Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка методик количественного определения L-тироксина и трийодтиронина методом вольтамперометрии

На правах рукописи

Доме Сергей Владимирович

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Ь-ТИРОКСИНА И ТРИЙОДТИРОНИНА МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

005537048 7 НОЯ 2013

Самара-2013

005537048

Диссертационная работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Ивановская Елена Алексеевна

Официальные оппоненты:

Федосеева Людмила Михайловна - доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства

здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии, заведующая кафедрой

Агапов Альберт Иванович - доктор биологических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра общей, бионеорганической и биоорганической химии, профессор кафедры

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «Об» декабря 2013 г. в 10.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее десятилетие проблема дефицита йода, профилактики и лечения патологий, связанных с этим дефицитом, приковывает внимание не только эндокринологов, но и врачей других специальностей - терапевтов, врачей семейной практики, а также представителей власти и государственных деятелей. Это не случайность, - по данным экспертов ВОЗ, в мире около 2 млрд. жителей (фактически треть населения Земли) проживает в условиях йодного дефицита.

Россия является страной, на территории которой практически не существует регионов с достаточным содержанием йода в воде и почве, и, как следствие, население не получает с питанием необходимое количество этого важнейшего микроэлемента. К наиболее частым проявлениям дефицита йода у взрослых относятся увеличение щитовидной железы (эндемический зоб), а также снижение функции щитовидной железы (гипотиреоз). У детей дефицит йода способствует развитию умственной отсталости (кретинизма), врожденного гипотиреоза, нарушений умственного, физического и полового развития, которые могут проявиться на любом этапе жизни ребенка. Дефицит йода неблагоприятно отражается на репродуктивном здоровье женщины, приводя к бесплодию, невынашиванию беременности, мертворождению, появлению детей с различными врожденными аномалиями, увеличению младенческой смертности. Поэтому ликвидация йодной недостаточности является одной из глобальных и социально значимых проблем.

В настоящее время для определения тироксина и трийодтиронина в препаратах существует только один документально утвержденный метод определения: высокоэффективная жидкостная хроматография. Основными недостатком данного метода является: длительность проведения анализа, относительная дороговизна оборудования (около 1 млн. руб.), труднодоступные и токсичные реактивы и длительная пробоподготовка.

Электрохимические методы характеризуются высокой чувствительностью, точностью, экспрессностью, поэтому они находят все более широкое применение как для определения, так и для исследования свойств органических соединений, имеющих фармацевтическое значение, и создают разумную альтернативу традиционным хроматографическим методам анализа.

Весьма перспективным для определения электрохимически активных, лекарственных, биологически активных и токсических веществ, а также их метаболитов в биологических матрицах является современный метод вольтамперометрии, чувствительность которого составляет 10~8 - 10~9 г/мл. Этот метод обладает следующими преимуществами: низкая стоимость оборудования, конкурентоспособная себестоимость анализа, высокая чувствительность, селективность и экспрессность, легкость автоматизации измерительного процесса, относительная простота, время единичного измерения не превышает 10 мин.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка методик количественного определения Ь-тироксипа (Т4) и трийодтиронина (ТЗ) вольтамперометрическим методом в модельных растворах и

лекарственных препаратах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследование электрохимического поведения Ь-тироксина и трийодтиронина методом инверсионной вольтамперометрии для выяснения возможности аналитического определения их микроколичеств.

2. Проведение квантово-химического исследования структуры Ь-тироксина и трийодтиронина с целью выявления наиболее электрохимически активных функциональных групп и выяснения вероятного механизма электрохимической реакции.

3. Установление влияния различных факторов (потенциал и время накопления, скорость и границы развертки потенциала) на величину аналитического сигнала тироксина и трийодтиронина в исследованиях на модельных растворах методом вольтамперометрии.

4. Подбор оптимальных условий вольтамперометрического определения тироксина и трийодтиронина в лекарственных препаратах.

Научная новизна. На основании квантово-химических расчетов структур Ь-тироксина и трийодтиронина, впервые получены значения их энергий сродства к электрону, потенциала ионизации, энтальпий образования исходных субстратов и их катион- и анион-радикалов, распределения электронной плотности и других параметров; предложен вероятный механизм электрохимического процесса.

Впервые определены оптимальные условия определения Ь-тироксина и трийодтиронина методом вольтамперометрии в модельных растворах на ртутно-пленочном электроде.

Впервые разработаны методики количественного химического анализа проб лекарственных препаратов (таблетки) на содержание Ь-тироксина и трийодтиронина методом вольтамперометрии с использованием ртутно-пленочного электрода. Получен патент на изобретение № 2428690 «Вольтамперометрический способ количественного определения Ь-тироксина».

Практическая значимость. Разработанные методики определения содержания Ь-тироксина и трийодтиронина являются экспрессными и недорогими по сравнению с известными хроматографическими и могут быть использованы в техническом анализе лекарственных средств.

Предложенные методики позволяют экспрессно (за 20-40 минут) определить количества Ь-тироксина и трийодтиронина в лекарственных препаратах, что актуально для эффективной работы контрольно-аналитических лабораторий.

