Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Рецепторы эпидермального фактора роста в опухолях костей

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР пи. Н.Н.БЛОХИНА

ОД

на правах рукописи

КОСТЫЛЕВА Ольга Ивановна

РЕЦЕПТОРЫ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА В ОПУХОЛЯХ КОСТЕЙ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1996

Работа выполнена б Онкологическом научном центре РАМН им. Н.Н.Блохипа

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Н.ЕЛСушлннскнП доктор медицинских наук М.Д. Алиев

Официальные оппоненты:

доктор биолошческих наук, профессор Л.П. Горбачева доктор медицинских наук, профессор Д.В. Комоп

Ведущая организация:

Московский НИИ онкологии им. П.Л. Герцена МЗ России

Зашита состоится " 1996 г.

д . часов на заседании Специализированного Совета по защите кандидатских диссертаций (К.001.17.01) при Онкологическом научном це1ггре РАМН (Москва, 115478, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического научною центра им. Н.Н.Блохипа РАМН

Автореферат разослан " ^^ " ¿¿¿-С 1996 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор медицинских паук, профессор В.С.Турусои

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Экспериментальные исследования биологических особенностей опухолей костей показали, что эта группа злокачесгвенных новообразований относится к разряду гормоно-чувствительных (Corvo! и соавт., 1987; Бассалык и соавт., 1988; Куш-линский и соавт., 1992, 1992а]. В регуляции роста и дифференцировки клеток тканей скелета немаловажную роль играют не только эндокринные, но, также и ауто- и/или паракринные механизмы регуляции.

Изучение путей локальной (ауто/паракринной) регуляции роста клеток сарком костей стало активно развиваться п последние 10 лет. В результате было обнаружено, что клетки опухолей синтезируют локальные регуляторы роста, которые индуцируют их пролиферацию и дифференцировку, взаимодействуя со специфическими рецепторами мембран как окружающих опухолевых !<леток, так и стромальных компонентов [Goustin и соавт., 1986; Lippman и соавт., 1987; Munch и соавт., 1992; Naegele и соавт., 1992; Raile и соавт., 1994]. Так функцио-' нирует механизм ауто/паракринной регуляции опухолевого роста, который, по-видимому, является одним из звеньев в обеспечении автономного развития опухоли. Однако, следует отметить, что эти данные получены в условиях эксперимента, а клинические исследования в этой области до сих пор весьма немногочисленны и результаты их неоднозначны.

Исследования in vitro в первичны'х культурах неонатальных остеобластов мышей [Wigzell, 1991], в культурах клеток остеогенной саркомы человка HOS ТЕ 85 [Munch и соавт., 1992], SAOS-2 и PR [Raile и сбавт., 1994], OST-I-PF [Yamada и соавт., 1992], а также в опухолях больных саркомами костей [Naegele н соавт., 1992; Duda и соавт., 1993] ffoiaianii," что" неснатальные fr. опухолевые остеобласты

синтезируют некие ростовые факторы, модулирующие пролиферацию и дифференцировку опухолевых клеток по ауто- и/или паракрннному пути. In vivo полипептидные факторы роста реализуют свои эффекты во взаимодействии друг с другом и с центральными (эндокрнуньши) факторами, в частности,ico стероидными гормонами [Dickson и соавт., 1987; Benz и соавт., 1991; Bodine и соавт., 1995].

Среди наиболее активных и экспериментально изученных полипептидных факторов роста можно выделить- ЭФР - небольшой полипептид (6000 Да), взаимодействующий с рецептором на мембране клетки-мишени. Рецептор ЭФР (РЭФР), представляющий собой крупный (Мв » 170.000 Да) трансмембранный белок, - уникальная молекула, взаимодействующая, по крайней мере, с двумя лигандами - ЭФР и а-ТФР [Schlessinger, 1988]. РЭФР рассматривается в настоящее время в качестве одного из тканевых маркеров биологических особенностей опухолей, важных в прогностическом плане [Harris и соавт., 1992; Герштейн и соавт., 1994], а также, как потенциальная мишень для блокирования передачи митогенного сигнала в клетке [Burgess и соавт., 1994; Герштейн и соавт., 1995]. Тем не менее, несмотря на активное экспериментальное и клиническое исследование однозначного понимания роли ЭФР и его рецепторов при различных злокачественных опухолях человека до сих пор нет. Сведений об исследовании РЭФР в опухолях костей у человека в литературе мы не встретили.

Цель исследования. Изучение экспрессии РЭФР в опухолях костей у человека и ее взаимосвязи с основными клиническими и морфологическими показателями, обосновывающих учасгие ЭФР в процессах бластдмогенеза в костной и хрящевой тканях.

. Основные задачи исследования.

1. Радиолигандным методом определить содержание РЭФР и ис-

следовать параметры связывания ЭФР в мембранной фракции опухолей костей.

2. Провести скрининг частоты экспрессии РЭФР в различных опухолях костей.

3. Исследовать функциональную активность ГОФР в опухолях костей.

4. Сопоставить данные об экспрессии РЭФР с основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания.

