Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Разработка методов лечения локализованной формы саркомы Юинга

,РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК J ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

, .. ..л-i имени академика H.H.Блохина

1 1 МОП ibcj

На правах рукописи УДК 616-006.83-08

ТАЙЛАКОВ Балтабай Бейшеевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ЛЕЧЕНИЯ ЛОКАЛИЗОВАННОЙ ФОРМЫ САРКОМЫ ЮИНГА

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1996 г.

Работа выполнена в Онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина Российской Академии медицинских наук (директор, академик РАМН Трапезников H.H.)

Научный консультант:

академик РАМН, профессор Трапезников H.H.

Официальные оппоненты: д.м.н., профессор, член-корр.РАМН

Дурнов Л.А. Возный Э.К. Махсон А.Н.

доктор медицинских наук доктор медицинских наук

Ведущее учреждение: Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Минздрава Российской Федерации

Д.001.17.01. при Онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан " октября 1996 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета к.м.н. Ю.В.Шишкин

Защита диссертации состоится _ _1996 г.

в_часов на заседании Специализированною Ученого совета

1996 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В структуре заболеваемости среди злокачественных новообразований костей саркома Юинга занимает второе место после остеогенной саркомы, составляя 10-25%. Наиболее часто встречается в возрасте 1020 лет, т.е. у детей и подростков. Характерная локализация - метафизы и диафизы длинных трубчатых костей, кости таза, ребра, позвонки (Трапезников H.H. с соавт., 1986; Rosen G., 1993; Craft A.W., 1990; Jürgens Н. et. al. 1994 и др). В 6-10% случаях встречается так называемая экстраскелетная форма саркомы Юинга (Huvos A.G., 1991). Пестрота клинической картины, чрезвычайная агрессивность с бурным гематогенным метастазировамием в легкие и кости скелета, отсутствие четкой трактовки гистогенеза, а также малоудовлетворительные результаты терапии предопределяют ее особое место d .практическом отношении.

В последние десятилетие достигнуты определенные успехи в изучении природы заболевания и его лечении. Прогресс в современной он-коморфологии, молекулярной биологии, иммуногистохимии и цигоге-нетике позволил доказать родство саркомы Юинга с такими опухолями как примитивные нейроэктодермальные опухоли (PNET), опухоль Ас-кина, а также дифференцировать ее от других мелкоклеточных сарком костей и мягких тканей, нейробластомы и лимфом (Соловьев Ю.Н., 1995; Ambros I. et. al. 1991; Askin F.B. et. al. 1991; Dehner R. et. al. 1993 и другие).

Биологическая особенность этой опухоли, характеризующаяся высокой чувствительностью к химиолучевому воздействию, порождает два разных подхода в лечении локализованных форм этого заболевания. Ряд авторов ратуют за исключительно консервативное лечение с использованием химиолучевой терапии (Н.Н.Трапезников с соавт, 1986; Л.А.Еремина с соавт., 1979; Valdes Z.M. et.al., 1985; Munoz А. et. al., 1989 и др.). Другие исследователи наряду с химиолучевой терапией применяют хирургические методы лечения (Delepine G. et. al., 1986; Bilimor J.A. et. al. 1988; Bacci et. al. 1989 и др.). Такое разделение на сторонников консервативного и хирургического лечения, безусловно, очень относительно. В настоящее время, как видно из ряда последних публикаций, при лечении саркомы Юинга предпочтение отдается неоа-дъювантному подходу: на первом этапе полихимиотерапия, затем лучевая терапия, после которых следует длительная адъювантная химиотерапия. Дополнение этой методики оперативным вмешательством позволяет провести морфологическое исследование удаленной опухоли, гис-

тологически оценить эффективность проведенной терапии и, таким образом, корригировать последующие курсы дополнительной полихимиотерапии (Cagnano R. et. al. 1989; Roche H. et. al. 1989 и др.).

Несмотря на накопленный солидный клинический опыт научных центров и клиник разных стран мира лечение локализованной формы саркомы Юинга и ее метастазов, их профилактика на данном этапе развития онкологической науки часто носит эмпирический характер. К настоящему времени окончательно не изучены и требует своег о разрешения следующие вопросы: роль неоадъювантного подхода, степень эффективности различных комбинированных методов терапии, оптимальность сочетания лучевого и хирургического воздействия в лечении первичной опухоли, прогноз и выживаемость у больных на фоне адъювант-ной химиотерапии, а также возможность возникновения вторичных новообразований после излечения саркомы Юинга. Малоизученными остаются вопросы связанные с целесообразностью регионарной (внутриартериальной) химиотерапии и ее влияния на возникновение рецидива или на вероятность метастазирования опухоли.

Большинство специалистов, изучая иммунный статус больных, останавливаются лишь на клетках периферической крови, тогда как в первую очередь нарушения и изменения в их составе происходят непосредственно в области патологического очага (Balch et.al. 1990). Комплексное изучение иммунофенотипа опухоли и местного иммунологического статуса у больных саркомой Юинга может предоставить возможности для улучшения диагностики и более точного прогнозирования ее течения, а также для разработки методов иммунотерапии.

Широкое внедрение в клиническую практику метода проточной цитофлуорометрии позволило изучить одну из основных фундаментальных характеристик злокачественных опухолей - степень плоиднос-ти ДНК и пролиферативную активность клеток. Доказано, что ансупло-идное содержание ДНК в клетках солидных новообразований является критерием наихудшего прогноза (Atkin N.B. et. al. 1979; Aner G. et. al. 1984; Frankfurt O.S. et. al. 1984). Изучение степени плоидности ДНК и пролиферативной активности клеток саркомы Юинга позволило бы более точно предсказать течение заболевания и выбрать оптимальные методы терапии.

Экспериментальные и клинические исследования последних лет показали, что злокачественные новообразования костей относятся к разряду гормоночувствительных опухолей, о чем свидетельствует наличие в их клетках функционально активных рецепторов стероидных гормонов (Кушлинский Н.Е. с соавт. 1993; Corvol T. et. al. 1987 и др.). Изуче-

ние рецепторов половых стероидных гормонов при саркоме Юинга позволит определить степень их гормоночувствительности.

Все выше изложенное свидетельствуют о несомненной актуальности избранной темы и необходимости всестороннего анализа накопленного опыта диагностики и лечения саркомы Юинга с целью выработки оптимальных методов терапии

Цель исследования

Разработать комплекс оптимальных методов комбинированной терапии направленных на улучшение результатов лечения больных саркомой Юинга с учетом основных прогностических факторов, характеризующих биологические особенности опухоли.

Задачи исследования

1. Оценить результаты комбинированных методов терапии, применяемых в ОНЦ РАМН для лечс;:::я больных локализованной формой саркомы Юинга:

- изучить эффективность комбинированной терапии по схеме: лучевая терапия + адъювантная химиотерапия VAC (Протокол I); - оценить результаты комбинированной терапии по Протоколу II: внутриар-териальная инфузия химиопрепаратов или САР или VACM + лучевая терапия + многокомпонентная адъювантная полихимиотерапия (САР + VACM + VDC) по сравнению с уже изученными в ОНЦ схемами;

- разработать методики и изучить эффективности внутриартери-альной химиотерапии с использованием адриамицина и цисплатины с учетом влияния на рецидивирование первичной опухоли и вероятность метастазирования;

- изучить возможности хирургического метода в условиях современной комбинированной терапии саркомы Юинга.

- выработать гистологические критерии терапевтического патомо-рфоза опухоли и оценить их значение в прогнозировании течения заболевания и в планировании лечения.

2. Изучить влияние беременности на клиническое течение саркомы Юинга; определить частоту обнаружения и уровень рецепторов стероидных гормонов в ткани опухоли.

3. Исследовать содержание ДНК в клетках опухолей методом проточной цитофлуорометрии и определить его клипико-прогностическое значение.

4. Изучить иммунофенотип опухоли и местный иммунологический статус у больных саркомой Юинга с использованием широкой ианели моноклональных антител.

Научная новизна работы

Анализ самого крупного в отечественной практике клинического материала с применением современных методик статистического анализа на базе ЭВМ позволяет представить новые данные по следующим вопросам:

- Разработаны методики адъювантной химиотерапии по схемам VAC и САР + VACM + VDC, что позволило достоверно увеличить 5-летнюю выживаемость больных по сравнению с чисто лучевой терапией. Пятилетняя выживаемость составляет соответственно 36.4%, 57.2% и 7.5%.

- Разработана методика проведения регионарной внутриартери-альной инфузии адриамицином и цис-платином, которая в сочетании с лучевой терапией обеспечивает лучшие непосредственные и отдаленные результаты лечения. Показано, что при таком подходе, присоединение адъювантной химиотерапии по схеме САР + VACM +- VDC позволяет достоверно повысить 5-летнюю безрецидивную выживаемость по сравнению с лучевой терапией + VAC (66.2% и 46.5% соответственно).

- Всесторонне изучен терапевтический патоморфоз (ТП) саркомы Юинга на фоне химиолучевой терапии. Доказано, что этот показатель имеет прогностическое значение, так при ТП Ш-IY степени прогноз заболевания лучше чем при I-II степени ТП (67.7% и 54.5 % соответственно).

