Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка методик изолирования и определения тианептина в биоматериале для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа

На правах рукописи / -

Люст Елена Николаевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ИЗОЛИРОВАНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИАНЕПТИНА В БИОМАТЕРИАЛЕ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОГО И ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 5 МАР ¿0:2

Пермь-2012 005014096

005014096

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент

Малкова Тамара Леонидовна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Коркодинова Любовь Михайловна ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующая кафедрой

доктор фармацевтических наук, профессор Куклин Владимир Николаевич ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, профессор кафедры

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «27» марта 2012 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Мин-здравсоцразвития России по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерству, образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «с/О» февраля 2012 г. и на сайте ПГФА http://www.pfa.ru февраля 2012 г.

Автореферат разослан « » февраля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент

И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Состояние тревоги и беспокойства, депрессия стали часто встречающимися нарушениями здоровья, что значительно снижает качество жизни современного человека. Особенно высока частота депрессии у людей, имеющих различные соматические болезни. Основными признаками депрессии являются подавленное настроение, утрата интереса к жизни, нарушение сна, повышение раздражительности, суицидальные мысли.

Лекарственные средства, применяющиеся для коррекции данных расстройств, относятся к группе антидепрессантов и на текущий момент являются наиболее востребованными лекарственными препаратами. Наряду с этим антидепрессанты относятся к числу наиболее токсичных психотропных веществ. Необоснованное применение, как самостоятельного лекарственного средства, так и в комбинации с другими препаратами, может стать причиной острых отравлений и интоксикаций со смертельным исходом. Вследствие этого отравление антидепрессантами стало актуальной проблемой клинической токсикологии.

Среди антидепрессантов важное место занимают представители три-циклической структуры, к числу которых принадлежит тианептин («Коак-сил®», «51аЫоп®»). Зарегистрированные факты немедицинского применения лекарственного средства свидетельствуют о том, что преднамеренное избыточное потребление тианептина несет в себе угрозу негативных последствий для физического и психического здоровья человека. Последствиями применения завышенных доз тианептина становятся различные психические расстройства, а также соматические осложнения при инъекционном способе введения растертых и суспензированных с водой таблеток.

На основании Постановления Правительства РФ № 486 от 30.06.2010 «О внесении изменений в некоторые акты правительства РФ, связанные с оборотом наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров» тианептин отнесен к списку психотропных веществ (список III).

В связи с этим актуальным является направление по разработке методик судебно-химического и химико-токсикологического анализа тианептина. Цель и задачи исследования

Цель - разработка методик изолирования, обнаружения и количественного определения антидепрессанта тианептина («Коаксил®») для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Для достижения поставленной цели предстояло решить задачи:

> Разработать методики обнаружения тианептина на основе микро-кристаллоскопических реакций и тонкослойной хроматографии

> Разработать методики определения тианептина с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии с масс - детектированием

> Определить оптимальные условия изолирования тианептина из водных растворов

>> Изучить условия экстракции тианептина на модельных смесях биологических объектов (внутренние органы, биожидкости)

> Апробировать результаты исследований по изучению условий экстракции и методик определения тианептина в экспериментах с лабораторными животными

Личный вклад автора

Автором самостоятельно проведены исследования по выбору условий изолирования тианептина и созданию методик его анализа в биологических объектах, разработаны способы идентификации с помощью предварительных и подтверждающих методов, осуществлен анализ полученных экспериментальных данных. Самостоятельно проведены исследования в качестве оператора аналитического оборудования, используемого в работе. Научная новизна

Предложен алгоритм проведения микрокристаллоскопических реакций для идентификации тианептина в ряду антидепрессантов.

f

Разработаны условия определения тианептина и его метаболита в биологических объектах на основе тонкослойной хроматографии (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газовой хроматографии с масс - детектированием (ГХ-МС), установлены их хроматографические параметры. Предложенные методики позволяют определить тианептин в присутствии его метаболита и других антидепрессантов.

На основании изучения степени экстракции разработана методика изолирования тианептина из биоматериала для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Практическая значимость

Результаты проведенных исследований позволяют сформировать алгоритм проведения этапов судебно-химического и химико-токсикологического исследования антидепрессанта тианептина в биологических объектах.

