Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка методики определения кортизола и 6-бета-гидроксикортизола в моче с целью установления активности изофермента CYP 3A4
- Ученая степень
- кандидата фармацевтических наук
- ВАК РФ
- 14.04.02
Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка методики определения кортизола и 6-бета-гидроксикортизола в моче с целью установления активности изофермента CYP 3A4
СМИРНОВ Валерий Валерьевич
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОРТИЗОЛА И 6-0-ГИДРОКСИКОРТИЗОЛА В МОЧЕ С ЦЕЛЬЮ УСТАНОВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИЗОФЕРМЕНТА СУР ЗА4
14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
1 7 ШР 2011
Москва-2011
4840461
Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет имени ИМСеченова
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук, профессор
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук профессор
доктор медицинских наук, профессор
Раменская Галина Владиславовна
Чистяков Виктор Владимирович
Жердев Владимир Павлович
Ведущая организация:
ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ».
Защита состоится «2/ » ЛЛ^ТК 2011 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Первом Московском Государственном Медицинском Университете имени И.М.Сеченова по адресу: 119992, Москва, Трубецкая, дом 8.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной Медицинской Библиотеке Первого ПМГМУ имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49. п
Автореферат разослан « 2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор ' Наталья Петровна Садчикова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
На сегодняшний день одной из основных проблем, стоящей перед медициной остается оптимизация фармакотерапии. Эта проблема решается путем разработки и внедрения методов и технологий, повышающих эффективность и безопасность терапии лекарственными средствами.
Экспериментальные данные, полученные в различных исследованиях, показали, что одним из основных фармакокинегических процессов, определяющих индивидуальный фармакологический ответ, является метаболизм, или биотрансформация лекарственных средств [Кукес В.Г. и соавт.,2007].
Изучение различных факторов, влияющих на метаболизм лекарственных средств, помогает повысить эффективность проводимой терапии и избежать развития нежелательных лекарственных реакций. Так, на метаболизм лекарственных средств могут влиять пол, возраст, изменение функционального состояния органов метаболизма (печень, кишечник, почки), качественный и количественный состав пищевого рациона [Сычев Д.А. и соавт., 2007]. Кроме того, фармакокинети-ческое взаимодействие лекарственных средств на уровне метаболизма является, пожалуй, наиболее клинически значимым. Велико значение генетических полиморфизмов ферментов метаболизма лекарственных средств в формировании индивидуального фармакологического ответа.
Изофермент цитохрома Р450 (СУР) ЗА4 участвует в метаболизме большого количества лекарственных средств (около 60% всех применяемых в настоящее время лекарственных средств). Он катализирует несинтетическую стадию биотрансформации. При этом под действием СУР ЗА4 лекарственные средства превращаются в более гидрофильные, чем нативные вещества, метаболиты, в результате чего скорость выведения почками данных соединений возрастает. В большинстве случаев, помимо увеличения скорости выведения, в процессе метаболизма так же теряется фармакологическая активность. Однако некоторые лекарственные вещества, так называемые пролекарства, изначально обладают меньшей фармакологической активностью, и только под влиянием СУР ЗА4 пре-
вращаются в активные метаболиты, которые и вызывают фармакологические эффекты. Кроме того, CYP ЗА4 участвует в биотрансформации не только введенных из вне лекарственных средств, но и эндогенных соединений — таких, как стероидаые гормоны, метаболиты витамина D и др.
Некоторые вещества влияют на изофермент CYP ЗА4, ингибируя или индуцируя его активность. Индукция ведет к ускорению метаболизма ЛС и, как правило, к увеличению скорости выведения вещества и снижению его фармакологической активности. Ингибирование же наоборот, снижает активность ферментов и повышает концентрацию ЛС в крови.
Определение активности изофермента CYP 3Â4 является важной задачей для рациональной фармакотерапии, особенно при одновременном назначении нескольких препаратов. Так, например, индукторы или ингибиторы изофермента CYP ЗА4 при совместном приеме с субстратом данного изофермента будут изменять фармакокинетические характеристики этого субстрата [Amber Huis, 2007].
Активность CYP ЗА4 в организме человека можно определить по концентрации в крови метаболита (возможно, и в других биологических жидкостях), который образуется из введенного ранее лекарственного средства, причем этот метаболит должен образовываться исключительно под действием CYP ЗА4. Такие лекарственные средства называют маркерными субстратами. В настоящее время для оценки активности CYP ЗА4 в научных целях используется несколько маркерных субстратов: эритромицин, лидокаин, нифидипин, дапсон и мидозалам.
Даш rue тесты обладают рядом выраженных недостатков, таких как необходимость внутривенного введения препаратов, применение которых сопряжено с риском развития HJIP и, прежде всего — аллергических реакций и аритмоген-ных эффектов; необходимость, как минимум, двукратного забора крови из вены; тестирование может проводиться только в условиях лечебно-профилактического учреждения; Например, MEGX может образовываться из лидокаина под влиянием не только CYP ЗА4, но и CYP1А2, а значит, данный тест отражает суммарную активность этих 2 изоферментов цитохрома Р450.
В связи с этим более перспективны, методы оценки активности CYP ЗА4 по концентрации в биологических жидкостях эндогенных метаболитов, которые
образуются только под действием СУР ЗА4, что исключает необходимость введения какого-либо лекарственного средства, а значит, делает метод на 100% безопасным для больного.
Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.
Цель исследовании.
Разработать методику количественного определения кортизола и 6-0-гидроксикортазола в моче, позволяющую оценивать активность СУР ЗА4.
Задачи исследования.
1. Провести информационно-аналитический анализ существующих методик определения активности СУР ЗА4.
2. Подобрать оптимальные условия количественного определения 6-0-гидроксикортизола и кортазола в моче методом ЬС-МЗ.
3. Провести валидацию разработанной методики.
4. Изучить активность СУР ЗА4 у пациентов с помощью разработанной методики.
5. Изучить изменение активности СУР ЗА4 у пациентов при приеме индукторов и ингибиторов активности данного изофермента.
6. Сделать вывод о возможности использования данной методики для определения изменений активности при приеме индукторов и ингибиторов активности СУР ЗА4.
Научная новизна.
В работе впервые разработана чувствительная и воспроизводимая методика оценки активности СУР ЗА4 с помощью отношения концентраций 6-0-гидроксикортизола и кортизола в моче методом ЬС-МБ. Данная методика позволяет определил, активность СУР ЗА4 по концентрации в биологических жидкостях эндогенных соединений, что исключает необходимость введения какого-либо лекарственного средства, а значит, делает метод на 100% безопасным для больного. Существующие на сегодняшний момент методики определения активности СУР ЗА4 в основном подразумевают введите экзогенных веществ.
Практическое применение и внедрение результатов в практику.
Разработанная методика количественного определения кортизола и его метаболита в моче методом ЬС/МБ может быть использована для определения изменения активности изофермента СУР ЗА4 в процессе лечения, что позволит корректировать дозу препарата и повысить эффективность и безопасность фармакотерапии. Данная методика внедрена для определения активности изофермента СУР ЗА4 в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН (акт внедрения от 11.05.2010) и Институте Клинической Фармакологии ФГУ «НЦ ЭСМП» (акт внедрения от 26.05,2010).
Положения, выносимые па защиту.
1. Условия количественного анализа кортизола и его метаболита в моче методом ЬС/МБ.
2. Использование разработанной методики определения активности изофермента СУР ЗА4 возможно, в силу того, что данная методика показала высокую эффективность, точность и воспроизводимость.
3. Разработанная методика определения активности изофермента СУР ЗА4 является наиболее безопасной для пациента из всех существующий альтернативных методик на сегодняшний день.