- Впервые в отечественной и зарубежной практике комплексно изучены плоидность и пролиферативная активность ДНК, содержание рецепторов стероидных гормонов опухолевых клеток, местный имму-нофенотип при саркоме Юинга. Полученные данные могут быть весьма полезны в понимании природы заболевания и планировании лечения больных.

Практическая значимость работы

Разработанные на основании проведенного исследования подходы к терапии саркомы Юинга предопределяют перспективы к улучшению отдаленных результатов лечения и в понимании биологических особенностей данного новоообразования.

1. Внедрены в практику и широко применяются в ряде лечебных учреждений России методики адъювантной полихимиотерапии по схемам VAC, CAP, VDC и VACM и регионарной химиотерапии.

2. Впервые в отечественной практике па большом клиническом материале изучены роль и место хирургического метода в современной комбинированной терапии саркомы Юинга. Определены показания и противопоказания к его применению.

3. Отработаны методики изучения рецепторов стероидных гормонов, плоидности и пролиферативной активности опухолевых клеток, местного иммунофенотипа опухоли.

Полученные в результате настоящего исследования данные открывают новые возможности для дальнейшего развития комбинированных методов терапии, а также в понимании биологических особенностей этого, до конца не изученного, новообразования.

Внедрение результатов исследования.

Практические рекомендации, сформулированные в исследовании, внедрены в практику работы кафедры онкологии Московской Медицинской Академии им.И.М.Сеченова и Академии последипломного образования врачей Минздрава Российской Федерация, хирургического отделения общей онкологии, отделения амбулаторных методов диагностики и лечения НИИ клинической онкологии Онкологического научного центра им.Н.Н.Блохина и НИИ детской онкологии Онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина Российской Академии медицинских наук.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на I съезде онкологов Узбекистана с международным участием (Ташкент, 1994); на IX съезде онкологов и радиологов Украины (Винница, 1995); на Научно-практической конференции, посвященной 30-летию Республиканского онкодиспансера Башкортостана (Уфа, 1995); VIII республиканской научно-практической конференции по актуальным вопросам диагностики и лечения злокачественных новообразований (Казань, 1995); Смоленской областной научно-практической конференции онкологов (Смоленск,

1995); шестом Международном Конгрессе по лечению рака (Париж,

1996); четвертой Международной конференции по компьютеризации цитологических и гистологических лабораторий (Чикаго, 1996); XXXVII Международной конференцнн по детской онкологии (Вена, 1996).

Диссертация апробирована на совместной научной конференции с участием хирургического отделения общей онкологии, отдела патологической анатомии опухолей человека, лабораторий клинической биохимии и клинической иммунологии.

Публикации

Основные результаты исследования отражены в 22 научных работах, из них опубликованы 15.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, семи глав, представленных литературным обзором, описанием материалов и методов клинических, гистологических, цитологических, биохимических и иммунологических исследований, результатов собственных исследований, обсуждением результатов, заключением, выводами, указателем литературы, который включает 42 источника отечественной и 215 источников зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая клиническая характеристика больных, методов лечения и исследования.

В Онкологическом Научном Центре п течение нескольких лет целенаправленно, с учетом собственного опыта и результатов лечения других крупных научных учреждений зарубежных стран, разрабатываются различные схемы комбинированной терапии саркомы Юинга. Клиника Центра располагает опытом наблюдения за 412 больными, для лечения которых использовались различные методы и их комбинации.

По мере накопления достаточного количества клинических наблюдений проводился критический анализ эффективности тех или иных лечебных программ, которые нашли свое отражение в работах, вышедших из стен Онкологического центра (Н.Н.Трапезников, 1964; Л.А.Еремина, 1979, И.Б.Морошкин, 1979; Е.М.Слонимская, 1986; Е.С.Готько, 1992 и др.). Результаты этих исследований как бы представляют эволюцию развития терапии данной опухоли, а также являются основой для разработки других более эффективных схем лечения.

Согласно задаче и целям исследования нашей работы мы анализируем результаты лечения 199 больных саркомой Юинга, находившихся в НИИ клинической онкологии ОНЦ РАМН с 1955 по 1996 гг. Основную группу составляют пациенты, получавшие лечение с 1982 г., согласно схеме новых протоколов (127 больных). Кроме этой основной группы проанализированы результаты лечения 80 больных получивших хирургическое лечение в разные годы в клинике Центра. Немаловажно отметить и то, что наша клиника относится к сторонникам консервативного метода. Однако в силу сложившийся клинической ситуации части больных выполнялись различные виды оперативного вмешательства (80 наблюдений). Кроме того, в настоящее время пересматривается роль хирургического метода в терапии данного новообразования, что продиктовано следующими моментами: внедрение неоадъювантного подхода, изучение терапевтического патоморфоза, контроль эффективности про-

веденной терапии методом проточной цитофлуорометрии и т.д. Учитывая особую актуальность вопросов связанных с беременностью, нами отобрано 18 больных, имевших это физиологическое состояние в период болезни.

Наш клинический материал представлен 73 (36.7%) женщинами и 126 (63.3%) мужчинами, в возрасте от 13 до 34 лет. Анализ наших наблюдений подтвердил известную закономерность, что эта опухоль преимущественно встречается во втором десятилетии жизни и чаще у лиц мужского пола. В возрасте старше 30 лет данная патология наблюдается крайне редко.

Наиболее часто опухоль располагалась в костях нижних конечностей (110/55.3%). Кости верхних конечностей (32/16,1%), таза (26/13.1%) и ребра (25/12.6%) поражались намного реже.

Методы лечения локализованной саркомы Юинга.

С 1982 г. использована следующая методика комбинированной терапии больных саркомой Юинга: лучевая терапия в РОД - 2, СОД - 5060 Грей на первичную опухоль, сразу же после ее завершения назначалась адъювантная полихимиотерапия но схеме VAC(VCR + ADR + СТХ): винкристин по 0,75 мг/м2, адриамицин по 20 мг/м2 1,8,15 дни цикла внутривенно и циклофосфан внутривенно или внутримышечно 3 раза в неделю, всего 6 раз до общей дозы 1,5 г/м (ПРОТОКОЛ 1, рис I ). В зависимости от переносимости проводилось от 6 до 9 курсов.

Лучевая терапия 50-60 Гр

VVVVVVVVV

5-6 недель 0 4 8 16 20 28 32 40 44

недели

Рис. 1 Схема лечения больных саркомой Юинга (Протокол I)

С 1986 г. в ОНЦ РАМП применяется комбинированное лечение (ПРОТОКОЛ II, рис. 2) больных локализованной саркомой Юинга, которое начинается с химиотерапии по схеме САР (СТХ + ADR + DDP) или VACM (VCR + ADR + СТХ + MTX) или внутриартериалыюй инфу-зии ADR по 30 мг/м* 1,2 и 3 сутки или внутриартериалыюй инфузии DDP по 100 мг/м" в виде 3-часовой инфузии на фоне гипергидратации. Поддерживающая химиотерапия проводилась сразу же после окончания лучевой терапии в РОД - 2, СОД - 50-60 Грей и состояла из чередующих курсов полнхимиотерапии: 1) по схеме САР; 2) VACM; 3) VDC (VCR ■+ DACT + СТХ). Количество курсов колебалась от 6 до 9 .

Одним из методов локального воздействия на опухоль в наших наблюдениях являлась лучевая терапия. Лучевое лечение проводилось на установках для дистанционной гамма-терапии с преимущественным использованием статического режима. Учитывая свойственное саркоме Юинга распространение по костномозговому каналу и, нередко, значительную протяженность процесса, лучевому воздействию подвергалась вся кость, в которой находился очаг поражения. Облучение проводилось ежедневной разовой поглощенной дозой 1.8 - 2.0 Грей. Суммарная очаговая доза в среднем составляла для обеих групп 55-60 Грей.

3

Прочие локализации А

Ж

О О V

Верхние и нижние конечности В

V

Лучевая терапия 50-60 Гр

5-6 недель

Адъювантная химиотерапия

3

[у о о

о

8 недель

V

о

БОР -150 мг/м2 в/а, 1 день АОЯ - 30 мг/м2/день х 3 в/а

АБЯ - 20 мг/м2 в/в, 3 дня СТХ - 500 мг/м2 в/в, 1 день МТХ - 12 мг/м2 в/в и УСЯ- 1,5 мг/м2 в/в, 1,8 дни

V О

АЭЯ - 50 мг/м в/в, 1 день БЭР - 40 мг/м2 в/в, 3 дня СТХ - 600 мг/м: в/в, 2 день

БАСТ - 0,3 мг/м2/день х 5, в/в, СТХ - 400 мг/м2 в/в,, 1 день УСЯ - 1,5 мг/м2 в/в, 1,8 дни

Рис. 2. Схема комбинированной терапии больных саркомой Юинга по Протоколу 11.

Отбор больных в исследуемую группу и лечение проводилось строго по разработанному протоколу. Основными критериями для включения больных в исследование были: 1) морфологическое (гистологическое или цитологическое) подтверждение диагноза; 2) отсутствие предварительного противоопухолевого (химиолучевого) лечения; 3) отсутствие признаков диссеминации опухоли; 4) принципиальное согласие больного, а у подростков и их родителей.

Поскольку основой целью данной работы является изучение эффективности лечения локализованной формы саркомы Юинга, критериями оценки исходов комбинированной терапии явились непосредственные и отдаленные результаты лечения.

