Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Клиническое значение исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга при саркомах у детей

На правах рукописи

Горбунова Татьяна Викторовна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ КОСТНОГО МОЗГА ПРИ САРКОМАХ У ДЕТЕЙ

14.01.12-онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ШВГДОЗ

Москва-2013

005532115

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН)

Директор академик РАН и РАМН Давыдов Михаил Иванович

Научные руководители: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Поляков Владимир Георгиевич

доктор медицинских наук, профессор Тупицын Николай Николаевич

Официальные оппоненты:

Попа Александр Валентинович

Пинегин Борис Владимирович

Доктор медицинских наук, заведующий отделением химиотерапии гемобластозов НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН

Доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции

ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА России

Ведущая научная организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшее профессиональное образование «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « _2013 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.017.01 при ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (115478, г. Москва, Каширское шоссе, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан

« /-К

2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, * /7

доктор медицинских наук, профессор . А /У Юрий Владимирович Шишкин

Актуальность темы.

Саркомы мягких тканей и костей составляют 12% от всех злокачественных опухолей детского возраста. Несмотря на достижения последнего десятилетия в области лечения сарком у детей, прогноз при распространенных стадиях опухолевого процесса остается неблагоприятным и общая выживаемость больных не превышает 25-30%. До сих пор остаются не изученными иммунологические факторы прогноза при солидных опухолях у детей. Особое место в этих исследованиях занимает изучение иммунной системы костного мозга. В последние годы доказано, что костный мозг играет важную роль в канцерогенезе и метастазировании. Иммунные клетки костного мозга могут выполнять защитную противоопухолевую функцию. Показано, что зрелые Т-лимфоциты костного мозга способны сдерживать в течение длительного времени развитие костномозговых метастазов из диссеминированных опухолевых клеток. Напротив, присутствие выраженной пропорции Т-регуляторных клеток (CD4+ CD25+) ассоциируется с развитием метастазов при саркоме Юинга.

Возможности использования клеток костного мозга с лечебной целью при саркомах были впервые продемонстрированы в экспериментальных работах Г.И. Дейчман и соавторов (1982). Введение суспензии клеток нормального костного мозга хомячкам с метастатическими опухолями приводило к уменьшению количества и размера легочных метастазов или к их полной редукции. Дальнейшие исследования проведены на собаках: выявлена регрессия легочных метастазов при введении клеток костного мозга животным при остеосаркоме и увеличение общей выживаемости животных. H.H. Трапезников и соавторы (1993) провели клиническое исследование у 24 больных остеосаркомой, которым после радикальной операции, была выполнена трансфузия суспензии клеток аллогенного костного мозга. Период наблюдения за пациентами составил 8 лет. Более чем у 50% пациентов не выявлено метастазов через 4 года наблюдения. В этих работах сделано предположение, что клетки естественной резистентности играют роль

эффекторов противоопухолевого иммунитета. В последние годы открыта важная роль ТСГ1у8-лимфоцитов, естественных киллерных клеток (МК-клеток), а также некоторых особых субпопуляций лимфоцитов (например, С057+ клеток) в противоопухолевом иммунитете. Анализ этих субпопуляций в костном мозге детей с саркомами мягких тканей и костей не проводился.

В литературе встречаются лишь единичные работы по сравнительной характеристике иммунокомпетентных клеток костного мозга здоровых детей и детей с солидными опухолями. Углубленный анализ лимфоцитарных субпопуляций костного мозга при саркомах у детей представляет несомненно актуальную задачу, так как в перспективе может быть использован для разработки и совершенствования иммунотерапевтических подходов у этих больных.

Цель исследования

Целью работы является изучение клинически значимых особенностей субпопуляционного состава зрелых лимфоцитов костного мозга у детей больных рабдомиосаркомой и опухолями семейства саркомы Юинга (ОССЮ). Задачи исследования

1. Изучение субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток костного мозга у детей с мелкоклеточными опухолями (рабдомиосаркома, семейство опухолей саркомы Юинга) и в группе детей, у которых в ходе комплексного обследования была исключена злокачественная опухоль, - группа сравнения.

2. Сопоставление субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме с результатами, полученными в группе сравнения.

3. Сопоставление субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга при ОССЮ с результатами, полученными в группе сравнения.

4. Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга у детей.

5. Выявление корреляций между уровнями иммунокомпетентных клеток костного мозга при рабдомиосаркоме у детей с Клиническими проявлениями и известными факторами риска при этой опухоли.

6. Выявление корреляций между уровнями иммунокомпетентных клеток костного мозга при ОССЮ у детей с клиническими проявлениями и известными факторами риска.

Научная новизна

Впервые проведен анализ субпопуляций зрелых лимфоцитов костного мозга у детей больных рабдомиомаркомой, опухолями семейства саркомы Юинга, а также у детей, не имеющих онкологической патологии. Установлено, что субпопуляционный состав клеток костного мозга при рабдомиосаркоме у детей отличается от состава этих клеток у детей, не имеющих злокачественных опухолей, повышением уровней активированных Т-цитотоксических клеток (СВЗ+СВ8+НЬА-ОЯ+), повышением процентного содержания зрелых -у5Т-клеток, а также снижением в два раза Т-хелперных клеток (СВ4+), экспрессирующих молекулу адгезии СТ)62Ь (Ьеи8).

В работе впервые показано, что субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга больных опухолями семейства саркомы Юинга отличается от такового у детей, не имеющих онкологической патологии, следующими признаками:

-повышением уровня зрелых Т-цитотоксических лимфоцитов (СОЗ+СВ28+); -снижением уровня зрелых Т-хелперных клеток (С03+С04+); -более низкими уровнями иммунорегуляторного индекса СБ4/С08; -повышением уровня Т-цитотоксических лимфоцитов (СВЗ+С08+НЬА-0Я+); -снижением общего уровня СБ62Ь+ Т-клеток и уровня Т-хелперныхСВ62Ь+ Т-клеток (С03+С04+ С062Ы-);

-повышением уровня СЭЗ+СВ8+СВ57+ лимфоцитов.

Уровни Т-цитотоксических лимфоцитов (СОЗ+СБ8+) являются достоверно более высокими при саркоме Юинга в сравнении с рабдомиосаркомой, напротив, содержание ТСЯу§-лимфоцитов более высокое при рабдомиосаркоме.

Субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга больных рабдомиосаркомой взаимосвязан с факторами прогноза. При распространенных стадиях рабдомиосаркомы по сравнению с локализованными опухолями у детей

выявлено повышение уровня С062Ь-позитивных зрелых Т-лимфоцитов, снижение NK-клеток и у5Т-лимфоцитов. При ОССЮ установлено снижение количества активированных (CD38+) Т-цитотоксических клеток и у5Т-лимфоцитов у пациентов группы высокого риска.

Научно-практическая значимость

Выявлена диагностическая и прогностическая значимость ТС Куб-лимфоцитов при распространенных стадиях рабдомиосаркомы и при поражении осевого скелета ОССЮ у детей, что может служить основанием для привлечения в клиническую практику стимуляторов убТСЯ-лимфоцитов - бисфосфонатов - у пациентов с метастазами рабдомиосаркомы, а также у больных ОССЮ с поражением осевого скелета, независимо от наличия метастазов. Отмечено снижение Т-цитотоксических клеток при нарастании опухолевой массы (более 100 см3) при ОССЮ у детей. Рекомендовано исследование субпопуляций лимфоцитов костного мозга при солидных опухолях у детей с целью оценки и разработки методов иммунокоррекции.

Апробация диссертации

Диссертация апробирована на совместной научной конференции с участием поликлинического отделения, отдела общей онкологии, отдела химиотерапии гемобластозов НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН, группой гемоцитологии клинико-диагностической лаборатории централизованного клинико-лабораторного отдела, лабораторией иммунологии гемопоэза, лабораторией иммунологии опухолей НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 15 марта 2012.

Объем и структура диссертации

Текст диссертации изложен на 120 страницах и состоит из введения, 4 глав, в которых представлены данные литературы, результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами, 6 диаграммами, 5 рисунками и 1 схемой. Список литературы содержит 210 источников, из них 34 отечественных.

б

Содержание работы.

Характеристика больных и методы исследования.

Изучение субпопуляций лимфоцитов костного мозга проведено у 49 детей, проходивших обследование и лечение в НИИ Детской онкологии и гематологии ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН в период с декабря 2005 по февраль 2011 года. У 34 больных подтвержден диагноз злокачественной опухоли (рабдомиосаркома -18, опухоли семейства саркомы Юинга - 16). У 15 детей, проходивших обследование в НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН по поводу подозрения на онкологическую патологию, в ходе комплексного обследования диагноз злокачественной опухоли был исключен. Мы использовали результаты исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга у этих детей (группа сравнения) для сопоставления с результатами, полученными у больных злокачественными опухолями. Средний возраст детей в группе сравнения составил 8,4 года (медиана — 9 лет), диапазон от 1 до 17 лет. В анализируемой группе преобладали мальчики - 11 (73,3%). Причинами обращения родителей с детьми в поликлинику НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН были воспалительные заболевания, доброкачественные опухоли, пороки развития органов и тканей. Всем детям проведено комплексное обследование, включающее визуализирующие и лабораторные методы. В ходе проведенного комплексного обследования диагноз злокачественной опухоли был исключен. Забор костного мозга для морфологического и иммунологического исследований осуществлялся в ходе обследования.

Больным было проведено стандартное общее клиническое обследование, включающее современные методы диагностики онкологических заболеваний. Диагноз во всех случаях был верифицирован на основании морфологического или иммуногистохимического исследования материала первичной опухоли в отделе патологической анатомии опухолей человека (руководитель - профессор А.И. Карселадзе). Всем больным проведено морфологическое исследование костного мозга в группе гемоцитологии детского возраста клинико-диагностической лаборатории (руководитель - д.м.н. И.И. Матвеева).

Иммунологические исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга

Иммунологическое исследование костного мозга проводилось в

лаборатории иммунологии гемопоэза ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН

(руководитель - профессор H.H. Тупицын). Объем костного мозга для

иммунологического исследования, во избежание контаминации

периферической кровью, составлял не более 0,5 мл.

Ядросодержащие клетки костного мозга выделяли путем стандартного

лизиса эритроцитов (использован FACS Lysingsolution, BD). Окраску

лимфоидных популяций костного мозга проводили с использованием широкой

панели моноклональных антител (трехцветная флуоресценция), производитель

BectonDickinson, USA. Панель антител представлена в таблице 1.

Таблица 1

Панель моноклональных антител для изучения субпопуляций лимфоцитов костного мозга у детей

№ пробирки FITC PE PE/Cy5 (PerCP) Примечание

1 IgG2a IgGl IgGl Контроль

2 IgG2a IgGl CD45 Контроль,

3 CD3 CD56 CD45 Т-клетки и NK-клетки

4 CD19 CD5 CD45 В-лимфоциты

5 IgG2a IgGl CD3 Контроль в пределах Т-клеток

6 CD4 CD62L CD3 Т-хелперы, в том числе CD62L

7 CD 8 CD38 CD3 Т-цитотоксические клетки, в том числеС038

8 CD 8 HLA-DR CD3 Т-цитотоксические лимфоциты, в том числе HLA-DR+

9 CD57 CD 8 CD3 Т-цитотоксические лимфоциты, в том числе CD57

10 CD 8 CD28 CD3 Т-цитотоксические лимфоциты, в том числе CD28

11 TCRaß CD25 CD3 TCRap Т-лимфоциты, в том числе CD25

12 TCRyS CD2 CD3 TCRyS Т-лимфоциты

Сбор клеток осуществляли на проточном цитометре БАСБсап (ВБ), последующий анализ проводили с использованием программы WinMDI 2.8.

Определяли проточно-цитометрически процент Т-клеток, В-клеток и ІЧК-клеток среди зрелых лимфоцитов (С045-Н-), рисунок 1 А. Субпопуляции Т-лимфоцитов определяли среди зрелых СБЗ+ Т-клеток, рисунок 1Б.

Рисунок 1А. Рисунок 1Б.

Рисунок 1. А - Гейт зрелых (CD45++) лимфоцитов, в Определение процентного содержания Т (CD3+), В (CD19+), NK-клеток (CD3-CD56+) и С05-позитивных В-лимфоцитов в гейте зрелых лимфоцитов (CD45++). Б - субпопуляции Т-лимфоцитов в гейте СБЗ-позитивных клеток.