Разработанные методики определения тианептина для целей химико-токсикологического анализа на основе химических и хроматографических методов внедрены в учебный процесс студентов кафедр биохимии с курсом токсикологической химии Оренбургской государственной медицинской академии (акт внедрения от 20 сентября 2011 г.), фармацевтической химии и слушателей центра повышения квалификации специалистов Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (акт внедрения от 20 октября 2011 г.), фармацевтической и токсикологической химии Кемеровской государственной медицинской академии (акт внедрения от 28 октября 2011 г.), в практическую работу судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы Республики Алтай (акт внедрения от 10 октября 2011 г.), Самарского областного бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 03 ноября 2011 г.), Свердловского бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 08 декабря 2011 года), Ульяновского областного бюро судебно-медицинской экспертизы (акт внедрения от 28 декабря 2011 года)

По результатам исследований подготовлено, утверждено Ученым сове-

том Российского центра судебно-медицинской экспертизы и разослано в территориальные бюро судебно-медицинской экспертизы информационное письмо «Обнаружение и количественное определение антидепрессанта тиа-нептина для целей химико-токсикологического анализа».

Апробация работы

Основные материалы работы доложены на научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2007), международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Палермо, 2007), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М. Кубицкого «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009), 74-ой итоговой студенческой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения профессора A.M. Дыхно (Красноярск, 2010), 85-ой Всероссийской студенческой научной конференции памяти профессора Д.М. Зубаирова (Казань, 2011), научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения профессора В.И. Алисиевича «Морфология критических и терминальных состояний» (Москва, 2011), ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2011), Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских ВУЗов: от разработки до коммерциализации» (Пермь, 2011).

Объем и структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы, вклю-

чающего 133 наименования (35 источников зарубежной литературы), приложения. Работа изложена па 118 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу, 32 рисунка и 35 страниц приложения, включающего акты внедрения, Информационное письмо. Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, из них 2 - в журналах Перечня ВАК РФ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007417).

На защиту диссертации выносятся следующие положения:

> Методики обнаружения тианептина на основе тонкослойной хроматографии и микрокристаллоскопических реакций

> Методики подтверждающего исследования тианептина методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии с масс-детектированием

> Результаты изучения условий изолирования тианептина из биообъектов в зависимости от pH раствора и природы органического растворителя

^ Результаты определения тианептина и его метаболита с использованием предложенных методик анализа в модельных смесях и в опытах с биологическими объектами от лабораторных животных ^ Схема анализа тианептина в биообъектах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Обзор литературы

Обобщены данные литературных источников о фармакологических свойствах тианептина, токсических поражениях в случаях злоупотребления препаратом. Описаны способы изолирования, химические и физико-

химические методы анализа, применяемые для идентификации антидепрессантов.

2. Объекты и методы исследования

В эксперименте были использованы объекты исследования:

• рабочий стандартный образец тианептина

• модельные смеси биоматериала

• внутренние органы и биологические жидкости от лабораторных животных (суточная моча, печень, почки крыс)

Оборудование и средства измерений:

Для разработки методики идентификации тианептина методом ТСХ использовали пластинки марок: «Silufol UV 254», «Sorbfil ПТСХ - АФ - В -УФ», «Merck DC - Alufolien RP - 18 F 254».

Для проведения измерений методом ВЭЖХ использовали жидкостный хроматограф «Милихром А-02», детектор - двухлучевой УФ-спектрофотометр (г. Новосибирск, ЗАО Институт хроматографии «ЭКОНО-ВА»), программа обработки данных «МУЛЬТИХРОМ», методика программы «База Данных-2003», аттестованная Государственным комитетом РФ по стандартизации и метрологии в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.56396 и ГОСТ Р ИСО 5725-2002.

Для проведения измерений методом ГХ-МС использовали газовый хроматограф Agilent 7890А с масс-селективным детектором Agilent 5975С (Agilent Technologies (USA)), программно-аппаратный комплекс включает в себя базу данных NIST® 2005.