Предложенный способ количественного определения гормонов щитовидной железы может быть использован для разработки методик количественного химического анализа Ь-тироксина и трийодтиронина в биосистемах (кровь, моча и др.), для проведения фармакокинетических исследований.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России в соответствии с планом научно-исследовательских

работ по теме «Разработка методик количественного определения лекарственных препаратов в биологических средах и проведение фармакокинетических исследований» (государственная регистрация № 01200956813).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует форме специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты диссертационной работы соответствуют области исследования специальности, в частности — пункту 3 паспорта фармацевтической химии.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

1. Характер влияния различных факторов (потенциала и времени накопления, скорости и границ развертки потенциала, режима регистрации вольтамперограмм) на величину тока восстановления гормонов щитовидной железы.

2. Возможный механизм участия Ь-тироксина и трийодтиронина в электродном процессе с учетом химического строения, реакционной способности и материала электрода.

3. Методики количественного определения Ь-тироксина и трийодтиронина в лекарственных препаратах (таблетки).

Апробация работы. Основные результаты диссертации обсуждены и одобрены на Всероссийской научно-практической конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2009); межрегиональной научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы развития фармацевтической науки и образования» (Томск, 2011); международном инновационном форуме «Интерра» (Новосибирск, 2012) в рамках инновационного проекта «Лаврентьевский прорыв» (Новосибирск, 2012); на III Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Фармацевтический кластер как интеграция науки, образования и производства» (Белгород, 12-17 апреля 2013); на IV Российской (итоговой) научно-практической конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2013» (Новосибирск, 2013); на международной заочной научно-практической конференции «Теоретические и практические аспекты современной медицины» (г. Новосибирск, 2013); на VII международной научно-практической конференции «Тенденции и инновации современной науки» (Краснодар, 16 апреля 2013); на I всероссийской научной интернет-конференции с международным участием «Химическая наука: современные достижения и историческая перспектива» (Казань, 29 марта 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из которых 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России. Получен один патент на изобретение № 2428690 «Вольтамперометрический способ количественного определения Ь-тироксина».

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. В частности, автор провел исследование электрохимического поведения Ь-тироксина и трийодтиронина методом вольтамперометрии; квантово-химические расчеты структуры Ь-тироксина и трийодтиронина; разработал методики вольтамперометрического количественного

определения исследуемых веществ в модельном растворе и лекарственных препаратах.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описаний материалов и методов исследования, 3-х глав описаний собственных исследований, выводов. Диссертация содержит 9 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 115 источников, из которых 65 - зарубежных авторов.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современным физико-химическим методам исследования L-тироксина и трийодтиронина в различных объектах.

В главе 2 приведено описание используемой аппаратуры, типов электродов, методики проведения эксперимента.

В третьей главе отражены результаты квантово—химического исследования L-тироксина и трийодтиронина, описаны возможные механизмы электрохимической реакции.

Четвертая глава посвящена разработке вольтамперометрических методик количественного определения лекарственных средств в растворах стандартных образцов.

В пятой главе продемонстрированы результаты подбора условий количественного определения лекарственных средств в лекарственных формах.

В приложении представлены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объекты и методики исследования

В качестве объекта исследования для подбора оптимальных условий электролиза использованы субстанции:

1) L-тироксина (Lot № Т2376, фирма Sigma Aldrich);

2) L-трийодтиронина (Lot № Т2877, фирма Sigma Aldrich).

Для изучения влияния компонентов лекарственной формы на параметры вольтамперометрической методики использовали таблетированную лекарственную форму «L-тироксин» производства «Берлин-Хеми», серия 5828, с содержанием действующего вещества 100 мкг и «Трийодтиронин» производства «Берлин-Хеми», серия 94003, с содержанием активного вещества 100 мкг.

Экспериментальные данные были получены на вольтамперометрическом анализаторе ТА-4 (ООО «НПП «Томьаналит», г. Томск, регистрационный номер в Госреестре средств измерений № 25353-03), управляемом через персональный компьютер с помощью программного обеспечения VALabTX, обеспечивающим обработку данных.

В работе использовали ртутно-пленочный электрод на серебряной подложке, представляющий собой тонкую пленку ртути (20 - 100 мкм), нанесенную на

отшлифованную серебряную проволоку или путем погружения ее в чистую металлическую ртуть, или путем электролиза. Серебряная подложка крепится в инертном материале — стекле, фторопласте или полиэтилене. Подготовку поверхности ртутно-пленочного электрода осуществляли электрохимическим способом в соответствии с МУК 4.1.1501-03 с использованием ртути (I) азотнокислой 2-водной (ГОСТ 4521).

Электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод (А§ / AgCl) (ГОСТ 17792). Хлорсеребряный электрод изготавливают путем нанесения хлористого серебра разными способами на серебряную проволоку. Подготовку электрода осуществляли в соответствии с ГОСТ Р 51301.

Источником информации служили поляризационные кривые. В эксперименте использовали кварцевую посуду (ГОСТ 19908), стеклянные колбы, цилиндры, стаканчики (ГОСТ 25336) для приготовления растворов.

Для приготовления стандартных растворов и фоновых электролитов использовали следующие реактивы:

натрия гидроксид марки х.ч. по ГОСТ 4328;

натрия тетраборат 10-водный марки х.ч. по ГОСТ 4199;

аммония нитрат марки х.ч. по ГОСТ 22867.

Приготовление стандартных и фоновых растворов проводили общепринятыми методами с использованием воды дистиллированной (ГОСТ 6709).