Апробация работы.
Апробация работы проведена на научно-практическом заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова 26.08.2010 г.
Основные результаты работы доложены и обсуждены на межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (Санкт-Петербург, 2009 г.), международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (Шыкмент, 2009 г.), научно-практической конференции с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009 г.), международном конгрессе Европейского Общества Клинических Фармакологов и Терапевтов (ЕАСРТ) (Эдинбург, 2009 г.), международном конгрессе \¥огИРЬагта 2010 (Копенгаген, 2010 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом.
Диссертационная работа является частью исследований, которые разрабатываются на кафедре фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, номер Государственной регистрации - 01.2.006 06352.
Публикации:
По результатам диссертационного исследования опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 3 публикации в зарубежных изданиях.
Объем н структура диссертации:
Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», выводов и списка литературы из 98 источников (70 из которых зарубежные).
Результаты эксперимента, обобщены в таблицах, проиллюстрированы рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Подбор условий экстракции кортизола и 6-р-гидроксикортизола из мочи и последующее хроматографическое исследование этих соединений выполнялись на основании анализа данных по их физико-химическим свойствам (кислотность, коэффициент распределения, растворимость и др.). Для разработки методики количественного определения кортизола и 6-|3-гидроксикортизола был выбран метод LC/MS.
1.Аппаратура.
• LC/MS Agilent 1200 series:
• насос высокого давления - градиентный Agilent 1200, смешивающий 4 компонента подвижной фазы;
• резервуары с растворителями (х4) объёмом по 1 л;
• инжектор с автосемплером;
• хроматографическая колонтка Agilent XDB-С 18 (4,6x50 мм; 1,8 мкм);
• UV-Vis Спектрофотометр Agilent;
• масс-детектор Agilent 6140 квадруполь;
• ЭВМ с ПО - Chemstaition vi.
• рН-метр «MetroHm 744» (Швейцария);
• водяная баня;
• роторный вакуумный испаритель;
• магнитная мешалка;
• вихревая мешалка Vortex;
• шейкер;
• центрифуга; 2. Реактивы
В работе использовались следующие реактивы: вода деионизированная, кислота муравьиная, этанол 96%, ацетонитрил, этидадетат, изопропанол.
Образцы субстанций кортизола и 6-р-гидроксикортизола фирмы Sigma-Aldrich - Кортизол {>98%, для ВЭЖХ) и 6-§-гидроксикортизол (>98%, для ВЭЖХ). Структурные формулы представлены на рисунках 1,2.
Рисунок 1. Структурная формула кортизола.
он
о
С21Нзо06
М.м.378,46
Рисунок 2. Структурная формула 6-Р-гидроксикортизола.
3. Оценка активности СУР ЗА4.
В качестве объекта исследования была выбрана моча. Исходя из фармако-кинетики определяемых эндогенных соединений, была использована утренняя моча. Так как кортизол является гормоном стресса, то его наивысшая концентрация достигается в утренние часы. Необходимо время для того, чтобы кортизол, биотрансформировался до 6-Р-гидроксикортизола и вывелся почками, поэтому первую порцию утренней мочи выливали, а все последующие в течение 8 часов собирали в одну емкость. Затем объем мочи измеряли и аликвоту (около 10 мл) переносили в пластмассовую пробирку. Допускалось замораживание мочи до анализа при -18°С.
Для разработки методики ЬС-МБ определения кортизола и 6-0-гидроксикортизола была выбрана моча пациентов. Для испытания не подходила моча пациентов с заболеваниями почек, сопровождающимися полнурией, олигу-рией или анурией. А так же моча пациентов с заболеванием надпочечников и нарушением гормональной регуляции и моча поциентов, которые принимали глю-кокортикостероиды.
Для возможности сделать вывод о зависимости активности изофермента СУР ЗА4 от отношению кортизола и 6-р-гидроксикортизола, моча у пациентов отбиралась два раза. Сначала до применения ингибитора или индуктора активности изофермента СУР ЗА4, а потом спустя неделю после начала систематического приема индуктора или ингибитора изофермента СУР ЗА4. В качестве индук-
тора применялась настойка зверобоя (Hypericum perforatum), а в качестве ингибитора - грейпфрутовый сок.
4. Обработка полученных результатов.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью t-теста Стыодента (доверительный интервал 0,95), используя пакет Microsoft Office Excel 2007. Валидация методики приведена далее.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Разработка методики определения отношения кортизола и 6-р-гидроксикортизола в моче.
Разработка определения кортизола и ô-fi-гидроксикортизола в растворах с помощью LC-MS.
В качестве метода определения был выбран метод обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с тавдемными УФ- и масс-детекторами, как один из наиболее чувствительных и специфичных.
Методика.
Определение проводили на приборе «Agilent 1200» с программным обеспечением ChemStation v.l .0.
Стандартный раствор. Стандартный раствор представлял собой спиртовой раствор кортизола и 6-Р-гидроксикортизола с концентрацией кортизола в растворе 10 мкг/мл, и 6-Р-гидроксикортизола - 1 мкг/мл. 1,5 мл стандартного раствора вносили во флакон для автосемплера на 2 мл. Закрывали крышкой, и помещали в автосемплер.
Объем вкола: 50 мкл.
Колонка: Agilent XDB-C18 4,6x50 мм; 1,8 мкм.
Подвижная фаза: вода, подкисленная НСООН (1мл муравьиной кислоты на 1 л воды, рН = 4,5)/ацетоншрил (55/45).
Скорость потока: 1,0 мл/мин.
Детектирование :
• УФ-детектор: при длине волны 246 нм.
10
• Масс-селективный детектор:
- Режим анализа: SCAN в пределах от 300 - 400 m/z
- Полярность: негативная
- Тип ионизации: MM-ES + APCI.
Так как мы определяем одновременно два вещества, поэтому мы не можем использовать SIM режим, что уменьшает селективность метода, но делает его более универсальным.
Идентификация кортшола и 6-§-гидроксикортизола\ времена удерживания главных пиков на хроматограмме, полученной от УФ-детекора следующие:
время удерживания кортизола: около 2,5 мин.
время удерживания 6-ß-гидроксикортизола: около 4,5 мин.
Относительное время удерживания б-^-гидроксикортизол/ кортизола: около 1,81
Этим же пикам на хроматограмме, полученной от масс-селективного детектора, главным пикам с вышеуказанными временами удерживания соответствовали характерные масс-спектры. Образец хроматограммы представлен на рисунке 3.
Пригодность хроматографической системы.
Пригодность хроматографической системы рассчитывали по хроматограмме, полученной от масс-детектора.
Эффективность колонки:
• эффективность колонки, рассчитанная по пику кортшола составила 15000;
• эффективность колонки, рассчитанная по пику 6-ß-гидроксикортизола составила 7800.
Коэффициент разрешения: разрешение пиков кортизола и 6-ß-гидроксикортизола было больше 1,5.
Фактор асимметрии:
• фактор асимметрии пика кортизона составил 1,05;
• фактор асимметрии пика б-р-гидроксикортизола составил 0,98.
ЛД/УО! А пт
№01 ТЮ.ШВ+Л'е!,Ш. ЙЯ1
4030000 ЗЯ)00001
зоооооо
2500000 Н 2000000 Н 1500000 1 1000000 \ 500000 \
Рисунок 3. Образец хроматограммы (А -УФ-детекторирование, Б - масс-детекгарование)
Построение калибровочной кривой.
Приготовление калибровочных растворов.