По результатам комплексного обследования больные распределились на 3 группы - рабдомиосаркома, опухоли семейства саркомы Юинга; дети, у которых в ходе комплексного обследования диагноз злокачественной опухоли был исключен. Лечение пациентов проведено по международным протоколам и протоколам, утвержденных на ученых советах НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН». Последний пациент включен в исследование 21.02.2011. Анализ результатов лечения проведен на 24.05.2011.

Эффективность лечения оценивалась соответственно стандартным критериям эффективности лечения. Математические расчеты проведены с помощью программы SPSS 15 и включала корреляционный анализ (коэффициент Пирсона), сравнение средних (критерий Стьюдента), и точный критерий Фишера с доверительным интервалом 95%. Различия считались статистически значимыми при р< 0,05 (95% точности).

9

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Рабдомиосаркома. Клиническая характеристика больных и результаты лечения.

В исследование включены 18 детей с рабдомиосаркомой от 1 года до 15 лет, мальчики - 8 (44,4%), девочки - 10 (55,6%), средний возраст - 7 лет. Первичная локализация опухоли: область головы и шеи - 10 (параменингеальная локализация - 8, в т.ч. 4 с интракраниальным ростом; орбита - 1, мягкие ткани лица - 1), малый таз - 4 (предстательная железа - 1), конечности — 2, паравертебральная локализация — 1, не выявлена первичная локализация опухоли - 1. Стадии заболевания в соответствии с классификацией TNM: I - 3 , II - 7, III - 3 и IV - 5 пациентов. Наличие метастазов: в регионарные лимфатические узлы - 7 (38,9%) больных, отдаленные (легкие, костный мозг, мягкие ткани спины) - 5 пациентов (26,6%).

Выбор схемы лечения проводился на основании определения клинической группы и с учетом стандартных критериев включения в протоколы лечения рабдомиосаркомы среднего и низкого риска. По протоколу лечения рабдомиосаркомы среднего риска ДОРМС-Об, утвержденного на ученом совете НИИ ДОГ «ФГБУ РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН 13.12.2006, проведено лечение 11 пациентам. Лечение включает 14 курсов полихимиотерапии (винкристина 1,5 мг/м2, циклофосфамид 2,2 г/м2, дактиномицин 0,045 мг/кг и топотекана 075 мг/м2); хирургическое удаление опухолевого очага после 4 курса химиотерапии и вторую операцию после 8 курса полихимиотерапии (ПХТ) (24 неделя), если у больного по данным обследования имеется резидуальная опухоль; облучение первичного очага после начала 5 курса ПХТ (доза лучевой терапии в зависимости от радикальности проведенного оперативного лечения составила от 30,6 до 50,4 Гр на первичную опухоль и от 40,8Гр до 48,6 Гр на лимфатические узлы шеи).

В протокол лечения рабдомиосаркомы низкого риска (Children's oncology group, фаза III) включены 2 пациента (подгруппа В): 4 курса ПХТ (винкристин 1,5 мг/м2 1-й, 8-й, 15-й дни, дактиномицин 0,045 мг\кг 1-й день и циклофосфамид 1,2 г/м2 1-й день; ЛТ на первичную опухоль в дозе 36 Гр;

12 курсов ПХТ (винкристин 1,5 мг/м2 1-й, 8-й, 15-й дни и дактиномицин 0,045 мг/кг 1-й день). По схеме цикловой интенсивной химиотерапии ССЕ/1СЕ проведено лечение 4 пациентам: 6 курсов ПХТ (ифосфомид 1800 мг/м2 1-5-й дни, карбоплатин 500 мг/м2 5-й день, этопозид 100 мг/ м2 1-5-й дни), оперативное лечение после индукционного курса ПХТ при достаточном сокращении опухоли; лучевая терапия после курса ПХТ, следующего за операцией или по достижения полного сокращения опухоли, после 4-го курса ПХТ, если получен частичный эффект или стабилизация заболевания при нерезектабельной опухоли (доза - 30 Гр при полной регрессии/удалении опухоли и 36 Гр при частичной регрессии), облучение легких в дозе 12 ГР, облучение зон метастатического поражения печени в дозе не более 8 Гр.Результаты лечения детей с рабдомиосаркомой представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты лечения больных рабдомиосаркомой

Результаты* Количество Количество

пациентов, п пациентов, %

Полный эффект 8 44,5

Частичный эффект 5 27,8

Стабилизация 3 16,7

Отказ от лечения 1 5,5

Прогрессирование на лечении 1 5,5

Всего 18 100%

♦Рецидив после окончания лечения наступил у 1 больного, летальный исход

отмечен в 4 случаях.

Опухоли семейства саркомы Юинга (ОССЮ). Клиническая

характеристика больных и результаты лечения.

В исследование включены 16 детей с ОССЮ в возрасте от 2 до 16 лет,

средний возраст 10,5 лет, мальчиков - 11 (68,7%), девочек - 5 (31,2%).

Диагноз ОССЮ устанавливали на основании иммунопатологических и

молекулярно-генетических исследований. Преобладала классическая саркома

Юинга - 12 пациентов (75%), примитивная нейроэктодермальная опухоль

(ПНЭО) выявлена в 3 случаях (18,7%) и опухоль Аскина в 1 случае (6,2%).

11

Локализованная стадия преобладала среди исследуемой группы у 12 пациентов (75%), изолированные метастазы в легкие наблюдались в 2 случаях (12,5%) и сочетание метастатического поражения легких с поражением лимфатических узлов средостения выявлено в 2 наблюдениях (12,5%) - при опухоли Аскина и ПНЭО ребра. Центральное расположение опухоли и поражение конечностей выявлялись одинаково часто - по 8 пациентов. Локализация опухоли в дистальных отделах конечностей наблюдалась у 6 пациентов (37,5%), в проксимальных - у 2 (12,5%). Объем опухоли более 100 см3 выявлен у 4 детей (25%), протяженность поражения опухолью длинной трубчатой кости более 8 см выявлена у 3 детей (18,7%). Наличие внекостного компонента по данным КТ выявлено у 8 пациентов (50%). Распределение пациентов в зависимости от наличия факторов риска показано в таблице 3.