5. Сопоставить показатели экспрессии рецепторов стероидных гормонов и ЭФР в различных опухолях костей.

Научная попита работы. Впервые на большом клиническом материале с использованием единого методического подхода исследовано'распространение в опухолях костей ГОФР, являющегося важным звеном ауго-/паракринной регуляции в широком спектре опухолей, различных по гистогенезу и клиническому течению.

Впервые продемонстрировано присутствие РЭФР в значительной части исследованных опухолей костей и показано, что частота экспрессии РЭФР в опухолях значительно выше по сравнению с опу-холеподобными поражениями костей.

Впервые изучены параметры связывания ЭФР в мембранной фракции остеоге^ной саркомы и хондросаркомы и выявлен один тип мест связывания ЭФР в этих новообразованиях, характеризующихся низкой аффинностью к ЭФР.

Впервые продемонстрирована взаимосвязь экспрессии РЭФР со степенью злокачественности сарком костей и показано, что более злокачественные гистологические варинаты остеогенной саркомы и хондросаркомы чаще экспрессируют РЭФР, чем менее злокачественные.

Впервые проведен комплексный анДлиз экспрессии рецепторов стероидных гормонов и ЭФР, в результате чего установлено, что для опухолей костей совместная экспрессия РЭФР и рецепторов стероидных гормонов не характерна, а наблюдается преимущественно экспрессия РЭФР в отсутствии рецепторов стероидов.

Научно-практическая значимость.- Результаты настоящего исследования, в основу которого положено изучение 114 наблюдений первичных опухолей костей различного гистогенеза, обосновывают роль РЭФР и их лигандов в патогенезе опухолей костей и создают базис для разработки принципиально новых методов противоопухолевого воздействия на злокачественные новообразования костей, основанных. на блокировании передачи митогенного сигнала ЭФР в опухолевой клетке. Обнаруженная взаимосвязь экспрессии РЭФР и степени злокачественности остеогенной саркомы и хондросаркоыы может быть использована как вспомогательный критерий при оценке прогноза заболевания.

Апробация работы. Диссертация апробирована на межотделенческой конференции ОНЦ РАМН 17 мая 1996 г. Материалы диссертации изложены на XI Конгрессе онкологов Турции (Аиталия, Турция, 1995); 11-ом Европейском Конгрессе по клинической химии "Laboratory Medicine'95"(Тампере, Финляндия, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ в отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментального раздела (включающего описание материала и методов, и результатов исследования), обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Общий объем диссер

тации - 126 листов машинописного текста. Указатель литературы содержит 9 работ отечественных и 157 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 12 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Краткая характеристика больных и материала. В исследование включены 114 больных злокачественными и доброкачественными опухолями и опухолеподобными поражениями костей, находившихся на лечении в ОНЦ РАМН в период с сентября 1994 г. по апрель 1996 г. Подавляющее большинство (47 >■ ловек) составляли больные остео-генной саркомой: 30 мужчин н 17 женщин в возрасте от 17 до 57 лет; средний возраст - 21 г. Вторую по численности группу составляли 24 пациенты с хондросаркомой: 13 мужчин и 11 женщин в возрасте от 17 до 63 лет; средний возраст - 39 лет. Обследовано 13 больных саркомой Юннга: 6 мужчин и 7 женщин в возрасте от 15 до 29 лет, средний возраст - 19 лет. Среди 8 больных злокачественной фиброзной гистно-цитомой было 7 мужчин и 1 женщина в возрасте от 22 до 69 лет, средний возраст - 43 г./ В группу доброкачественных опухолей были включены 14 больных гигантоклеточной опухолью (женщины в возрасте от 15 до 36 лет, средний возраст - 25 лет). В группу опухолеподобных поражений скелета были включены 8 (3 мужчин и 5 женщин в возрасте от 16 до 40 лет, средний возраст - 23 г.) пациентов с костно-хрящевым экзостозом, оссифицирующен фибродисплазией и фиброзной остео-дисплазией.

Получение и обработка тканей. Для исследования рецепторов стероиных гормонов и ЭФР образцы опухолей массой 500 мг растира-пи в жидком азоте, а затем гомогенизировали в ТЭД-буфере (рН 7,4)

с

при 4°С, содержащем 10 мМ трис-HCI ("Merck", Германия), 1,5 мМ ЭДТА ("Sigma", США), 0,5 мМ дитиотрейтола ("Koch-Light Laboratories", Великобригания), 10% (v/v) глицерина (о.с.ч.) из расчета 1 мл буфера на .100 мг ткани. Цитозольную.фракцию получали с результате центрифугирования гомогената при 105.000xg, 4°С в течение 40 мин. (центрифуга Optima ТМ TLC, "Beckman", США) и использовали для определения рецепторов стероидных гормонов. Осадок использовали для получения грубой мембранной фракции клеток опухолей, где определяли содержание рецепторов ЭФР. Для этого осадок регомогенизировали при 4°С в 0,25 мМ К, Na-PBS-буфере (рН 7.4), содержащем 1 г/л БСА ( Sigma, США) и 0.07 г/л бацитрацина (Sigma, США) и центрифугировали при 2.000xg в течение 10 мин при 4°С.