В пять отдельных флаконов переносили 0,1 мл, 0,3 мл, 0,5 мл, 0,7 мл и 1,0 мл стандартного раствора кортизола и 6-Р-гидроксикортизола (концентрация кортизона в растворе 10 мкг/мл, концентрация 6-р-гидроксикортизола-1 мкг/мл), и прибавляли 9,9 мл, 9,7 мл, 9,5 мл, 9,3 мл и 9,0 мл воды деионизи-рованной во флаконы соответственно. Интенсивно встряхивали. Концентрации кортизола и 6-Р-гидроксикортизола в полученных растворах приведены в таблице 1.
Таблица 1
Концентрация кортизола и 6-(3-гидроксикортазола в калибровочных
растворах
Номер раствора Концентрация кортизола, Концентрация б-Р-
нг/мл гидроксикортизола,
нг/мл
1 100 10
2 300 30
3 500 50
4 700 70
5 1000 100
Построение качибровочной кривой.
Хроматографировали все полученные растворы в приведенных выше условиях. Записывали площади пиков кортизола и б-Р-гидроксикортизола, и строили две калибровочные кривые в системе координат зависимости концентрации от площади пика кортизола или 6-Р-гидроксикортизола.
Калибровочная кривая кортизола имела следующие характеристики: коэффициент корреляции (г) = 0,99998; уравнение прямой: у = 24,72579934х - 0,01298
Калибровочная кривая б-Р-гидроксикортизола имела следующие характеристики:
коэффициент коррелящш (г) = 0,99949;
уравнение прямой: у = 35,40994х-1,41
Методика пробоподготовки мочи для анализа.
Приготовление экстрагента.
В результате серии экспериментов наиболее оптимальным экстраген-том была признана смесь этилацетата и изопропанола в соотношении 85:15. В подходящую колбу отмеряли 85 мл этилацетата и 15 мл изопропанола. Закрывали пробкой и встряхивали в течение 5 минут.
Процедура экстракции.
2 мл исследуемой мочи пипеткой переносили в полипропиленовую пробирку. В эту же пробирку пипеткой переносили 4 мл экстрагента. Встряхивали в течение 10 минут на шейкере, для полноты экстракции, так, чтобы не образовывалась эмульсия. Затем центрифугировали в течение 5 минут при скорости 3000 об/мин. Помещали пробирку в морозильную камеру с температурой -18° С. Спустя 15 минут пробирку вынимали и немедленно отделяли органический слой от замерзшего водного, переливая его в чистую полипропиленовую пробирку, которую сразу плотно закрывали пробкой. Водный слой выстаивали до комнатной температуры. Повторно проводили ту же самую процедуру. Органические слои объединяли. Объединенный органический слой точно и аккуратно переносили в стеклянную колбу для упаривания, помещали ее на водяную баню при температуре 40° С, и при помощи роторного вакуумного испарителя выпаривали органический слой досуха. В колбу для выпаривания вносили 750 мкл фильтрованного 96% этилового спирта. Колбу закрывали притертой пробкой. Взбалтывали колбу на вихревой мешалке Vortex в течение 1 минуты. Прибавляли в колбу еще 750 мкл фильтрованного 96% этилового спирта. Колбу закрывали притертой пробкой, и опять взбалтывали колбу на вихревой мешалке Vortex в течение 1 минуты. Переносили содержи-
мое колбы для упаривания во флакон на 2,5 мл для автосемплера. Закрывали флакон пробкой. Взбалтывали флакон на вихревой мешалке Vortex в течение 30 секунд. Помещали флакон в автосемплер.
Оценка полноты экстракции.
Для того чтобы оценить полноту экстракции из мочи кортизола и б-(3-гидроксикортизола добавляли к моче не содержащей кортизол и б-[3-гидроксикортизол известное количество стандартного раствора кортизола и 6-Р-гидроксикортизола, проводили экстракцию и хроматографировали, как описано выше. Полученные значения площади под кривой соотносили со значениями площадей растворов аналогичных концентраций.
Процедура оценки полноты экстракции при пробоподготовке.
В 3 отдельные полипропиленовые пробирки помещали 100 мкл, 500 мкл и 1000 мкл стандартного раствора кортизола и 6-р-гидроксикортизола (концентрация кортизола в растворе 10 мкг/мл, концентрация б-Р-гидроксикортизола - 1 мкг/мл). Переносили в эти пробирки мочу, не содержащую кортизол и 6-Р-гидроксикортизол.
Концентрации кортизола и б-Р-гидроксикортизола в полученных растворах приведены в таблице 2. Экстракцию определяемых соединений проводили , как описано выше (см. Процедура экстракции).
Таблица 2
Концентрация кортизола и б-Р-гидроксикортизола в моче для определения
эффективности экстракции
Номер раствора Концентрация кортизола, Концентрация 6-Р-
нг/мл гидроксикортизола,
нг/мл
1 100 10
2 500 50
3 1000 100
После расчета и усреднения значений было получено, что процент экстракции кортизола равен 83%, а процент экстракции 6-Р-гидроксикортизола равен 79%. Полученные значения процента экстракции подходят для использования данного метода в качестве пробоподготовки.
Метод количественного определения кортизола и 6-Р-гидроксикортизола в моче.
В качестве метода количественного определения был выбран метод абсолютной калибровки. Так как мы определяем одновременно два вещества, и больше всего нас интересует отношение их количеств, то введение внутреннего стандарта нецелесообразно, как утяжеляющее методику.
Приготовление калибровочных растворов.
В 9 различных пробирок помещали 0 мкл, 50 мкл, 100 мкл, ЗООмкл, 500 мкл, 700 мкл, 1000 мкл, 2500 мкл, 5000 мкл стандартного раствора кортизола и 6-Р-гидроксикортизола (концентрация кортизола в растворе 10 мкг/мл, концентрация 6-Р-гидроксикортизола - 1 мкг/мл). Так как моча обычно содержит какое-либо количество эндогенных кортизола и 6-Р-гидроксикортизола, то ее использование для разбавления образцов недопустимо. Поэтому использовали образцы мочи, не содержащие кортизол и 6-р-гидроксикортизол. Переносили в эти пробирки мочу, не содержащую кортизол и 6-Р-гидроксикортизол, так, чтобы объем содержимого каждой пробирки равнялся 10 мл.
Концентрации кортизола и 6-Р-гидроксикортизола в полученных образцах приведены в таблице 3.
Отбирали из каждой пробирки аликвоту по 2 мл, и проводили экстракцию, как описано выше (см. Процедура экстракции). После проведения экстракции, хроматографировали, как описано выше.
На полученных хроматограммах отмечали площади пиков кортизола и 6-Р-гидроксикортизола. Строили две калибровочные кривые в системе координат зависимости концентрации от площади пика кортизола или 6-Р-гидроксикортизола.
Таблица 3
Концентрация кортизола и 6-Р-гидроксикортизола в калибровочных образцах
Номер раствора Концентрация кортизола, Концентрация 6-Р-
иг/мл гидроксикортизола,
иг/мл
1 0 0
2 50 5
3 100 10
4 300 30
5 500 50
6 700 70
7 1000 100
8 2500 250
9 5000 500
Калибровочная кривая кортизола имела следующие характеристики: коэффициент корреляции (г) = 0,99982; уравнение прямой: у = 1,6736 х - 0,0263
Калибровочная кривая 6-(3-гидроксикортизола имела следующие характеристики:
коэффициент корреляции (г) = 0,99579; уравнение прямой: у = 0,927467х- 1,367 Пригодность хршатографической системы. Эффективность колонки:
• эффективность колошей, рассчитанная по пику кортизола составила 8700;
• эффективность колонки, рассчитанная по пику б-Р-гидроксикортизола составила 7300.
