Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка и оптимизация методик определения опийных алкалоидов и их производных в наркотических средствах и биологичесокм материале

На правах рукописи /

Барсегян Самвеп Сврежаевич

Разработка и оптимизация методик определения опийных алкалоидов и их производных в наркотических средствах и биологическом материале

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

г 8 АВГ 2014

Москва - 2014

005551955

005551955

Работа выполнена ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов».

Научный руководитель:

Плетенева Татьяна Вадимовна, доктор химических наук, профессор, заведующая кафедрой фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов».

Официальные оппоненты:

Гармонов Сергей Юрьевич, доктор химических наук, профессор, профессор кафедры аналитической химии, сертификации и менеджмента качества ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Каленикова Елена Игоревна, доктор фармацевтических наук, заведующая кафедрой фармации, Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет»

Защита диссертации состоится «_22_»_сентября_2014 г. на заседании

Диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина,7) по адресу: 123056, ул. Красина, д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, д. 7

Автореферат разослан: « »_2014 г.

Факс: 8(495)712-09-18 E-mail:dis-sovet@mail.ru, www.vilarnii.ru

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук ^^А.--------Громакова Алла Ивановна

Актуальность темы. Идентификация и определение содержания наркотических средств (НС) в биологических материалах, лекарственных средствах и вещественных доказательствах играют важную роль в криминалистике, судебной химии, клинической лабораторной диагностике и фармацевтическом анализе. С этой целью возможно использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), особенно ее микроколоночного варианта. Метод позволяет идентифицировать полярные и термолабильные вещества, существенно повышая качество и достоверность исследований и снижая их стоимость.

Однако использование микроколоночного ВЭЖХ в рутинном токсикологическом анализе, в криминалистической и медицинской практике ограничено из-за отсутствия унифицированных методик.

Совершенствование и унификация методик определения наркотических средств, в том числе опиатов (морфина, кодеина, диацетилморфина, моноацетилморфина, дезоморфина и др.), позволит расширить область использования ВЭЖХ в экспертной практике, повысит достоверность фармацевтического и клинического анализа, увеличит объективность рассмотрения административных и уголовных дел в судебной практике.

Цель работы: Разработка и совершенствование методик микроколоночного ВЭЖХ-определения алкалоидов опия и способов интерпретации результатов анализа.

В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

1. Оптимизировать и унифицировать процедуру пробоподготовки образцов наркотических средств (НС) для определения в них опиатов методом микроколоночной ВЭЖХ.

2. Оптимизировать методику микроколоночного ВЭЖХ- определения опия и героина для выбора идентификационных признаков и установления общности источника происхождения НС.

3. Разработать алгоритм оценки идснгнчности образцов героина по содержанию 6-моноацетилморфина, диацетилморфина, кодеина, морфина, наркотина для оперативного отслеживания поступления наркотических средств в регион.

4. Исследовать возможности применения микроколоночной ВЭЖХ для идентификации компонентов кустарно изготавливаемого НС на основе дезоморфина.

5. Разработать методики ВЭЖХ - определения опиатов в биологических материалах (кровь моча, печень, желчь) с использованием УФ- и масс - селективного детекторов.

Научная новизна исследования.

1. Впервые разработаны экономичные методики сравнительного исследования наркотических средств опия, героина с применением микроколоночлой ВЭЖХ, позволяющие сократить длительность и стоимость анализа.

2. Выявлены идентификационные признаки, по которым устанавливают общность источника происхождения НС и формируют базы данных об образцах. Эта информация позволяет проследить пути распространения и перемещения наркотического средства.

3. Предложен уникальный подход для оценки идентичности образцов героина (метод многофакторного анализа): по значению угла между парами векторов, размер которых соответствует площадям хроматографических пиков пяти основных компонентов героина (б-моноацетилморфина, диацетилморфина, кодеина, морфина, наркотина).

4. Впервые в экспертных образцах и биологическом материале идентифицирован 7,8-дидегидродезоморфин (побочный продукт синтеза дезоморфина). Для дезоморфина и 7,8-дидегидродезоморфина определены времена удерживания, УФ- и масс-спектральные характеристики.

5. Разработаны методики качественного и количественного определения морфина и кодеина в крови, моче, желчи и тканях печени с применением ВЭЖХ с УФ-и масс-селективным детектором в двух режимах работы по выбранным ионам. Отличительные особенности методик: использование малого количества биоматериала (2-6 г); высокая воспроизводимость результатов (среднее значение относительной погрешности 10%), низкий предел определения (до 0,02 мкг/мл (г)).

Практическая значимость работы.

Создана база данных в виде компьютерной программы, содержащая хроматографические данные об образцах героина (более 300), позволяющая выявлять образцы с общим источником происхождения по сырью.