Кроме того, в процессе лечения или непосредственно после него оценивалась переносимость химиотерапии, ее местные и общерезорбти-вные проявления токсичности. Последнее производилось по общепринятой методике с распределением на 4 степени при каждом виде побочных проявлении ( Н.И.Переводчикова, 1993).

Основным критерием оценки отдаленных результатов комбинированной терапии явилась продолжительность жизни от начала специфической терапии без каких-либо проявлений заболевания, т.е. рецидивов или метастазов, что в иностранной литературе соответствует термину "disease free-survival".

При вычислении кривых выживаемости использована методика Kapian G. и Meier Р. (¡958), более известная в отечественной литературе как моментный метод построения таблиц дожития (В.В.Двойрин с со-авт., 1985.). Важным преимуществом данной программы является возможность ее использования при малом числе наблюдений (В.В. Двой-рин с соавт., 1985; Anderson J.R. et.al., 1989; Warr D. et. al., 1989 и др.).

Оценка эффективности адъювантной и неоадыовантной химиотерапии проводилась в сравнению с группой так называемого "исторического контроля", что так же принято в мировой практике при изучении результатов лечения костных сарком, поскольку данная форма опухоли характеризуется высокой летальностью. Различия показателей выживаемости оценивалось тестом Wilcoxon/Gehan (В.В.Двойрин с соавт., 1985; Anderson J.R. et. al., 1989). Кривые выживаемости в тексте отражались графически, где по вертикали - % безметастатической выживаемости, а по горизонтали - продолжительность наблюдения в месяцах.

Анализ числовых рядов, характеризующих другие проявления эффективности лечения проводился по критериям t Стыодента или X2 Фишера (Т.Б.Постнова, 1972; Е.В.Гублер с соавт., 1973; В.В.Двойрин с соавт., 1985).

Методика определения содержания ДНК методом проточной цитоф-луорометрии при саркоме Юинга.

Клеточная суспензия для проточной цнтофлуорометрин изготавливалась как из свежего материала (15 случаев), так и из парафниовых блоков (16).

Образцы исследовались на проточных анализаторах I СР-11 (Phywe, ФРГ) и FACS (Becton Dickinson, Colifornia, USA) с ртутно-кварцевой лампой.

В полученной гистограмме % клеточных ядер с различным содержанием ДНК вычислялся по отношению к общему числу исследованных

клеток. Коэффициент вариации в был не выше 10 %. В качестве диплоидного стандарта использовали лимфоциты человека, а в качестве внутреннего стандарта - эритроциты петуха.

Для характеристики степени анеуплоидии применяли индекс (и-ДНК), который вычисляли как соотношение интенсивности флюоресценции пика анеуплоидных клеток к пику диплоидных. Индекс высчитывали из соотношения истинного канала, соответствующего исследуемой популяции клеток к стандартному каналу. И-ДНК диплоидных клеток (2с) принимали за 1, и-ДНК тетраплоидных был равен 2, анеуплоидных - более 1.1.

Методы получения и обработки образцов опухоли Юинга для изучения рецепторов стероидных гормонов.

Цитозольную фракцию получали в результате центрифугирования гомогената при 105.000 xg, 4°С в течении 40 минут (центрифуга Optima ТМ TLC, Beckman, USA). Полученный супернатант, представляющий собой цитозоль, использовали для определения рецепторов эстрогенов, андрогенов и глюкокортикоидов стандартным радиолигандным методом, рекомендованным EORTC, с разделением гормон-рецепторных комплексов и несвязанного лиганда на угле, покрытом декстраном, с небольшими модификациями (Л.С.Бассалык с соавт., 1986).

При определении рецепторов стероидных гормонов в качестве ли-гандов использовали синтетический эстроген диэтилстилбестрол (Sigma, США) для РЭ, синтетический меченый андроген Н - метилтрие-нолон (R1881) (NEN, США) для РА, синтетический глюкокортикоид Н-дексаметазона (Amerham, Великоббритания).

Радиометрию проб проводили на жидкостном сцинтилляционном Р-счетчике LS 6500 (Beckman, США).

Специфическое связывание меченого гормона с рецепторами рассчитывали как разницу между общим (без конкурента) и неспецифическим (в присутствии конкурента) связыванием. Содержание рецепторов стероидных гормонов выражали в фмоль/мг цитозольного белка.

Границей рецептороположительности для рецепторов андрогенов считали 5 фмоль/мг цитозольного белка, а для рецепторов эстрогенов и глюкокортикоидов 10 фмпль/мг цитозольного белка.

Изучение иммунофенотипа клеток саркомы Юинга.

Специфичность использованных моноклональных антител представлена в таблице 1.

Таблица 1

Специфичность использованных моиоклональных антител

NN КЛАСТЕР ДИФФЕРЕ11ЦИРОВКИ НАЗВАНИЕ

П/П МОНОКЛОНАЛЫ1ЫХ АНТИТЕЛ

ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЕ АНТИГЕНЫ Т-КЛЕТОК

1. CD5 А 50*

2. CD7 1 21 Ox, HD49**

3. CD4 HP 2/6**

4. CD8 L533*

5. CDIa L161*

ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЕ АНТИГЕНЫ В-КЛЕТОК

6. la-подобный антиген ИКО-1, 2.06**

7. CD 19 HD37**

8. CD22 HD6xx, HD 39**, ИКО-12

9. CD23 HD 50**

10. CD37 D 28**

11. CD76 HD 66**

МИЕЛОМОНОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕНЫ

12. CD11B ИКО-ГМ1

13. CD15 ИКО-Г2

14. антиген ИК084 ИКО-84

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАРКЕРЫ

15. CD10 (CALLA) К 503

16. CD38 ИКО-20

17. CD45 Вга55

18. CD53 HD 77**

19. RFB-1 антиген ИКО-40

20. L-LFA-1 антиген ИКО-11

21. Дифференцировочный антиген гемо-поэтических клеток ИКО-63

22. [3-цепь VLA-4 антигена (CD29) К20*

23. Антигены HLA-1 класса W 6/32**

24. Раково-эмбриональнын антиген НЕА 19**

25. Общеэпителиальный антиген НЕА 125**

26. HMFGI антиген ИК0 25

ЭРИТРОИДНЫЕ АНТИГЕНЫ

27. Гликофорин А НАЕЗ

28. Антиген ядерных эритроидных клеток НАЕ 9

Использованы следующие реакции определения активности МКАТ и иммунореактивности антител с опухолевыми клетками:

- непрямая реакция поверхностной иммунофлюоресценции (РИФ) на криостатных срезах;

- прямая реакция иммунофлюоресценции на криостатных срезах;

- иммуноферментный метод.

При иммунофенотипировании опухолевых клеток результаты реакции оценивали полуколичественным методом. Выделяли 3 типа реакции: 1). Отсутствие реакции; 2). Мозаичная реакция; 3). Мономорфная экспрессия антигена на опухолевых клетках.

Результаты адъювантнойхимиотерапии саркомы Юинга.

Лечение больных саркомой Юинга является достаточно сложной проблемой современной онкологии. Последнее обусловлено способностью этой опухоли к гематогенной диссеминации. Поэтому разработка новых схем профилактической химиотерапии, направленных на подавление субклинических метастазов в стратегии лечения этого сложного контингента больных, является приоритетной. В данной главе будут анализированы результаты лечения опухоли Юинга по двум вышеописанным протоколам, где основным компонентом комбинированной терапии являлось адъювантное лекарственное лечение по схемам VAC и САР + VACM + VDC. Перед тем, как приступить к изложению материала исследования необходимо подчеркнуть, что в диссертационной работе Е.М.Слонимской (1986) обобщены результаты монохимиотерапии циклофосфаном и сарколизином, адриамицином и часть исследования по адъювантной химиотерапии по схеме VAC (22 больной). Сравнительная оценка эффективности схем данных протоколов с использованными прежде режимами, таким образом, будет произведена со ссылкой на вышеуказанную диссертацию.

Результаты применения адъювантной химиотерапии по схеме VAC.

Данное исследование по систематическому изучению дополнительной химиотерапии по схеме VAC было начато в январе 1982 г. и включало 59 больных.

Изучение применения дополнительной химиотерапии по схеме VAC после лучевой терапии во всей исследуемой группе больных показало, что 5 лет без проявлений заболевания переживает 36,4%, тогда, как при только лучевом методе лечения этот показатель составляет 7.5%. Следовательно, подобный комбинированный подход улучшает результаты практически в 5 раз.

В этой группе рецидивы опухоли выявлены у 12(23%) больных. У большинства пациентов - 9(75%) они появились в сроки до 12 месяцев. Среднее время возникновения рецидивов составило 11.3±2.1. месяцев.

Метастазы опухоли выявлены у 41(78.8%) больного. Чаще опухоль метастазнровала в легкие в 21(51.2%) наблюдениях и в кости в 11(26.8%) случаях. Диссеминация процесса в 15 (36.6%) случаях носила солитарный и единичный характер, а в 26(63.4%) - множественный. Анализ процесса метастатнзирования показывает, что критическим сроком отдаленных проявлений заболевания является первые 24 месяца. В указанное время наблюдения у 87.8% наших пациентов выявлялись клинико-ренггенологически регистрируемые метастазы. Средние сроки мегастазирования составили 13.4+1.1. месяцев.