Коэффициент разрешения между пиками кортизола и 6-Р-гидроксикортизола бьш болыне 1,5.
Фактор асимметрии:
• фактор асимметрии пика кортизола равнялся 1,07;
• фактор асимметрии пика б-Р-гидроксикортизола равнялся 0,95.
Валндация методики определения кортизола и 6-р-
гидроксикортнзола в моче.
Разработанная методика была валидирована по показателям линейности, специфичности, прецизионности и воспроизводимости. Так же был рассчитан предел обнаружения и предел количественного определения, как для кортизола, так и для 6-р-гидроксикортизола.
Предел обнаружения.
Для определения предела обнаружения готовили следующие образцы.
Для кортизола: готовили серию разведений стандартного раствора кортизола в моче, не содержащей кортизол и б-Р-гидроксикортизол. Далее проводили экстракцию и хроматографическое определение (см.выше). Предел обнаружения кортизола составил 0,1 иг/мл мочи.
Для 6-р-гидроксикортизола: готовили серию разведений стандартного раствора 6-р-гидроксикортизола в моче, не содержащей кортизол и 6-Р-гидроксикортизол. Далее проводили экстракцию и хроматографическое определение (см.выше). Предел обнаружения б-Р-гидроксикортизола составил 0,5 нг/мл мочи.
Предел количественного определения.
Аналогичным образом для определения предела количественного определения готовили образцы мочи с содержанием кортизола и 6-Р-гидроксикортизола (см.Предел обнаружения).
Минимальная концентрация кортизола в моче, которую было возможно количественно определить по калибровочной кривой, составила 1 нг/мл мочи.
Минимальная концентрация 6-Р-гидроксикортизола п моче, которую было возможно количественно определить по калибровочной кривой, составила 5 нг/мл мочи.
Линейность метода.
Для установлещш диапазона концентраций кортизола и 6-р-гидроксикортизола в моче, в которых зависимость их концентрации от площади хроматографических пиков носит линейный характер, были приготовлены следующие растворы.
Для кортизола: помещали 1 мл стандартного раствора кортизола (концентрация кортизола 1 мг/мл) в мерную колбу на 10 мл и доводили до объема фильтрованным 96% этиловым спиртом. Взбалтывали. В 7 пробирок помещали 0 мкл, 10 мкл, ЮОмкл, 500 мкл, 1000 мкл, 2500 мкл, 5000 мкл полученного раствора.
Концентрации кортизола в полученных растворах приведены в таблице 4.
Таблица 4
Концентрация кортизола в калибровочных растворах
Номер раствора Концентрация кортизола,
нг/мл
1 0
2 10
3 100
4 500
5 1000
6 2500
7 5000
Отбирали из каждой пробирки аликвоту, и проводили экстракцию, как описано выше (см. Процедура экстракции). После проведения экстракции, хроматографировали в тех же условиях, в которых проводят количественное
определение. После этого строили калибровочную прямую, и записывали ее характеристики:
коэффициент корреляции (г) = 0,99946 (он больше 0,99, а значит, между анализируемыми величинами имеется прямо пропорциональная зависимость);
уравнение прямой: у = 6,666272х - 0,01298.
Линейность зависимости концентраций была доказана в диапазоне от 10 нг/мл до 5 мкг/мл.
Для 6-р-гидроксикортизола: помещали 1 мл стандартного раствора 6-Р-гидроксикортизола (концентрация 6-Р-гидроксикортизола 0,1 мг/мл) в мерную колбу на 10 мл и доводили до объема фильтрованным 96% этиловым спиртом. Взбалтывали. В 7 пробирок помещали 0 мкл, 10 мкл, ШОмкл, 500 мкл, 1000 мкл, 2500 мкл, 5000 мкл полученного раствора.
Концентрации 6-Р-гидроксикортизола в полученных растворах приведены в таблице 5.
Таблица 5
Концентрация 6-Р-гидроксикортизола в калибровочных растворах
Номер раствора Концентрация кортизола,
нг/мл
1 0
2 1
3 10
4 50
5 100
6 250
7 500
Отбирали из каждой пробирки аликвоту, и проводили экстракцию, как описано выше (см. Прщедура экстракции). После проведения экстракции, хроматографировали в тех же условиях, в которых проводили количественное
определение. После этого строили калибровочную прямую, и записывали ее характеристики:
коэффициент корреляции: (г) = 0,997775
(он больше 0,99, а значит, между анализируемыми величинами имеется прямо пропорциональная зависимость);
уравнение прямой: у = 0,611729х - 0,075.
Линейность зависимости концентраций была доказана в диапазоне от 1 нг/мл до 0,5 мкг/мл.
Специфичность определения.
У пиков кортизола и 6-Р-гидроксикортизола в определяемых образцах не имелось наслоений другими субстанциями. По времени удерживания пики из исследуемых образцов совпадали с пиками стандартного раствора.
Каждому пику на хроматограмме, полученной от УФ детектора, соответствовал пик, на хроматограмме, полученной от масс-детектора. Причем масс-спектры были специфичны для кортизола и 6-Р-гидроксикортизола.
Прецизионность.
Один и тот же образец с известной концентрацией кортизола и 6-Р-гидроксикортизола анализировали 6 раз подряд в одних и тех же. условиях. Полученные результаты отношения концентраций кортизола и 6-Р-гидроксикортизола имели коэффициент вариации 1,07100.
Воспроизводимост ь.
Образец подвергали повторным исследованиям в разные дни и разными специалистами. Проводили по три измерения. Полученные результаты имели коэффициент вариации 0,90568.
Зависимость активности изофермснта СУР ЗА4 и шменеиня отношения кортизола и 6-р-гидроксикортизола в моче.
Для установления зависимости активности изофермента СУР ЗА4 от отношения концентраций эндогенных кортизола и 6-|3-гидроксикортизола в моче проводили серию измерений данного отношения, в динамике при приеме
известного индуктора (настойка зверобоя) или ингибитора (грейпфрутовый сок) изофермента СУР ЗА4.
Пациенты были разбиты на 3 группы по 24 человека. У каждой группы отбиралась моча, и в ней определялось отношение кортизола и 6-Р-гидроксикортизола с помощью разработанной методики количественного определения. Результаты измерений приведены в таблице 6. Далее, в течение недели, пациенты первой группы принимали настойку зверобоя, в качестве индуктора изофермента СУР ЗА4. Пациенты другой группы принимали, так же в течение недели, грейпфрутовый сок, в качестве ингибитора того же изофермента. Третья группа была контрольной - пациенты этой группы не получали ни индукторов ни ингибиторов изофермента СУР ЗА4. В результате после измерения у них отношения 6-Р-гидроксикортизола к кортизолу были получены значения, приведенные в таблице 6.
Таблица б
Отношение 6-Р-гидроксикортизола к кортизолу
Отношение 6-Р-гидроксикортизола к кортизолу до приема индуктора/ингибитора Отношение 6-р-гидроксикортизола к кортизолу после приема индуктора/ингибитора
I группа (прием индуктора) 0,6109 2,3152
II группа (прием ингибитора) 0,6230 0,0417
III ¡руппа (контроль) 0,6296 0,6730
Из полученных данных видно, что результаты отношений до и после приема индуктора/ингибитора в I и II группах статистически достоверно различаются, что позволяет использовать разработанную методику определения кортизола и 6-Р-гидроксикортизола в моче с целью оценки активности изофермента СУР ЗА4.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
1. Проведенный информационно-аналитический анализ существующих методик определения активности СУР ЗА4 показал, что наиболее часто используемыми на сегодняшний момент методиками оценки активности изо-фермента СУРЗА4 являются МЕСХ-тсст и эритромициновый дыхательный тест. Данные методики обладают рядом недостатков, среди которых введение экзогенных веществ, инвазивность методов (забор крови), возможность возникновения побочных и аллергических реакций.