Таблица 3

Распределение больных ОССЮ в зависимости от наличия факторов риска

Факторы риска Количество больных, п %

Метастазы 4 25

Аксиальные опухоли 8 50

Возраст старше 15 лет 4 25

Низкий ответ на индуктивную химиотерапию 4 25

Объем опухоли более 100 см3 или протяженность поражения длинной трубчатой кости более 8 см 7 43,8

Наличие мягкотканого компонента 8 50

Повышение уровня ЛДГ 3 18,8

По протоколу лечения больных группы высокого риска ОССЮ лечение проведено 13 пациентам. На первом этапе лечения проводили 5 курсов ПХТ, чередование блоков А и В. Блок А включает: циклофосфамид 2,1г/м2 1, 2 дни, доксорубицин 75 мг/м2 1-2 дни и винкристин 1,5 мг/м2 1,8, 15 дни. Блок В: ифосфомид 2,4 г/м2 1-5 дни, этопозид 100 мг/м2 1-5 дни. Сбор периферических стволовых клеток и эксфузия костного мозга производили после 2 курсов индукционной химиотерапии при отсутствии поражения костного мозга. При невозможности проведения резекции опухоли пациенты получали

дистанционную лучевую терапию на область первичного очага поражения в режиме гиперфракционирования. Лучевая терапия на метастатические очаги в легких проводилась после 2 курсов ПХТ. Хирургический этап лечения в виде резекции опухолевого очага (при возможности его выполнения) проводили после 3 курса ПХТ. Лечение больных группы стандартного риска ОССЮ проведено 3 пациентам (протокол СЮ-Стандарт - 2000). При возможности радикального удаления первичного опухолевого очага с сохранением функции пораженного органа операция выполнялась на первом этапе лечения. В этом случае ПХТ начинали через 24 часа после проведения оперативного вмешательства. При невозможности проведения операции на первом этапе лечения, ее выполнение должно быть осуществлено после проведения 3 курса ПХТ. При этом очередной 4-ый курс ПХТ начинали через 24 часа после проведения оперативного вмешательства. Все пациенты получали 10 курсов ПХТ в альтернирующем режиме, препаратами циклофосфамид 1,4 г/м2 1-й и 2-й дни, доксорубицин 25 мг/м21-й и 2-й дни, винкристин 1,5 мг/м21, 8, 15 дни и ифосфамид 3,0 г/м2 1-3-й дни, этопозид 150 мг/м2 1-3-й дни. В случае выполнения оперативного вмешательства до начала лечения ЛТ проводится после 1 курса ПХТ, при выполнении операции после 3 курса ЛТ проводится после 4 курса. При радикальном удалении опухоли и/или наличии IV степени лекарственного патоморфоза ЛТ не проводится. В случаях микроскопически определяемой остаточной опухоли после проведенного оперативного вмешательства ЛТ проводится в СОД 30 Гр в режиме стандартного фракционирования (разовая очаговая доза, РОД - 2 Гр).

Лучевая терапия проведена 16 пациентам, при этом суммарная очаговая доза (СОД) соответствовала объему первичной опухоли и подбиралась с учетом группы риска. Крупнопольное облучение легких проведено всем пациентам с метастазами в легкие. Оперативное лечение проведено у 8 (50%) пациентам, у 2 (12,5%) пациентов выполнена радикальная операция на первом этапе лечения. Патоморфоз 4 степени установлен в 4 (25%) случаях, в 2 (12,5%) случаях - 3 степени. Оценка эффективности лечения проводилась в соответствии со

стандартными критериями. Результаты лечения больных ОССЮ представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты лечения больных ОССЮ

Результат Количество Количество

пациентов, п пациентов, %

Полный эффект 11 68,8

Частичный эффект 3 18,8

Стабилизация заболевания 1 6,2

Прогрессия на лечении 1 6,2

Всего 16 100

Летальность, из них 2 12,5

РЕЗУЛЬТАТЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. Субпопуляции лимфоцитов костного мозга детей, не имеющих злокачественных опухолей.

В литературе отсутствует единство мнений относительно нормального содержания различных субпопуляций лимфоцитов в костном мозге ребенка. По этой причине субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга у 15 детей, у которых в ходе комплексного обследования диагноз злокачественной опухоли был исключен, может быть рассмотрен как «группа сравнения», то есть -показатели при отсутствии онкологической патологии. Результаты иммунологического исследования костного мозга этих детей представлены в таблице 5.

В костном мозге детей, не имеющих злокачественной опухоли, преобладают зрелые Т-клетки (в среднем 60,8%) (табл. 5). Количество CD3+ и CD5+ лимфоцитов практически совпадает. Содержание С07-позитивных клеток, изученное у трех детей, не было более высоким (среднее 57,1%), чем количество CD3+ и CD5+ лимфоцитов,, что свидетельствует об отсутствии Т-клеточных предшественников в гейте CD45++ лимфоцитов. Интересно отметить, что наименьшее содержание Т-клеток (по маркерам CD3 и CD5) отмечено у ребенка в возрасте 1 год. Это хорошо согласуется с данными литературы.

Таблица 5

Субпопуляция лимфоцитов костного мозга детей, не имеющих онкологической патологии (группа сравнения)

№ Маркер Количество в % Количество

М±т, пациентов

1 СБЗ 60,8±5,0 15

2 СБЗ+С08+ 50,5±2,4 14*

3 С03+С04+ 39,3±2,8 14*

4 С03+С04+/ С03+С08+ 0,8±0,09 14*

5 С05 59,2±5,4 13*

6 С019 27,8±4,5 15

7 С019+СЭ5+ 14,6±4,2 13*

8 СБ20+ 25,3±3,8 15

9 СОЗ- СЭ56+ 9,4±1,7 12*

10 С03+С056+ 12,6±5,5 13*

11 ТСЯсф 86,4±1,5 13*

12 ТСЯу5 9,2±1,4 И*

13 С08+НЬА-Ш1+ 8,9±1,4 11*

14 СОЗ+НЬА-ОЯ+ 12,2±1,9 13*

15 СБ25+ТСЯаР+ 5,6±1,1 10*

16 С03+СЭ38+ 66,0±7,3 11*

17 СБ8+ СБ38+ 34,6±3,7 10*

18 СБ8+С028+ 49,1±10,3 11*

19 СБЗ+С057+ 16,9±5,6 11*

20 СБ8+СВ57+ 11,6±5,0 10*

21 СБЗ+Ьеи8+ 47,9±7,5 11*

22 СЭ4+ Ьеи8+ 17,6±3,5 10*

♦Примечание: в ряде случаев обследовано менее 15 детей, так как количество клеток костного мозга было недостаточным для изучения всех

маркеров.