Анализ побочных явлений от применяемых химиопрепарагов выявил, что основным проявлением токсичности явилось угнетение кроветворения. Учитывая кумулятивную кардиогоксичность адриамицина и наличие зафиксированных случаев этого побочного эффекта в наших наблюдениях, необходима особая осторожность и тщательный динамический контроль за показателями ЭКГ в ходе химиотерапии.

Результаты применения многокомпонентных курсов адъювантной химиотерапии (ПРОТОКОЛ II).

Систематический целенаправленный отбор больных по данному протоколу начат в январе 1986 г. и включил 68 больных.

Следует отметить, что в данную главу вошли больные, определяющим критерием для которых являлся вид адъювантной химиотерапии, т.е. схема дополнительного лекарственного лечения по протоколу II. Подобный подход оправдан с точки зрения оценки эффективности именно данного вида многокомпонентной полихимиотерапии.

33(48.5%) больным комбинированное лечение начиналось внутри-артериальным введением антрациклинов и цисплатины, 18 (26.5%) и 11(16.2%) - по схеме САР и УАСМ соответственно. Исходя из различных клинических и организационных соображений в ходе набора клинического материала требования протокола были видоизменены. Например, ряд больных (12) с локализацией опухоли в верхних и нижних конечностях начали комбинированное лечение по схемам САР и УАСМ, а для 6 (8.8%) - первым видом специфической терапии являлась лучевая терапия по радикальной программе.

Изучение применения адъювантной химиотерапии по схеме протокола II - САР + УАСМ + УОС показало что, во всей анализируемой группе без каких либо проявлений заболевания 3 года и 5 лет переживает 57.2%, больных тогда как при только лучевом методе лечения этот

показатель составляет 7,5%. Иными словами представленный комбинированный подход позволяет реально повысить эффективность лечения примерно в 8 раз.

За время наблюдения рецидивы возникли у 14 больных, из них в срок до 12 месяцев - только у 1, до 24 месяцев - у 9. Таким образом, рецидивы заболевания, возникшие в сроки до двух лет, зафиксированы у 71.4%, а в более поздние сроки - у 28.6% больных. Средний срок реци-дивпрования в данной группе составил 22.2±6.7% месяцев.

Метастазы клинико-рентгенологически и по данным комплексного обследования зарегистрированы у 40 больных. Диссеминация процесса отмечена в большинство случаев в легком - 19(47.5%) и костях скелета -14(27.5%). В 17.5% случаях метастазы выявлены одновременно в нескольких органах. В 47.5% наблюдениях данный процесс носил единичный и солитарный характер, а в 52.5% - множественный. Средние сроки метастазирования составили 16.2+ 1.5 месяцев.

В группах больных, которые начинали лечение со схемы САР и внутриартериальной инфузип адриамицина (цисплатипы), показатели 3-х и 5-летней выживаемости (68.3% и 62.1% соответственно) лучше, чем при применении схемы УАСМ (40.%). В тех ситуациях, когда комбинированное лечение начиналось с лучевой терапии ни один больной не пережил без метастазов 18 месячный рубеж. Однако, полученные данные, хотя и свидетельствуют о некотором преимуществе результатов лечения первой группы, они не могут быть признаны справедливыми, поскольку анализируемые наблюдения были достаточно разнородными по прогностическим критериям.

Анализ побочных проявлений при применении дополнительной многокомпонентной химиотерапии по схеме САР + УЭС + УАСМ показал, что основными проявлениями токсичности являлись угнетение кроветворения, тошнота, рвота к алопеция. Выраженная тошнота и рвота явились одними из серьезных субъективных факторов, из-за которого больные отказывались от продолжения лечения.

Обобщая анализ токсических проявлений химиотерапии, необходимо подчеркнуть, что проведение специфической терапии с использованием производных платины требует тщательного соблюдения режимов гипергидратации, форсированного диуреза и поддерживающей гипергидратации, а также использование эффективных нрошворвотных препаратов.

В ОНЦ РАМН на протяжении нескольких лет разрабатываются различные варианты применения химиотерапии в комбинированном лечении саркомы Юинга. Самая первая программа включала применение в качестве дополнительной химиотерапии сарколизина или циклофосфа-

на. Она позволила достигнуть 25.5% безметастатической выживаемости при 5-летней продолжительности наблюдения, в то время как только при лучевом лечении этот показатель составил 19.5%. Применение в качестве адъюваптного режима монохимиотерапии адриамнцииом позволило улучшить результаты предыдущей схемы до 43.6%. (Трапезников H.H. с соавт., 1988). Вышеприведенные данные подтверждают преимущества использования химиотерапии в качестве адъюваптного режима и свидетельствуют о необходимости дальнейшего поиска эффективных комбинированных методов лечения. Отражением наших усилий в этом направлении является применение различных схем полихимиотерапин. В данном разделе будет дана сравнительная характеристика результатов лечения больных сг.р:со:,:ой Юппга, получивших лечение соишсно протоколам I и II.

Представленные результаты применения дополнительной химиотерапии свидетельствуют, что полихимиотерапия достоверно улучшает результаты лучевого воздействия независимо от разбираемых признаков (т.е. пола, возраста, локализации опухоли и т.д.). При этом было отмечено, что адъгавантная химиотерапия по схеме VAC позволяет добиться 5-летней безмегастатической выживаемости у 36.4±6.7% больных, а при использовании многокомпонентных схем - САР + VACM f VDC у 57.2+7.4% (р<0.05, X2 = 4.43).

Проведенный анализ времени генерализации и выживаемости больных позволил констатировать следующее: во первых подтвердить описанные выше особенности, присущие адъювантной химиотерапии, во-вторых выявить некоторые тенденции характерные для предлучевого лечения.

Прежде всего это касается частоты и сроков наступления неблагоприятных исходов. Прослеживается такая закономерность: среднее время появления метастазов в группе больных, получивших только лучевую терапию достоверно ниже по сравнению с группой пациентов прошедших курс лечения согласно протоколам I и II (р^О.05). Так же и как ранее, проявление диссемнпации наиболее вероятно в первые 12-24 месяца с момента лечения. Однако если в группе только лучевого лечения к 12 месяцам метастазы выявляются у 87.8% случаев, го в группах протокольных исследований I и II в указанные сроки отдаленные проявления заболевания регистрируются в 36.6% и 39% наблюдениях.

Представленные на рис.3 кривые выживаемости а зависимости от схем дополнительной химиотерапии свидетельствуют, что результаты лечения больных саркомой Юипга оказались лучше в группах, где проводилась полихимиотерапин по схеме протокола II в сравнении с моно-

химиотерапией циклофосфаном - 25.6+7.2% (р<0.05; X2 = 5.42) и адри-амицииом - 32.8± 13.1% (р>0.05; X2 = 2.19).

Выживаемость больных саркомой Юн ига в зависимости от схем профилактической химиотерапии

—CAP+VACM+VDC —*— Алриамицин • VAC ' Цнклофосфан

Рисунок 3

Результаты 5-летней выживаемости по схеме VAC несколько лучше по сравнению с полученными данными при монохимиотерапии циклофосфаном и адриамицином, однако эти различия не носило статистически достоверного характера (р>0.05, X2 = 2.25).

Как свидетельствуют литературные данные, сравнение эффективности нескольких методов дополнительной химиотерапии возможно лишь в условиях рандомизированных исследований, проведение же последних при таких редких опухолях, как саркома Юинга имеет значительные сложности как у нас в стране, так и за рубежом (Трапезников Н.Н. с соавт., 1986; Двойрин В.В. с соавт., 1985; Bacci G. el. al., 1989; Rosen G. et. ai., 1993 и др.). Поэтому некоторое преобладание эффективности дополнительного использования адриамнцина на уровне 3-летних сроков наблюдения по сравнению со схемой VAC (43.6% и 36.4% соответственно) следует признать условными.

Таким образом, проведенное исследование показало, что любая из представленных в этой работе схем химиотерапии достоверно улучшает отдаленные результаты лечения по сравнению с лучевой терапией.

Сравнительная оценка эффективности двух протокольных исследований показывает, что имеется статистически достоверная разница по

основным прогностическим критериям - безрецидивной и безметастатической выживаемости для общей группы анализируемых больных. Тем не менее, при сопоставлении отдельных прогностических признаков эта закономерность не подтверждается статистически.

Изучение отдаленных результатов данных исследований показало, что 5 лет без метастазов переживает 36.4%±6.7% больных при адъювантной химиотерапии по схеме VAC, а при применении дополнительного лекарственного лечения по программе САР + VACM + VDC -57.2±7.4%. (р<0.05; X2 = 4.43). Безрецидивная выживаемость сравниваемых групп составили 40.9±7.2% и 62±8.8% (р<0.05; X2 = 4.! 2).

Проведенный анализ характера метастазирования и выживаемости больных на фоне ал-мппянтно?? химиотерапии пемнилил выявить определенные тенденции. Следует отмети i ь, что иод влиянием современной химиотерапии несколько изменились биологические особенности костных сарком и в частности саркомы Юинга. Последнее проявляется не только в отдалении сроков метастазирования, но и в самом характере его. Если раньше, по данным ОНЦ РАМН (Е.Е.Ковалевский, 1980) преобладали множественные метастазы, а солитарные и единичные составляли 9.0%, то теперь, на фоне адъювантной химиотерапии, указанный характер поражения отмечен при схеме VAC 34.8%, а при схеме дополнительной химиотерапии по схеме протокола И 47.5% наблюдениях. Таким образом, наличие солитарного или единичных метастазов представляет ту клиническую ситуацию, когда существует возможность оказать больному реальную помощь.