2. Подобраны условия количественного определения 6-Р-гидроксикортизола и кортизола в моче методом ЬС-МБ. Для экстракции предложен метод жидко-жидкостной экстракции. Данная методика позволяет одновременно определить концентрации кортизола и 6-Р-гидроксикортизола.
3. Проведена валидация разработанной методики по показателям линейности, специфичности, прецизионности и воспроизводимости. Так же был рассчитан предел обнаружения и предел количественного определения, как для кортизола, так и для 6-Р-гидроксикортизола.
4. С помощью данной методики была проведена оценка активности изофермента СУР ЗА4 у пациентов.
5. Определено изменение активности СУР ЗА4 у пациентов при приеме индукторов и ингибиторов активности данного изофермента. У пациентов принимавших индуктор изофермента СУР ЗА4 отношение 6-Р-гидроксикортизола к кортизолу статистически достоверно возросло от 0,6109 до 2,3152. У пациентов принимавших ингибитор изофермента СУР ЗА4 отношение 6-Р-гидроксикортизола к кортизолу снизилось от 0,6230 до 0,0417.
6. Разработанная методика количественного определения 6-р-гидроксикортизола и кортизола в моче методом ЬС-Мв может быть рекомендована для использования оценки изменений активности при приеме индукторов и ингибиторов активности СУР ЗА4.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Сычев Д.А., Аникин Г.С., Александрова Е.К., Шадрина М.В., Смирнов В.В., Раменская Г.В., Кукес В.Г. Фармакокинетическое взаимодействие лекарственных средств с фруктовыми соками. Клиническое значаще // Клиническая фармакология и фармакоэкономика. - 2008. - № 2. - т.1. - С.57-67.
2. Смирнов В.В. Изучение активности изоферменга CYP3A4 по соотношению кортизол/6-Р-гидроксикортизол в моче // Тезисы докладов межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений». - Санкт-Петербург, 2009. - С.42-43.
3. Смирнов В.В., Раменская Г.В., Красных Л.М. Изучение активности изофермента CYP3A4 по соотношению кортизол/6-Р-гидроксикортизол в моче // Материалы международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства». - Шым-кент, 2009. - т.2. - С.368-370.
4. Смирнов В.В., Раменская Г.В. Изучение активности изофермента CYP3A4 по соотношению кортизол/6-|3-гидроксикортизол в моче // Клиническая фармакология и терапия. - 2009. - б (дополнительный). - С. 309-310.
5. Смирнов В.В. Изучение активности изофермента CYP3A4 по соотношению кортизол/6-Р-гидроксикортизол в моче // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная медицина и биобезопасность». -Москва, 2009. - С. 206-208.
6. Smirnov V.V., Ramenskaya G.V., Sichev DA., Bubolc A.V., Savchenko A.U., Paukov S.V., Sivkov A.S. Studying of activity of isoenzyme CYP3A4 on cortisol/6 P-hydroxycortisol ratio in human urine // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. - Edinburg, UK, 2009. -p. 107.
7. Smirnov V.V., Ramenskaya G.V., Savchenko A.U. Methods for determination 6 p-hydroxycortisol/cortisol ratio in human urine by LC-MS // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. Copenhagen, Denmark, 2010 p. 33.
8. Смирнов B.B., А.Ю. Савченко, Г.В. Раменская Разработка методики количественного определения эндогенного кортизола и 6-Р-гидроксикортизола в моче с целью определения активности изофермента CYP ЗА4 // Биомедицина. - № 4. - 2010. - С.56-60.
Оглавление диссертации Смирнов, Валерий Валерьевич :: 2011 :: Москва
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Система метаболизма (биотрансформации) лекарственных средств.,.
1.2 Ингибирование и индукция активности изофермента СУР ЗА4.
1.3. Методы определения активности СУРЗА4.
1.4. Определение активности СУР ЗА4 по отношению кортизол/6(3-гидроксикортизол.
1.5. Лекарственный мониторинг и персонализированная медицина.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
ГЛАВАЗ. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Разработка методики определения отношения кортизола и 6-(3-гидроксикортизола в моче.
3.2. Валидация методики определения кортизола и 6-р-гидроксикортизола в моче.
3.3. Зависимость активности изофермента СУР ЗА4 и изменения отношения кортизола и 6-р-гидроксикортизола в моче.
Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Смирнов, Валерий Валерьевич, автореферат
Актуальность темы
На сегодняшний день одной из основных проблем, стоящей перед медициной остается оптимизация фармакотерапии. Эта проблема решается путем разработки и внедрения методов и технологий, повышающих эффективность и безопасность терапии лекарственными средствами [1ДЗД0].
Экспериментальные данные, полученные в различных исследованиях, показали, что одним из основных фармакокинетических процессов, определяющих индивидуальный фармакологический ответ, является метаболизм, или биотрансформация лекарственных средств [2,6,21,19].
Изучение различных факторов, влияющих на метаболизм лекарственных средств, помогает повысить эффективность проводимой терапии и избежать развития нежелательных лекарственных реакций [14,20,8]. Так, на метаболизм лекарственных средств могут влиять пол, возраст, изменение функционального состояния органов метаболизма (печень, кишечник, почки), качественный и количественный состав пищевого рациона. Кроме того, фармакокинетическое взаимодействие лекарственных средств на уровне метаболизма является, пожалуй, наиболее клинически значимым. Велико значение генетических полиморфизмов ферментов метаболизма лекарственных средств в формировании индивидуального фармакологического ответа.
Изофермент цитохрома Р450 (СУР) ЗА4 участвует в метаболизме большого количества лекарственных средств (около 60% всех применяемых в настоящее время лекарственных средств) [14]. Он катализирует несинтетическую стадию биотрансформации. При этом под действием СУР ЗА4 лекарственные средства превращаются в более гидрофильные, чем нативные вещества, метаболиты, в результате чего скорость выведения почками данных соединений возрастает. В большинстве случаев, помимо увеличения скорости выведения, в процессе метаболизма так же теряется фармакологическая активность. Однако некоторые лекарственные вещества, так называемые пролекарства, изначально обладают меньшей фармакологической активностью, и только под влиянием СУР ЗА4 превращаются в активные метаболиты, которые и вызывают фармакологические эффекты [17,18,12,11]. Кроме того, СУР ЗА4 участвует в биотрансформации не только введенных из вне лекарственных средств, но и эндогенных соединений — таких, как стероидные гормоны, метаболиты витамина I) и др.
Некоторые вещества влияют на изофермент СУР 3 А4, ингибируя или индуцируя его активность. Индукция ведет к ускорению метаболизма ЛС и, как правило, к увеличению скорости выведения вещества и снижению его фармакологической активности. Ингибирование же наоборот, снижает активность ферментов и повышает концентрацию ЛС в крови [30,67,75].
Определение активности изофермента СУР ЗА4 является важной задачей для рациональной фармакотерапии, особенно при одновременном, назначении нескольких препаратов. Так, например, индукторы или ингибиторы изофермента СУР ЗА4 при совместном приеме с субстратом данного изофермента будут изменять фармакокинетические характеристики этого субстрата.
Активность СУР ЗА4 в организме человека можно определить по концентрации в крови метаболита (возможно, и в других биологических жидкостях), который образуется из введенного ранее лекарственного средства, причем этот метаболит должен образовываться исключительно под действием СУР ЗА4 [18,79]. Такие лекарственные средства называют маркерными субстратами. В настоящее время для оценки активности СУР ЗА4 в научных целях используется несколько маркерных субстратов: эритромицин, лидокаин, нифидипин, дапсон и мидозалам [32,90].