Для исследования скорости обращения фосфолипидов фрагмент опухоли массой 500-700 мг измельчали и помещали в 5 мл Среды Игла, содержавшей 0,5 мл ферментативного коктейля (1% коллагеназы, 0,1% гиалуронидазы и 0,02% ДНКазы) и инкубировали 18 час. при 20°С. После инкубации живые опухолевые клетки выделяли в результате центрифугирования в слое фикогл-верографина (р=1,077) при 400xg в течение 30 мин.

Определение рецепторов эпидермадьного фактора роста. Анализ содержания РЭФР в мембранной фракции опухолей проводили модифицированным радиолигандным методом Benraad & Foekens (1990), используя в качестве лиганда мышиный ЭФР (receptor grade, "Sigma", США), иодированный с помощью Na12JI в присутствии хлорамина Т (удельная радиоактивность 45-120 Ки/ммоль). Мембранные прецараты, содержащие 0,2-1,0 мг/мл белка, - инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с 3,5 нмоль 1251-ЭФР в при-

сутствии или отсутствии 200-кратного избытка немеченого ЭФР. Реакция прекращалась при добавлении 75% суспензии гидроксклаппа-nrra (DNA-grade, "Sigma", США) л K.Na-PBS-буфере (pH 7,4) на льду. После 3 последовательных отмываний К.Ыэ-РВЗ-буфером при 4°С пробы радиометрировали на гамма-счетчике Cobra-II gamma ("Packard", Австралия) и рассчитывали количество специфически связанного аз1-ЭФР. РЭФР-положительными считали опухоли, содержащие не менее 5 фмоль РЭФР/мг мембранного белка.

Влияние ЭФР на скорость обращении фосфолипидов исследовали по изменению включения 33Р-меченого ортофосфата в фос-фолипиды мембран в краткосрочных культурах клеток опухолей костей по методу М.А.Красильникова и В.А.Шатской (1991).

Определение рецепторов стероидных гормонов (эстрогенов,

I

андрогенов и глюкокортикоидов) проводили стандартным радноли-гандным методом, рекомендованным EORTC, с разделением гормон-рецепторных комплексов и несвязанного лиганда на активированном угле, покрытом декстраном [Бассалык и соавт., 1986]. Опухоли считали рецепторположительнымн по РА, если количество специфически связанного лиганда составляло не менее 5.фмоль/мг белка цитозоля, а по РЭ и РГ - не менее 10 фмоль/мг белка.

Статистическая обработка данных. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

в

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Экспрессия РЭФР о мембранной фракции первичных опухолей костей

Известно, что главным передаточным звеном в реализации эффектов ЭФР в клетке является его рецептор. Однако, до сих пор экспрессия РЭФР в клетках опухолей костей практически не изучалась, хотя известные эффекты ЭФР в клеточных культурах остеогенной саркомы носят дозозависимый насыщаемый характер, а следовательно, опосредуются рецепторами [Уатас1а и соавт., 1992]. В связи с этим нами исследована экспрессия РЭФР в качестве.одного из основных критериев чувствительности клеток к ЭФР в наиболее часто встречающихся первичных опухолях костей различного гистогенеза, с целью показать принципиальную возможность участия ЭФР в бласто-могенезе столь разнородной группы опухолей. В результате проведенного скрининга нами было обнаружено, что более половины включенных в исследование злокачественных и доброкачественных опухолей экспрессируют РЭФР, в то время как в опухолеподобных поражениях костей РЭФР встречаются значительно реже (табл. 1). Обращает на себя внимание не только сам факт столь высокой частоты экспрессии РЭФР в опухолях костей, но также и отсутствие принципиальных различий в частоте обнаружения РЭФР между злокачественными (остеогенная саркома - 63%; хондросаркома - 54%; саркома Юинга -57%, злокачественная фиброзная гистиоцитома - 63%;) и доброкачественными (гигантоклеточная опухоль - 57%), а также соответствие частотам выявления РЭФР в типичных ЭФР- регулируемых опухолях, например в раке яичников (приблизительно 50% РЭФР-поло^ительных опухолей [ВаПа§Па и соавт,, 1989]) и раке шнненола

(60-70% РЭФР-положнтельных опухолей [Уап^\уа и соавт., 1992]. Следует также отметить, что исследованные нами опухоли отличаются по гистогенезу: саркома Юинга, согласно современным представлениям, имеет нейроэктодермальную природу, а остальные опухоли имеют мезенхимальное происхождение. По-видимому, экспрессия РЭФР, а, следовательно, потенциальная чувствительность к ЭФР являются достаточно общей характеристикой злокачественной трансформации клеток. ч

Таблица 1

Экспрессия РЭФР в мембранной фракции первичных опухолей и опухолеподобных поражений костей

Нозологическая форма Число наблюдений РЭФР+-опухоли <%) Пределы колебаний уровней РЭФР, (фмоль/мг белка) РЭФР М ± гп, (фмоль/мг белка)

Остеогенная саркома 47 63 10 + 605 184 ±29**

Хондро-саркома 24 54 17 +662 211 ± 50**

Саркома • Юинга 14 57 30 +212 142 ±25**

Злокачественная фиброзная гистиоцитома 8 63 69 +271 199 ± 37**

Гиганто- клеточная опухоль 14 57 10 + 128 60 ± 16*

Опухолепсдобные поражения костей \ 8 38 47,+ 303 216 ± 85

р*у8« £0,05.