Критическим сроком для проявления отдаленных метастазов в условиях адъювантной химиотерапии костных сарком является первые 24 месяца (Трапезников Н.П. с соавт., 1988; Синюков П.А., 1993; Rosen G., 1991; Dcllcpine G. et. al. 1989 и другие). Однако возможно появление метастазов в более поздние сроки. По данным П.А.Синюкова (1993) на фоне адьюваптного и неоадъювантного лекарственного лечения остео-генной саркомы поздние метастазы зарегистрированы у 4.5%. Подобная статистика подтверждается и нашими данными, так для всей группы (протокол I и II) более поздние, чем два года, сроки метастазы выявлялись в 5% наблюдениях. Последнее свидегельстпует о необходимости длительного, не менее 5-летнего диспансерного наблюдения данного контингента больных.

Резюмируя вышеизложенное можно подчеркнуть, что алъювант-ные схемы химиотерапии VAC и САР + VACM +VDC, дополняющие лучевую герапшо, статистически достоверно улучшают отдаленные результаты лечения по сравнению с только лучевой терапией. Раннее начало хпмиогерапевтпческого системного воздействия на первичную

опухоль и ее субклинические метастазы обеспечивает лучшие отдаленные результаты терапии, о чем свидетельствуют результаты протокольного исследования по схеме программы И. '

Роль внутриартериальной химиотерапии в комбинированном лечении саркомы Юинга

В отделении общей онкологии ОНЦ РАМН, с 1986 г. по 1995 г. 47 больным проведена внутриаргериальная химиотерапия с целью изучения эффективности этого метода. У 43 больных в качестве химиопрепа-ратов использовали антрациклины (адриамицин, фарморубищш, доксо-рубипии) по 30 мг/м" 1,2 и 3 сутки в виде непрерывной внутриартериальной инфузии, а у 4 - производные платины по 100 мг/м" в виде 3-часовой инфузии на фоне гипергидратации. Для сравнения результатов внутриартериальной химиотерапии в качестве "исторического контроля" отобрано 4Q больных саркомой Юинга, получивших лучевую терапию в СОД-50-60 Грей и адыовантную полихнмиотерапшо но схеме VAC.

Применение внутриартериальной инфузии антрациклипов и цисп-латины свидетельствует о хороших непосредственных результатах лечения. Так, по клиническим данным ни в одном случае не отмечено прогрессирования опухолевого процесса. Зафиксирован высокий аналь-гезирующнй эффект антрациклинов при данном способе введения, о чем свидетельствуют уменьшение или исчезновение болевого синдрома во всех наблюдениях. Контрактура и размеры опухоли стабилизировались или уменьшились также у всех больных.

Положительный рентгенологический эффект в виде нарастания репаративных процессов в зоне опухолевого поражения отмечен у 17(39,5%), стабилизация процесса - у 19(44,2%), отрицательная динамика - у 7(16,3%) больных. В процессе дальнейшего лечения и наблюдения у 4 из 7 больных, где отмечена отрицательная динамика, по данным контрольных рентгенологических снимков и клинических данных выявлены рецидивы заболевания, а у остальных (3) в интервале времени от 3 до 6 месяцев появились признаки репарации опухоли.

В сроки от 6 до 64 месяцев наблюдения рецидив заболевания отмечен у 4 из 47 больных лечебной группы, что составило 8,5 ±4,1%, в то время как в группе "исторического контроля" это было зафиксировано в 11 случаях (27,5 ± 6,5%). Полученные результаты позволяют сказать, что применение внутриартериальной химиотерапии достоверно снижает вероятность возникновения рецидивов опухоли (р<0.05).

В группе "исторического контроля" у 2(18,2%) больных рецидив новообразования появился менее чем через 6 месяцев от начала лучевой

терапии, у 6(54,5%) - от 7 до 12 месяцев и у 2(18,2 %) - между 13 и 24 месяцев, и только в одном наблюдении - через 31 месяц. Среднее время развития рецидивов в данной группе составило 12,8 ± 2,9 мес. В лечебной группе реиидивы заболевания выявлены у 4 больных в сроки 12,13,19 и 23 месяцев, что в среднем составило 17,5 ± 5,2 мес. Различие этих сроков в сравниваемых группах статистически не достоверно (р>0.()5). Однако при сопоставлении результатов DFR получены данные позволяющие говори п. об эффективности внутриартериальной регионарной химиотерапии но сравнению с методикой лечения больных "исторического контроля" (66,8±6,5% против 46,5+8.5% соответственно, р<0.05, рис.4).

Безрецндпвная выживаемость больных саркомой Юинга (лечебная и контрольная группы)

—X— Лечебная —В— Контрольная

Рисунок 4

Одним из направлений неоадыовантной химиотерапии является использование длительных внутриартериальных инфузий противоопухолевых препаратов. Клинические исследования последних лет свидетельствуют об эффективности данной методики в лечении солидных опухолей (Тюляпдин С.Д., 1985) и костных сарком (Спшоков II.Д.. 1993). в юм числе саркомы Юинга. Гак, КшЫс1а V. с1. а1 (1992), использовав вышеуказанную методику у 8 больных с локализацией опухоли в конечностях, пришли к заключению, чю данный метод снижаем риск возникновения рецидивов опухоли. В сроки наблюдения 01 3 до 55 месяцем ни в одном сл\чае не было отмечено признаков рецидива, а 5 лег-

няя выживаемость составила 56,3%. Е1сЬГе1с1 и. еЬ а1.( 1993) сообщает об успешном применение регионарной перфузии цитостатика у 1 больного с внескелетной саркомой Юинга. Готько Е.С.(1992) на фоне 72-часовой внутриартериальной инфузии адриамицина (23 больных) получил непосредственный хороший клинический эффект у всех больных, рецидив возник только у 2 (8,7±5,8%) пациентов при минимальном сроке наблюдения 24 месяцев. На наш взгляд использование данного способа введения противоопухолевых препаратов не только усиливает местный контроль над первичной опухолью в сочетании с лучевой терапии, но и обеспечивает раннее начало системного воздействия на клинически неопределяемые метастазы. Полученные непосредственные хорошие клинические результаты вполне оправдывают обсуждение вопроса о снижении доз лучевой терапии, что немаловажно в практике.

Следует сказать, что применение в плане комбинированного лечения внутриартериальной химиотерапии у больных саркомой Юинга позволяет повысить эффективность лечения при минимальных побочных проявлениях цитостатиков, снижает риск возникновения рецидивов, а также обеспечивает раннюю профилактику реализации субклинических метастазов.

Возможности хирургии в комбинированном лечении саркомы Юинга.

Исторически лучевая терапия считается традиционным методом лечения первичной опухоли Юинга, при котором местный контроль достигается в 60-95% случаев (Трапезников Н.Н. с соавт., 1986; КшБсПа е1. а1. 1984 и др.). Роль хирургического лечения длительное время обсуждалась в кругу специалистов, занимающихся костными новообразованиями, и в ряде клиник мира этот метод нашел вполне адекватное применение. Традиционно наша клиника является сторонником консервативного лечения локализованной формы заболевания. Однако, в силу сложившихся клинических ситуаций, у ряда наших больных оперативное лечение было использовано в комбинированной терапии.

Как видно из таблицы 2, самую большую группу составили больные, у которых опухоли локализовались в, так называемых, "малозначимых" в функциональном отношении костях скелета, таких как ребро (22/27.%), малоберцовая кость (14/17.5%). ключица (3/3.8%) и локтевая кость (3/3.8%). Больные, вошедшие в эту группу в большинстве случаев подвергались хирургическому лечению в объеме резекции кости. В остальных наблюдениях мы были вынуждены оперировать больных в тех ситуациях, когда отмечались рецидивы опухоли, патологически переломы, распад и кровотечение. В двух случаях произведены

калечащие операции п объеме ампутации и экзартикуляции по поводу вторичной саркомы.

Таблица 2

Показания для хирургического лечения у больных саркомой Юинга

Показания к хирургическому лечению Виды оперативного лечения Всего

Резекция Амп-ция Экз-ция

1. Патологические переломы - 5 2 10* (12.5%)

2. Рецидив опухоли - 7 2 9(11.3%)

3. Вторичная саркома - 1 1 2 (2.5%)

4.Распад, кровотечение и большие размеры опухоли £ 9 ( П .3%)

5. Отсутствие эффекта от консервативного лечения - 7 1 8(10%)

6. Локализация опухоли в функционально "малозначимых" костях (ребро, малоберцовая и др.) -операция как метод лечения 42** 42 (52.5%)

Всего 42(52.5%) 26(32.5%) 9(11.3%) 80

* 3 больным произведен интрамедуллярный остеосинтез

Ozaki T. et. al. (1995) представили результаты лечения 31 больного с локализацией опухоли в ребрах, получивших терапию согласно программе протоколов CESS-81 и CESS-86. 10-летняя безрецидивная выживаемость составила 61%. A Thomas P.R. et. al.(1983) указывают на 53% 5-летнюю выживаемость у больных саркомой Юинга ребер, проходивших курс лечение по протоколу IESS. В наших наблюдениях 5-летняя безрецидивная и бсзметастатическая выживаемость оказались на уровне 50% и 44% соответственно.