Разработанные методики с 2004 г. внедрены в повседневный токсикологический анализ при проведении экспертиз с целью идентификации и определения содержания опиатов в образцах НС, а также при сравнительных экспертизах героина и опия в ЭКО

4

Управления Федеральной службы РФ но контролю за оборотом наркотиков по Кемеровской области (Акт внедрения № 56/2372 от 28 февраля 2008 г.).

Разработанные методики определеЕпм морфина и кодеина в биологическом материале с 2004 г. используют в химико-токсикологической лаборатории ГУЗ "Кемеровский областной клинический наркологический диспансер" и в химическом отделении Кемеровского областного бюро судебно-медицинской экспертизы для проведения химико-токсикологических и судебно-химических исследований.

С 2010 г. разработанные методики определения морфина и кодеина в биологическом материале используют в экспертной практике отделения общих химических методов исследования Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы. Методика модифицирована для ВЭЖХ с одноквадруполышм масс-селективным детектором.

По результатам исследований подготовлены и внедрены два рационализаторских предложения для использования в экспертной практике:

1. Удостоверение на рационализаторское предложение № 116 от 25.06.2007 г., принятое Бюро судебно-медицинской экспертизы ДОЗН Кемеровской области к использованию под наименованием «Способ очистки гидролизатов биоматериала при количественном определении морфина и кодеина методом ВЭЖХ с помощью амилового спирта»

2. Удостоверение на рационализаторское предложение №115/2 от 28.05.2007 г., принятое Бюро судебно-медицинской экспертизы ДОЗН Кемеровской области к использованию под наименованием «Способ подщелачивания кислотных гидролизатов биоматериала при судебно-химическом исследовании на алкалоиды опия».

Результаты исследований явились основой для издания Информационного письма ФГБУ Российского центра судебно-медицинской экспертизы Минздравсоцразвития России «Об определении морфина и кодеина в моче и желчи с применением тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии» (Москва, 2010 г.).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены в устных докладах на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы химико-'гоксикологического анализа наркотических средств» (г. Санкт-Петербург, 1999 г.); научно-практической конференции «Непрерывное последипломное образование - инвестиции в здравоохранение России» посвященной 25-летию факультета последипломного образования

провизоров (г. Москва, 2005 г.); всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектромегрия» »освещенный к 100-летию со дня рождения профессора A.B. Киселева). Москва - Клязьма 14 - 18 апреля 2008 г; VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока ». Томск 13-18 октября 2008 г.; научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора О.Х. Поркшеяна (г. Москва, МГСУ, 2010 г.); научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (г. Москва, 2012 г.), объединенном научном семинаре кафедры фармацевтической и токсикологической химии, кафедры биохимии, кафедры общей и клинической фармакологии и лаборатории физико-химических методов исследования ЦКП (НОЦ) РУДН (Москва, 25.01.2013), на заседании секции по поиску биологически активных веществ, технологии получения лекарств, фармацевтической химии, фармакогнозии Ученого совета ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии от 25 октября 2013 г.

Личное участие автора. Данные, приведенные в диссертации, получены при непосредственном участии автора как на этапах постановки задач и разработки методических подходов к их выполнению, так и при наборе первичных фактических данных, статистической обработке и анализе полученных результатов и написании публикаций. Диссертация и автореферат написаны лично автором.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности по специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведённого исследования соответствуют пункту 3 «Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления»; пупкту 4 «Разработка методов анализа лекарственных веществ и их метаболитов в биологических объектах для фармакокинетаческих исследований, эколого-фармацевтического мониторинга, судебно-химической и наркологической экспертизы».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 8 статей, 6 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 - в зарубежной печати, тезисы к 7 докладам.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Усовершенствование методики микроколоночного ВЭЖХ определения опия и героина с целью установления общности источника происхождения.

2. Усовершенствование процедуры создания базы данных по НС для экспертно-криминалистических учреждений. Разработка алгоритма обработки хромэтографических данных.

3. Оптимизация методики определения дезоморфина при экспертно-криминалистических и химико-токсикологических исследованиях.

4. Усовершенствование методики ВЭЖХ определения морфина и кодеина в биологическом материале с применением внутреннего стандарта (ВС) - налтрексона.

5. Особенности применения разработанных методик определения опиатов при исследования на жидкостных хроматографах Agilent 1200, Agilent Technologies, США с масс-селективными детекторами 6110.

Объем п структура диссертации.