Нами не обнаружено достоверных отличий в уровнях РЭФР о остеогенной саркоме, хондросаркоме, саркоме Юинга, злокачественной фиброзной гистиоцитоме и опухолеподобных поражениях костей (табл.1). Однако, статистически достоверные отличия при р^0,05 имелись при сравнении всех злокачественных опухолей с гигантоклеточ-ной опухолью. Интересно, что; хотя в опухолеподобных поражениях РЭФР вывлялись значительно реже, чем в доброкачественных опухолях (гигантоклеточная опухоль), мы не обнаружили статистически достоверного отличия между уровнями РЭФР.

Таким образом, полученные нами данные подтверждают результаты экспериментальных исследований РЭФР в культурах остеогенной саркомы человека, свидетельствующих о-значительной роли ЭФР и

I

его рецепторов в патогенезе опухолей костей [Li и соавт., 1994; Matsuda и соавт., 1993; Salomon и соавт., 1990; Yamada и соавт., 1992; Yudph и соавт., 1994].

2. Параметры связывания ЭФР в мембранной фракции опухолей костей

До сих пор физико-химические характеристики РЭФР хорошо исследованы в ткани рака молочной железы, где было обнаружено два типа рецепторов ЭФР с высокой (Kd = 0,1-0,3 нМ) и низкой (Kj = 2-15 нМ) аффинностью к лигандам [Schlessinger, 1988]. Для нормальной костной ткани экспрессия РЭФР не характерна. До сих пор параметры связывания ЭФР были исследованы лишь в нескольких. культурах остеогенной саркомы, где обнаружены высокоаффинные РЭФР [Yamada и соавт., 1992], и в дифференцированных хондроцитах кроликов, где было выявлено два типа мест связывания ЭФР - высокоаффинные и низкоаффинные [Kinoshita и соавт., 1992], Мы исследовали параметры связывания ЭФР в мембранной фракции остеогенной cap-

Рйс. 1. Исследование параметров связывания ЭФР в мембранной фракции опухолей костей

! К(1=],4нМ, Вгпах=216 фмоль/мгбелка I | Кс1=2,15нМ,Вгаах=80 фмоль/мгбелка

комы и хондросаркомы методом Скэтчарда и обнаружили один тип мерт связывания ЭФР в остеогенной саркоме (Kd= 1,04 нМ) и в хондро-саркоме (Kd=2,15 нМ) (рис.1). Если следовать классификации ЮФР, предложенной Schlessinger, (1988) и Kinoshita и соавт., (1992), тр обнаруженные нами параметры связывания характеризуют РЭФР в контрольной системе и опухолях костей как низкоаффинные рецепторы.

3. Взаимосвязь экспрессии РЭФР в опухолях костей с чувствительностгло их к ЭФР in vitro

Известно, что инициация клеточного деления под действием полипептидных факторов роста, в частности, ЭФР сопровождается быстрой активацией цикла обращения фосфолипидов [Красильников 1993, Krasil'nikov и соавт., 1993; Gershtein и соавт., 1995], которая имеет ключевое значение на стадии инициации клеточного деления. В качестве критерия функциональной активности ЮФР мы использовали степень индукции обмена фосфолипидов в краткосрочных культурах клеток, выделенных из опухолей, под воздействием ЭФР,

Проведенные исследования позволили сделать несколько интересных выводов. Ни в одном из РЭФР-отрицательных образцов (табл. 2) стимуляция цикла обращения "фосфолипидов под воздействием ЭФР не обнаружена, что подтвердило данные радиолигандно-го исследования содержания РЭФР в этих оп> холях. Обраб тка клеток 10 8М ЭФР в течение 10 мин. приводила к достоверной (не менее 120% от контрольного уровня) стимуляции включения ИР в фосфоли-пиды в одном из трех РЭФР-положительных, образцов ("пбл. 2). В одном из РЭФР-положительных образцов удалось исследовать влияние генистеина (неспецифического ингибитора тирозинкиназ) в присутствии ЭФР (табл^'2)ГОдин ЭФР в этом образце не активировал

Таблица 2

Влияние ЭФР на скорость обмена: фосфолипидов в первичных !сультурах опухолей костей

N образца Нозологическая форма РЭФР (фмоль/мг белка) ' Включение 32Р в фосфолипиды (% от контроля) ЭФР ЭФР + Генистеин

1. Остеогенная саркома 138 111 не опр.

2. Остеогенная саркома 0 ПО не опр.

5. Остеогенная саркома 177 84 97

4. Хондро-саркома 0 95 не опр.

5. Саркома Юинга 189 153(+) не опр.

6. Саркома Юинга 0 112 не опр.

