 524,0 мгк/кг продукта) В то же время следует отметить, что процент обнаружения ПТ в образцах промышленного и любительского вылова, был практически одинаковым Это, во-первых, может свидетельствовать о том, что ПТ являются практически постоянно присутствующими токсинами в морепродуктах, во-вторых, что технологическая обработка приводит к некоторому снижению уровня ПТ, но не к полному нх удалению, в третьих, учитывая токсикологические характеристики ПТ, требуется определение их содержания - в системе производственного контроля в каждой выловленной партии морепродуктов и выборочный контроль в процессе технологической переработки

Ди-щеииые токсины

Несколько иные данные были получены при изучении содержания окадаиковой кислоты в образцах гидробнонтов (всего было исследовано 152 образца)

Из 133 образцов морепродуктов промышленного вылова, только в 22 (16,5%) бьпи обнаружены ДТ, однако при этом в 11 образцах импортного производства (8,3% от всех образцов и 50% от образцов, содержащих ДТ) содержание ДТ превышало гигиенический регламент, установленный Европейским Союзом (160 мкг/кг) Обращает на себя внимание, что большая часть образцов с концентрацией ДТ более 160 мкг/кг представлена двустворчатыми моллюсками (мидии, устрицы)

В связи с тем, что процент выявления ДТ в образцах промышленного вылова был невысоким (количество «пропущенных значений» составляют 83,5%), то при расчете средних значений и медианы, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, их заменяли на 0 (расчет 1) и на число, соответствующее пределу чувствительности метода, то есть 100 мкг/кг (расчет II) [WHO, 1995]

При проведении изучения содержания ДТ в образцах промышленного вылова импортного и отечественного производства были применены оба типа расчетов Анализ полученных данных показал отсутствие достоверно значимых различий дня результатов, полученных для групп морепродуктов отечественного и импортного производства, как при расчете I (р>0,2), так и при расчете II (р>0,2), что позволило объединить данные по содержанию ДТ в морепродуктах промышленного вылова, для проведения дальнейшего анализа (табл 6)

Таблица 6

Содержание ДТ в образцах морепродуктов промышленного вылова_

Образцы Количество образцов Содержание ДТ в образцах, мкг/кг

Мах М Ме Sd

Всего | Содержащих ДТ

Расчет I

Отечественные 24 2 151,1 11,57 0,0 39,37

Импорт 108 20 657,0 37,63 0,0 95,02

Расчет II

Отечественные 24 2 151,1 103,24 100,0 11,55

Импорт 108 20 657,0 119,12 100,0 66,04

Однако обращает на себя внимание тот факт, что максимальное содержание ДТ в морепродуктах импортного производства превышает установленный гигиенический регламент более, чем в 4 раза, а частота контаминации образцов отечественного производства в 2 раза ниже, чем импортного (8,3% и 18,5% соответственно)

При исследовании образцов любительского вылова из 19 образцов токсины обнаружены в 15 (78,9%), при этом в 10 образцах ДТ обнаружены в количестве, превышающем установленное пороговое значение Это, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, позволяет при проведении расчетов заменить «пропущенные значения» (ниже 100 мкг/кг) числом, равным половине предела чувствительности метода, те 50 мкг/кг (расчет III) (табл 7)

Таблица 7

Содержание ДТ в образцах морепродуктов_

Метод расчета Количество образцов Содержание ДТ в образцах, мкг/кг

Мах М Ме Sd

Всего | Содержащих ДТ

Образцы промышленного вылова

Расчет I 133 22 675,0 32,6 - 87,7

Расчет II 133 22 675,0 116,1 100,0 59,9

Образцы любительского вылова

Расчет 111 19 15 435,0 198,4 190,0 117,8

Проведенные расчеты показали, что среднее содержание ДТ в образцах морепродуктов промышленного вылова составляет при I типе - 32,6±87,7 мкг/кг, а при II типе расчета - 116,1±59,9 мкг/кг Среднее содержание ДТ в морепродуктах любительского вылова составляет 198,4± 117,8 мкг/кг и также превышает установленное пороговое значение для ДТ

При сравнении средних значений содержания ДТ для образцов промышленного и любительского вылова при всех способах расчета среднего содержания токсинов в

морепродуктах, значения, полученные для второй группы, значительно превышают таковые для образцов первой (рис. 4).

Промышленный Промышленный Любительский вылов вылов (расчет I) вылов (расчет II) (расчет III)

Рис. 4. Среднее содержание ДТ-токсинов в изученных образцах (среднее значение и доверительный интервал для среднего).

Таким образом, полученные данные показывают, что при достаточно низком проценте обнаружения (из 152 изученных образцов только в 37 образцах были обнаружены ДТ в концентрации более 100 мкг/кг), в целом, содержание ДТ в этих образцах были на достаточно высоком уровне и составили в среднем (только для контаминированных образцов) 217,9± 18,6 мкг/кг, а в 21 образце (13,8% от общего числа исследованных проб) их уровень был более 160 мкг/кг.

А.мисстические токсины

Из 120 образцов гидробионтов промышленного вылова, ДК была обнаружена только в 4 образцах в следовых количествах (максимум - 1,5 мг/кг). В образцах любительского вылова (21 образец), наличие токсина также было выявлено в 4 образцах: в трех - в следовых количествах, а в образце модиолуса длиннощетинистого в концентрации 13,17 мг/кг. Вследствие столь малого числа контаминированных образцов и низкий уровень контаминации, сравнение содержания AT в группах морепродуктов импортного и отечественного производства, а также любительского вылова не проводилось. Таким образом, из 141 исследованного образца морепродуктов ДК была обнаружена только в 8 образцах (5,67%) в концентрациях от 0,5 мг/кг до 13,17 мг/кг. При этом ни в одном из образцов, ее уровень не превышал установленных в мире гигиенических нормативов (20 мг/кг). Это можно объяснить тем, что во-первых, импортная продукция, которая поступает для реализации на российский рынок, уже прошла соответствующий контроль на содержание этого токсина, а, во-вторых, в настоящее время в мире разработана система и критерии вылова морепродуктов, обеспечивающие минимальный риск их контаминации фикотоксинами, в том числе ДК.