Для количественного определения анализируемых веществ в модельных растворах использовали метод стандартных добавок, согласно которому, концентрацию определяемого вещества рассчитывали по формуле:

/ •С •V ■V

__пробы добавки добавки минерализапа

в пробе - -П — Т^ — где

\ пробасдобавкой проба) аликвоты навески

1пробы - высота пика вещества на кривой пробы, мкА; Сцобавт ~ концентрация стандартного раствора, мг/л; ^добавки - объем добавки, мл; ^'минерализапа - объем минерализата, мл;

1пробас добавкой — высота пика элемента на кривой пробы с добавкой, мкА;

К

аликвоты

— объем аликвоты, мл;

М„авески — величина навески, г или мл. Каждое из приведенных цифровых значений является средним из пяти измерений.

Чувствительность метода вольтамперометрии достаточно высока, следовательно,

при работе с растворами, концентрация которых составляет менее 0,01 мг/л, существует большая вероятность загрязнения со стороны воздуха, реактивов, посуды, поэтому особое внимание уделялось чистоте химической посуды (колб для приготовления растворов, кварцевых стаканчиков), сменных наконечников дозаторов, которые подготавливали следующим образом. Промывали раствором соды (натрий двууглекислый марки х.ч. по ГОСТ 2156), затем азотной кислотой (ГОСТ 4461) и бидистиллированной водой (ТУ 6-09-2502-77). Кварцевые стаканчики дополнительно кипятили в разбавленной (1:1) серной кислоте (ГОСТ 4204) в течение 5-10 мин и прокаливали в муфельной печи при температуре 500-600 °С в течение 5-10 мин. Сменные кварцевые стаканчики хранили в эксикаторе. Кварцевые стаканчики после проведения анализа обрабатывали концентрированной серной кислотой и промывали бидистиллированной водой.

Источником информации служили вольтамперометрические кривые.

Каждый эксперимент выполнен в соответствии со следующей схемой: на персональном компьютере запускали программное обеспечение УАЬаЬТХ вольтамперометрического анализатора. После загрузки программы из окна ее графического интерфейса открывали пункт стандартной панели «Методика», в появившемся окне устанавливали параметры проведения измерений: количество повторов серии (3 — 5), подготовительные стадии, включающие установку временных интервалов исполнения различных стадий измерения, их потенциалов и необходимости пропускания инертного газа; форму, границы и скорость развертки потенциала.

Выбранные параметры исследования сохраняли как новую методику измерения.

После того, как все параметры программы были заданы, приступали непосредственно к процессу электролиза. Для этого в три кварцевых стаканчика объемом 20 мл, соответственно, помещали по 10 мл фонового электролита и запускали программу электролиза, нажатием клавиши «ФОН» на панели задач программы УАЬаЬТХ. При этом раствор предварительно перемешивали и деаэрировали газообразным азотом (ГОСТ 9293) с содержанием кислорода не более 0,001 % в течение определенного промежутка времени, затем наступала стадия успокоения, и только после этого прибор фиксировал вольтамперограмму на экране монитора. Отсутствие посторонних сигналов на линии фона свидетельствовало о его чистоте.

Затем в стаканчики добавляли исследуемый образец и вновь запускали программу электролиза, нажимая на кнопку «ПРОБА» на стандартной панели.

После проведения электролиза исследуемого образца в электрохимическую ячейку добавляли аликвоту стандартного раствора и запускали программу электролиза нажатием клавиши «СТАНДАРТ».

В работе задействованы одноканальные дозаторы на 0,01; 0,05; 0,10; 1,00; 10,00 мл фирм «Ртр1рейе» (Финляндия), «Ленпипет» (Россия) со сменными наконечниками.

Расчет квантово-химических параметров определяемых веществ произведен полуэмпирическим методом РМ-3 с помощью программного пакета НурсгСЬеш 6.0.

Статистическую обработку экспериментальных данных (Р = 95 %) проводили общепринятыми методами.

2. Результаты квантово-химического исследования молекул Ь-тироксииа и трийодтиронина

Для рационализации теоретической аргументации электрохимической активности, обнаружения функциональных групп, участвующих в электродном процессе, и выяснение конформационных особенностей исследуемых гормональных препаратов использовали квантово-химический расчет структуры молекул.

Для этого с помощью программы НурегСЬет (метод РМЗ) впервые проведена оптимизация геометрии исходных субстратов, их катион- и анион-радикалов, вычислили энтальпии образования ДН и энергии высших занятых ВЗМО и низших вакантных НСМО орбиталей (таб. 1).

Таблица 1

Значения энтальпии образования, потенциала ионизации, энергии сродства к

элнггрону

Субстрат Энтальпия образования, ДН/, кДж/моль Изменение энтальпии образования АСАН/), кДж/моль Потенциал ионизации, Евзмо, эВ Сродство к электрону, Енсмо, эВ

Катион-радикал тироксина 730,95 761,61

Анион-радикал тироксина -236,10 -205,44

Тироксин -30,66 - 8,69 0,89

Катион-радикал трийодтиронина 627,74 767,28

Анион-радикал трийодтиронина -343,59 -204,05

Трийодтиронин -139,54 - 8,89 1,02

В результате установлено, что в вакууме бензольные кольца в структуре обоих препаратов находятся во взаимно перпендикулярных плоскостях, что связано со взаимным отталкиванием атомов йода, радиус которых значительно превышает радиус атомов углерода. Полученный результат хорошо согласуется с литературными данными.