7. Злокачествен ная фиброзная ги-стиоцитома 0 120 не опр.

цикл обращения'фосфолипидов, при воздействии ЭФР в сочетании с генистеином также не наблюдалось достоверных изменений включения 32Р в фосфолипиды. Полагаем, что отсутствие ответа на экзогенный ЭФР и генистеин в этом образце может быть связано, по крайней мере, с тремя следующими положениями: 1) рецепторы хрони ски активированы эндогенным лигандом; 2) обнаруженные РЭФР являются функционально неактивными по неизвестным нам причинам; 3) нарушено следующее звено передачи митогенного сигнала ЭФР от рецеп-

тора к циклу обращения фосфолипидов (фосфолипаза С).

Учитывая полученные результаты, можно предположить, что наличие РЭФР на мембранах опухолевых клеток хотя и является лимитирующим фактором в отношении чувствительности их к ЭфР, однако не всегда достаточно для реализации, митогенного эффекта ЭФР.

4. Экспрессия РЭФР в различных гистологических вариантах остеогенной саркомы и хондросаркомы

Как известно, остеогенная саркома -включает в себя несколько гистологических вариантов, отличающихся по степени злокачественности и, соответственно, прогнозу [ОаЬНп & ипш, 1986, Трапезников и соавт., 1993]. Учитывая степень дифференцировки опухолевых клеток, остеобластический, анаплазированный и телеангиоэктатический варианты остеогенной саркомы относят к наименее дифференцированным, а, следовательно, более агрессивным опухолям. Имеющиеся в настоящем исследовании хондробластический, мелкоклсточный и смешанный гистологические варианты характеризуются более высокой степенью дифференцировки. При сравнении частоты экспрессии РЭФР в этих гистологических вариантах остеогенной саркомы мы обнаружили (табл. 3), что остеобластический, анаплазированный и телеангиоэктатический варианты экспрессируют РЭФР значительно ( в 71%, 83% и 75%, соответственно) чаще, чем хондробластический, мел-кокпеточный и смешанный варианты (50%,'63% и 50%, соответственно). То ссть, по-видимому, существует тенденция увеличения частоты экспрессии РЭФР в менее дифференцировашшх опухолях, по сравнению с более дифференцированными вариантами остеогенной саркомы. Следует также отметить, что мы не обнаружили каких-либо отличий' между средними уровнями РЭФР в исследованных гистологиче

ских вариантах.

Таблица 3

Содержание РЭФР в различных гистологических вариантах остеогенной саркомы

Гистологический вариант остеогенлой саркомы Число наблюде-' ний РЭФР+-опухоли, (%) РЭФР М±ш, (фмоль/мг белка)

Остеобластический 71 196 ±51

Анаплазированный 6 • 83 194 + 71

Тслеангиоэктатнческий ,4 75 205±140

Хондробластический 4 50 10 и 432

Мелкоклеточный 8 63 146 ±58

Смешанной 8 0 146 ±49

Хондросаркома также включает в себя несколько гистологических вариантов [Е>аЫт & Шш, 1986]. В настоящем исследовании при верификации морфологии опухолей были выявлены типичная, дедиф-ференцированная, светлоклеточная и мезенхимальная хондросарко-мы. Группа типичных хондросарком включала в себя опухоли I, II и III степеней анаплазйи. При анализе частот экспрессии РЭФР в хон-дросаркоме (табл. 4) нами обнаружена та же тенденция увеличения частоты экспрессии РЭФР по мере, увеличения степени злокачественности опухолей: для наиболее дифференцированной типичной хондро-саркомы I степени анаплазии, по-видимому,- экспрессия РЭФР не характерна, так как мы не обнаружили РЭФР ни з одном из исследованных обра-яюв опухолей; 7 из 13 типичных хондросарком (I степени

злокачественности, 2/3 хондросарком III степени злокачественности' И все хондросаркомы дедифференцированного типа были охарактеризованы как РЭФР-положительные.

Таблица 4

Экспрессия РЭФР в различных гистологических _ вариантах хондросаркомы

Гистоло "-ический вариант и степень дифференцировки хондросаркомы Число наблюдений % РЭФР + РЭФР М±т, фмоль/мг белка

Типичная, I степени анаплазии 3 0 _ -

Типичная, II степени анаплазии 13 ,54 153 ±47

Типичная, III степени анаплазии 3 67 »3-й 411

Дедифференированная 3 100 • 306 ±180

Светлоклеточная 1 ■ 0

Мезенхимальная 1 / .. — 259

Высокозлокачественная мезенхимальная хондросаркома была охарактеризована как РЭФР-положительная, однако, в связи с тем, что эт.о было единственное наблюдение этой нозологической формы, мы не можем судить об экспрессии РЭФР в мезенхимальных хондро-саркомах.