Учитывая, что действие ДК на организм является наиболее тяжелым и необратимым по сравнению с фикотоксинами остальных изучаемых групп, а основным органом-мишенью для ее действия является головной мозг, необходимо подробное изучение механизма действия данного токсина В литературе рассматривается возможность действия ДК через инициирование процессов апоптоза, однако этот механизм пока малоизучен [Chandrasekaran A et al, 2004, Giordano G 2007] В связи с этим в настоящей работе были проведены предварительные эксперименты, направленные на изучение возможного влияния ДК на апоптоз в клетках глин головного мозга, что может являться одним из элементов механизма ее действия* Одними из признаков апоптоза является олигонуклеосомальная фрагментация ДНК и экспрессия рецептора CD95 на поверхности клетки Полученные результаты свидетельствуют о значительном повышении (в 3 раза) количества клеток, находящихся в апоптозе, по сравнению с контролем при исследовании уже через 3 ч после введения токсина (табл 8)

Таблица 8

Доза, мг/кг Процент клеток в апоптозе (%)

0(контроль) 6,70±1,49

0,50 19,57±3,78*

0,75 19,81±3,23*

1,00 21,04±4,09*

1,25 16,29±2,18*

* - р < 0,05 по сравнению с контролем

Через 5 суток после однократного введения ДК также была выявлена четкая тенденция увеличения процента клеток, находящихся в апоптозе, хотя степень нарастания была меньшей и статистически значимые различия между данным показателем контрольной и исследуемых групп были выявлены только при введении токсина в максимальной концентрации - 1,25 мг/кг массы тела

Экспрессия трансмембранного рецептора С095 также является маркером запуска механизмов апоптоза Как через 3 часа, так и через 5 суток наблюдается увеличение числа клеток, окрашиваемых антителами к С095, при этом на 5 сутки после однократного введения это увеличение было более выраженным, чем через 3 ч Полученные данные подтверждают предположение, что ДК инициирует сигнальные пути апоптоза в клетках глии мозга

* Совместно со с н с лаб обмет веществ и энергии ГУ НИИ питания РАМН к м и Мартыновон Е А (рук лаб - член корр РАМН профессор Гаипаров М М Г ) и сотр лаб клинической иммунологии ГНЦ РФ Институт иммунологии ФМБА к б н Ппчугпнон ЛВ(р>к пб - профессор Ппнегин Б В)

3 Оценка рнека для здоровья населения, связанного с контаминацией морепродуктов фнкотоксинлмн

На следующем этапе работы была проведен расчет нагрузкн и оценка рнека для здоровья населения, связанного с контаминацией морепродуктов фикотокспнами Принимая во внимание то, что отравления фикотоксинами обычно случаются редко и посят нерегулярный характер, для проведения расчетов была использована величина разовой порции морепродуктов Учитывая данные литературы, за величину разовой порции потребления были приняты следующие величины 100, 250 и 380 г [Тоуо1ики Н , 2006] На основании полученных данных о содержании ПТ, ДТ и ДК в морепродуктах (медиана и максимум) и величин разовых порций потребления были рассчитаны возможные уровни поступления фикотоксинов при употреблении в пищу гидробнонтов, для человека массой тела 60 кг Для оценки полученных результатов были использованы предложенные Советом Экспертов РАО/ШНО/ЮС величины острых референтных доз (ОРД), составляющие для ПТ - 0,7 мкг/кг массы тела, для ДТ кислоты - 0,33 мкг/кг массы тела, для ДК - 100 мкг/кг массы тела [ТоуоГики Н , 2006] Для характеристики риска развития неканцерогенных эффектов был использован расчет коэффициента опасности В случае, если значение данного показателя не превышает 1,0, риск развития вредных эффектов рассматривается как малый При значениях, больших, чем 1,0, вероятность развития вредных эффектов возрастает, однако точно указать величину этой вероятности невозможно [Онищенко Г Г , 2002]

Папапитнческие токсины

Учитывая, что значения содержания ПТ для морепродуктов промышленного и любительского вылова различны, был проведен расчет коэффициента опасности отдельно для этих двух групп (табл 9)

Таблица 9

Расчет коэффициента опасности для ПТ в мышечной ткани __гидробионтов___

Содержание в образцах мкг/кг Масса порции Количество токсина за разовый прием (мкг) Доза токсина за разовый прием (мкг/кг массы тела) Коэффициент опасности ОРД (мкг/кг массы тела)

Для морепродуктов промышленного вылова

Медиана 110,4 100 11,04 0,18 0,26 0,7

250 27,6 0,46 0,65

380 41,9 0,69 1,0

Для морепродуктов любительского вылова

Медиана 263,2 100 26,32 0,44 0,62 0,7

250 65,8 1,09 1,56

380 100,02 1,67 2,38

При расчете коэффициента опасности по медиане содержания ПТ для морепродуктов промышленного вылова, полученный показатель не превышает значение 1,0, что позволяет говорить о несущественной вероятности развития отрицательных эффектов При оценке риска, связанного с употреблением в пищу морепродуктов любительского вылова для небольших порций (100 г) риск неблагоприятных эффектов можно считать несущественным, однако при увеличении порции (250 г и более) коэффициент опасности увеличивается Диарейные токсины