Второй по величине субпопуляцией лимфоцитов костного мозга детей являются В-клетки (СБ 19+) - 26,7%. Такой же процент В-клеток определен у четверых обследованных по маркеру СЭ20 детей (25,3±3,8%). Это свидетельствует об отсутствии В-линейных предшественников (С019+СВ20-) в пределах изучаемых зрелых (СБ45++) лимфоцитов костного мозга детей.

Третью по величине популяцию зрелых лимфоцитов костного мозга составляют NK-клетки (CD56+CD3-) - в среднем 9,4%. Сумма средних процентов Т-, В- и NK-клеток в пределах зрелых лимфоцитов равна 96,1%, что свидетельствует о методической правильности проточно-цитометрического обнаружения этих популяций.

Дальнейший анализ субпопуляций Т-лимфоцитов проведен нами в гейте СБЗ-позитивных клеток Изучены Т-хелперные (CD4+) и Т-киллерные (CD8+) лимфоциты, TCRa(3 и TCRyS Т-клетки, активированные лимфоциты (CD25, HLA-DR, CD38), а также некоторые особые субпопуляции - CD57, CD28 как показано на рисунке 2.

А. Б. В.

Рисунок 2 Гетерогенность CD8+ лимфоцитов костного мозга детей по экспрессии антигенов CD57 (А - низкая экспрессия, Б - высокая экспрессия) и CD28 (В). Представлены клетки в гейте CD3+ лимфоцитов.

Субпопуляции лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме у детей.

Сопоставление иммунологических данных у детей при рабдомиосаркоме с показателями в группе сравнения представлено в таблице 6.

Выявлены достоверные различия в уровнях активированных Т-клеток (CD3+HLA-DR+), активированных Т-киллерных клеток (CD3+CD8+HLA-DR+), Т-клеток (CD3), коэкспрессирующих CD4 и Leu8 (CD62L), а также Т-клеток (CD3), имеющих у5Т-клеточные рецепторы.

Различия состояли, в первую очередь, в значимом увеличении при рабдомиосаркоме субпопуляции активированных Т-клеток и Т-цитотоксических клеток, а также в увеличении пропорции зрелых Т-клеток, экспрессирующих на мембране TCRyS.

Таблица 6

Сопоставление субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга детей больных рабдомиосаркомой и у детей без онкологической патологии

№ Маркер Группа сравнения, % M±m Количество пациентов, п Рабдо-миосар кома, %, М±Щ Количество пациентов, п Р

1 CD3 60,8±5,0 15 59,9±4,3 18 0,89

2 CD3+CD8+ 50,5±2,4 14 50,5±3,9 16 0,99

3 CD3+CD4+ 39,3±2,8 14 33,0±2,7 15 0,12

4 CD3+CD4+/ CD3+CD8+ 0,8±0,09 14 0,7±0,09 15 0,39

5 CD5 59,2±5,4 13 62,8±5,1 15 0,63

6 CD19 27,8±4,5 15 21,4±4,4 18 0,4

7 CD19+CD5+ 14,6±4,2 13 8,5±2,4 14 0,17

8 CD20+ 25,3±3,8 15 22,9±6,2 5 0,52

9 CD3- CD56+ 9,4±1,7 12 14,2±3,5 14 0,26

10 CD3+CD56+ 12,6±5,5 13 -8,6±3,3 17 0,19

И TCRaß 86,4±1,5 11 83,1±1,9 11 0,19

12 TCRyS 9,2±1,4 11 15,8±1,6 11 0,007

13 CD8+HLA-DR+ 8,9±1,4 11 28,7±6,1 10 0,004

14 CD3+HLA-DR+ 12,2±1,9 13 37,1±6,3 14 0,001

15 CD25+TCRaß+ 5,6±1,1 10 10,6±2,7 10 0,77

16 CD3+CD38+ 66,0±7,3 11 60,0±7,9 14 0,6

17 CD8+ CD38+ 34,6±3,7 10 46,0±4,8 9 0,08

18 CD8+CD28+ 49,1±10,3 11 17,8±4,9 9 0,32

19 CD3+CD57+ 16,9±5,6 11 19,6±8,3 8 0,78

20 CD8+CD57+ 11,6±5,0 10 12,2±б,2 7 0,94

21 CD3+Leu8+ 47,9±7,5 11 35,5±7,7 11 0,08

22 CD4+ Leu8+ 17,6±3,5 10 13,6±2,5 10 0,015

При рабдомиосаркоме отмечено снижение почти в два раза процентного содержания зрелых Т-клеток, коэкспрессирующих СБ4 (Т-хелперы/индукторы) и адгезионную молекулу СЭ62Ь (Ьеи8). Повышение процента НЬА-ВЯ+ Т-

цитотоксических клеток (в три раза) следует рассматривать как проявление активации клеток иммунной системы костного мозга при рабдомиосаркоме.

Еще один интересный результат связан с установлением факта увеличения субпопуляции ТСЯ у8-позитивных клеток у больных рабдомиосаркомой.

При сопоставлении субпопуляций лимфоцитов костного . мозга с факторами прогноза при рабдомиосаркоме у детей значимые различия отмечены лишь для одной Т-клеточной субпопуляции (Ьеи8, СБ62Ь). Клетки этого типа преобладали при наличии метастазов в регионарные лимфатические узлы - 69,8±8,0 и 35,5±7,7% соответственно, р=0,016. Та же тенденция сохранялась и в отношении СВ4-позитивных Т-клеток, экспрессирующих СБ62Ь: 27,0±9,2% и 13,6±2,5% соответственно, р=0,08. Важно отметить, что Т-лимфоциты костного мозга с маркером Ьеи8 (в особенности, С04-позитивные) были существенно снижены при рабдомиосаркоме при сопоставлении с группой сравнения. Проведенный нами анализ показал, что это обусловлено, в первую очередь, показателями у больных, не имеющих поражения регионарных лимфатических узлов. Не менее интересные данные получены и при анализе отдаленного метастазирования (индекс М). В этом случае значимыми оказались три субпопуляции костномозговых лимфоцитов: 1ЧК-клетки (С056+С03-), ТСЯ ар-лимфоциты и ТСЯ у5-лимфоциты.