Расчеты показывают, что тироксин и трийодтиронин имеют относительно низкие значения энергии сродства к электрону (0,89 и 1,02 соответственно), оба исходных соединения должны сравнительно легко принимать на НСМО орбитали электроны, образуя анион-радикалы, что определяет электрофильные свойства молекул изучаемых веществ. Значение потенциала ионизации лежит в достаточно высокоэнергетической области (8,69 и 8,89 эВ соответственно), что предполагает значительные энергетические затраты на отрыв электрона при образовании катион-радикала. Рассчитанные значения изменений энтальпий образования анион-радикала по сравнению катион-радикалом подтверждают изложенные выше положения. Полученные данные позволяют судить в целом о большей устойчивости анион-

радикалов по сравнению с катион-радикалами тироксина и трийодтиронина.

Таким образом, и исходное электронное состояние изучаемых соединений, и изменения энтальпий образования при одноэлектронном переносе одинаковым образом показывают, что тироксин и трийодтиронин должны существенно легче подвергаться электрохимическому восстановлению, нежели окислению.

При анализе данных по распределению зарядов атомов в молекулах, катион- и анион-радикалов тироксина и трийодтиронина обнаружены три электрохимически активные функциональные группы - это фенольный гидроксил, карбоксильная группа и ковалентно-связанный йод.

Анализ длин связей нейтральной молекулы тироксина и его анион-радикала (табл. 2) показал значительное увеличение длины связи с 1,9665 до 2,1142 (Д = 0,1477) между атомом йода фенильного фрагмента и атомом углерода бензольного кольца в анион-радикале. На этом же атоме йода сосредоточен наибольший отрицательный заряд. Второй атом йода также удален от кольца на значительное расстояние, но все же на порядок меньшее. В феноксильном фрагменте расстояния между атомами йода и атомами углерода также увеличены. Длины связей между остальными атомами остались практическими неизменными. Аналогичные данные получены и в отношении молекулы трийодтиронина и его анион-радикала (табл. 3).

Примечательно, что происходит удлинение связи в анион-радикалах обоих соединений О (7) - С (8) и укорочение связи О (7) - С (4).

Таблица 2

Длины связей в молекуле тироксина и его анион-радикале_

Связь Молекула Т4 Анион-радикал Т4 Разница Вывод

1(18)-С(9) 1,9665 2,1142 0,1477 Удлинение

I (19) — С(10) 1,9645 1,9804 0,0159 Удлинение

I (20) — С(1) 1,9650 1,9709 0,0059 Удлинение

1(21)-С(6) 1,9714 1,9789 0,0075 Удлинение

О (7)-С (8) 1,3856 1,3940 0,0084 Удлинение

О (7)-С (4) 1,3907 1,3745 -0,0162 Укорочение

Таблица 3

Длины связей в молекуле трийодтиронина его и анион-радикале_

Связь Молекула ТЗ Анион-радикал ТЗ Разница Вывод

1(18)-С(9) 1,9639 2,1186 0,1547 Удлинение

I(19) — С(10) 1,9691 1,9789 0,0098 Удлинение

1(20)-С(1) 1,9723 1,9776 0,0053 Удлинение

О (7)-С (8) 1,3862 1,3930 0,0068 Удлинение

О (7)-С (4) 1,3927 1,3766 -0,0161 Укорочение

Полученные результаты позволяют сделать предположение о вероятных механизмах реакций, протекающих на поверхности электродов.

Катодное восстановление карбоксильной группы может давать карбоксилат-

анион, альдегид, спирт или углеводород при одно-, двух-, четырех-, или шестиэлектронном процессе восстановления соответственно (схема 1).

Схема 1

РС02Н

—- 2е- ^

2Н + 4е- ^

4Н + бе- _

ЯС02- + 1/2 Н2 ОН

ЯСН

6НН

Ън

РСН2ОН + Н20 ЙСН3 + 2Н20

ЯСНО + Н20

Восстановление протекает преимущественно в кислой среде и достаточно низком отрицательном потенциале. Альдегиды обычно восстанавливаются при менее отрицательных потенциалах чем карбоновые кислоты, поэтому остановить процесс восстановления на стадии образования альдегида достаточно трудно. Карбоксилат-ион восстанавливается сложнее, чем собственно карбоновая кислота, поэтому требует гораздо более низкий уровень рН фонового электролита. Как правило, при этом выделяется водород. Карбоновые кислоты, содержащие активирующие группы, могут восстанавливаться и без выделения водорода, и без жесткой зависимости от рН фонового электролита. Однако при повышении уровня рН до слабощелочной происходит смещение потенциала полуволны в более отрицательную область. В щелочной среде карбоновая кислота полностью депротонирована, поэтому восстанавливается с большим трудом.

Восстановительная ионизация связи углерод-галоген необратима и не зависит от рН среды. Легкость восстановления галогенпроизводных понижается в ряду Ы > ЯВг > ЯС1 > ЯР и третичный ЯХ > вторичный ИХ > первичный ЮС.

Несмотря на большой объем теоретической и практической информации по восстановительной диссоциации связи углерод-галоген, невозможно отнести все данные строго к ионному или свободно-радикальному механизму из-за чрезвычайно двойственной природы процесса. В принципе, вероятны несколько возможных механизмов принятия электрона и разрыва связи углерод-галоген, которые представлены на схемах 2-7.

Разрыв связи в результате простого двухэлектронного процесса, дающего карбанион.