По мере развития эффективных программ химиотерапии локализованной формы саркомы Юинга и профилактики реализации ее микрометастазов многие исследователи стали пересматривать роль и место хирургического лечения в комбинированной терапии этого новообразования (Rosen Ci., 1993; Wunder J.S. ct. al. 1995; Jürgens H. et. al. 1990; Picci P. et. al. 1993; Delepine N. et. al. 1991 и др.). Обобщая данные вышеуказанных авторов можно отметить, что современные химиопрепара-

ты не только предупреждают развитие метастазов, но и значительно уменьшают массу первичной опухоли. Таким образом, открываются перспективы для сохранных операций. Необходимо отметить еще один немаловажный аспект, связанный с хирургическим методом, т.е. гистологическое изучение удаленной опухоли с оценкой степени терапевтического патоморфоза. Коррекция дополнительных курсов химиотерапии с учетом ТП улучшает отдаленные результаты лечения от 79 до 90%.

Следует отметить, что благодаря современной химиотерапии несколько изменились биологические особенности костных сарком, в частности саркомы Юинга. Последнее проявляется изменением характера и сроков метастазирования. Если раньше, по данным ОНЦ РАМН (Е.Е.Ковалевский, 1980) преобладали множественные метастазы, а со-литарные и единичные составляли 9.0%, то теперь, на фоне адыовант-ной химиотерапии, указанный характер поражения отмечен в 54.5% наблюдений. В настоящее время наличие солитарного и единичных метастазов опухоли в легких представляет ту клиническую ситуацию, когда существует возможность оказать больному реальную помощь с использованием оперативного лечения. В наших наблюдениях трем больным по поводу солитарного метастаза выполнена лобэктомия (1) и резекции (2) легкого. Изучение метастатической опухоли показало 1 и 11 степень лечебного патоморфоза, т.е. минимальный эффекта от предоперационной терапии. Таким образом, не только солитарный характер метастазирования, но и его минимальная реакция на проведенное лечение может быть показанием в пользу хирургического вмешательства.

Терапевтический патоморфоз опухоли Юинга и его прогностическое значение.

В современной онкологии надежным, проверенным практикой критерием оценки эффективности проведенной специфической (лучевой или лекарственной) терапии является изучение, так называемого терапевтического патоморфоза. Ценность этого метода заключается в том, что с учетом степени терапевтического патоморфоза целенаправленно, а не вслепую, назначаются дополнительные курсы химиотерапии.

В 21 (77.7%) наблюдении ТП изучен после химиолучевой терапии, в остальных 6 - после только одной лучевой терапии. Таким образом, в большинстве случаев имела место картина посттерапевтического патоморфоза, обусловленного химиолучевой терапией. Среди 27 изученных образцов опухолей в 11(40.7%) случаях посттерапевтические изменения саркоматозной ткани охарактеризованы как 1-Н степени, а в 16(59.3%) -Ш-1У степени ТП.

Предоперационная химиотерапия в сочетании с лучевой терапией взапмоуснливают свои повреждающие действия на опухолевую ткань, о чем свидетельствует высокая частота III-1Y степени T1I - 13(61.9%), по сравнению с только лучевой терапией - 3(50%).

Изучение кривых выживаемости показывает, что на уровне 3-х и 5-ти лет наиболее благ оприятные результаты следует ожидать при III-IY степени терапевтического патоморфоза - 67.7+16.3%, по сравнению с III степенью TII - 54.5±18.6%. Полученные данные позволяют рассматривать степень ТГ1 как один из важных прогностических факторов при саркоме Юннга.

Плоидность ДНК и пролиферативная активность клеток сарко^ь; Юинга, их ппогнсстичсская значимость

В период с 1987 по 1996 гг. у 31 больного (8 женщин и 23 мужчины) саркомой Юинга в возрасте от 15 до 34 лет (19.311.1) исследованы опухолевые образцы, полученные путем трепано- и операционной биопсии и из парафиновых блоков.

Полученные данные демонстрируют высокую степень злокачественности саркомы Юинга, о чем свидетельствуют высокая частота выявления анеуплоидных клонов клеток. Так, опухолевые ткани 25 (80.6%) больных имели анеуплоидное содержание ДНК, и только у 6 (19.4%) в опухолевых клетках выявлено диплоидное содержание ДНК.

Таблица 3

Плоидность /IHK и пролиферативная активность опухолевых клеток саркомы Юинга

Плоидность N боль- Фазы клеточного цикла Индекс про-

Д1IK опухоли ших лиферации

G0 + Gl S G2 + M G2 + M + S

Анеуплоидпая 25 79.5±2.5 10.6±1.2 10.8+1.6 21.7+2.8

опухоль

Диплоидная 6 85.2±4.2 5.8+1.9 7.4+2.1 13.1 + 4.0

опухоль

Р >0.05 <0.05 >0.05 <0.05

Среди анеуплоидных опухолей индекс ДНК (н-ДНК) варьировал от 1.2 до 2.91. В пределах митотического цикла в зависимости от и-ДНК опухоли распределялись следующим образом: диплоидные (19.3%), анеунлондныс с и-ДНК=1.1-1.8 (29%), тетраплоидные -н-ДНК=1.9-2.1 (9.7%). В 6.5% случаев выявлены гиперапсуилоидпые - и-ДНК • 2.1, в

35.5% - многоклоновые опухоли (наличии в новообразовании нескольких клонов анеуплоидных клеток с различными показателями и-ДНК.

Анализ индекса пролиферации (количество опухолевых клеток находящихся в G2+ М + S фазах клеточного цикла) свидетельствует о том, что для анеуплоидных опухолей характерна статистически достоверно более высокая иролиферативная активность по сравнению с диплоидными новообразованиями (21.7±2.7 и 13,1 ±4.0 соответственно, р<0.05). Анеуплоидные опухоли с высокой пролиферативной активностью встречались в 14 случаев (45.2%), тогда как среди диплоидных опухолей этот показатель зафиксирован только в одном случае (3.2%).

При анализе отдаленных результатов лечения при диплоидных опухолях 3-х и 5-летняя выживаемость оказалась на уровне 83.3±16.7% и 62.3±21.7%, тогда как при анеуплоидных опухолях эти показатели соответствовали 54.9±15.3% и 54.9±15.3%. Полученные данные свидетельствуют о тенденции к худшему прогнозу заболевания при наличии анеуплоидных клонов клеток по сравнению с диплоидными.

Результаты проведенного исследования подчеркивают необходимость изучения популяционной структуры опухолевых клеток и их пло-идности для прогнозирования течения, а также для выявления новых биологических параметров в оценке степени злокачественности опухоли Юинга. К настоящему времени имеются вполне обоснованные данные, позволяющие отнести показатель плоидности ДИК к категорию независимого прогностического фактора. Для солидных злокачественных новообразований яичника и молочной железы на большом клиническом материале показана взаимосвязь между увеличением плоидности и плохим прогнозом (Богатырев Т.Г., 1991; Николаева Т.Г., 1994; Becrossian C.W. et. al., 1981; Volm H. et. al., 1985). По данным Herzberg A. et. al. (1992) ДНК анеуплоидия имеет тесную связь со степенью злокачественности ("Tumor grade") и распространенности опухоли. Так, опухоли мягких тканей с Grade III чаще анеуплоидны (до 83%), в то время как при Grade I и II анеуплоидность наблюдается только в 33%. Пролиферативная активность (индекс пролиферации - ИП) также связана с плоидностыо и Grade опухоли: она увеличивается при анеуплоидии (ИГ1>2% в 73% опухолей), чем при нормальном распределении ДНК (эуплоидии), когда ИП>2 наблюдался только в 30% опухолей.

Что касается костных сарком, то пока имеются лишь единичные сообщения.-Заслуживает внимания данные Dieterick et. al. о том, что выживаемость больных саркомой Юинга при наличии диплоилного характера распределения ДНК в клетках опухоли достоверно выше, чем при анеуплоидном. В первом случае 58% больных прожили 5 и более

лет, во втором - все больные за вышеуказанные сроки имели отдаленные метастазы или умерли.

Местный иммунитет при саркоме Юинга

Моноклоиальные антитела, специфичные для саркомы Юинга. к настоящему времени не получены. Отсутствуют работы по комплексной оценке маркерной гетерогенности приданной опухоли, ее роли в генерации иммунного ответа, а также многофакторному изучению нарушений местного иммунологического статуса. Экспериментальные и кли- -нические исследования в этой области могут предоставить возможности для улучшения диагностики и дифференциальной диагностики саркомы Юинга, для более точного прогнозирования ее течения и для разработки методов иммунотерапии, что несомненно, является актуальном задачей современной клинической онкологии и важно как с теоретической, гак и с практической точки зрения.

Исследование на криостатных срезах опухолей проведено у 6 больных саркомой Юинга и у 2 - первичной нейроэктодермальной опухолью.