Данные тесты обладают рядом выраженных недостатков, таких как необходимость внутривенного введения препаратов, применение которых сопряжено с риском развития НЛР и, прежде всего — аллергических реакций и аритмогенных эффектов; необходимость, как минимум, двукратного забора крови из вены; тестирование может проводиться только в условиях лечебно-профилактического учреждения; Например, МЕСтХ может образовываться из лидокаина под влиянием не только СУР 3 А4, но и СУР1А2, а значит, данный тест отражает суммарную активность этих 2 изоферментов цитохрома Р450 [64,87].
В связи с этим более перспективны, методы оценки активности СУР ЗА4 по концентрации в биологических жидкостях эндогенных метаболитов, которые образуются только под действием СУР ЗА4, что исключает необходимость введения какого-либо лекарственного средства, а значит, делает метод на 100% безопасным для больного.
Цель исследования.
Разработать методику количественного определения кортизола и 6-(3-гидроксикортизола в моче, позволяющую оценивать активность СУР 3 А4.
Задачи исследования.
1. Провести информационно-аналитический анализ существующих методик определения активности СУР 3 А4.
2. Подобрать оптимальные условия количественного определения 6-р-гидроксикортизола и кортизола в моче методом ЪС-МБ.
3. Провести валидацию разработанной методики.
4. Изучить активность СУР ЗА4 у пациентов с помощью разработанной методики.
5. Изучить изменение активности СУР ЗА4 у пациентов при приеме индукторов и ингибиторов активности данного изофермента.
6. Сделать вывод о возможности использования данной методики для определения изменений активности при приеме индукторов и ингибиторов активности СУР 3 А4.
Научная новизна
В работе впервые разработана валидированная чувствительная и доступная методика оценки активности СУР ЗА4 методом определения отношения концентраций 6-[3-гидроксикортизола и кортизола в моче методом ЬС-МБ. Данная методика позволяет определить активность СУР ЗА4 по концентрации в биологических жидкостях эндогенных метаболитов, которые образуются только под действием СУР ЗА4, что исключает необходимость введения какого-либо лекарственного средства, а значит, делает метод на 100% безопасным для больного. Существующие на сегодняшний момент методики определения активности СУР ЗА4 подразумевают введение экзогенных веществ.
Практическое применение и внедрение результатов в практику.
Разработанная методика количественного определения кортизола и его метаболита в моче методом ЬС/М$ может быть использована для определения изменения активности изофермента СУР ЗА4 в процессе лечения, что позволит корректировать дозу препарата и повысить эффективность и безопасность фармакотерапии. Данная методика внедрена для определения активности изофермента СУР ЗА4 в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН (акт внедрения от 11.05.2010) и Институте Клинической Фармакологии ФГУ «НЦ ЭСМП» (акт внедрения от 26.05.2010).
Положения, выносимые на защиту.
1. Условия количественного анализа кортизола и его метаболита в моче методом ЬС/МБ.
2. Использование разработанной методики определения активности изофермента СУР ЗА4 возможно, в силу того, что данная методика показала высокую эффективность, точность и воспроизводимость.
3. Разработанная методика определения активности изофермента СУР ЗА4 является наиболее безопасной для пациента из всех существующий альтернативных методик на сегодняшний день.
Апробация работы.
Апробация работы проведена на научно-практическом заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова 26.08.2010 г.
Основные результаты работы доложены и обсуждены на межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (Санкт-Петербург, 2009 г.), международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (Шыкмент, 2009 г.), научно-практической конференции с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009 г.), международном конгрессе Европейского Общества Клинических Фармакологов и Терапевтов (ЕАСРТ) (Эдинбург, 2009 г.), международном конгрессе \\гог1с1Р11агта 2010 (Копенгаген, 2010 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом.
Диссертационная работа является частью исследований, которые разрабатываются на кафедре фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, номер Государственной регистрации - 01.2.006 06352.
Публикации.
По результатам диссертационного исследования опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 3 публикации в зарубежных изданиях.
Объем и структура диссертации.
Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка методики определения кортизола и 6-бета-гидроксикортизола в моче с целью установления активности изофермента CYP 3A4"
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
1. Проведенный информационно-аналитический анализ существующих методик определения активности СУР ЗА4 показал, что наиболее часто используемыми на сегодняшний момент методиками оценки активности изофермента СУРЗА4 являются МЕОХ-тест и эритромициновый дыхательный тест. Данные методики обладают рядом недостатков, среди которых введение экзогенных веществ, инвазивность методов (забор крови), возможность возникновения побочных и аллергических реакций.
2. Подобраны условия количественного определения 6-0-гидроксикортизола и кортизола в моче методом ЬС-МЭ. Для экстракции предложен метод жидко-жидкостной экстракции. Данная методика позволяет одновременно определить концентрации кортизола и 6-0-гидроксикортизола.
3. Проведена валидация разработанной методики по показателям линейности, специфичности, прецизионности и воспроизводимости. Так же был рассчитан предел обнаружения и предел количественного определения, как для кортизола, так и для 6-0-гидроксикортизола.
4. С помощью данной методики была проведена оценка активности изофермента СУР ЗА4 у пациентов.
5. Определено изменение активности СУР ЗА4 у пациентов при приеме индукторов и ингибиторов активности данного изофермента. У пациентов принимавших индуктор изофермента СУР ЗА4 отношение 6-0-гидроксикортизола к кортизолу статистически достоверно возросло от 0,6109 до 2,3152. У пациентов принимавших ингибитор изофермента СУР ЗА4 отношение 6-0-гидроксикортизола к кортизолу снизилось от 0,6230 до 0,0417.
6. Разработанная методика количественного определения 6-0-гидроксикортизола и кортизола в моче методом ЬС-МБ может быть рекомендована для использования оценки изменений активности при приеме индукторов и ингибиторов активности СУР ЗА4.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Смирнов, Валерий Валерьевич
1. Взаимодействие лекарств и эффективность фармакотерапии. /Л.В. Деримедведь, И.М. Перцев, Е.В. Шуванова, И.А. Зупанец, В.Н. Хоменко; под ред. И.М.Перцева.-Х.:Изд-во «Мегаполис», 2001.
2. Жердев В.П., Адекенов С.М., Сариев А.К., Колыванов Г.Б., Литвин A.A. Экспериментальное изучение фармакокинетики и биотрансформации арглабина // Российский биотерапевтический журнал, 2007, № 1, Т. 6. с. 45.
3. Государственная Фармакопея XII издания.
4. Заикин В.Г., Микая А.И., Химические методы в масс-пектрометрии органических соединений, М., 1987
5. Каркищенко H.H., Хоронько В.В., Сергеева Л.А. Каркищенко В.Н. Фармакокиентика. Ростов-на-Дону. Феникс. 2001. 383 с.
6. Литвин A.A., Колыванов Г.Б., Жердев В.П., Арзамасцев А.П.// Зависимость биотрансформации производных 1,4-бензодиазепина от их химической структуры/Хим.-фарм. Журн., 2004. Т.38, 11, С. 87-89.
7. Исследование «Здоровье нации 2005», www.rdeuropehealth.com
8. Карасек Ф., Клемент Р. Введение в хромато-масс-спектрометрию: Пер. с англ. -М.: Мир, 1993. 237 с.
9. Кукес В. Г., Сычев Д. А., Ших Е. В. Изучение биотрансформации лекарственных средств — путь к повышению эффективности и безопасности фармакотерапии // Врач. — 2007. — № 1. — С. 6-8.