Схема 2

ЯХ +2е —> Я" + X"

Два одноэлектронных переноса, первый совмещен с разрывом связи. Если наблюдается только одна волна восстановления, то предполагается, что второй шаг

протекает быстро, и что стандартный потенциал восстановления радикала требует анодного потенциала для первого электронного переноса:

Схема 3

ЮС + е —» Я' + X" Я' + е —»1Г

В данном случае первый шаг является сложным и состоит в генерации анион-радикала, который впоследствии распадается следующим образом:

Схема 4

ЮС + е ^ [ЮС]'~

[ЯХр^Я'+Х" 2 К/ -> ЯЯ Я' + е —> Я"

Присоединение второго электрона к анион-радикалу происходит одновременно с разрывом связи:

Схема 5

ЮС + е —► [ИХ]'"

[ИХ]'" + е —► Я" + X"

Образование дианиона из анион-радикала:

Схема 6

[ЯХ]" + е — [ЮС]2'

Восстановление, которое сопровождается образование органомеркуратных интермедиатов:

Схема 7

ЮС + Нб -«• И^Х Я^Х + е-^КН^ + Х" 21Шё-а<15-^К2Не + Н§0 Я21^ + 2е —> 2 Я" + Нё°

Механизм, представленный на схеме 4, включающий образование интермедиатов в виде анион-радикала и свободного радикала, является общепринятым, хотя и имеет некоторые ограничения.

Присоединение электрона к арилгалогениду приводит вначале к образованию п-делокализованному анион-радикалу. Этот этап сопровождается разрывом связи галоген-углерод и образованием локализованного о-радикала, который может принимать второй электрон или от электрода, или путем гомогенного электронного переноса от другого я-ион-радикала. Протонирование полученного карбаниона приводит к замене галогена на водород. Восстановление йодбензола в ацетонитриле, содержащем оксид дейтерия, при использовании перхлората лития в качестве фонового электролита приводит к замене галогена на дейтерий. Если транспорт второго электрона затруднен, а-радикал может протонироваться от протонодонорного растворителя.

Как показывает практика, материал катода играет существенную роль в процессе электролиза и, в некоторых условиях, может определять степень дегалогенирования

полигалогензамещенных углеводородов. В случаях, когда необходимо полное удаление всех имеющихся в молекуле атомов галогена целесообразно использовать катодный материал, обладающий наиболее высоким перенапряжением водорода. С этой целью применяют свинец, реже ртуть и кадмий. Частичное дегалогенирование можно осуществить, используя в качестве катода медный электрод.

Свойства электролита, особенно катиона фона, зачастую имеют существенное значение. Они оказывают влияние не только на ток фона, но и на скорость восстановления, поскольку строение двойного электрического слоя и специфические взаимодействия на поверхности электрода и в объеме раствора зависят от природы электролита.

Реакция среды фонового электролита также оказывает заметное влияние на процесс электролиза, хотя многие литературные источники указывают на независимость процесса электровосстановления арилгалидов от рН. Отщепление галогена протекает, как правило, в водных щелочных растворах, причем повышение концентрации щелочи приводит к увеличению выхода дегалогенированного продукта. Однако возможно восстановление и в кислых средах. Выбор зависит от возможных взаимодействий определяемого вещества с фоновым электролитом (например, в щелочных растворах некоторые галогенпроизводные могут омылятся).

Исходные анализируемые вещества, интермедиа™ и конечные продукты помимо указанных процессов могут вступать во взаимодействие с материалом электрода вне зависимости от свойств используемого индифферентного электролита. Во многом этому способствует природа материала катода, однако не последнюю роль в этом процессе играет и природа электроактивного вещества. Некоторые йодпроизводные ароматических углеводородов могут генерировать диарилмеркураты на ртутном катоде. В случае 4-йоданизола восстановление приводит к образованию ди-(4-метоксифенил)-ртути. С 4-броманизолом этого не происходит.

Избежать протекания подобных процессов можно путем применения в качестве катодного материала графита или стеклоуглерода, которые, в свою очередь, не лишены таких недостатков, как повышенная адсорбционная способность многих органических соединений, что снижает разрешающую способность и воспроизводимость метода.

Ранее уже было отмечено, что природа материала электрода в определенной мере влияет на скорость процесса восстановления галогенорганических соединений.

Таким образом, если создавать методику количественного определение тироксина и трийодтиронина на основе электрохимической реакции восстановления по ковалентно-связанному йоду, то в качестве электрода следует выбрать ртутно-пленочный, платиновый, медный или стеклоуглеродный (графитовый) электроды; реакция среды фонового электролита должна быть смещена щелочную сторону, а электролиз необходимо вести в области отрицательных потенциалов.

Если подбирать условия электрохимического анализа тироксина и трийодтиронина, ориентированных на определение лекарственного вещества по карбоксильной группе, необходимо ориентироваться на использование стеклоуглеродного, графитового или ртутно-пленочного индикаторных электродов.

Реакция среды фонового электролита должная находиться в кислой, нейтральной или слабощелочной области. Потенциал восстановления карбоксильной группы находится в более отрицательной области, чем потенциал арилгалидов, из чего следует, что ковалентно-связанный йод восстанавливается легче.

Согласно литературным данным, фенольный гидроксил подвергается только окислению.