Количество ЫК-клеток костного мозга при наличии отдаленных метастазов было значимо более низким - 6,9±1,9% и 18,6±4,8% соответственно, р=0,039. Эти данные могут иметь важное практическое значение, так как позволяют выявить МК-клеточный иммунодефицит при прогрессировании рабдомиосаркомы.

Повышенное содержание уровня у5 Т-клеток, в костном мозге больных при диагностике рабдомиосаркомы в сравнении с аналогичными показателями у детей не имеющих онкологической патологии, по-видимому, отражает компенсаторный механизм иммунитета у больных. При развитии отдаленных метастазов содержание ТСЯ уб-клеток падает: 18.5±1,7% (п=7) и 11,0±1,7% (п=4), р=0,019.

Субпопуляции лимфоцитов костного мозга у детей с опухолями семейства саркомы Юинга.

Сопоставляя результаты исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга при опухолях семейства саркомы Юинга с группой сравнения, не установлено различий в уровнях содержания зрелых Т-клеток, оцениваемых по маркерам CD3 и CD5, а также в уровнях В-лимфоцитов (CD19+). Не было различий и в некоторых популяциях В-клеток (CD19+CD5+) и Т-клеток (CD3+CD56+), а также в уровнях Т-клеток, экспрессирующих ар и у5 Т-клеточные рецепторы. Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга у детей при ОССЮ и в группе сравнения представлена в таблице 7.

Субпопуляционный состав зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) костного мозга больных саркомой Юинга существенно отличался от результатов в группе сравнения значительным повышением пропорции CD8+ цитотоксических лимфоцитов (68,5±3,1% и 50,5±2,4%; р=0,000) и снижением CD4+ Т-хелперных клеток (26,9±3,5% и 39,3±2,8%; р=0,01). Это, в свою очередь, отразилось на вдвое более низких значениях иммунорегуляторного индекса - соотношения CD4/CD8 - у больных саркомой Юинга при сопоставлении с группой сравнения: 0,4±0,08 и 0,8±0,09; р=0,002. Нами детально изучена структура пула Т-цитотоксических клеток костного мозга (CD3+CD8+) у больных саркомой Юинга в сравнении с детьми, не имеющими онкологической патологии, и установлен ряд важных различий. В первую очередь, отмечены более высокие уровни активации Т-клеток (CD3+) и, в частности, Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+), результат получен на основании возрастания более чем в три раза HLA-DR-позитивной фракции (р=0,001). Специфической особенностью Т-цитотоксических лимфоцитов костного мозга больных саркомой Юинга явилось достоверное возрастание в сопоставлении с группой сравнения пропорции CD8+CD38+ клеток среди СБЗ-позитивных лимфоцитов -55,5±4,8% и 34,6±3,7%; р=0,004. Важно отметить, что процент CD38+ клеток

среди всех зрелых лимфоцитов (СОЗ+) не отличался от такового в группе сравнения, то есть отклонения касались лишь СЭв-позитивной субпопуляции.

Таблица 7

Сопоставление субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга детей больных саркомой Юиига и детей, не имеющих злокачественных опухолей

№ Маркер Норма, %, ' М±ш Количество пациентов^ ОССЮ, %, М±ш Количество пациентов,п Р

1 СБЗ 60,8±5,0 15 54,3±4,6 16 0,3

2 СОЗ+СБ8+ 50,5±2,4 14 68,5±3,1 16 0,000

3 СВЗ+СБ4+ 39,3±2,8 14 26,9±3,5 16 0,01

4 СБЗ+СБ4+/ СОЗ+СБ8+ 0,8±0,09 14 0,4±0,08 16 0,002

5 СБ5 59,2±5,4 13 48,7±4,7 14 0,16

6 СБ19 27,8±4,5 15 21,8±3,5 16 0,3

7 СП19+СБ5+ 14,6±4,2 13 13,2±2,4 14 0,78

8 СБ20+ 25,3±3,8 15 11,9 1 -

9 СБЗ- СБ56+ 9,4±1,7 12 18,0±3,7 14 0,049

10 СБЗ+С056+ 12,б±5,5 13 7,5±2,0 15 0,38

11 ТСЯсф 86,4±1,5 13 85,1±2,4 12 0,65

12 ТСЯуЗ 9,2±1,4 11 10,0±1,2 11 0,69

13 С08+НЬА-БК+ 8,9±1,4 11 33,8±5,4 14 0,001

14 СОЗ+НЬА-В11+ 12,2±1,9 13 37,5±6,3 15 0,001

15 СВ25+ТСЯаР+ 5,6±1,1 10 11,0±3,7 12 0,8

16 С03+СБ38+ 66,0±7,3 11 75,0±5,3 15 0,32

17 СБ8+ СБ38+ 34,6±3,7 10 55,5±4,8 14 0,004

18 С08+СБ28+ 49,1±10,3 11 22,4±5,5 14 0,27

19 СБЗ+СБ57+ 16,9±5,6 11 38,4±6,4 14 0,022

20 СВ8+СБ57+ 11,6±5,0 10 25,8±3,7 14 0,03

21 СБЗ+Ьеи8+ 47,9±7,5 11 36,0±7,4 14 0,04

22 С04+ Ьеи8+ 17,6±3,5 10 13,6±2,5 14 0,005

Особого внимания, на наш взгляд, заслуживает увеличение количества СБ 5 7-позитивных Т-клеток (р=0,022) и, в частности, Т-цитоксических (СВЗ+СБ8+) клеток (р=0,028) в костном мозге больных саркомой Юинга в сравнении с нормой. Возрастание количества этих клеток, как правило, ассоциируется с неблагоприятным прогнозом.