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, главы, включающие описание материалов и методов и результаты исследования и их обсуждение, выводы, список литературы, приложения. Работа изложена на 141 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком, содержит 43 таблицы. Библиографический перечень включает 181 наименование, из них 116 - на иностранных языках. Приложение - на 2 листах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использовали оборудование:

- микроколоночный жидкостный хроматограф "Милихром А-02" (ЗАО "ЭкоНова", Новосибирск);

- жидкостной хроматограф Agilent 1200, Agilent Technologies, США, с масс -селективным детектором Agilent 6110 Quadrupole LC/MS с источником ионизации электрораспылением (США);

- газовый хроматограф Agilent 6850 с масс - селективным детектором Agilent 5973, Agilent Technologies (США);

- встряхиватель «Ротатор программируемый MULTI RS-60» (BioSan Латвия), центрифуга Eppendorf 5810 (Эппендорф, Германия), аналитические весы «OHAUS. Pioneer РА213 С» (США).

Реактивы. Вода для ВЭЖХ; ацетонитрил для ВЭЖХ, "сорт 0" НПК "Криохром", С.-Петербург; кислота соляная, стандарт-титр. ТУ 6-09-2540-72; натрия гидроксид, "х.ч."; гидрокарбонат натрия "х.ч.".

Реактивы производства "ALDRICH", США: перхлорат лития тригидрат, кислота хлорная, кислота соляная концентрированная, кислота серная концентрированная, амиловый спирт, диэтиловый эфир, хлороформ, этиловый спирт, бензол, диэтиламин, изопропиловый спирт, безводный сульфат натрия, формальдегид, трифторуксусная кислота, трихлоруксусная кислота.

В качестве дериватизируюших реактивов использовали TFA (трифторуксусный ангидрид), BSTFA (М,0-бис-(триметилсилил)-трифторацетамид), MBTFA (N-метил-бис-(трифторацетамид)), фирмы «Sigma» (США).

В качестве стандартных содинений были использованы рабочие стандартные образцы из коллекции, централизовано поступающие в экспертно-криминалистические лаборатории.

Графики строили в программме Origine, химические формулы - с использованием программы ChemOffïce.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Microsoft Office Excel 2007 в соответствии с требованиями ГФ XI (раздел 1.4).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выбор режима хроматографического разделения алкалоидов опия

Условия хроматографического разделения подбирали с учетом опубликованных ранее методик [Baram G.I., 1996, Барам Г.И., 2003; Исии Д., 1991]. В указанных работах теоретически обоснована реализация метода микроколоночного варианта ВЭЖХ в режиме многоволнового детектирования на обращенно-фазовых сорбентах при линейном градиентном элюировании для определения низкомолекулярных азотсодержащих оснований.

Одновременное уменьшение длины колонки и ее внутреннего диаметра приводит к сокращению времени анализа и расхода подвижной фазы. В наших исследованиях оптимальной оказалась длина колонки 75 мм с внутренним диаметром 2 мм. Дальнейшее уменьшение внутреннего диаметра колонки приводило к увеличению давления в системе. При выбранных условиях расход элюента снижается в 10 раз.

Выбор длин волн детектирования. Для алкалоидов группы опия основной длиной волны является ^=210 нм, которая соответствует максимальному поглощению. При многоволновом детектировании рассчитывали спектральные отношения, т.е. отношение площадей пиков зарегистрированных при длине волн и базовой длины волны Х=210 нм. Идентификацию веществ проводили по спектральным отношениям, характерным для каждого исследуемого вещества (210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм).

Выбор подвижной фазы. Для выбора оптимальных условий элюирования сравнивали разделение компонентов опия в двух ражимах: 1-е применением 0,2 M водный раствор перхлората лития (ПХЛ) и II - с применением 0,1 % раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ) - как наиболее перспективных для разделения опийных алкалоидов.

В режиме с применением ПХЛ наблюдали более высокое разделение минорных пиков, что способствовало получению стабильных, воспроизводимых значений их площадей. При хроматографировании в режиме I фактор емкости больше (например, для морфина I - 3,76 и II - 3,42), а коэффициент асимметрии пиков меньше (I - 1,59 и II - 2,43), чем в режиме II. В связи с этим для дальнейшей работы использовали режим элюирования I.

2. Применение метода ВЭЖХ при установлении общности источника происхождения опия

Для экстракции исследуемых веществ из опия использовали слабо подкисленный водный раствор этилового спирта с содержанием этанола 5-50%. Повышение содержания этанола в водно-спиртовых смесях более 20% приводило к раздвоению пика морфина. Использование раствора этанола с концентрацией 20% и ниже позволяло добиться разделения минорных компонентов.