Вследствие того, что при определении уровня контаминации с использованием расчета I медиана содержания ДТ равна 0, при определении нагрузки при этом типе расчета было использовано значение среднего их содержания в морепродуктах (табл 10)

Таблица 10

Расчет коэфс )ициепта опасности для ДТ

Содержание в образцах мкг/кг Масса порции Количество токсина за разовый прием (мкг) Доза токсина за разовый прием (мкг/кг массы тела) Коэффициент опасности ОРД (мкг/кг массы тела)

Для морепродуктов промышленного вылова

Расчет I

Среднее 32,6 100 3,26 0,05 0,15

250 8,15 0,135 0,4 0,33

380 12,38 0,21 0,6

Расчет II

Медиана 100,0 100 10,0 0,17 0,52

250 25,0 0,42 1,27 0,33

380 38,0 0,63 1,9

Для морепродуктов любительского вылова

Медиана 190,0 100 19,0 0,32 0,95

250 47,5 0,79 2,4 0,33

380 72,2 1,2 3,6

При оценке риска, связанным с употреблением в пищу морепродуктов промышленного вылова, при расчете I, риск развития неблагоприятных последствий является несущественным В случае расчета II риск развития неблагоприятных последствий увеличивается при употреблении в пищу средних и больших порций гидробионтов

При оценке риска, связанного с морепродуктами любительского вылова было установлено, что риск развития неблагоприятных последствий повышен при употреблении в пищу средних и больших порций гидробионтов (2,4 и 3,6 соответственно), учитывая тот факт, что изначально медиана содержания ДТ превышала установленные пороговые значения

Амисстическис токсины

Учитывая тот факт, что ДК была обнаружена только в 5,67% образцов гидробионтов промышленного и любительского вылова, расчет коэффициента опасности проводили по максимальному из полученных значений (табл 11)

Таблица 11

Расчет коэфс шциента опасности для ДК

Содержание в образцах м кг/кг Масса порци и Количество токсина за разовый прием (мкг) Доза токсина за разовый прием (мкг/кг массы тела) Коэффициент опасности ОРД (мкг/кг массы тела)

Для морепродуктов промышленного вылова

Максимум 1500,0 100 150,0 2,5 0,025 100

250 375,0 6,25 0,0625

380 570,0 9,5 0,095

Для морепродуктов любительского вылова

Максимум 13170,0 100 1317,0 21,95 0,22 100

250 3292,5 54,87 0,55

380 5004,6 83,4 0,8

Полученные данные свидетельствуют о том, что при употреблении в пшцу морепродуктов, содержащих ДК в количествах, установленных при проведении исследований, риск развития неблагоприятных последствий можно считать незначительным, однако, учитывая тяжесть и необратимость последствии интоксикации при воздействии ДК, введение норматива на ее допустимое содержание в морепродуктах является необходимым

Таким образом, достаточная частота контаминации фикотоксинами гидробионтов, в первую очередь ПТ и ДТ, и возможность риска неблагоприятных эффектов для здорового населения, является важной проблемой, требующей принятия соответствующих управленческих решений

Учитывая результаты проведенных исследований по определению содержания ПТ, ДТ и АТ в различных морепродуктах, их токсикологические характеристики, расчет нагрузки и оценку риска употребления в пищу гидробионтов, контаминнрованных фикотоксинами, а также в целях гармонизации законодательствами с международными требованиями рекомендуется введение в Российской Федерации следующих допустимых уровней содержания паралитического яда моллюсков (сакситоксина) - не более 0,8 мг/кг (для моллюсков), амнестического яда моллюсков (домоевой кислоты) - не более 20 мг/кг (для моллюсков) и 30 мг/кг (для внутренних органов крабов), диарейнош яда моллюсков (окадаиковой кислоты) - не более 0,16 мг/кг (доя моллюсков)

выводы

1 Впервые обоснованы и разработаны методическая и нормативная базы по организации системы контроля в Российской Федерации за загрязнением морепродуктов природными фикотоксинами

2 Модифицирован и унифицирован ВЭЖХ-метод обнаружения, идентификации и количественного определения домоевой кислоты, основанный на ее градиентном элюировании с УФ-детектированием и обеспечивающий максимальную степень экстракции токсина (83,3%) и снижение уровня потерь при пробоподготовке до 13% Предел обнаружения метода - 0,5 мкг/г, относительное стандартное отклонение - 11,3%, средняя степень извлечения - 83,3%

3 Апробированы и адаптированы иммуноферментные методы для серийных исследований паралитических и диарейных фикотоксинов с пределом обнаружения 50 мкг/кг и 100 мкг/кг и диапазоном определяемых концентраций 50-800 мкг/кг и 100-1000 мкг/кг соответственно

3 Изучены частота и уровни контаминации 21 вида морских гидробионтов (178 образцов), используемых в питании человека, как промышленного (отечественного и импортного производства), так и любительского вылова в прибрежных водах Японского моря Промышленным выловом добыты 10 видов гидробионтов, го числа которых 81,0% являлись двустворчатыми моллюсками (устрицы, гребешки, мидии), 19,0% - головоногими моллюсками и ракообразными Любительским выловом получены 14 видов гидробионтов, го которых наибольший процент составляли двустворчатые моллюски (гребешки, мидии, съедобные ракушки) - 37,5% и ракообразные - 20%, 42,5% - брюхоногие и головоногие моллюски, иглокожие и оболочники