Анализируя вышеизложенное, можно предположить два механизма электрохимической реакции, протекающей на поверхности электрода. Первый механизм обусловлен диссоциативным электронным транспортом от электрода к анализируемому веществу (схема 8):

Схема 8

I

Второй механизм связан с непосредственным участием ртути в электродном процессе (схема 9):

Схема 9

I

ОН 1

анализируемых субстратов, установлены специфические электрохимически активные центры в каждой из молекул, а также предложены возможные механизмы электровосстановления, соответствующие приведенным в литературе для проявляющих электрохимическую активность функциональных групп.

3. Результаты разработки методики количественного определения Ь-тироксина и трийодтиронниа вольтамперометрнческнм методом в модельном растворе стандартного образца Начальным этапом в разработке методики количественного определения тироксина и трийодтиронина являлся выбор оптимальных условий обнаружения аналитического сигнала.

На основании теоретического обоснования электрохимической активности тироксина и анализа литературных данных в качестве индикаторного (рабочего) электрода использовали ртутно-пленочный.

На следующем этапе выбирали фоновый электролит. В качестве фоновых электролитов были исследованы растворы: хлоридов натрия, калия, лития, сульфатов и нитратов натрия, калия, аммония, натрия гидрофосфат, кислоты хлористоводородной и ряда других растворов квалификации о.с.ч. и х.ч. Однако аналитические сигналы тироксина на данных фоновых электролитах были нечеткими и плохо

воспроизводимыми, либо вообще отсутствовали. Тогда как раствор боратного буфера обеспечивал широкую область, хорошую электропроводность и необходимую площадь для обработки сигнала. Исходя из этого, мы получали вольтамперограммы (рис 1 А) при рН, соответствующей 10 (растворы сильных электролитов — хлориды натрия, калия, лития с добавлением боратного буфера, чистый боратный буфер). В менее щелочных растворах с рН=8; 9; 9,5 четкий и однозначный аналитический сигнал тироксина отсутствовал. Выбранная же величина рН обеспечивала минимальный остаточный ток и максимальную величину аналитического сигнала, что согласуется с литературными данными. Для трийодтиронина (рис. 1 Б) в качестве фонового электролита был выбран раствор аммония нитрата в концентрации 0,01 моль/л.

А Б

Рис. 1. Вид вольтамперометрических кривых для раствора стандартного образца тироксина(А) и трийодтиронина (Б)

Обозначения: 1 - линия фонового электролита; 2 - линия стандартного раствора; 3 - линия стандартного раствора с добавкой

3.1 Установление оптимальных условий электролиза

К основным условиям электролиза можно отнести время и потенциал накопления, а также оптимальные границы развёртки потенциала.

Наиболее важным контролируемым параметром методики является потенциал накопления, при котором определяемое вещество максимально полно осаждается на индикаторном электроде. Экспериментальным путём установили оптимальное значение данного параметра, составляющее -1,800 В. Изменение значения данной величины в более положительную или более отрицательную область способствовало уменьшению величины тока аналитического сигнала и изменению его геометрической формы. Для трийодтиронина значение потенциала накопления составило -0,3 В.

Оптимальная длительность электролиза, обеспечивающая эффективность накопления и получение более выраженного аналитического сигнала, установлена экспериментальным путем в области значений данного показателя от 20 до 240 секунд. При этом величина тока возрастала пропорционально времени накопления до 150 с, достигая максимального значения высоты аналитического сигнала, хорошей

воспроизводимости результатов и чувствительности определения. При меньшей продолжительности накопления не достигали предела эффективности накопления, что приводило к снижению чувствительности определения исследуемого вещества. Увеличение времени накопления более 150 с способствовало насыщению поверхности электрода осадком, искажению суммарного контура аналитического сигнала тироксина и затруднению обработки вольтамперограмм. Время электролиза трийодтиронина составило 260 с.

Наряду с имеющимися параметрами экспериментальным путем была определена рациональная скорость развёртки потенциала, равная 50 мВ/с для тироксина и 90 мВ/с для трийодтиронина, при замедлении или ускорении которой границы аналитического сигнала становились нечёткими, что затрудняло обработку поляризационных кривых.

Важным этапом в подборе условий электролиза является определение границ развёртки. Оптимальная область развёртки потенциала для тироксина соответствовала значениям от - 1,800 до 0,000 В; для трийодтиронина —от-0,3 до - 1,5 В.

Изменение данных значения в более положительную область приводило к размыванию пика, расширение же области приводило к увеличению предельного тока, что затрудняло обработку сигнала.

Наиболее важным показателем правильности разработанной методики является наличие прямолинейной зависимости силы тока в цепи от концентрации тироксина в датчике, что и было установлено в нашем исследовании. Однако сила тока возрастала до определённого момента, а затем резко уменьшалась. Подобная зависимость характерна для веществ органической природы и связана с тем, что их крупные молекулы постепенно занимают активные центры электрода, уменьшая тем самым его рабочую поверхность.

Подтверждение правильности и оценку воспроизводимости результатов определения тироксина по разработанной методике провели методом «введено — найдено», исследуя семь серий с концентрациями 2-Ю"2; 2-10" ; 2-10 ; 2-10" ; 210" ; 2-10" 7 и 2-10"8 мг/л, по десять проб для каждой. Для этого в кварцевый стаканчик емкостью 20 мл помещали 10 мл 0,05 М боратного буфера с рН=10. Мешающее влияние кислорода исключали путем пропускания газообразного азота через раствор в электрохимической ячейке в течение всего процесса электролиза. Процесс измерения проводили при следующих параметрах: потенциал накопления —1,800 В, длительность процесса накопления - 150 с. Получали вольтамперограмму при постоянно-токовой скорости развертки потенциала 50 мВ/сек. О чистоте фона судили по отсутствию пиков на вольтамперометрической кривой.