3. Разработка методик обнаружения тианептина на основе метода ТСХ и МКС-реакций

ТСХ. Подобраны оптимальные условия предварительного обнаружения тианептина: пластинки «Sorbfil ПТСХ - АФ - В - УФ»; хроматографиче-ская система - этанол 96 %: метиленхлорид: аммиака раствор концентрированный 25 % (57,5: 40: 2,5); детекция - облучение УФ-светом при длине вол-

ны 254 (50 мкг), реактив Драгендорфа (50 мкг) (йод кристаллический, 50 мкг); величина ЯГтианептина 0,53 ± 0,05.

Разработанная методика позволяет разделить и идентифицировать тиа-нептин в ряду антидепрессантов (амитриптилин, имипрамин, тианептин, флуоксетин) (рис. 1).

Рисунок 1 - Хроматограмма в системе этанол 96 %: метиленхлорид: аммиака раствор концентрированный 25 % (57,5: 40: 2,5) на пластинке «8огЬЯ1 ПТСХ -АФ - В - УФ» после обработки реактивом Драгендорфа:

1 - амитриптилин ЯГ = 0,86,

2 - имипрамин 0,83,

3 - тианептин И! = 0,53,

4 - флуоксетин ИТ = 0,64,

5 - смесь антидепрессантов

для включения в схему химико-токсикологического анализа тианептина МКС-реакции с реагентами - кадмия хлорида раствором 10 % (предел обнаружения 70 мкг), кобальта роданида раствором (70 мкг), хлорцинкйода раствором (10 мкг). Кристаллы, образованные тианептином с данными реагентами, приведены в таблице 1.

Установлено, что в ряду антидепрессантов (тианептин, амитриптилин, имипрамин, флуоксетин) кроме тианептина либо ни одно из веществ с рекомендованными реагентами кристаллы не образовало, либо форма кристаллов была отличной от формы кристаллов тианептина.

Таблица 1 - Эффекты микрокристаллоскопнческих реакций тианептина

Реактив Эффект (предел обнаружения, мкг)

Кобальта роданида раствор голубые вытянутые топкие прямоугольники (70 мкг)

Хлорцинкйода раствор мелкие темно-коричневые игольчатые (10 мкг)

Кадмия хлорида раствор 10% тонкие игольчатые, собранные в сфероиды(70 мкг)

?о 8

И О 0

О ф 0

т

1 2 3 4 5

МКС. Рекомендованы

4. Выбор условий изолирования из водных растворов и определения тианептнна методами ВЭЖХ и ГХ-1У1С

ВЭЖХ. Исследование проводили обращенно-фазным вариантом ВЭЖХ на приборном комплексе «Милихром А-02» по унифицированной ВЭЖХ-методике анализа (База данных-2003) (табл. 2).

Таблица 2 - Данные анализа тианептнна методом ВЭЖХ (п=5)

Анализируемое вещество Время удерживания, мин Спектральные отношения, Я = 81/8210 ни

220 230 240 250 260 280

Тианептин 20,20 0,494 0,395 0,180 0,056 0,044 0,042

В качестве дополнительного параметра идентификации использовали УФ-спектр тианептнна, полученный непосредственно в режиме хроматогра-фирования (рис. 2).

Рисунок 2 - Хроматограмма элюирования тианептнна методом ВЭЖХ и его УФ-спектр поглощения

Для количественного определения тианептнна нами предложен метод абсолютной калибровки. В качестве параметра, характеризующего содержание исследуемого вещества в пробе, использовали площадь хроматографиче-ского пика. Линейная зависимость между концентрацией растворов и площадью хроматографических пиков наблюдается во всем интервале выбранных концентраций (рис. 3). Предел обнаружения тианептина методом ВЭЖХ составил 4,5 нг. Значение градуировочного коэффициента (к) в соответствии с градуировочной характеристикой Б = к * С было рассчитано методом наименьших квадратов и составило к = 0,3477.

Рисунок 3 - Калибровочный график определения тианептина методом ВЭЖХ (п = 5)

В предложенных хроматографических условиях при проведении скрининга антидепрессантов (амитриптилин, имипрамин, тианептин, флуоксетин) наблюдается эффективное разделение всех исследуемых веществ (рис. 4).