Анализ полученных данных показал, что сложности морфологической верификации саркомы Юинга из группы мелкокруглоклетчоных опухолей и в частности, дифференциальной диагностики с лимфобласт-ными лимфомами могут быть разрешены иммунологическими методами. Ни в одном из случаев саркомы Юинга не наблюдались реакции с панлейкоцитарными антигенами CD45 и CD50, а также с Т-клеточными (CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7), В-клеточными антигенами (CD 19, CD22), панмакрофагальными маркерами (антитела Dl 1, GHY-61), молекулами миелоидной дифференцировки (CDllb, CD14, CDI5), а также активационнымн и линейно не рестриктированными лимфоидными антигенами (CD30, CD38, CD25, CD10, CD26, CD39, CD70, CD27). Полученные данные дали возможность провести оценку уровней инфильтрации опухоли различными субпопуляциями иммунокомпонентных клеток, идентифицируемых но пышеперечисленным маркерам, полуколичественным методом, а также оценить количество этих тумор-пенетрируюших лимфоцитов ие единицу площади опухолевого среза. Опухоли Юинга, как правило, характеризовались крайне слабым уровнем или отсутствием инфильтрации В-клетками и плазмоцитамп, в то время как ответы 'Г-клеток, их субпопуляций и степень их активации варьировали в широких пределах (от практически негативных до резко выраженных). Эти различия не были связаны с морфологическими особенностями опухоли. Анализ экспрессии нейрональных и нейроэктоде-рмальных антигенов проведен при саркоме Юинга с использованием 5

маркеров: ганглиозид GD2 (антитела !4G2a), антиген Thy-1 (антитела ИКО-Ю и 390); антигены, выявляемые моноклональными антителами USAN, 490, 126-4. Отмечен полиморфизм в экспрессии этих маркеров: антш еннегативные опухоли, случаи с мономорфной или мозаичной экспрессией HSAN (наиболее часто), GD2, Thy-I. Полученные данные соответствуют данным литературы о нейроэктодермальпой природы саркомы Юинга и различной степени дифференцировки этой группы опухолей. Исследование мономорфных детерминант молекул HLA I и II классов показало полное отсутствие антигенов HLA-Dr и выраженную экспрессию HLA-I на клетках саркомы Юинга.

Помимо перечисленных клетки саркомы Юинга характеризовались такими маркерами как 4F2, CD9, CD107b (LAMP-2), CD109, а также менее изученными - L129, L 106, F10-3. Взаимосвязь этих молекул с гистогенетической принадлежностью и степенью дифференцировки саркомы Юинга предстоит оценить в дальнейшем. Установлено, что уровень местной Т-клеточной интратуморальной реакции и степень активации Т-клеток детерминированы иммунологическим фенотипом опухоли. При практически полном отсутствии E-клеточной инфильтрации опухоль не экспрессировала общую бета-цепь интегринов (CD29), имела нейральный маркер HSAN, а также более высокие уровни CD9, CD106, L106, F10-3. Это дает основание для продолжения исследования по характеристике молекул, опосредующих взаимодействия иммунной системы и клеток саркомы Юинга.

Саркома Юинга и беременность.

С 1955 г. по 1995 г. в отделении общей онкологии ОНЦ РАМН находились 18 больных опухолью Юинга в возрасте от 16 до 33 лет (20,9+0,9), т.е в период детородного возраста.

Накопленный опыт лечения этой категории больных показывает, что беременность в большинстве случаев выступает как неблагоприятный прогностический фактор. Так, у 11(61,1%) - беременность совпала с развитием первичной опухоли и спровоцировала быстрый ее рост, а среди них у 5(27,8%) - опухолевый процесс носил первично-генерализованный характер. Становиться очевидным тот факт, что беременность способствует прогрессированию опухолевого процесса: в 8 случаях отмечено появление отдаленных метастазов, в 4 - зафиксированы рецидивы + метастазы, в 1-рецидив болезни в течение первых девяти месяцев после наступления беременности. Таким образом, у 13(72,2%) из 18 больных выявлены признаки ухудшения клинического течения заболевания. Только 5 (27,8%) пациентов пережили 3 летний рубеж без рецидивов и метастазов с наличием беременности в период болезни.

По нашим данным, в 16 случаях беременность (у 12 больных) наступила на протяжении 12 месяцев от начала лечения, т.е. по времени совпадала с проведением интенсивных курсов адъювантной полихимиотерапии. Подобная ситуация выдвигала суровую дилемму: или лечить основную болезнь или сохранить беременность, отказавшись от дальнейшего специфического лечения. Поскольку больные находились под наблюдением у онколога и соответственно беременности диагностированы в первом триместре (в 7 случаях), всем больным рекомендовано прерывание беременности, учитывая возможные тератогенные и канцерогенные эффекты предыдущей и планируемой химиотерапии. В ситуации, когда 6 больных женщин имели беременность до начало специфического лечения, ^иттыр^я локальный характер заболевания и гтоздпнс ее сроки им были разрешены роды с определенной долей риска (теоретически невозможно было исключить влияние саркомы Юиига на плод).

Сочетание беременности и саркомы Юинга выдвигает не только чисто медицинские, но и общебиологические и этические проблемы. 13 частности, окончательно не изучено влияние опухолевого процесса на плод, вопросы связанные с влиянием на половые клетки предшествующих лучевых и химиотерапевтических факторов, могущих вызывать мутации и врожденные уродства. На таком малом количестве клинического материала выявить четкие критерии для рекомендаций но срокам беременности после комбинированных методов лечения у больных данной патологией не представляется возможными. Однако, для тех лиц, которые забеременели в период проведения химиолучевой терапии, рекомендуют медицинские аборты, поскольку однозначно доказан тератогенный эффект вышеуказанных лечебных процедур. Касаясь этической стороны этого вопроса, в тех случаях, когда наши пациенты имеют ремиссии заболевания 3-5 и более лет может быть разрешена беременность, даже в этой ситуации последнее решение должно исходить от самой больной. В клинической практике беременность, как неблагоприятный прогностический фактор, должна учитываться при планировании лечения больным саркомой Юинга.

Рецепторы стероидных гормонов опухолевых клеток саркомы Юинга

Нами исследованы опухолевые образны 13 больных саркомой Юинга (7 женщин и 6 мужчин) в возрасте от 15 до 22 лег (19±1.5).

При анализе содержания рецепторов стероидов и глюкокортнкои-дов выявлено, что чаще всего в первичной опухоли Юинга встречается рецепторы глюкокортикоидов (62%), чем рецепторы эстрогенов (23%). Рецепторы андрогеиов обнаружено лишь в одном случае.

Не было опухолевых образцов, в которых удалось бы обнаружить все три вида изучаемых рецепторов стероидных гормонов. РЭ и РГ одновременно присутствовали всего в 3 случаях, а РА и РГ в одном наблюдении. По частоте выявления и количественном отношении опухолевые образцы мужчин и женщин не имели статистически достоверного различия. Конечно, в таком немногочисленном наблюдении делать выводы не уместны. Количество РГ в опухоли Юинга составляло - 65.9 ± 13.9 фмоль/мг белка, а РЭ - 50.1 ± 24.4 фмоль/мг белка. Концентрация рецепторов вышеуказанных гормонов в цитозолях опухолевых клеток колебались в широких пределах: от 10.5 до 137.6 фмоль/мг белка ци го-золя для РГ; от 25.3 до 98.8 фмоль/мг белка цитозоля для РЭ. Возможно, такое широкое колебание уровней рецепторов стероидных гормонов связано с морфологической и биологической гетерогенностью опухоли, что нашло подтверждение при исследовании различных клеток некоторых гормонозависимых опухолей (Бассалык Л.С., 1988).

За вышеуказанный срок наблюдения у 6 (46.2%) больных выявлены метастазы, среди них отдаленные проявления заболевания обнаруживались преимущественно в РГ+ и РЭ+ опухолях. Таким образом, как видно из таблицы 31 отмечена тенденция к повышению частоты появления отдаленных метастазов, соответственно худший прогноз, у больных с РГ+ и РЭ+ в сравнении РГ- и РЭ- опухолями. Подобные прогностические данные получены в исследованиях Н.Е.Кушлинского (1992) касательно остеогенных сарком. Однако подобная тенденция находится в противоречии с мнением, что у больных с рецептороотрицательными опухолями заболевание протекает более неблагоприятно, чем рецептороотрицательными. Это было подтверждено в исследованиях по изучению прогноза гормонозависимых опухолей, в частности у больных раком молочной железы ( Бассалык Л.С., 1987 и др.).

В заключение хотелось бы отметить, что наличие рецепторов стероидных гормонов, особенно РГ в саркоме Юинга наводит на мысль о гормоночувствительности данного новообразования. Однако, малое число наблюдений не позволило нам отразить все детали этой сложной проблемы. Нам представляется, что данное направление костной онкологии перспективное и дальнейшие исследования позволит изучить влияние стероидных гормонов на автономный рост опухоли, а также оценить степень и критерии ее гормоночувствительности.

ВЫВОДЫ

1. Саркома Юинга относится к нейроэктодермальным новообразованиям и характеризуется быстрой гематогенной диссеминацией в легкие и кости. Метастазы в легких и костях даже на фоне современных

схем химиотерапии через 12 месяцев выявляются у 32.5%, а к 24 - у 63.3% больных. Поэтому основной проблемой в лечении указанного новообразования является профилактика реализации субклиническнх метастазов.

2. Применение адъювантной химиотерапии по схеме VAC и САР + VACM + VDC после лучевой терапии позволяет добиться 5-ти летней выживаемости соответственно у 36.4 ± 6.7% и 57.2±7.4% больных (Р<0.05, X2 = 4.9), тогда как при чисто лучевом лечении этот показатель составляет 7.6 ± 4.9% (Р<0.05; Р<0.01). Некоторое преобладание эффективности монохимиотерапии адриамицином перед схемой VAC не носит статистически достоверного характера.