Затем в электрохимическую ячейку добавляли 0,1 мл стандартного раствора тироксина определенной концентрации, проводили электрохимическое накопление, используя те же параметры методики. Аналитический сигнал тироксина регистрировали как пробу в диапазоне потенциалов от -0,150 до -0,100 В.

В качестве стандарта использовали такое же количество раствора тироксина, при этом высоту суммарного аналитического сигнала измеряли как пробу с добавкой.

Время единичного анализа не превышало 10 мин.

Наиболее важным показателем правильности разработанной методики является наличие прямолинейной зависимости аналитического сигнала в цепи от концентрации определяемого вещества в электрохимической ячейке. Как видно из графика, зависимость силы тока от содержания тироксина в диапазоне концентраций 2-10"8-2-10"2 мг/л имеет прямолинейный характер.

Результаты, полученные в ходе исследования, статистически обработали. В итоге установили, что относительная погрешность методики определения составляет не более 10 % для диапазона концентраций 2-10"7 - 2 -10"2 мг/л, что не превышает ошибку метода. Значение рассчитанных коэффициентов Стьюдента не превышает табличное значение.

Проверку правильности результатов определения трийодтиронина по разработанной методике провели методом «введено — найдено» для пяти серий с концентрациями 10; 1; 0,1; 0,01 и 0,001 мг/л, по десять проб для каждой. Для этого в кварцевый стаканчик емкостью 20 мл помещали 10 мл 0,01 моль/л раствора нитрата аммония. Мешающее влияние кислорода исключали путем пропускания газообразного азота через раствор в электрохимической ячейке в течение всего процесса электролиза. Процесс измерения проводили при следующих условиях: потенциал накопления -0,3 В, продолжительность накопления - 260 с. Фиксировали вольтамперограмму при дифференциально-импульсной скорости развертки потенциала 90 мВ/с и амплитуде импульса 14 мВ. О чистоте фона судили по отсутствию пиков на вольтамперометрической кривой.

Затем добавляли 0,02 мл стандартного раствора трийодтиронина определенной концентрации, электрохимическое накопление проводили при тех же параметрах. Аналитический сигнал трийодтиронина регистрировали как пробу в диапазоне потенциалов от-1,2 до -1,1 В.

В качестве внутреннего стандарта использовали такое же количество раствора трийодтиронина, при этом высоту суммарного сигнала замеряли как пробу с добавкой.

Время единичного анализа не превышало 15 мин.

Зависимость аналитического сигнала трийодтиронина от его концентрации носит прямолинейный характер в исследованном диапазоне концентраций.

Результаты, полученные в ходе исследования, статистически обработали. В итоге установили, что относительная погрешность методики определения составляет не более 10 % для диапазона концентраций 0,001 — 10 мг/л, что не превышает ошибку метода. Значение рассчитанных коэффициентов Стьюдента не превышает табличное значение.

Таким образом, установленные параметры анализа позволяют с достаточно высокой чувствительностью и экспрессностью определять содержание тироксина и трийодтиронина в модельных растворах методом катодной инверсионной вольтамперометрии, что в дальнейшем позволит адаптировать методики количественного определения тироксина и трийодтиронина на лекарственные препараты.

4. Применение метода вольтамперометрии для определения Ь-тироксина и трийодтиронина в лекарственных препаратах

Подготовку таблеток, содержащих тироксин, осуществляли следующим образом. В ступку помещали 20 таблеток с содержанием тироксина 100 мкг, растирали их до порошкообразного состояния, затем полученный порошок, соответствующий массе 0,2000 г, помещали в мерную колбу на 50 мл, растворяли в небольшом количестве 0,01 М раствора натрия гидроксида, затем объем доводили до метки. Полученный раствор фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу на 100 мл и затем объём раствора в мерной колбе доводили раствором гидроксида натрия до метки. На анализ брали объем аликвоты, равный 0,1 мл.

Все параметры методики определения тироксина в препарате были идентичны параметрам методики тироксина в модельном растворе.

При определении трийодтиронина в лекарственном препарате использовали следующую схему пробоподготовки.

Для приготовления исследуемого раствора лекарственного препарата трийодтиронина с концентрацией 4 мг/л 20 предварительно взвешенных таблеток растирали до тонкого порошка, брали навеску, равную 0,1000 г трийодтиронина, помещали в мерную колбу на 25 мл, добавляли 10 мл 0,01 М раствора №ОН, затем доводили объем до метки тем же растворителем и 3 мин взбалтывали на магнитной мешалке. Затем проводили измерение. На анализ брали объем аликвоты, равный 0,02 мл.

Все параметры методики определения трийодтиронина в препарате были идентичны параметрам методики трийодтиронина в модельном растворе.

Правильность методики была проверена методом «введено-найдено». Полученные в ходе исследования результаты подвергли статистической обработке, которая показала, что относительная погрешность методики составляет не более 4% , что не превышает ошибку метода.

ВЫВОДЫ

1. Впервые исследовано электрохимическое поведение Ь-тироксина и трийодтиронина методом инверсионной вольтамперометрии на ртутно-пленочном электроде. Специфичность, точность, воспроизводимость и линейность этих методик подтверждена на основе статистической обработки с использованием коэффициента Стьюдента.