4 Установлено, что частота контаминации морепродуктов паралитическими токсинами составляет 83,8%, при этом наиболее высокие уровни токсинов определены в двустворчатых моллюсках (50,0 - 536,8 мкг/кг) Содержание токсинов во внутренних органах гидробионтов было в 2 раза выше, чем в мышечной ткани (72,0 - 757,9 мкг/кг) Содержание паралитических токсинов в морепродуктах промышленного вылова в группах импортного и отечественного производства не имело статистически значимых различий Содержание токсинов в морепродуктах любительского вылова, как в целом (257,5 мкг/кг), так и в мышечной ткани (229,5 мкг/кг) было выше, чем в морепродуктах промышленного вылова (133,9 и 126,9 мкг/кг соответственно)

5 Наличие диарейных токсинов определено в 16,5% морепродуктов промышленного вылова (100,0 - 657,0 мкг/кг), при этом в морепродуктах импортного производства токсины определялись в 2 раза чаще, чем в отечественных (18,5% и 8,3% соответственно) В 10,1% морепродуктов импортного производства содержание

диарейных токсинов превышало гигиенический регламент, установленный Европейским Союзом (160 мкг/кг), при этом 91,0% их них составляли двустворчатые моллюски (мидии, устрицы) Средний уровень контаминации морепродуктов двух групп промышленного вылова не имел статистически значимых различий Частота контаминации морепродуктов любительского вылова (78,9%) и ее средний уровень превышали значения, полученные для морепродуктов промышленного вылова

6 Частота контаминации домоевой кислотой морепродуктов как промышленного вылова (импортных и отечественных), так и любительского вылова составила 5,67% при концентрациях 0,5 - 13,17 мг/кг

7 На основании полученных результатов и с учетом возможных величин разовых порций потребления морепродуктов, в соответствии с расчетным методом ФАО/ВОЗ, получены величины коэффициента опасности, характеризующего риск развития неблагоприятных последствий для здоровья населения Российской Федерации при употреблении в пищу морепродуктов, контаминированных фикотоксинами Максимальные значения коэффициента опасности для паралитических и диарейных токсинов составили для гидробионтов промышленного вылова - 1,0 и 1,9, любительского-2,38 и 3,6 соответственно Результаты расчетов позволяют отнести загрязнение фикотоксинами к реальным рискам, при этом первостепенное значение имеют двустворчатые моллюски, уровни контаминации которых фикотоксинами являются максимальными, что требует введения гигиенических регламентов и проведения контроля за этими веществами в двустворчатых моллюсках

8 С учетом данных оценки риска для здоровья населения предложены гигиенические регламенты для следующих групп фикотоксинов

- паралитический ад моллюсков (сакситоксин) - не более 0,8 мг/кг,

- Д1 ирейный яд моллюсков (окадаиковая кислота) - не более 0,16 мг/кг,

- амнесп меш ш яд моллюсков (домоевая кислота) - не более 20 мг/кг

Внедрение результатов работы в практику

1) МУК 4 1 2229-07 «Определение домоевой кислоты в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» - М Роспотребнадзор, 2007

2) MP 01 015-07 «Экспресс-определение сакситоксина в моллюсках с помощью тест-системы «RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)», производства фирмы «R-Biopharm AG, Германия» - М ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007

3) MP 01 016-07 «Экспресс-определение окадаиковой кислоты в моллюсках с помощью тест-системы «DSP-Check», производства фирмы «Parapharm Laboratones Со, Ltd, Япония» - М ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007

4) Разработан допустимый уровень содержания ПТ, ДТ и ДК в нерыбных объектах промысла (моллюски, ракообразные) Дополнение в СанПиН 2 3 2 1078-01 - М Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2008

Список опубликованных работ по теме диссертации Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК:

1 Коханова Ю А, Хотимченко С А Биобезопасность Фикотоксины // Вопросы питания

-2006 -№2 -С 3-8

2 Коханова Ю А , Хотимченко С А Биобезопасность Фикотоксины II Вопросы питания

-2006 -№3 -С 3-8

3 Коханова Ю А , Хотимченко С А Биобезопасность Фикотоксины // Вопросы питания

-2006 -№4 -С 16-19

4 Коханова Ю А , Хотимченко С А Киселева Т В Фикотоксины групп ASP, PSP и DSP в

морепродуктах // Вопросы питания - 2007 - №4 -С 54-57

Другие публикации

5 Коханова Ю А , Хотимченко С А Токсикологическая оценка фикотоксинов // Научные

труды Федерального научного центра гигиены им Ф Ф Эрисмана "Благополучная среда обитания - залог здоровья населения", вып 12 - Воронеж, 2004- С 402-403

6 Коханова Ю А, Хотимченко С А Изучение токсичности фикотоксинов в морепродуктах // Научные труды Федерального научно] о центра гигиены им Ф Ф Эрисмана «Факторы риска и здоровье населения России» вып 13 - Липецк, 2004 -С 523-524

7 Коханова 10 А, Хотимченко С А Изучение содержания фикотоксинов группы PSP и DSP в морепродуктах // Вестник (приложение) Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им И И Мечникова - 2007 - №2(2) - С 84

8 Коханова Ю А , Хотимченко С А Токсикологическая оценка домоиковой кислоты //

Материалы конференции «Питание здорового и больного человека» - С -Пб , 2005 - С 117-118

9 Коханова ЮА Изучение содержания сакснтоксина в морепродуктах // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» - Суздаль, 2005 - С 292-293

10 Коханова ЮА, Киселева ТВ, Хотимченко С А Методы определения домоиковой кислоты в морепродуктах // Материалы VIII Всероссийского конгресса «Оптимальное питание - здоровье нации» -Москва, 2005 -С 134

11 Коханова Ю А , Хотимченко С А Изучение содержания токсинов группы PSP в морепродуктах // Материалы IV межрегиональной научно-практической конференции «Питание здорового и больного человека» - С -Пб , 2006 - С 107-108