3. Использование на первом этапе комбинированной терапии хи-миотерапевтпчееких режимов (внутриартериальная инфузия адрпами-цина и цисплатины, схем CAP, VACM) достоверно улучшает отдаленные результаты лечения по сравнению с альтернативной ситуацией, когда специфическое лечение начинается с лучевой терапии. Так, больные, получавшие лечение по Протоколу И имеют наилучшие показатели 5-тн летней выживаемости нежели чем, пациенты прошедшие курс лечения по схеме: лучевая терапия + адыовантная химиотерапия цикло-фосфаном, адриамицином и VAC вместе взятых (57.2 ± 7.4% против 31.1 ± 6.0% соответст венно, Р<0.05, X2 - 5.2).

4. Применение на первом этапе комбинированного лечения саркомы Юинга внутриартериальной регионарной химиотерапии достоверно снижает вероятность возникновения рецидива опухоли, имевших место у 8,5 + 4.1% пациентов, по сравнению с 27.5 ± 6.5% больных, не получавших указанного лечения (Р<0.05).

5. Использование внутриартериального введения химиопрепаратов обеспечивает лучшие непосредственные и отдаленные результаты лечения. Так, безрецидивная выживаемость больных на фоне данного вида терапии составила 66.8 ± 6.5%, против 40.9 ± 7.2% при лучевой терапии и адъювантной химиотерапии по схеме VAC (Р<0.05; Х: = 4.1).

6. Сопоставление связи степени повреждения опухоли на фоне предоперационной химиолучевой терапии с прогнозом заболевания показало, что больные с III-IY степенью терапевтического иатоморфоза имеют относительно благоприятный прогноз но сравнению с теми же наблюдениями, где эти явления были менее выражены. 5-ти летняя выживаемость составила 67.7 ± 16.3% и 54.5 ± 18.6% соответственно. (X2 -2.87).

7. Неблагоприятные исходы заболевания в условиях адъювантной химиотерапии наиболее вероятны в первые 24 месяца. Однако у 5.2%

больных возможно появление метастазов в более поздние сроки. Последнее свидетельствует о необходимости длительного, не менее 5-ти летнего диспансерного наблюдения данного контингента больных.

8. В условиях современной комбинированной терапии пересматривается роль хирургического метода. Он применяется при отсутствии эффекта от специфической терапии, патологических переломах, распаде, кровотечениях, а также может быть рекомендован при локализации опухоли в малофункциональных костях скелета, при возможности сохранить конечность, что важно для изучения терапевтического патомор-фоза.

9. Исследование содержания ДНК методом проточной цитофлуо-рометрии подтверждает высокую степень злокачественности этого новообразования, о чем свидетельствуют высокая частота выявления ане-уплоидных клонов клеток. Опухолевые ткани 25(80.5%) больных имели анеуплоидное содержание ДНК, только у 6(19.4%) - в опухолевых клетках выявлено диплоидное содержание ДНК. Также отмечено, что для анеуплоидных опухолей характерна более высокая пролиферативная активность по сравнению с диплоидными новообразованиями (21.7 ± 2.7 и 13.1 ± 4.0 соответственно, Р<0.05).

10. Полученные данные свидетельствуют о тенденции к худшему прогнозу при наличии анеуплоидных клонов клеток по сравнению диплоидными. Так, 5-ти летняя безметастатическая выживаемость составила в первом случае 62.3 ± 21.7, в во втором - 54.9 ± 15.3% (Р>0.05; X2 = 2.1).

11. Беременность в большинстве случаев выступает как неблагоприятный прогностический фактор. Так, беременность в 61.1% наблюдениях совпадала с возникновением первичной опухоли и спровоцировала ее быстрый рост, а в 27.8% случаях опухолевый процесс на фоне данного физиологического состояния имел первично-множественный характер. С наступлением беременности у 71.1% больных выявлены метастазы или рецидивы заболевания.

12. В опухолевой ткани саркомы Юинга в два раза чаще выявляются рецепторы глюкокортикоидов (62%), чем рецепторы эстрогенов (23%). Рецепторы андрогенов обнаружены только лишь в 7.7% опухолей. Наиболее высокой была концентрация глюкокортикоидов (до 137.6 фмоль/мг белка) и эстрогенов (до 98.8 фмоль/мг белка). Использование широкой панели моноклональных антител показало, что уровень местной Т-клеточной интратуморальной реакции и степень активации Т-клеток детерминированы иммунологическим фенотипом опухоли.

список

опубликованных работ по теме диссертации

1. Трапезников H.H., Алиев М.Д., Тайлаков Б.Б., Сишоков Г1:А., Макрецов H.A. Перспективы комбинированной терапии саркомы Юин-га // В книге "Труды I съезда онкологов Республики Узбекистан с международным участием" - Ташкент - ноябрь, 1994 - стр. 3-4.

2. Тайлаков Б.Б., Сишоков H.A., Щербаков С.Д., Макрецов H.A. Внутриартериальная химиотерапия в комбинированном лечении саркомы Юинга // В книге "Труды I съезда онкологов Республики Узбекистан с международным участием" - Ташкент - ноябрь, 1994 - стр. 2-3.

3. Макрецов I I.A., Перевошиков А.Г., Тайлаков Б.Б. Диагностика мелкоклеточных опухолей костей и мягких тканей // Тезисы докладов Y1II республиканской научно-практической конференции онкологов Татарстана Казань - 1995 - стр. 94-95.

4. Тайлаков Б.Б., Богатырев В.Н., Соколова В.К., Макрецов H.A. Использование ДНК-проточной цитометрии для анализа плоидности ДНК опухолевых клеток при саркоме Юинга// В кн. "Актуальные вопросы онкологии". Мат. научн.-практич. конференции - Уфа - 1995 -сгр.90-91.

5. Синюков H.A., Тайлаков Б.Б., Соколовский В.А., Тепляков В.В. Влияние беременности па прогноз саркомы Юинга// В кн. "Актуальные вопросы онкологии", Mar. научн.-практич. конференции - Уфа - 1995 -стр.247-248.

6. Мусаев Э.Р., Тайлаков Б.Б., Соболевский В.А. Первичные опухоли костей таза // Тезисы докладов YII1 республиканской научно-практической конференции онкологов Татарстана - Казань - 1995 -стр.198.

7. Сишоков Г1.А., Тайлаков Б.Б., С.Д.Щербаков, В.А.Соколовский. Регионарная (внутриартериальная) химиотерапия в комбинированном лечении саркомы Юинга // Тезисы докладов IX съезда онкологов Украины - Винница - 1995 - стр.342-343.

8. Трапезников H.H., Г-ремина J1.A., Синюков H.A., Алиев М.Д., Б.Б.Тайлаков. Перспективы неоадъювантной и адъювангной химиотерапии саркомы Юинга // Тезисы докладов IX съезда онкологов Украины - Винница - 1995 - стр.348-349.

9. Тайлаков Б.Б., Богатырев В.Н., Сишоков H.A., Макрецов H.A., Соколова В.К. Клиническое значение степени плоидности Д1IK опухолевых клеток при саркоме Юинга // Тезисы докладов научно-практической конференции, посвященной 25-летшо республиканского онкологического диспансера - г)листл - апрель, 1996 - стр. 125.

10. Сишоков Г1.А., Тайлаков Ь.Б., Ковалевский Е.Е., Хатырен С.А. Клиническое течение саркомы Юинга на фоне беременности // Тезисы докладов научно-практической конференции, посвящсннон 25-летию республиканского онкологического диспансера - Элиста - апрель, 1996-стр. 126.

11. Трапезников Н.Н., Еремина J1.A., Синюков П.А., Алиев М.Д., Тайлаков Б.Б., Ковалевский Е.Е., Стефанков С.В. Результаты комбинированной терапии саркомы ЮИНГА // Тезисы докладов научно-практической конференции, посвященной 25-летию республиканского онкологического диспансера - Элиста - апрель, 1996 - стр. 129.

12. Тайлаков Б.Б., Богатырев В.Н., Синюков П.А., Макрецов Н.А., Соколова В.К. Значения изучения методом лазерной проточной цитометрии плоидности опухолевых клеток при саркоме Юинга // Тезисы докладов Смоленской областной научно-практической конференции онкологов - Смоленск - декабрь, 1995 - стр. 210-211.

13. Bogatyrev V., Makretsov N., Tailakov В., Sinjukov P., Sokolova V. DNA Flow Cytometry in Ewing's sarcoma // Analytical and quantitative cytology and histology, - V.18 - N 1 - 1996.-p.52-53.

14. Trapeznikov N.N., Eremina L.A., Sinjukov P.A., Aliev M.D., Tailakov B.B. The results of combined therapy of Ewing's sarcoma //Sixth International Congress on Anti-Cancer Treatment - Paris - 1996 - p. 174.

15. Kadagidze Z., Trapeznikov N., Tupitsin N.. Bogatyrov V., Artamonova E., Aliev M., Tailakov В., Soloviev Yu., Makretsov N. Some immunopathological features of Ewing's sarcoma// Medical and pediatric oncology- v.5 - N.4 - 1996 - р.310.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подп. к печати \S АО, 94 Заказ 4"И Тираж 100 экз.