5. Анализ экспрессии РЭФР в опухолях костей в зависимости от возраста пола пациентов

Пики возникновения исследованных опухолей костей приходятся на разные возрастные периоды: так остеогенная саркома и саркома Юинга поражают в основном молодых людей, а хондросаркома, зло-

качественная фиброзная гистиоцитома и гигантоклеточная опухоли . развиваются в более поздней возрасте. Ь настоящем исследовании большую часть больных остеогенной саркомой составляли молодые люди в возрасте от 12 до 20 лет, в этой возрастной группе 64% передов: иных опухолей оценивались как РЭФР-положительные (табл. 5). В остальных четырех возрастных группах (от 21 до 60 лег) РЭФР-положительные опухоли встречались в единичных случаях. Таким образом, в остеогенной саркоме обнаружена обратная связь между частотой экспрессии РЭФР и возрастом больных, причем максимальная частота- экспрессии РЭФР в опухоли приходится на пубертатный период.

Таблица 5

Содержание РЭФР в опухолях костей в зависимости от возраста пациентов

Частота экспрессии РЭФР (%) и уровни экспрессии РЭФР, М±ш, (фмоль/мг белка)

■ Возраст (лет)

Нозологическая форма 10-20 21-30 31 -40 41-50 51 -60

Остеогенная саркома 165 ±29 64 305 107 и 112 39 и 107 177

Гип гго- клеточная опухоль 19 и 54 32 ± 13* 43 102 ±25** 75 - -

р.„»<;0,05

Для гиганток'лсточной опухоли, которая развивается, как правч-ло, в постпубертатном периоде, оказалось характерным ' сличение частоты и уровней экспрессии РЭФР по мере увеличения возраста пациентов (табл. 5)., Мы яе ст^Ш, приводить данные подобного анализа в хондросаркоме, саркоме Юинга, злокачественной фиброзной гисшо-' цитоме и спухолепоцобных пораже1Шях костей а связи с немногочис*

леиностью пациентов в этих группах, что не позволяет говорить о наличии или отсутствии зависимости экспрессии РЭФР от возраста больных этими одухолямй

Таблица 6

Содержание РЭФР в опухолях костей с учетом пола пациентов

— мужчины Жсщины

Нозологическая форма РЭФР, М±ш, (фмоль/мг белка) РЭФР'-опухоли, {%) РЭФР, М±ш, (фмоль/мг белка) РЭФР+-опухоли ,(%)

Остсогенная саркома 195 ± 41 70 147 ±42** 59

Хондросаркома 249 ± 77 62 150 ±39** 46

Саркома Юинга 151 ±32 83 126 ±48** 43

Злокачественная фиброзная гистиоцитома 183 ±43 57 265

Гигантоклеточная опухоль - - 60 ± 16* 58

Р'У1" ^ 0,05

При сравнении экспрессии РЭФР в опухолях костей у мужчин и женщин обнаружено, что средние уровни РЭФР у мужчин и женщин достоверно не отличались ни в одной из исследованных нозологических форм (табл. 6). Однако, частота экспрессии РЭФР была значительно выше в опухолях костей у мужчин по сравнению с женщинами. Эга тенденция отчетливо просматривается на. примере остеогенной . саркомы, хондросаркомы и саркомы Юинга. Так, РЭФР были обнаружены в 70% опухолей у мужчин и 59% опухолей у женщин, страдающих остеогенной саркомой. Еще -более резкая разница в экспрессии РЭФР с учетом пола пациентов наблюдалась в хондросаркоме (

62% РЭФР+-опухолей у мужчин и 45% РЭФР+-опухолей у женщин) и саркоме Юинга (83% РЭФР+-опухолей у мужчин и 43% РЭФР^-опухолей у женщин).

6. Взаимосвязь экспрессии РЭФР и рецепторов стероидных гормонов в опухолях костей

Участие половых стероидов в процессах опухолевого роста в костной и хрящевой тканях подтверждено многочисленными экспериментальными и клиническими исследованиями. Эстрогены оказывают дифференцировочные эффекты (прямое дозозависимое увеличение активности ЩФ, стимуляция продукции молекул экстрацеллтолярного матрикса) и ингибируют рост различных клеточных культур остеоген-ной саркомы человека. Причем эти эффекты обратимы под влиянием антиэстрогенов, конкурирующих с эстрогенами за.связывание с рецепторами [Gray и с'оавт., 1987а; Migliaccio и соавт.,1992; Oursler и соавт., 1994; Mahonen и Маепраа, 1994], в хондроцитах человека [Franchimont и Bassleer, 1991] и в цитозольной фракции опухолей больных остеоген-ной саркомой [Кушлннский и соавт., 1993]. О роли андрогенов в развитии нетрансформированных и опухолевых остеобластов и хондро-цитов существуют весьма противоречивые представления. В результате проведения большого клинического исследования Кушлинским и соавт., (1992, 1992а, 1993) было показано, что наличие рецепторов андрогенов в остеогенной саркоме является неблагоприятным прогностическим признаком относительно сроков метастазирования, а выявленная гнперандрогения у преобладающего числа больных остеогенной саркомой и напичие специфического связывания андрогенов в опухоли являются одним из патогенетических факторов разви-