Рисунок 4 - Хроматограмма смеси антидепрессантов (ВЭЖХ):

1 - тианептин 20,080 мин,

2 - имипрамин 22,230 мин,

3 - амитриптилин 23,071 мин,

4 - флуоксетин 23,380 мин

ГХ-МС. Исследование проводили на газовом хроматографе Agilent 7890А (Agilent Technologies (USA)). В ходе испытаний нами был сделан вывод о том, что при стартовых температурах анализа методом ГХ-МС (150 °С, 200 °С) тианептин не переходит в парообразное состояние, поэтому для получения интенсивного ионного тока исследование проводили при повышенных температурах. Таким образом, условиями анализа тианептина выбраны:

> Температура испарителя 250 °С;

У Температура хроматографической колонки: до 70 °С за 5 минут; далее прогрев со скоростью 10 °С в минуту до 300 °С, выдержка 10 минут;

> Температура интерфейса 310 "С.

В данных условиях абсолютное время удерживания для тианептина составило 25,12 мин (таб. 3).

Таблица 3 - Параметры идентификации тпаисптина в методе ГХ-МС

Соединение Параметры идентификации

Время удерживания, мин Характеристические ионы (в порядке уменьшения интенсивности)

Тианептин 25,12 228(100), 293(56), 194(52), 214 (35), 276(28)

Отсутствие молекулярного иона в спектре можно связать с разрушением в процессе анализа молекулы тианептина путем отщепления алифатической цепочки. Ион с наибольшим m/z составляет 293. Наибольшую интенсивность пика имеет фрагментарный ион с m/z 228.

При скрининговых исследованиях группы антидепрессантов (амитрип-тилин, имипрамин, тианептин, флуоксетин) в предложенных хроматографи-ческих условиях ГХ-МС анализа наблюдается эффективное разделение исследуемых веществ с возможностью получения масс-спектров для всего ряда антидепрессантов (рис. 5).

TIC AITF12i;il D-Л

Амитрипташн

Флуоксетин /

-J_и

\

Гт»-1_16 И

ч se_25.00_гам

и.м р оо гг.» гэи гз.»

'«.SO 2! 00_2fM 2i СО «.fO 27 00 .27.М

Ьсет '9Ю9 124 064 тЧ AiTf 1? 13 V I

Тианептин

U_

М__С) _ 70 БЭ * '1*1 ча

гю й] г» . г« . г« г« гк зм

Рисунок 5 - Хроматограмма смеси антидепрессантов и масс-спектр тианептина

Изолирование. Изучение условий изолирования тианептина из водных растворов проводили с использованием ряда растворителей в широком интервале рН от 2 до 12 (рис. 6).

Максимальное извлечение хлороформом наблюдается при рН 3 и 7 (соответственно 75,56 и 67,40 %), эфиром диэтиловым - в интервале рН от 4 до

7 (65,84 % - 69,51 %), метиленхлоридом при значениях рН 4, 5 и 7 (65,34 %, 65,90 %, 66,10 % соответственно). Полученные данные использовали для разработки методики изолирования тианептина из биологических объектов.

5. Изучение условий изолирования и определения тианептина в биологических объектах

В опытах с модельными смесями биожидкостей и тканей органов установлено, что максимальное извлечение тианептина достигается в следующих условиях:

- из мочи: с использованием хлороформа при рН 3 (52,74 %), эфира ди-этилового - при рН 5 (69,87 %), метиленхлорида - при рН 7 (52,60 %);

- из плазмы: с использованием хлороформа при рН 5 и 6 (29,52 % и 31,61 % соответственно), метиленхлорида - при рН 6 (33,81 %), эфира диэти-лового - при рН 7 (19,60 %);

- из биологических органов: в условиях ненаправленного (метод Васильевой А.А.) и направленного исследования (метод Валова П. и метод Крамаренко В.Ф.).

Таким образом, установлено, что тианептин извлекается в широком интервале значений рН. В условиях направленного анализа пробоподготовку целесообразнее вести из кислых растворов, в случае ненаправленного исследования изолирование можно проводить при рН 8-9, так как при щелочных значениях рН изолируется большинство наркотических средств и психотропных веществ. Пробоподготовку из биологических органов с целью иденти-

80

Рисунок 6 - Зависимость степени экстракции тианептина из водных растворов от рН раствора и природы органического растворителя

5 10

рНбуфгрного раствора

15

фикации и установления концентрации тианептина целесообразно вести по методике Васильевой A.A. с экстракцией тианептина как из кислого, так и щелочного раствора.