12 Киселева Т В , Коханова Ю А Фикотоксины - биологические опасности загрязнения морепродуктов // Сборник докладов IV международной конференции-выставки

«Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» Ч II-2006 -С 65-67

13 Коханова 10 А , Хотимченко С А Изучение содержания фикотоксинов группы PSP в морепродуктах // Материалы научно-практических конгрессов III Всероссийского форума «Здоровье нации - основа процветания России» - Москва, 2007 - Т 2 Ч 1 -С 81-82

14 Коханова 10 А Изучение содержания фикотоксинов различных групп в морепродуктах // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» - Рязань, 2007 - С 181-183

Автор благодарен директору ГУ НИИ питания РАМН академику РАМН, доктору медицинских наук В А Тутельяну за постоянное внимание и помощь при выполнении диссертационной работы

Заказ № 211/04/08 Подписано в печать 24 04 2008 Тираж 120 экз Уел пл 1,5

ч\ ООО' Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ■\\rww с/г ги , е-тай т/о@с/г ¡и

В последние годы в питании населения России все большее место занимают рыба и морепродукты. В соответствии с разработанными в Минэкономразвития России макроэкономическими показателями развития экономики страны и повышения благосостояния населения, рост среднедушевого потребления рыбных товаров по оптимистическому сценарию может составить за 2003-2010 годы около 35%. При этом в структуре океанического рыболовства более быстрыми темпами будет возрастать о,бъем добычи нерыбных объектов промысла, удельный вес которых увеличится с 4,2% в 2003 г. до 10,6% в 2010 г [Ильясов С.В., 2004]. По данным маркетингового исследования компании "АМИКО" рынок морепродуктов является сегодня одним из самых динамично растущих среди всех сегментов продовольственного рынка России. Ежегодный рост рынка морепродуктов составляет 30-40% [Маркетинговое исследование рынка морепродуктов и морских деликатесов, 2007]. Являясь источником высококачественного белка и микроэлементов [Тутельян В.А. с соавт., 2002], морепродукты одновременно могут содержать и опасные вещества, одними из которых являются фикотоксины. Фикотоксины представляют собой группу токсинов, продуцируемых некоторыми видами водорослей, микроводорослей и цианобактериями, многие из которых являются начальным звеном пищевой цепи и служат источником пищи для многих морских животных, в том числе моллюсков и некоторых видов рыб и ракообразных, часть из которых имеет промысловое значение [FAO, 2004; Орлова Т.Ю. 2005].

Являясь природными контаминантами морепродуктов, фикотоксины представляют несомненную опасность для здоровья населения. Эти вещества могут вызывать выраженные как острые отравления, сопровождающиеся специфичной для различных групп фикотоксинов клинической картиной, так и отдаленные эффекты, в том числе канцерогенез [White J., et al 2003; White J., et al 2003; Foodborne Poisonings and Toxicity., 2006].

Ежегодно во всем мире регистрируются отравления фикотоксинами, некоторые из которых заканчиваются летальным исходом [Van Dolah F.M. 2000]. Наиболее часто отравления происходят при употреблении в пищу двустворчатых моллюсков — мидий, гребешков, устриц и различных ракушек [Stewart J.E. and Subba Rao D.V., 1997; FAO., 2004]. При этом установлено, что технологическая обработка не приводит к полной деконтаминации продукта [Lawrence J.F. et al., 1994; Indrasena W. M., Gill T. A., 2000; FAO., 2004; Stommel E.W., Watters M.R. 2004].

Отсутствие официально зафиксированных случаев отравления в нашей стране, по-видимому связано с неосведомленностью медицинского персонала о возможности отравления фикотоксинами при употреблении в пищу морепродуктов, неспецифичностью клинической картины отравления при поступлении малых доз токсинов, а также отсутствием утвержденных лабораторных методов исследования, позволяющих провести дифференциальную диагностику интоксикации.

Обращает на себя внимание тот факт, что в ряде случаев опасны не только острые отравления фикотоксинами, но и хроническое поступление малых доз данных контаминантов, что связано наличием у некоторых из них (DSP-токсины) канцерогенных свойств [Maynes J.T. et al., 2001]. В связи с этим представляется актуальным изучение механизмов действия фикотоксинов, что позволит более достоверно оценивать риск для здоровья населения, связанный с поступлением фикотоксинов в организм человека.

Несмотря на то, что во многих странах мира уже организован мониторинг за загрязнением гидробионтов фикотоксинами [FAO., 2004], в России еще не сформирована нормативная и методическая база в отношении этих контаминанов.

В целях обеспечения безопасности морепродуктов необходимо всестороннее изучение проблемы контаминации их фикотоксинами, а также оценка риска поступления этих веществ с рационом. Обязательным элементом системы контроля контаминации фикотоксинами морепродуктов является методическая база. Таким образом, актуальным и необходимым является разработка методов обнаружения, идентификации и количественного определения фикотоксинов.

Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы является модификация и унификация метода обнаружения, идентификации и количественного определения ДК в морепродуктах и оценка риска для здоровья населения, связанного с загрязнением некоторыми фикотоксинами морепродуктов.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1) Оптимизировать основанный на ВЭЖХ метод обнаружения, идентификации и количественного определения ДК и апробировать и адаптировать основанные на ИФА скрининговые методы определения PSP- и DSP-токсинов в морепродуктах.

2) Изучить содержание фикотоксинов групп PSP, ASP и DSP в морепродуктах.

3) Рассчитать нагрузку и оценить риск для здоровья населения, связанный с загрязнением PSP, DSP и ASP морепродуктов, с целью обоснования гигиенических нормативов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Разработан метод обнаружения, идентификации и количественного определения ДК в моллюсках с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, характеризующийся хорошей воспроизводимостью и надежностью (предел обнаружения 0,5 мкг/г).