У больных саркомой Юинга увеличено процентное содержание ЫК-клеток (СВЗ-СБ56+) среди лимфоцитов костного мозга при сопоставлении с результатами в группе сравнения (18,0±3,7 и 9,4±1,7), различия статистически значимы, р=0,049. Особое значение имеют достоверные различия в функционально значимых субпопуляциях зрелых (СБЗ+) Т-лимфоцитов. Так, снижение уровней экспрессии молекулы адгезии СВ62Ь (Ьеч8) на Т-лимфоцитах костного мозга больных саркомой Юинга при сопоставлении с уровнями в группе сравнения было обусловлено в основном достоверными различиями в субпопуляции С04+С062Ь+ Т-клеток - 13,7±2,4 и 30,5±5,2; р=0,005. Молекула Ь-селектина (СБ62Ь) играет важную роль в хоминге Т-лимфоцитов, и ее снижение при саркоме Юинга может препятствовать проникновению зрелых Т-клеток в периферические лимфоидные органы, а также в костный мозг.

При сопоставлении уровней субпопуляций лимфоцитов костного мозга при ОССЮ с клиническими факторами прогноза мы выявили, что при нарастании объема опухолевой массы (более 100 см3 или протяженности поражения кости более 8 см) отмечалось снижение количества активированных Т-цитотоксических клеток (С03+СБ8+С038+) в сравнении с больными, у которых опухолевая масса была меньшего размера: 41,7+8,2% (п=5) и 63,2±4,3% (п=9), соответственно (р=0,024). Следовательно, повышение уровней активированных Т-цитотоксических клеток при саркоме Юинга можно, вероятно, рассматривать как реакцию на опухоль на ранних стадиях ее роста, а при большом размере опухоли этот показатель снижается.

Интересное наблюдение получено в отношении низких уровней ТСЯуб-клеток костного мозга у больных саркомой Юинга с поражением осевого скелета в сравнении с больными, у которых были поражены конечности: 7,6+0,9% (п=6) и 12,9±1,6% (п=5) соответственно (р=0,016). В целом по группе саркомы Юинга уровни Т-клеток с у5-рецептором не отличались от нормы.

21

Известно, что опухоли семейства саркомы Юинга с локализацией в области осевого скелета имеют менее благоприятный прогноз. При сопоставительном анализе уровней субпопуляций костного мозга при ОССЮ с клиническими признаками мы отметили две субпопуляции. Субпопуляция Т-цитотоксических клеток (С03+С08+С038+) снижалась при увеличении объема опухолевой массы более 100 см3 или нарастании протяженности поражения длиной трубчатой кости более 8 см. Уровень ТС11у5-лимфоцитов был ниже у пациентов с поражением осевого скелета по сравнению с их уровнем при поражении конечностей.

Сравнительный анализ субпопуляций лимфоцитов костного мозга у детей при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга.

Сопоставив уровни субпопуляций лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга у детей, мы выявили, что содержание Т-цитотоксических клеток (СОЗ+, СБ8+) было достоверно более высоким у больных с саркомой Юинга по сравнению с уровнем этих клеток у больных рабдомиосаркомой - 68,5±3,1% (п=16) и 50,5±3,9% (п=16), соответственно 0,001. Наличие на клетках саркомы Юинга выраженной экспрессии молекул НЬА-1 и связывание с ними СБ8+ цитотоксических клеток может объяснять высокий уровень этих клеток в костном мозге.

Уровень ТСЯ у5-лимфоцитов был выше при рабдомиосаркоме - 15,8±1,6%; по сравнению с больными ОССЮ - 10,0±1,2%, р = 0,01. Отсутствие прямого тесного взаимодействия мягкотканой опухоли (рабдомиосаркомы) с клетками костного мозга обуславливает иные иммунологические механизмы взаимодействия организма с опухолью, что, по-видимому, отражает различия в эффекторах противоопухолевого иммунитета при этих заболеваниях. Интересное наблюдение повышения уровня маркеров активации Т-клеток (НЬА-ОЯ) как при рабдомиосаркоме, так и при саркоме Юинга по сравнению с нормой - 37,1±6,3% и 37,5±6,3% против 12,2±1,9% соответственно, р = 0,001. При этом по нашим результатам, отмечено снижение уровня СБЗ+СБ4+ при ОССЮ по сравнению с данными в группе сравнения - 2б,9±3,5% и 39,3±2,8% соответственно, р = 0,01. Так же отмечено, снижение вдвое иммунорегуляторного индекса С04/СБ8 у пациентов с ОССЮ по сравнению с

результатами в группе сравнения - 0,4±0,08 и 0,8±0,09 соответственно, р = 0,002. Результаты сопоставления лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и ОССЮ представлены в таблице 8.

Таблица 8

Сопоставление субпопуляций лимфоцитов костного мозга

при рабдомиосаркоме и ОССЮ

№ Маркер Рабдо-миосар-кома, %, М±ш Количество пациентов, п ОССЮ, %, М±ш Количество пациентов, п Р