Балластные вещества биообъектов, извлекающиеся совместно с тиа-нептином, не мешают его хроматографическому определению, так как имеют меньшие времена удерживания. Причем, при использовании хлороформа экстрагируется гораздо меньшее количество балластных веществ.

В работе с биологическими объектами от лабораторных животных использовали нелинейных беспородных лабораторных животных - белых крыс массой 180,0 - 220,0 г, одно животное использовалось в качестве контрольного (холостой опыт). Изолирование из биологических объектов вели по классическому методу Васильевой A.A. - водой, подкисленной щавелевой кислотой; из суточной мочи тианептин последовательно извлекали прямой экстракцией при pH 3-4 и 8-9. Полученные извлечения анализировали методами ВЭЖХ, ГХ-МС, ТСХ, МКС-реакциями. Параллельно основному исследованию в тех же условиях вели изолирование из контрольных образцов.

Исследование методом ТСХ

Экстракты из биологических объектов и холостых проб, рабочий стандартный образец тианептина наносили на пластинку «Sorbfil ПТСХ - АФ - В -УФ». Хроматографирование вели в системе растворителей этанол 96 %: ме-тиленхлорид: аммиака раствор концентрированный 25 % (57,5: 40: 2,5). После высушивания пластины просматривали в УФ свете.

При использовании данной хроматографической системы удалось отделить тианептин от метаболита. При этом значения Rf как для стандартного образца, так и тианептина в извлечениях составили 0,53 ± 0,05. Для метаболита значение Rf составило 0,30 ± 0,05 (рис. 7).

Для детектирования тианептина и его метаболита рекомендуется облучение пластины УФ-светом с дальнейшей обработкой реактивом Драгендор-фа или парами йода. Реактивы не являются специфичными по отношению к тианептину и его метаболиту, однако, дают с ними четкий аналитический

эффект. Далее из зон локализации пятен (тианептин, метаболит) вещества элюировали и исследовали методами ВЭЖХ и ГХ-МС.

е I • • •

и

12 3 4 5

Рисунок 7 - ТСХ-пластина при облучении УФ-светом:

1 — экстракт холостой пробы (почка),

2 — экстракт из почек,

3 - экстракт из мочи,

4 - экстракт холостой пробы (моча),

5 - рабочий стандартный раствор

тианептина 100 мкг

Проведение МКС-реакций

МКС-реакции с экстрактами из биообъектов проводили с кадмия хлорида раствором 10 %, так как в экспериментах с модельными смесями после извлечения тианептин образовывал кристаллы именно с этим реагентом. Одновременно проводили реакцию с извлечениями из холостых проб и контрольную реакцию только с реактивами. Наблюдали под микроскопом образование характерных кристаллов (рис. 8).

Рисунок 8 - Кристаллы тианептина с кадмия хлорида раствором 10 % после извлечения из ткани почки

Исследование методом ВЭЖХ

Хроматографировали экстракты из биологических объектов (мочи, печени, почек) по выбранным нами условиям. В качестве параметров идентификации использовали абсолютное время удерживания и УФ-спектр.

На рисунке 9 представлены хроматограммы извлечений из биологических объектов (суточная моча, печень). Абсолютные времена удерживания для тианептина и его метаболита составили: моча - тианептин 20,03 мин, метаболит 26,02 мин; почка - тианептин 20,11 мин, метаболит 25,82 мин; печень - тианептин 20,12 мин, метаболит 25,78 мин.

В экспериментах с холостыми пробами установлено, что балластные вещества биообъектов не мешают хроматографическому определению тианептина и его метаболита.

А Б

Рисунок 9 - Хроматограммы определения тианептина и метаболита МС5 методом ВЭЖХ: А - в моче, Б - в печени (детекция многоволновая)

Исследование методом ГХ-МС

Анализировали экстракты из биологических объектов (суточной мочи, печени, почек) методом ГХ-МС по выбранным нами условиям. Идентификацию осуществляли на определении времени удерживания и масс-спектрам. На хроматограммах обнаруживали пик тианептина со временем удерживания 25,13 мин. Основные характеристические ионы идентичны параметрам, установленным при хроматографировании рабочего стандартного раствора тианептина.