10. Кукес В.Г., Сычёв Д.А., Андреев Д,А. Взаимодействие лекарственных средств. Под ред. Академика РАМН, проф Кукеса В.Г. М:ГЕОТАР-МЕД, 2004.
11. Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармаколо-гические аспекты. — М. — Реафарм, — 2004.
12. Кукес В.Г., Фисенко В.П., Стародубцев А.К., Раменская Г.В., Сычев Д.А., Андреев Д.А., Рейхарт Д.В. Метаболизм лекарственных препаратов под ред. Академика РАМН, проф. Кукеса В.Г., чл.-кор. РАМН, проф. Фисенко В.П. М.: Палея-М, 2001.
13. Кукес В.Г., Ших Е.В., Сычев Д.А., Булаев В.М., Раменская Г.В. // Вопросы питания. — 2003. —72(5). — С. 39—43.
14. Пилат Т.П., Иванов A.A. Биологически активные добавки к пище (теория, производство, применение). — М. — 2002. — С. 184—90, 646—656.
15. Проведение качественных исследований биоэквивалентности лекарственных средств. Методические указания. Под ред. В.Г. Кукеса, Фисенко В.П. М., 2008. - 34 с.
16. Раменская Г. В. Хроматографическое определение лекарственных средств и их метаболитов для фенотипирования изоферментов цитохрома Р-450 // Химико-фармацевтический журнал — 2005. — Т. 39, № 2. — С. 53-56
17. Раменская Г. В., Светый JI. И., Кулинченко А. С. Влияние флуконазола на концентрацию блокаторов медленных кальциевых каналов в плазме крови // Клиническая фармакология и терапия. — 2002. — № 5. — С. 54-56.
18. Раменская Г.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в оценке биотрансформации лекарственных средств (фармакокинетика и фармакогенетика). Автореф. диссер. на соиск. уч. степени докт. фарм. наук. 2003.
19. С.Б. Середенин, Т.А. Воронина, Г.Г. Незнамов, В.П. Жердев. Феназепам. 25 лет в медицинской практике//Москва, Наука, 2007 г., 381 с.
20. Сердин С.Б. Лекции по фармакогенетике. М.:МИА,2004.-303 с.
21. Сычев Д. А., Раменская Г. В., Игнатьев И. В. и соавт. Клиническая фармакогенетика / Под редакцией В. Г. Кукеса, Н. П. Бочкова // М.: Гэотар-Медиа, 2007. — 248 с.
22. Сычев Д.А., Игнатьев И.В., Раменская Г.В., Колхир C.B., Кукес В.Г. Значение полиморфизма гена MDR1, кодирующего гликопротеин-Р, для индивидуализации фармакотерапии. // Клиническая фармакология и терапия. -2005. -т. 14. №1. -с.92-96.
23. Сычёв ДА. Клиническая фармакогенетика. Клиническая фармакология под ред. Академика РАМН, проф Кукеса В.Г. М.:ГЕОТАР
24. МЕД, 2004.Кукес В.Г., Стародубцев А.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия.-М: ГЭОТАР-Медиа, 2006.
25. Хайс Р.Х., Гуляева Л.Ф. Биологические эффекты токсических соединений: курс лекций / Новосибирск, 2003 .Anon, 2005.
26. Augen J. The evolving role of information technology in the drug discovery process / J. Augen // Drug Discov. Today. — 2002. — Vol. 7. — P. 315-323.
27. Bailey D., Dresser G., Bend J. et al. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2003. —73.— P. 23—27.
28. Bailey D.G., Dresser G.K. // Am. J. Cardiovasc. Drugs. — 2004. — 4(5).—P. 281—97.
29. Bidstrup ТВ, Bjornsdottir 1ю CYP2C8 and CYP3A4 are the princepal enzymes involved in the human in vitro biotransformation of the insulin secretagogue repaglinide. Br О Clin Pharmacol. 2003 Sep;56(3):305-14.
30. British Pharmacopoeia. 2007.
31. Cacabelos R. Pharmacogenomics in Alzheimer's disease / R. Cacabelos // Mini Rev. Med. Chem. — 2002. — Vol. 2. — P. 59-84.
32. Chan W.K., Delucchi A.B. // Life Sci. 2000. Nov. 10. 67(25).
33. Cummins L. Sex-related differences in the learance of cytochrome P450 3A4 substrates may be caused by P-glycoprotein. Clin Pharmacol ther 2002: 75: 56-67.
34. Dresser K. et al. // Clin. Pharmacol. Ther. -2003.- 73- P.- 3243.
35. European Pharmacopoeia, 5th ed. 2005.
36. Fugh-Berman A., Ernst E. // Br. J. Clin. Pharmacol. — 2001. — 52. — P. 58—795.
37. Ganzera M., Schneider P., Stuppner H. // Life Sci. — 2006. — 78 — P. 856—861.
38. Gorski J.C., Hamman M.A., Wang Z., Vasavada N., Huang S., Hall S.D. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2002. — 71— P. 25.
39. Gorski C., Huang HM., Pinto A., Hamman M.A., Hilligoss J.K., Zaheer N.A., Desa Mi., Miller M., Hall S.D. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2004. — 75. — P.36—48.
40. Guo L.Q., Taniguchi M., Chen Q.Y., Baba K., Yamazoe Y. // Jpn. J. Pharmacol. — 2001, Apr — 85(4) — P. 399—408.
41. Huang S.M., Hall S., Watkins P., Love L.A., Serabjit-Singh C., Betz J.B., Hoffinan F.A., Honig P., Coates P.M., Bull J., Chen S.T., Kearns G.L, Murray M.D. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2004. — 75(1). — P. 21—24.
42. Issa A. M. Ethical perspectives on pharmacogenomic profiling In the drug development process / A. M. Issa // Nat. Rev. Drug Discov. — 2002. — Vol. 1. —P. 300-308.
43. Iwata H, Tezuka Y., Kadota S., Hiratsuka A., Watabe T // DMD. 2004.— 32. —P. 1351 —1358.
44. Izzo A.A., Ernst E. //Drugs. — 2001. — 61. — P. 2163—2175.
45. Jain K. K. From molecular diagnostics to personalized medicine / K. K. Jain // Exp. Rev. Mol. Diagn. — 2002. — Vol. 2. P. 299-301.
46. Jain K. K. Personalized Medicine / K. K. Jain. — Basel: Jain PharmaBiotech Publications, 2003.
47. Jain K. K. Personalized Medicine / K. K. Jain. — London : Informa Pharmaceutical Publications, 2001.
48. Kapur PA, Law T, Watson E. Simultaneous quantitation of verapamil, norverapamil, and N-dealkylated metabolites in human plasma following oral administration //J.Chromatogr.Biomed.Appl.1985,337:160-165.
49. Kaufman D.W., Kelly J.P., Rosenberg L., Anderson T.E., Mitchell A.A. // JAMA. — 2004. — 287. — P. 337—344.
50. Kessler R.C., Davis R.B., Foster D.F., Van Rompay M.I., Walters E.E., Wilkey S.A., et al. // Ann. Intern. Med. — 2001. — 135. — P. 262—268.
51. Klepser T.B., Doucette W.R., Horton M.R., Buys L.M., Ernst M.E., Ford J.K. et al. //Pharmacotherapy. — 2000 — 20.— P. 83—87.
52. Kobayashi M., Saitoh H., Seo S., Butterweck V., Nishibe S. // Biol. Pharm. Bull. — 2004 — 27(10) — P. 1649—1652.
53. Litalien C, Phan V, Insuffisance rénale aiguë Dictionnaire de thérapeutique pédiatrique Weber, 2e édition 2007 744-749.