1 СБЗ 59,9±4,3 18 54,3±4,6 16 0,38

2 СБЗ+СБ8+ 50,5±3,9 16 68,5±3,1 16 0,001

3 СОЗ+СБ4+ 33,0±2,7 15 26,9±3,5 16 0,18

4 СОЗ+СБ4+/ С03+С08+ 0,7±0,09 15 0,4±0,08 16 0,024

5 С05 62,8±5,1 15 48,7±4,7 14 0,054

6 СШ9 21,4±4,4 18 21,8±3,5 16 0,95

7 С019+СБ5+ 8,5±2,4 14 13,2±2,4 14 0,18

8 СЭ20+ 22,9±6,2 5 11,9 1 -

9 СОЗ- СЭ5б+ 14,2±3,5 14 18,0±3,7 14 0,45

10 СОЗ+СБ56+ 8,6±3,3 17 7,5±2,0 15 0,8

11 ТСЯаР 83,1±1,9 11 85,1±2,4 12 0,54

12 ТСЫуб 15,8±1,6 11 10,0±1,2 11 0,01

13 С08+НЬА-0Ш- 28,7±б,1 10 33,8±5,4 14 0,55

14 СОЗ+НЬА-ОШ- 37,1±6,3 14 37,5±6,3 15 0,96

15 С025+ТСЯаР+ 10,6±2,7 10 11,0±3,7 12 0,9

16 С03+С038+ 60,0±7,9 14 75,0±5,3 15 0,12

17 СЭ8+ СБ38+ 46,0±4,8 9 55,5±4,8 14 0,19

18 СБ8+С028+ 17,8±4,9 9 22,4±5,5 14 0,57

19 СЮЗ+С057+ 19,6±8,3 8 38,4±6,4 14 0,09

20 СБ8+С057+ 12,2±6,2 7 25,8±3,7 14 0,06

21 СОЗ+Ьеи8+ 47,5±7,9 11 36,0±7,4 14 0,28

22 СБ4+ Ьеи8+ 17,6±3,5 10 13,6±2,5 14 0,36

выводы

1. Субпопуляционный состав зрелых (эффекторных) лимфоцитов костного мозга детей, больных мелкоклеточными саркомами (рабдомиооаркомой, опухолями семейства саркомы Юинга), значительно отличается от субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга детей, не имеющих онкологической патологии, по уровням Т-цитотоксических клеток (С03+С08+), ЫК-клеток (С03-С056+) и ТСЯуЗ-клеток.

2. Характерным для субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме у детей при сопоставлении с группой сравнения является:

повышение уровней активированных Т-цитотоксических клеток (С03+С08+НЬА-011+) - 37,1% и 12,2%, р=0,001;

- повышение популяции зрелых у5Т-клеток -15,8% и 9,2%, р=0,007;

- снижение популяции Т-хелперных клеток (СВ4+), экспрессирующих молекулу адгезии СОб2Ь (Ьеи8), - 17,6% и 33,5%, р=0,015.

3. Субпопуляционный состав костного мозга при ОССЮ у детей отличался от значений в группе сравнения:

- повышением уровня зрелых Т-цитотоксических лимфоцитов - 68,5% и 50,5%, р=0,001;

- снижением СБ4+ Т-хелперных клеток - 26,9% и 39,3%, р=0,01;

- более низкими уровнями иммунорегуляторного индексаСВ4/СЭ8;

- снижением уровней С04+С062Ь+ Т-клеток -13,7±2,4 и 30,5±5,2; р=0,005;

повышенными уровнями Т-цитотоксических лимфоцитов СБЗ+ С08+С057+ (р=0,028).

4. На основании проведенного анализа установлены достоверные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов костного мозга между рабдомиосаркомой и ОССЮ у детей. При опухолях семейства саркомы Юинга выявлено преобладание Т-цитотоксических клеток (СБЗ+ СБ8+) -68,5% и 50,5%, р=0,001 и более низкие уровни ТСЯу5-лимфоцитов - 10,0% и 15,8%, р=0,01.

5. У детей с распространенными стадиями рабдомиосаркомы в сравнении с локализованными опухолями выявлено повышение уровня СБ62Ь-

позитивных зрелых Т-лимфоцитов - 69,8% и 35,5% (р=0,016), снижение NK-клеток - 6,9% и 18,6% (р=0,039), и у5Т-лимфоцитов - 11,0% и 18,5% (р=0,019).

6. Анализ уровней субпопуляций лимфоцитов костного мозга у больных, опухолями семейства саркомы Юинга показал снижение уровней активированных (CD38+) Т-цитотоксических лимфоцитов костного мозга -41,7% и 63,2% (р=0,024) и уровней у5Т-лимфоцитов 7,6% и 12,9% (р=0,016) у пациентов из группы высокого риска (объем опухолевой массы более 100 см3, поражение осевого скелета).

Статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ:

1. Горбунова, Т.В. Критерии иммунологической нормы субпопуляций лимфоцитов костного мозга у детей / Т.В. Горбунова, В.Г. Поляков, Т.В. Шведова, И.Н. Серебрякова, В.В. Тимошенко, H.H. Тупицын // Детская онкология.—2011.—№1. — С. 33-36.

2. Горбунова, Т.В. Клиническое значение исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме у детей / Т.В. Горбунова, В.Г. Поляков, Т.В. Шведова, И.Н. Серебрякова, В.В. Тимошенко,

H.H. Тупицын // Детская онкология. — 2012. —№ 1-2. — С. 3-10.

3. Горбунова, Т.В. Сравнительный анализ субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга у детей при мелкоклеточных опухолях / Т.В. Горбунова, В.Г. Поляков, Т.В. Шведова, И.Н. Серебрякова, В.В. Тимошенко, H.H. Тупицын // Иммунология. — 2012. — № 1. — С. 37-44.

Тезисы научных конференций:

I. Горбунова, Т.В. Особенности субпопуляций лимфоцитов костного мозга при мелкоклеточных саркомах у детей // Т.В. Горбунова, В.Г. Поляков, Т.В. Шведова, И.Н. Серебрякова, В.В. Тимошенко, H.H. Тупицын// Онкология и радиология Казахстана. — 2010. — №3-4 (16-17). — С. 145.

2. Горбунова, Т.В. Соотношение субпопуляций лимфоцитов в костном мозге при мелкоклеточных саркомах у детей: Сборник тезисов I научно-практической конференции детских онкологов Северо-Западного региона России

«Инновационные технологии в детской онкологии: достижения и перспективы развития» Санкт-Петербург, 2011. / Т.В. Горбунова, В.Г. Поляков, Т.В. Шведова, И.Н. Серебрякова, В.В. Тимошенко, Н.Н. Тупицын. — С.-Пб., 2011, —С. 101-102.

3. Gorbunova, Tatiana. Criteria norm of immunology in subpopulation lymphocytes of the bone marrow at children / Gorbunova Tatiana, Polyacov Vladimir, Serebraycova Irina, Shvedova Tamara, Timoshenko Valentina, Tupitsyn Nicolai // Abstract. Pediatric blood &cancer. — 2011. — Vol. 57. — P. 883.

4. Gorbunova, Tatiana. The relationship of lymphocyte in bone marrow at presentation in pediatric small round cell tumor / Gorbunova Tatiana, Polyacov Vladimir, Serebraycova Irina, Shvedova Tamara, Timoshenko Valentina, Tupitsyn Nicolai. // Abstract. Pediatric blood &cancer. — 2011. — Vol. 57. — P.793.

Подписано в печать 30.05.13. Формат 60x84/16. Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 356. Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва. Кашипское шоссе, 24