2. На основании квантово-химических расчетов установлено, что Ь-тироксин и трийодтиронин легче подвергаются электрохимическому восстановлению, нежели окислению.

3. В структуре молекул Ь-тироксина и трийодтиронина выявлены электрофоры, подвергающиеся восстановлению: карбоксильная группа и ковалентно-связанный йод.

4. Предложен вероятный механизм электрохимической реакции, основанный на восстановительной диссоциации связи углерод-галоген.

5. Впервые определены оптимальные условия определения Ь-тироксина и трийодтиронина методом вольтамперометрии в модельных растворах на ртутно-

пленочном электроде: потенциал электролиза ((-1,800) - для L- тироксина и (-0,300) для трийодтиронина); время электролиза (150 сек - для L-тироксина и 260 сек для трийодтиронина); скорость развертки потенциала (50 мВ/с - для L-тироксина и 90 мВ/с - для трийодтиронина).

6. Предложены оптимальные условия электрохимического количественного определения L-тироксина и трийодтиронина в лекарственных препаратах. Данные методики характеризуются экспрессностью и простотой стадии пробоподготовки. Суммарное время проведения единичного измерения не превышает 20-25 мин.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Доме, C.B. Применение вольтамперометрии для количественного определения L-тироксина / C.B. Доме, Е.А. Ивановская // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. -Т. 10,- № 5.-С. 140-144.

2. Доме, C.B. Вольтамперометрическое количественное определение L-тироксина/ C.B. Доме, Е.А. Ивановская // Сибирское медицинское обозрение. - 2012. - Т. 74. №

2.-С. 26-30.

3. Доме, C.B. Вольтамперометрический способ количественного определения трийодтиронина / C.B. Доме, Е.А. Ивановская // Медицина и образование в Сибири: электронный научный журнал - 2013. - №2. - Режим доступа: (http://www.ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=967). — № гос. регистрации 0421100060\0002.

4. Доме, C.B. Применение вольтамперометрии для количественного определения трийодтиронина / C.B. Доме, Е.А. Ивановская // «Авиценна-2013»: материалы IV Российской (итоговой) научно-практической конкурс-конференции студентов и молодых ученых. — Новосибирск, 2013. — С. 242.

5. Доме, C.B. Вольтамперометрическое исследование электрохимической активности L-тироксина. / C.B. Доме, Е.А. Ивановская // «Авиценна-2013»: материалы IV Российской (итоговой) научно-практической конкурс-конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 2013. - С. 243.

6. Доме, C.B., Ивановская Е.А. Определение трийодтиронина методом инверсионной вольтамперометрии / C.B. Доме, Е.А. Ивановская // «Фармацевтический кластер как интеграция науки, образования и производства»: материалы III Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых. — Белгород, 2013. - С. 113-118.

7. Доме, C.B. Вольтамперометрический способ количественного определения трийодтиронина в модельном растворе и лекарственном препарате / C.B. Доме, Е.А. Ивановская // «Медицина в XXI веке: тенденции и перспектива»: сборник трудов международной виртуальной интернет-конференции. - Казань, 2013. - С. 79-85.

8. Доме, C.B. Вольтамперометрическое исследование электрохимической активности трийодтиронина / C.B. Доме, Е.А. Ивановская // «Химическая наука: современные достижения и историческая перспектива»: сборник трудов конференции. - Казань, 2013.-С. 61-63.

9. Доме, C.B. Вольтамперометрическое определение L-тироксина и трийодтиронина / C.B. Доме, Е.А. Ивановская // «Теоретические и практические аспекты современной медицины»: материалы международной заочной научно-практической конференции. -Новосибирск, 2013. - С. 71-76.

10. Доме, C.B. Использование катодной вольтамперометрии для определения концентрации трийодтиронина / C.B. Доме // «Тенденции и инновации современной науки»: материалы VII международной научно-практической конференции. -Краснодар, 2013.-С. 74.

11. Доме, C.B. Применение вольтамперометрии для количественного определения L-тироксина / C.B. Доме, Е.А. Ивановская // «Проблемы развития фармацевтической науки и образования»: материалы межрегиональной научной конференции с международным участием. - Томск, 2011. - С. 110.

12. Доме, C.B. Количественное определение L-тироксина в модельных растворах./ C.B. Доме, Е.А. Ивановская, C.B. Терентьева // «Авиценна-2010»: материалы ежегодного конкурса-конференции студентов и молодых ученых. —Новосибирск, 2010 - С. 526.

13. Ивановская, Е.А. Разработка методики количественного определения L-тироксина методом вольтамперометрии / Е.А. Ивановская, C.B. Доме // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сборник трудов межвузовской научной конференции, посвященной памяти проф. В.В.Пичугина и 75-летие КГМУ. - Курск, 2009., С.40-42.

14. Баранникова, JT.A., Доме C.B. Разработка экспресс-методики количественного определения L-тироксина./ JI.A. Баранникова, C.B. Доме // «Авиценна -2009»: материалы ежегодного конкурса-конференции студентов и молодых ученых. -Новосибирск, 2009. - С. 40-41.

15. Патент РФ на изобретение № 2428690 «Вольтамперометрический способ количественного определения L-тироксина» от 10.09.2011, заявка №2010126500, приоритет изобретения от 28.06.2010. Авторы: Доме C.B., Мазурикова JI.A., Ивановская Е.А.

Подписано в печать 24.10.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. Заказ № 181.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07