Кроме того, на хроматограммах присутствует пик соединения с временем удерживания 30,56 мин, которое мы идентифицировали как основной метаболит тианептина - МС5. Однако, вероятно, в условиях анализа метаболит МС5 подвергается химическому превращению - дегидратированию с

циклизацией, что может объяснять отсутствие молекулярного иона в спектрах метаболита. Для метаболита ион с наибольшим m/z составляет 390. Наибольшую интенсивность пика также имеет фрагментарный ион с m/z 228.

Хроматограмма и масс-спектры тианептина и метаболита в извлечениях из ткани почки представлены на рисунке 10. Метаболит извлекается в тех же условиях, что и тианептин.

Абсолютные времена удерживания для тианептина и метаболита составили: моча - тианептин 25,13 мин, метаболит 30,56 мин; почки - тианептин 25,14 мин, метаболит 30,52 мин; печень - тианептин 25,12 мин, метаболит 30,53 мин.

Рисунок 10 - А — Хроматограмма экстракта из почек, Б - масс-спектр тианептина, В — масс-спектр метаболита МС5

Параметры идентификации (время удерживания, основные характеристические ионы и их интенсивности) тианептина и его метаболита в моче, почке, печени приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты определения параметров идентификации тна-нептина и его метаболита в биообъектах методом ГХ-МС (п-5)_

Соединение Время удерживания, мин Характеристические ионы (в порядке уменьшения интенсивности)

Печень

Тианептин 25,12 228 (100), 293 (53), 194 (46), 214 (35), 276 (23)

Метаболит МС5 30,53 228 (100), 255 (48), 165 (52), 207 (61), 193 (27), 390 (16)

Почки

Тианептин 25,14 228 (100), 293 (47), 194 (68), 214 (34), 276 (26)

Метаболит МС5 30,52 228 (100), 255 (49), 165 (37), 207 (58), 191 (23), 390 (18)

Моча

Тианептин 25,13 228(100), 293(55), 194(50), 214(37), 276(24)

Метаболит МС5 30,56 228(100), 255(39), 165(38), 213(24), 193(22), 390(11)

Таким образом, предложенные условия ГХ-МС анализа позволяют полностью разделить и идентифицировать как тианептин, так и его метаболит МС5 в биологических объектах.

Нами проведена валидация разработанных методик определения тиа-нептина в биологических объектах методами ВЭЖХ и ГХ-МС, рассчитаны метрологические характеристики определения тианептина для трех концентраций и в 3-х повторностях в различных биологических объектах (моча, печень). Проведенная валидационная оценка показала, что методики отличаются специфичностью, чувствительностью, правильностью, повторяемостью, а метод ВЭЖХ линейной зависимостью, внутрилабораторной прецизионностью полученных результатов.

Схема анализа тнапептнна

Биологическая жидкость (моча)

Стадия изолирования

Жидкость-жидкостная экстракция pH 3-4, хлороформ

Изолирование по методике

Васильевой A.A. (вода, подкисленная щавелевой кислотой раствором 10 %) pH 3-4 и 8-9, хлороформ

Стадия предварительного обнаружения

Тонкослойная хроматография Пластинки: «ЭогШ ПТСХ - АФ - В - УФ» Система: этанол 96 %: метиленхлорид: аммиака раствор концентрированный 25 % (57,5: 40: 2,5) __Детекция: УФ-свет, реактив Драгендорфа_

Стадия обнаружения

Микрокристаллоскопический анализ

Реактив: кадмия хлорида раствор 10 %

Хромато-масс-спектрометрия Газовый хроматограф Agilent 7890А с масс-детектором

Стадия количественного определения

Высокоэффективная жидкостная хроматография «Милихром А-02» База данных-2003

20

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики обнаружения тианептина на основе ТСХ и МКС-реакций. Оптимальная хроматографическая система для анализа тианептина методом ТСХ: этанол 96 %: метиленхлорид: аммиака раствор концентрированный 25 % (57,5: 40: 2,5). Детектор: УФ-свет, реактив Драгендорфа (предел обнаружения 50 мкг). Значение ЯГ тианептина составило 0,53 ± 0,05. Рекомендована для включения в схему химико-токсикологического анализа МКС-реакция с кадмия хлорида раствором 10 % (предел обнаружения 70 мкг).