Впервые в России изучено содержание ASP-, PSP- и DSP-токсинов в морепродуктах как промышленного вылова (отечественного и импортного производства), так и любительского вылова (отечественные). Установлена высокая частота контаминации исследованных образцов PSP-токсинами (83,8%). Частота загрязнения морепродуктов ДК и DSP-токсинами была значительно ниже (5,67% и 24,3% соответственно), однако, уровни содержания DSP в ряде образцов превышали пороговые значения.

Проведены расчет нагрузки и оценка риска для здоровья населения, связанного с загрязнением PSP-, DSP и ASP-токсинами морепродуктов промышленного и любительского вылова.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1) Разработаны МУК 4.1. 2229-07 «Определение домоевой кислоты в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии». -М: Роспотребнадзор, 2007.

2) Разработаны MP 01.015-07 «Экспресс-определение сакситоксина в моллюсках с помощью тест-системы «RIDASCREEN FAST PSP (Saxitoxin)», производства фирмы R-Biopharm AG, Германия.». - М.: ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007.

3) Разработаны MP 01.016-07 «Экспресс-определение окадаиковой кислоты в моллюсках с помощью тест-системы «DSP-Check», производства фирмы Parapharm Laboratories Co., Ltd, Япония» - M.: ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007.

4) Разработан допустимый уровень содержания фикотоксинов групп PSP (паралитический яд моллюсков), ASP (амнестический яд моллюсков) и DSP (диарейный яд моллюсков) в нерыбных объектах промысла (моллюски, ракообразные). Дополнение в СанПиН 2.3.2.1078-01 - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2008.

7. ВЫВОДЫ

1. Впервые обоснованы и разработаны методическая и нормативная базы по организации системы контроля в Российской Федерации за загрязнением морепродуктов природными фикотоксинами.

2. Модифицирован и унифицирован ВЭЖХ-метод обнаружения, идентификации и количественного определения домоевой кислоты, основанный на ее градиентном элюировании с УФ-детектированием и обеспечивающий максимальную степень экстракции токсина (83,3%) и снижение уровня потерь при пробоподготовке до 13% Предел обнаружения метода - 0,5 мкг/г, относительное стандартное отклонение — 11,3%, средняя степень извлечения - 83,3%>.

3. Апробированы и адаптированы иммуноферментные методы для серийных исследований паралитических и диарейных фикотоксинов с пределом обнаружения 50 мкг/кг и 100 мкг/кг и диапазоном определяемых концентраций 50-800 мкг/кг и 100-1000 мкг/кг соответственно.

3. Изучены частота и уровни контаминации 21 вида морских гидробионтов (178 образцов), используемых в питании человека, как промышленного (отечественного и импортного производства), так и любительского вылова в прибрежных водах Японского моря. Промышленным выловом добыты 10 видов гидробионтов, из числа которых 81,0% являлись двустворчатыми моллюсками (устрицы, гребешки, мидии), 19,0% - головоногими моллюсками и ракообразными. Любительским выловом получены 14 видов гидробионтов, из которых наибольший процент составляли двустворчатые моллюски (гребешки, мидии, съедобные ракушки) - 37,5%) и ракообразные - 20%, 42,5% - брюхоногие и головоногие моллюски, иглокожие и оболочники.

4. Установлено, что частота контаминации морепродуктов паралитическими токсинами составляет 83,8%, при этом наиболее высокие уровни токсинов определены в двустворчатых моллюсках (50,0 - 536,8 мкг/кг). Содержание токсинов во внутренних органах гидробионтов было в 2 раза выше, чем в мышечной ткани (72,0 - 757,9 мкг/кг). Содержание паралитических токсинов в морепродуктах промышленного вылова в группах импортного и отечественного производства не имело статистически значимых различий. Содержание токсинов в морепродуктах любительского вылова, как в целом (257,5 мкг/кг), так и в мышечной ткани (229,5 мкг/кг) было выше, чем в морепродуктах промышленного вылова (133,9 и 126,9 мкг/кг соответственно).

5. Наличие диарейных токсинов определено в 16,5% морепродуктов промышленного вылова (100,0 - 657,0 мкг/кг), при этом в морепродуктах импортного производства токсины определялись в 2 раза чаще, чем в отечественных (18,5% и 8,3% соответственно). В 10,1% морепродуктов импортного производства содержание диарейных токсинов превышало гигиенический регламент, установленный Европейским Союзом (160 мкг/кг), при этом 91,0% их них составляли двустворчатые моллюски (мидии, устрицы). Средний уровень контаминации морепродуктов двух групп промышленного вылова не имел статистически значимых различий. Частота контаминации морепродуктов любительского вылова (78,9%) и ее средний уровень превышали значения, полученные для морепродуктов промышленного вылова.

6. Частота контаминации домоевой кислотой морепродуктов как промышленного вылова (импортных и отечественных), так и любительского вылова составила 5,67% при концентрациях 0,5 - 13,17 мг/кг.

7. На основании полученных результатов и с учетом возможных величин разовых порций потребления морепродуктов, в соответствии с расчетным методом ФАО/ВОЗ, получены величины коэффициента опасности, характеризующего риск развития неблагоприятных последствий для здоровья населения Российской Федерации при употреблении в пищу морепродуктов, контаминированных фикотоксинами. Максимальные значения коэффициента опасности для паралитических и диарейных токсинов составили для гидробионтов промышленного вылова - 1,0 и 1,9, любительского- 2,38 и 3,6 соответственно. Результаты расчетов позволяют отнести загрязнение фикотоксинами к реальным рискам, при этом первостепенное значение имеют двустворчатые моллюски, уровни контаминации которых фикотоксинами являются максимальными, что требует введения гигиенических регламентов и проведения контроля за этими веществами в двустворчатых моллюсках.