Рис.2 Сочетания РЭФР и РЭ в опухолях костей

Сочетание РЭФР'РА*

Сочетание РЭФР*РА'

i2

тия остсогснной саркомы. В связи с вышеизложенным, мы предприняли попытку сопоставить экспрессию РЭФ^ и рецепторов эстрогенов, андрогснов и глюкокортикоидов в опухолях костей, с целью выяснения соотношения между ауто/паракринными и эндокринными механизмами регуляции их роста. Проанализировав сочетания РЭФР и рецепторов половых стероидных гормонов, мы пришли к выводу, что для остеогенной саркомы совместная экспреосия РЭ ~>Р, РА и РЭ мало характерна (рис. 2 и 3). Чаще всего в остеогенной саркоме обнаруживались РЭФР без рецепторов половых стероидов, иллюстрируя гипотезу о том, что потеря чувствительности к центральным регуляторным влияниям (которая связана с элиминацией гормональных рецепторов) сопровождается усилением роли локальных факторов роста (что подтверждается экспрессией их рецепторов, на примере РЭФР). Для саркомы Юинга наименее характерен условно "эндокринный" фенотип (когда экспрессируются рецепторы половых стероидов в отсутствии РЭФР или одновременно оба типа рецепторов), и наиболее характерна экспрессия РЭФР в отсутствии РА и РЭ или рецептор-отрицательность по всем типам рецепторов. Для злокачественной фиброзной гистиоцитомы наиболее характерна совместная экспрессия РЭФР и РЭ, а также фенотипы РЭФРРЭ* и РЭФР+РА\ или одновременное отсутствие РЭФР и РА.

Главной мишенью глюкокортикоидов в костной ткани являются остеобласты, пролиферацию которых они угнетают [Gray и соавт., 1987а; Lajenesse и соавт., 1991]. Сочетание РЭФР и РГ наиболее характерно для гигантоклеточных опухолей и злокачественной фиброз-•ной гистиоцитомы, несколько реже встречается в остеогенной саркоме и саркоме Юинга (рис. 4), и наименее характерно для хондросар-ком и опухолемодибныч морижоипи косicii. Условно "аугокрннный"

фенотип РЭФР+РР чаще встречался в остеогенной саркоме, хондр'о-саркоме и саркоме Юинга , реже в злокачественной фиброзной ги-стиоцитоме и опухолеподобных поражениях костей и, по-видимому, был мало характерен для гигантоклеточной опухоли (рис. 4). Условно "эндокринный" фенотип РЭФР РГ* в опухолях встречался приблизительно одинаково часто, исключая злокачественную фиброзную ги-стиоцитому, однако наиболее характерен был для опухолеподобных поражений костей (рис. 4). Фенотипическал элиминация обоих типов рецепторов (РЭФР-РГ-) встречалась в два раза чаще в хондросаркомах, злокачественных фиброзных гистиоцитомах и опухолеподобных поражениях костей по сравнению с остеогенной саркомой, саркомой Юинга и ги антоклеточной опухолью.

7. Исследование взаимосвязи экспрессии РЭФР со сроками метастазмрования остеогенной саркомы

Остеогенная саркома является наиболее частой первичной злокачественной опухолью кости и отличается тяжестью течения и ранним гематогенным метастазированием в легкие, которое является основной причиной смерти больных'[Трапезников и соавт., 1993]. Средние сроки диссеминации не превышают 8-12 месяцев.

Основываясь на данных литературы об усилении метастатического потенциала остеогенной саркомы под влиянием ЭФР в экспериментах in vitro [Yudoh и соавт., 1994], мы исак довали взаимосвязь экспрессии РЭФР со сроками метастазирования в небольшой группе больных остеогенной саркомой. Нами было прослежено 16 пациентов (коюрым были произведены радикальные операции в объеме ампутации конечности или резекции пораженной кости и адъювантная химиотерапия по различным схемам) на протяжении 24 месяцев (табл. 9).

Таблица 9

Исследование экспрессии РЭФР в остеогенной саркоме в зависимости от сроков метастазированип

Сроки ыетастази-рования, (месяцы) Количество больных с МТС* Количество РЭФР+-первичных опухолей Количество больных без МТС Количество РЭФР+-опухолей

0-6 4 3

7-12 3 3 •

13-24 2 1 7 5

*МТС - метастазы в легких У 9 из них в разные сроки были выявлены метастазы в легких, причем первичные опухоли 7 пациентов были охарактеризованы как РЭФР-положительные. Однако, следует отмстить, что у 5 из 7 пациентов без клинически выявленных метастазов в период наблюдения опухоли также содержали РЭФР. Таким образом, мы не выявили связи между частотой экспрессии РЭФР и метастазированнем остеогенной саркомы, однако, этот вопрос требует дальнейшего изучения, так как короткий интервал между лечением и появлением признаков генерализации предполагает наличие микрометастазов уже при первых симптомах заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Рецепторы эпидермального фактора роста (РЭФР) выявлены в мембранной фракции злокачественных и доброкачественных опухолей,' и опухолелодобных поражений костей (в 63% остеогенной саркомы, 54% хондросаркомы, 57% саркомы Юиига, 63% злокачественной фиброзной гистиоцитомы, 57% гигантоклеточной опухоли и 38% опухолеподобных поражений костей).