54. Lorf T, Ramadori G, Ringe B, et al. Pantoprazole does not affect Ciclosporin A blood concentration in kidney-transplant patients. Eur J Clin Pharmacol 2000; 55: 733-5.
55. Lorf T, Ramadori G, Ringe B, et al. The effect of pantoprazole on tacrolimus and cyclosporin A blood concentration in transplant recipients. Eur J Clin Pharmacol 2000; 56: 439^10.
56. Metabolic Drug Interactions/editors Levy R.H., Thummmel K.E., Trager W.F., Hansten R.D., Eichelbaum M. Philadelphia. Lippincott Williams & Wilkins. 2000. 793 p.
57. Moore L.B., Goodwin B., Jones S.A., Wisely G.B., Serabjit-Singh C.J., Willson T.M. et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. — 2000. — 97.— P. 7500—7502.
58. Nicewamer-Pena S. R. Submicrometer metallic barcodes / S. R. Nicewamer-Pena, R. G. Freeman, B. D. Reiss et al. // Science. — 2001. — Vol. 294.—P. 137-141.
59. Nishikawa M., Ariyoshi N., Kotani A. et al. // Drug Metab. Pharmacokin. — 2004. — 19 (4). — P. 280—289.
60. Offman E.M., Freeman DJ., Dresser G.K., Munoz C., Bend J.R., Bailey D.G. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2001, Jul. — 70(1). —P. 17—23.
61. Palovaara S, Tybring G, Laine K. The effect of ethinyloestradiol and levonorgestrel on the CYP2C19- mediated metabolisn of omeprazole in healthy female subjects. Br J Clin Pharmacol 2003; 56: 232-7.
62. Pharmacogenetics/edited by Rothstein M.A. Willy-liss. New Jersey. 2003.368 p.
63. Pharmacogenomics / eds. W. Kalow, U. Meyer, R. F. Tyndale. — New York : Marcel Dekker, 2001.
64. Piscitelli S.C., Burstein A.H., Chaitt D., Alfaro R.M., Falloon J. // Lancet. — 2000. — 355. — P. 547—548.
65. Pitetti R., Singh S., Hornyak D., Garcia S.E., Herr S. // Pediatr. Emerg. Care. — 2001— 17. — P. 165-169.
66. Piver B., Berthou F., Dreano Y., Lucas D. // Life Sci. — 2003, Jul 18. — 73(9). — P. 1199—1213.
67. Pullarkat S. T. Thymidylate synthase gene polymorphism determines response and toxicity of 5-FU chemotherapy / S. T. Pullarkat, J. Toehlmacher, V. Ghaderi et al. // Pharmacogenomics J. — 2001. — Vol. 1. — P. 65-70.
68. Radhofer-Welte S. Pharmacokinetics and metabolism of the proton pump inhibitor pantoprazole in man. Drugs Today 1999; 35: 765—72.
69. Rebbek, T.R.; Jaffe, J.M.; Walker, A.H.; Wein, A.J.; Malkowicz, S.B.: Modification of clinical presentation of prostate tumors by novel genetic variant in CYP3A4. J. Nat. Cancer Inst. 90A 1225-1229, 1998.
70. Ruschitzka F., Meier P J., Turina M., Luscher T.T., Noll G. // Lancet. -2000.355:548-9.
71. Rusnak J. M. Pharmacogenomics: A clinician's primer on emerging technologies for Improved patient care / J. M. Rusnak, R. M. Kisabeth, D. P. Herbert, D. M. McNeil // Mayo Clin. Proc. — 2001. — Vol. 76. — P. 299-309.
72. Shug B.S., Blume H., Donath F., Warnke A., Pharmacokinetic drug interaction profiles of proton pump inhibitors// Drug Saf. — 2006. — Vol. 29 N9 -P. 769-784.
73. Simon WA. Faster in vitro biotransformation of S-omeprazole by the cytochrome P450 isoenzyme system compared to pantoprazole abstract. Pharmacotherapy 2003; 23: 1338.
74. Smith M., Lin K., Zheng Y., et al. // Clin. Pharmaco.l Ther. — 2001, Feb. — 69(2). — Abstract PHI—89.
75. Sridar C., Goosen T., Kent U., Williams J., Hollenberg P. // DMD. — 2004. — 32. — P. 587—594.
76. Sugimoto K., Ohmori M., Tsuruoka S., Nishiki K., Kawaguchi A., Harada K. et al. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2001. — 70. — P. 518—524.
77. Tribut P. O. Harmacogenomics / O. Tribut, Y. Lessard, J. M. Reymann et al. //Med. Sciences Monitor. — 2002. — Vol. 8. — P. RA152-RA163.
78. Troger U, Stotzel B, Martens-Lobenhoffer J, et al. Severe myalgia from an interaction between treatments with pantoprazole and methotrexate. BMJ 2002; 324: 1497.
79. Tsunoda S., Harris R., Christians U.etal.//Ibid.-2001 .-70.-P; 462-467.
80. United States Pharmacopoeia XXVIII. US Pharmacopoeia Convention, 2004.
81. Vizirianakis I. S. Pharmaceutical education in the wake of genomic technologies for drug development and personalized medicine /1. S. Vizirianakis // Europ. J. Pharm. Sei. — 2002. — Vol. 15. — P. 243-250.
82. Walter-Sack IE, Bliesath H, Stotzer F, et al. Lack of pharmacokinetic and pharmacodynamic interaction between pantoprazole and glibenclamide in humans. Clin Drug Invest 1998; 15: 253-60.
83. Wang Z., Gorski J.C., Hamman M.A., Huang S., Lesko LJ., Hall S.D. // Ibid. — 2001. — 70. — P. 317—326.
84. Wang LS, Zhou G, Zhu B, et al. St. John's wort induces both cytochrome P450 3A4-ctalyzed sulfoxidaiton and 2C19-dependent hydroxylation of omeprazole. Clin Pharmacol Ther 2004; 75: 191-7
85. Woolf T.F. Handbook of drug metabolism. 1999. 153-169.
86. Yang C.S., Chhabra S.K., Hong J., Smith TJ. // J. Nutr. — 2001. — 131. — 1041S—1045S.
87. Yasuda S, Higashi S, Murakami M, et al. Antacids have no influence on the pharmacokinetics of rabeprazole, a new proton pump inhibitor, in healthy volunteers. Int J Clin Pharmacol Ther 1999; 37: 249-53.
88. Yin OQ, Tomlinson B, Waye MM, et al. Pharmacogenetics and herb-drug interactions 2004; 14: 841-50.
89. Yoon Y.R., Kim M.J, Shin M.S. et al. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2001, Feb. 69(2). — Abstract PHI—97.
90. Yoshida N., Takagi A., Kitazawa H., Kawakami J., Adachi I.// Toxicol. Appl. Pharmacol. — 2005. — 209. — P. 167 173.
91. Yasui-Furukori N, Saito M, Uno T, et al. Effects of fluvoxamine on lansoprazole pharmacokinetics in relation to CYP2C19 genotypes. J Clin Pharmacol 2004b; 44: 1223-9.
92. Yu KS, Yim DS, Cho JY, et al. Effect of omeprazole on the pharmacokinetics of moclobemide according to the genetic polymorphism of CYP2C19. Clin Pharmacol Ther 2001; 69: 266-73.
93. Zhang S., Morris M.E.//Pharm.Res.-2003,Aug.-20(8)P. 1184-1191.
94. Zhang S., Morris M.E. //J Pharmacol.Exp.Ther.-2003,Mar.- 304(3).-P. 1258-1267.1. БЛАГОДАРНОСТИ