2. Разработаны методики исследования тианептина методами ВЭЖХ и ГХ-МС. Установлены параметры идентификации тианептина методом ВЭЖХ -время удерживания 20,20 мин, спектральные соотношения, спектр поглощения в УФ-области (предел обнаружения - 4,5 нг). Относительная погрешность обнаружения - 0,47 %. Установлены параметры идентификации тианептина при анализе методом ГХ-МС - время удерживания 25,13 мин, основные характеристические ионы масс-спектра 228, 293, 194, 214, 276 (предел обнаружения - 0,05 нг). Относительная погрешность обнаружения - 0,11 %.

3. Изучена степень извлечения тианептина из водных растворов в зависимости от рН буферного раствора и природы органического растворителя. Оптимальный экстрагент хлороформ, рН 3 (75,6 %).

4. Изучены условия изолирования тианептина из биожидкостей на примере модельных смесей, оптимальный экстрагент - хлороформ: степень извлечения из мочи при рН 3 - 52,74 %, из плазмы крови при рН 5-6 - около 30,00 %. Изолирование тианептина из биоорганов целесообразно вести по схеме ненаправленного анализа (методика Васильевой А.А.), выход 29,34 %.

5. С положительным результатом апробированы методики изолирования тианептина и его определения с использованием методов ТСХ, МКС, ВЭЖХ, ГХ-МС в опытах с биологическими объектами от лабораторных животных, разработана схема анализа. Установлено, что в данных условиях возможно достоверное определение тианептина и его метаболита МС5. Относительная

погрешность обнаружения в биообъектах методом ВЭЖХ не превышает для тианептина 0,47 %, для метаболита 0,65 %, методом ГХ-МС соответственно не превышает 0,17 % и 0,11 %.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1. Люст, E.H. Определение тианептина в моче / E.H. Люст // Вести. Рос. ун-та дружбы народов : серия медицина. - 2009. - № 4. — С. 137-140.

2. Люст, E.H. Токсикологическое значение тианептина и актуальность экспертного исследования с целью его обнаружения в биологическом материале / E.H. Люст, Т.Л. Малкова // Медицинская экспертиза и право.-2011.-№ 5.-С. 10-12.

3. Люст, E.H. К вопросу химико-токсикологического анализа тианептина, используемого в немедицинских целях / E.H. Люст, Т.Л. Малкова, Л. Фнан // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтич. продукции : сб. науч. тр. - Пятигорск, 2007. - Вып. 62. — С. 327-328.

4. Разработка методики определения ряда антидепрессантов методом ВЭЖХ для целей химико-токсикологического анализа / E.H. Люст [и др]. // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2007. -№2-С. 157-160.

5. Люст, E.H. Химико-токсикологическое исследование «Коаксила» / E.H. Люст, Т.Л. Малкова, Ю.Н. Карпенко // Здоровье и образование : материалы междунар. науч.-практич. конф. (8-15 окт. 2007 г., Сицилия (Палермо)). -Пермь: ГОУ ВПО ПГМА им. акад. Е.А. Вагнера Росздрава, 2007. - С. 139143.

6. Люст, E.H. Изолирование тианептина из мочи и его определение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / E.H. Люст, Т.Л. Малкова, Ю.Н. Карпенко // Сб. материалов всерос. науч.-практич. конф., посвящ. памяти проф. Ю.М. Кубицкого (31 окт. - 01 нояб. 2007 г., Москва) «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и хи-

мико-токсикологических экспертных исследований»; под ред. В.А. Клевно -М. : РИО ФГУ РЦСМЭ Росздрава, 2007. - С. 244-246.

7. Люст, E.H. Тонкослойная хроматография в анализе тианептина / E.H. Люст, К.С. Кабышко // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2008. -№ 4 - С. 191-193.

8. Люст, E.H. Разработка методик качественного химического анализа для целей химико-токсикологического исследования / E.H. Люст, Е.В. Беляева // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2009. -№ 5 - С. 132-133.