2. Частота обнаружения РЭФР в злокачественных и доброкачественных опухолях (57г63%) значительно выше, чем в опухолепо-добных поражениях костей (38%). Средние уровни содержания РЭФР

в злокачественных опухолях достоверно выше, чем в доброкачествен-

i

пых, однако, не 'выявлено различий между уровнем РЭФР в злокачественных опухолях и опухолеподобных поражениях костей.

3. В результате исследования параметров с: язывания ЭФР в

I

остеогенной саркому и хондросаркоме обнаружен один тип рецепторов: низкоаффинныё РЭФР с Kd=l,40 нМ и Kd=2,15 нМ, соответственно.

4. Изучение влияния ЭФР на скорость обращения фосфолипи-дов в изолированных клетках опухолей костей показало, что наличие РЭФР на мембране опухолевых клеток является необходимым, но недостаточным условием для чувствительности этих клеток к ЭФР in vitro.

5. (Обнаружены четко выраженные тенденции к повышению частоты экспрессии РЭФР с ростом степени злокачественности остеогенной саркомы и хондросаркомы.

6. Обнаружена обратная зависимость экспрессии от возраста у больных остеогенной саркомой: опухоли больных в пубертатном периоде в 64% наблюдений были охарактеризованы как РЭФР-положительные. 'В постпубертатном периоде РЭФР обнаруживались в единичных случаях. Для больных пи антоклеточной опухолью выявлена прямая зависимость между уровнями и частотой экспрессии РЭФР и возрастом пациентов.

7. При сопоставлении экспрессии РЭФР и рецепторов половых стероидных гормонов обнаружено, что, для остеогенной саркомы, ги-

2 Г

гаитоклеточной опухоли и саркомы Юинга наиболее характерным являются фенотипы РЭФР+РЭ- и РЭФР+РА\ отражающие преимущественно аутокринный характер регуляции этих опухолей. Для опухо-леподобных поражений костей более характерна экспрессия рецепторов половых гормонов в отсутствие РЭФР.

8. При сопоставлении экспрессии РЭФР и РГ в опухолях и опухолеподобных поражениях костей выявлено, что распределение РЭФР и РГ выражает более четкие тенденции к преимущественно ау-токринному типу регуляции в опухолях по сравнению с опухолепо-добными поражениями костей.

9. При исследовании взаимосвязи экспрессии РЭФР со сроками иетастазирования остеогенной саркомы показано, что большинство больных, у которых были выявлены метастазы в различные сроки после лечения (0-24 мес.) имели РЭФР+-первичные опухоли, однако не было выявлено корреляции между этими показателями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kushlinsky N.E., Gershtein E.S., Kostyleva O.I., Radtchenko A.A. Evaluation of epidermal growth factor receptors in human tumors as a possible basis for new treatment modalities. Fifth International Congress on Anti-Cancer Chemotherapy. Abstract. Jan. ,31st - Feb.3rd, 1995. Paris -France. P712, p.278.

2. Костылева О.И., Герштейн E.C., Кушлинский H.E., Алиев МД„ Соловьев Ю.Н. Оценка чувствительности опухолей костей к эпидермальному фактору роста. II Российский Национальный Конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов. 10-15 апреля 1995 г^ Москва, С.200.

3. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е., Костылева О.И., Ермилова В.Д., Ридченко А.А., Летягин В.П. Клинические перспективы исследования содержания рецепторов эпидермального фактора роста в опухолях человека. V Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике. Москва. 24-26 мая 1995 г. Тезисы докладов. Часть 1. М.; 1995.С.67-68.

4.0.Kostyleva, E.Gershtein, E.Tcheremushkit;, M.Aliyev, N. Makretzov, Yu.Solovyev, N.Kushlinsky. Estimation of sensitivity of bone tumors to epidermal growth factor. Scand. J. Clin. & Lab. Invest., 1995, v. 55, Suppl. 223. Proceed, of the Laboratory Medicine'95 11th 1FCC European Congress of Clinical Chemistry, Tampere, Finland, 2-7 July 1995, P-409.

5. Герштейн-E.C., Костылева О.И., Кушлинский H.E. Рецепторы эпидермального фактора роста как потенциальная мишень противоопухолевой терапии. Обзор. Вестник ОНЦ АМН России, 1995, N2, с.51-59.

6. Gershtein Е., Shatskaya V„ Kostyleva О., Ermilova V., Kushlinsky N.. Krasil'nikov M. Comparative analysis of the sensitivity of endometrial cancer cells to epidermal growth factor and steroid hormones. Cancer. -1995. - V. 76., N. 12, - p. 2524-2529.

7. Кушлинский H.E., Костылева О.И., Радченко A.A., Герштейн Е.С., Макрецов Н.А., Алиев М.Д. Рецепторы эпидермального фактора роста, эстрогенов и глюкокортикоидов в первичных опухолях костей. Вестник ОНЦ АМН России, 1996, N 1, с. 20-26.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подп. к печати 96 Заказ 85"

Тираж Л 00 эк