8. С учетом данных оценки риска для здоровья населения предложены гигиенические регламенты для следующих групп фикотоксинов:

- паралитический яд моллюсков (сакситоксин) - не более 0,8 мг/кг,

- диарейный яд моллюсков (окадаиковая кислота) - не более 0,16 мг/кг,

- амнестический яд моллюсков (домоевая кислота) - не более 20 мг/кг.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Учитывая рост потребления морепродуктов, возможность их контаминации фикотоксинами представляет несомненную опасность для здоровья населения.

Соответственно актуальным и необходимым является как разработка методов определения фикотоксинов, так и оценка нагрузки этими веществами на население, что позволяет проводить оценку риска развития неблагоприятных последствий для здоровья населения, связанного с загрязнением фикотоксинами морепродуктов, и обосновать введения гигиенических регламентов их содержания в гидробионтах.

В нашей работе был разработан метод определения одного из самых опасных фикотоксинов - домоевой кислоты, а также исследованы некоторые особенности механизма его действия на организм животных и изучено содержание фикотоксинов групп PSP, ASP и DSP в морепродуктах промышленного и любительского вылова.

В предварительной серии экспериментов были проведены сравнительные исследования четырех различных схем экстракции, очистки и ВЭЖХ определения домоевой кислоты в морепродуктах [Hatfield C.L. et al., 1994; Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG., 2002; Quilliam M.A., 2003; AOAC Official Method 991.26, 1999].

На этапе экстракции токсина из образца в результате проведенных исследований было установлено, что при использовании смеси метанол-вода (1:1), которая и была выбрана для проведения дальнейшей работы, наблюдалась наиболее высокая степень экстракции.

В ходе работы была изменена масса навески и объем экстракционной смеси, которые были уменьшены на 25%, что позволило сократить расход растворителей, при том, что степень извлечения не изменилась. Таким образом, предложена экстракция ДК из 3,0 г. измельченной навески путем гомогенизации с 12,0 мл смеси метанол-вода (1:1).

На следующем этапе в качестве метода очистки была использована твердофазная экстракция на патронах с силикагелем с привитыми четвертичными аммониевыми группами. Для повышения чувствительности метода был уменьшен объем экстракта, используемого в дальнейшем анализе, подобран состав элюирующей смеси. Результатом проведенной работы стала разработка оптимальных условий экстракции токсина из образца.

Определение содержания ДК в очищенном экстракте моллюсков определяли методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. Длина волны составляет 242 нм. При подборе подвижной фазы были использованы вода, ацетонитрил и метанол в различных сочетаниях и при разных значениях рН. В результате в качестве мобильной фазы предложено использование смеси ацетонитрил-вода-метанол, рН=2,5 (трифторуксусная кислота) и использовано градиентное изменение пропорций компонентов мобильной фазы. При этом удалось добиться сужения пика токсина и оптимального времени удерживания.

Таким образом, в результате проведенных исследований оптимальной для анализа ДК в моллюсках была признана разработанная схема, включающая экстракцию токсина смесью метанол-вода (1:1), очистку экстракта на патронах твердофазной экстракции и количественное определение с помощью ВЭЖХ при градиентном элюировании с УФ-детектированием.

В процессе работы были решены такие задачи, как подбор экстракционной смеси, позволяющей селективно извлекать ДК из образца; выбор способа очистки экстракта, позволяющий эффективно изолировать токсин от фоновых примесей; оптимизация условий проведения ВЭЖХ для обеспечения точного определения ДК в малых количествах.

В результате проведенных исследования были получены данные о содержании фикотоксинов групп PSP, ASP и DSP в образцах морепродуктов промышленного и любительского вылова.

PSP-токсины в количестве, превышающем порог чувствительности метода (50 мкг/кг) были обнаружены в 145 образцах из 173 (83,8 %). При этом установлено, что содержание этих токсинов во внутренних органах гидробионтов превышает данный показатель для мышечной части практически в 2 раза. Полученные результаты совпадают с литературными данными, указывающими на то, что максимальные концентрации токсинов обнаруживаются чаще всего именно во внутренних органах различных гидробионтов [Oikawa Н. et al., 2002; Pereira P. et al., 2004; Ito K. et al., 2004].

При анализе содержания PSP-токсинов в образцах промышленного вылова импортного и отечественного производства было установлено отсутствие статистически значимых различий между этими группами (р>0,5), что позволило объединить данные по содержанию этих фикотоксинов, полученные для этих двух групп, для проведения дальнейшего анализа.

При сравнении образцов промышленного и любительского вылова обнаружено, что процент загрязненных образцов в этих группах был практически одинаков (84,3% и 81,3% соответственно). Ни в одном из образцов не было обнаружено концентрации PSP-токсинов, превышающей гигиенический регламент, установленный в ряде зарубежных стран (800 мкг/кг продукта).

При сравнении содержания PSP-токсинов в данных группах образцов установлено, что содержание сакситоксина как в целом, так и в съедобной мышечной части морепродуктов было ниже в образцах промышленного вылова, чем в гидробионтах любительского вылова. При этом наибольшее количество образцов промышленного вылова (68,6%) содержало токсины в концентрациях 50 - 200 мкг/кг, а любительского (45,5%) - в концентрациях 200-400 мкг/кг.