9. Люст, E.H. К изолированию тианептина из биологического материала / E.H. Люст, Е.В. Пунтус // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2009. - № 5 - С. 148-150.

10. Люст, E.H. Тонкослойная хроматография и качественный химический анализ в химико-токсикологическом исследовании тианептина / E.H. Люст, Е.В. Беляева // Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа : материалы Рос. науч.-практич. конф. с международ, уч. (28 сент. - 3 окт. 2009). - Пермь, ГОУ ВПО ПГФА Росздрава, 2009. - С. 59 - 62.

11. Люст, E.H. Качественный химический анализ при идентификации тианептина / E.H. Люст // Альманах судебной медицины. - СПб. : Юридический центр Пресс, 2009. - № 5 (13). - С.48-49.

12. Люст, E.H. Изучение степени экстракции тианептина из плазмы / E.H. Люст, О.С. Новоселова, H.A. Урасова // Сб. материалов 74-ой итог, студен, науч.-практич. конф. с международ, уч., посвящ. 100-летию со дня рожд. проф. A.M. Дыхно. - Красноярск, 2010. - С. 567-569.

13. Люст, E.H. Анализ литературных данных по вопросу злоупотребления тианептином / E.H. Люст, H.A. Урасова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2010. -№ 6 - С. 350-351.

14. Люст, E.II. Изучение степени экстракции тнанептина из биологической жидкости (плазма) / E.H. Люст, О.С. Новоселова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2010. -№ 6- С. 175-177.

15. Люст, E.H. К вопросу экспертного анализа тианептииа / E.H. Люст, H.A. Урасова // Сб. тезисов 85-ой Всерос. студен, науч. конф. памяти проф. Д.М. Зубаирова (15-16 апр. 2011 г., Казань).- Казань, 2011. - С. 350.

16. Люст, E.H. Возможность использования метода газовой хроматографии для обнаружения тианептина в моче / E.H. Люст, H.A. Урасова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2011. - № 8 - С. 119-121.

17. Люст, E.H. Изучение условий обнаружения тианептина в биологических органах крыс / E.H. Люст, Г.А. Терёхин //: Материалы науч.-практич. конф. с международ, уч., посвящ. 85-летию со дня рожд. проф. В.И. Алисевича «Морфология критических и терминальных состояний». - М. : ЮрИнфоЗд-рав, 2011.-С. 120-124.

18. Люст, E.H. К вопросу о токсикологическом значении антидепрессанта тианептина / E.H. Люст // Фармация и общественное здоровье : материалы ежегод. конф. - Екатеринбург, 2011. - C.III-V.

19. Люст, E.H. К вопросу химико-токсикологического анализа антидепрессанта тианептина / E.H. Люст // Материалы науч.-практич. конф. с международ. уч., посвящ. 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» (7-9 дек. 2011 г., Пермь). -Пермь, 2011. - С.110-112.

Люст Елена Николаевпа (Россия)

Разработка методик изолирования н определения тиапептнна в биоматериале для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа

Работа посвящена разработке методик анализа трициклического антидепрессанта тианептина («Коаксил®») для целей химико-токсикологического и судебно-химического исследования. Предложены предварительные и подтверждающие способы идентификации тианептина химическими и физико-химическими методами в биологических объектах (микрокристаллоскопия, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия). Определены условия изолирования тианептина из биообъектов.

Lyust Elena (Russia)

Development of methods of isolation and determination of tianeptine in biological material for forensic-chemical and chemical-toxicological analysis

The work is devoted to developing techniques for the analysis of tricyclic antidepressant tianeptine («Coaxil®») for chemical-toxicological and forensic-chemical study. Preliminary and confirmatoiy methods of identification of tianeptine chemical and physico-chemical methods to biological objects (mikrokristal-loskopiya, thin-layer chromatography, high performance liquid chromatography, gas chromatography-mass spectrometry) were proposed. The conditions for isolation of biological objects tianeptine were determined.

Подписано в печать 20.02.2012 Формат 60*84/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Усл. печ. л 1,5 Заказ № 27/2012.

Отпечатано на ризографе в типографии ГБОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел. (342) 282-57-92