Данные различия можно объяснить как тем, что продукты промышленного вылова, отобранные в торговой сети, были перед замораживанием подвергнуты кулинарной обработке, позволяющей частично элиминировать токсины, так и тем, что основная масса морепродуктов, находящихся в торговой сети, представлена продукцией импортного производства и поступает на российский рынок из тех стран, где проводится постоянный мониторинг за содержанием фикотоксинов. Однако, в отдельных образцах морепродуктов промышленного вылова содержание PSP-токсинов было сравнительно высоким (в морском гребешке их концентрация доходила до 536,8 мгк/кг продукта). Учитывая то, что по литературным данным поступление 120-180 мкг сакситоксина уже может привести к отравлению средней тяжести, при такой концентрации токсина в гребешках это эквивалентно их потреблению в количестве 223-335 г [Shellfish toxins in food. A Toxicological review., 2001].

Несколько иные данные были получены при изучении содержания DSP-токсинов в образцах гидробионтов.

Из 133 образцов морепродуктов промышленного вылова, только в 18 (13,5%) были обнаружены DSP токсины. В 11 (7,5%) изученных образцах импортного производства содержание DSP-токсинов превышало установленный гигиенический регламент (160 мкг/кг). При этом 10 из них были представлены двустворчатыми моллюсками (мидии, устрицы, гребешок).

При исследовании образцов любительского вылова, из 19 образцов токсины обнаружены в 15 (78,9%), а в 10 из них концентрация DSP-токсинов превышала установленный в мире гигиенический регламент (160 мкг/кг).

Полученные данные показывают, что при достаточно низком проценте обнаружения (из 152 изученных образцов только в 37 образцах были обнаружены DSP-токсины в концентрации более 100 мкг/кг), в целом содержание DSP-токсинов в этих образцах были на достаточно высоком уровне и составило в среднем (только для образцов с обнаруженными токсинами) 217,9±18,6 мкг/кг, а в 21 образце (13,8% от общего числа исследованных образцов) их уровень был более 160 мкг/кг.

Результаты проведенного анализа указывают на то, что содержание токсинов в группе морепродуктов промышленного вылова было ниже, чем в группе любительского вылова.

Важно отметить, что DSP-токсины обнаруживались в основном в двустворчатых моллюсках (мидии и устрицы). Таким образом, можно заключить, что, несмотря на то, что процент обнаружения DSP-токсинов был низким, в тех образцах, где они были обнаружены, его содержание было довольно высоким, что указывает на увеличение риска отравлений этими токсинами.

При исследовании образцов гидробионтов на содержание ASP-токсинов, ДК была обнаружена в следовых количествах в 4 из 120 образцов промышленного вылова (3,3%) и в 4 из 21 образца любительского вылова (19,0%). При этом в одном образце любительского вылова содержание ДК, составившее 13,17 мг/кг приближалось к пороговому значению, установленному для ASP-токсинов (20 мг/кг).

Отсутствие превышения гигиенического регламента, установленного для ДК, в исследованных образцах гидробионтах можно объяснить следующим: во-первых, импортная продукция, которая поступает для реализации на российский рынок, уже прошла соответствующий контроль на содержание этого токсина; во-вторых, в настоящее время в мире разработаны критерии вылова, согласно которым, он осуществляется в период, когда можно ожидать наименьшего риска накопления ASP-токсинов в морепродуктах.

При проведении предварительных экспериментов, направленных на изучение возможного влияния ДК на апоптоз в клетках глии головного мозга, было показано, что под влиянием токсина увеличивается процент клеток с олигонуклеосомальной фрагментацией ДНК числа клеток, экспрессирующих рецептор апоптоза CD95. Полученные данные подтверждают предположение, что ДК инициирует сигнальные пути апоптоза в клетках глии мозга.

На основании полученных данных о< содержании фикотоксинов изучаемых групп в морепродуктах промышленного и любительского вылова, была проведен расчет нагрузки и оценка риска для здоровья населения, связанного с контаминацией морепродуктов фикотоксинами. Для этих целей расчет нагрузки проводился с учетом величины возможного, разоваго потребления морепродуктов в пищу. Учитывая- данные литературы, за величину разовой порции потребления были приняты следующие величины: 100, 250 и 380 г. [Toyofuku Н., 2006].

Полученные резльтаты свидетельствуют о возможности развития, неблагоприятных последствий для здоровья населения в случае употребления морепродуктов, контаминированных фикотоксинами. При этом для всех групп фикотоксинов величина коэффициента опасности для. гидробионтов любительского вылова превышала величину для морепродуктов промышленного вылова. Анализируя приведенные данные, можно заключить, что наибольшую опасность представляет продукция не прошедшая гигиенический контроль (любительский вылов).

Учитывая опасность, воздействия фикотоксинов на организм человека, вплоть до летального исхода, и полученные результаты, свидетельствующие о реальной возможности интоксикации, представляется необходимым проведение мониторинга содержания DSP, PSP, и ASP-токсинов в морепродуктах. При этом необходимо осуществление контроля именно на этапах вылова гидробионтов с тем, чтобы в реализацию и на переработку поступало безопасное сырье. Следует отметить, что контроль надо сконцентрировать на тех морепродуктах, которые могут содержать наибольшие концентрации фикотоксинов, т.е. двустворчатых моллюсках.

Учитывая наличие у фикотоксинов групп PSP, ASP и DSP токсических, а у DSP-токсинов и канцерогенных свойств, достаточно высокую частоту контаминации этими фикотоксинами морепродуктов и необходимость гармонизации отечественного пищевого законодательства с требованиями международных документов представляется целесообразным введение в Российской Федерации допустимого уровня содержания PSP-токсина (сакситоксина) - не более 0,8 мг/кг (для моллюсков); ASP-токсина (домоевой кислоты) - не более 20 мг/кг (для моллюсков); DSP-токсина (окадаиковой кислоты)—не более 0,16 мг/кг (для моллюсков).