Для оптимизации времени экстракции алкалоидов опия определяли содержание наркотически активных компонентов (HAK) в образцах после изолирования в описанных выше условиях (табл. 1). Уже через 15 мин экстракции извлечение алкалоидов происходит на 87-89%. После двухчасовой экстракции изменения содержания экстрагируемых соединений в растворе практически не происходит. Таблица 1. Зависимость степени извлечения морфина, кодеина и тебаина из

Время экстракции, ч Содержание НАК в образце

Морфин Кодеин Тебаин Наркотин"'

т % Q а1 % Q т% е ш% Q

0,25 7,1 100 3,0 39,5 1,6 29,0 - 29,0

03 7,3 100 3,1 39,3 1,7 28,4 - 28,4

1 7,4 100 3,1 39,9 1,7 30,2 - 30,2

2 7,6 100 3,2 39,9 1,8 29,1 - 29,1

4 7,6 100 3,2 39,9 1,7 28,8 28,8

9 7,7 100 3,2 40,0 1,8 29,0 - 29,0

24 8,1 100 3,4 39,3 1,8 28,3 - 28,3

ш содержание НАК в опии (масс %), Ц - содержание НАК относительно содержания морфина о210 /с210

вещество / морфин '

*> Здесь и далее под пиком "наркотин" подразумевается суммарный пик наркотина и папаверина, папаверин находится в значительно меньших концентрациях, чем наркотин.

Каждый экспертный образец опия количественно характеризовали по совокупности признаков: идентифицированные компоненты; объём удерживания; площадь хроматографического пика; значения спектральных отношений; содержание морфина; содержание НАК относительно морфина (рис.1, табл.2).

Для оценки воспроизводимости разработанной методики проводили исследование образца опия, высушенного до постоянной массы при 110°С. Определяли среднее значение содержания (%) НАК в опии - Х^ (табл. 3), полуширину доверительного интервала (ЛЛ") и относительную погрешность среднего результата (£сР = Ж).

2000

2500

1000 1500

Объбм, мкл

Рисунок 1. Хроматограмма экстракта из образца опия.

Проба: 1% раствор опия, экстракция 20% водным раствором этилового спирта в 0,01Мрастворе соляной кислоты. Объем пробы: 4 мкл.

Относительная погрешность среднего результата £ср (табл. 3) при определении массовой доли и относительного содержания основных НАК не превышает 4%. При определении содержания минорных компонентов относительная погрешность (£ср) также не превышает 4%. Таким образом, относительная погрешность определения опиатов в образцах опия менее 4% должна рассматриваться как один из существенных показателей идентичности образцов опия. В методической литературе по проведению сравнительных исследований различных образцов НС такой критерий не был описан

Таблица 2. Результаты хроматографического исследования опия

Нумерация пиков на рис. 1. Vr- объем удерживания (мкл), S210 ■ площадь пика при длине волны детектора л 210 нм (е.о.п. • икл,&% - содержание НЛК в опии (масс%), Q - содержание НАК относительно содержания морфина

^210 /с210

вещество / ]

морфин

JVj пика VR $110 Спектральные отношения SyJSno Идентифицированные соединения Q (0%

Sna Sna Sna S250 Sno ■S280 •S300

1. 751 72,13 0,62 0,24 0,17 0,08 0,02 0,06 0,01 Морфин 100,0 5,17

2. 1044 32,95 0,67 0,24 0,20 0,11 0,03 0,06 0,01 Кодеин 45,68 2,50

3. 1250 1,83 1,33 1,15 0,45 0,17 0,37 0,35 0,19 - 2,53 -

4. 1279 1,33 1,42 1,17 0,49 0,19 0,36 0,34 0,23 - 1,84 -

5. 1299 3,88 0,22 0,20 0,13 0,00 0,01 0,11 0,02 - 5,38 -

6. 1321 3,94 0,77 0,71 0,45 0,30 0,26 0,38 0,34 - 5,47 -

7. 1380 3,74 0,40 0,25 0,18 0,04 0,03 0,04 0,16 - 5,19 -

8. 1558 23,51 0,57 0,52 0,33 0,15 0,14 0,28 0,18 Тебаин 32,59 1,34

9. 1715 102,6 0,84 0,44 0,35 0,35 0,14 0,06 0,078 Наркотин 142,5 5,82

10. 2035 84,45 0,65 0,28 0,035 0,03 0,03 0,00 0,00 Димедрол 117,1 5,90

Для образцов с £ср < 4% сравнивали доверительные интервалы (Хср ± АХ) при определении массовой доли и относительного содержания НАК и минорных

компонентов. Если значение £ср превышало 4%, то отличить один образец от другого было невозможно из-за высокого значения систематической погрешности. В таких

ю

случаях необходимо выявить причину систематической погрешности и повторить измерения.

Таблица 3. Результаты количественного определения образца опия (л=10)*

Наркотически активный компонент Массовая доля IIAK в образце опия, е>% Относительное содержание HAK, Q

Хер ах Хер ах f

Кодеин 3,76 0,13 3,46 36,08 1,31 3,63

Морфин 9,85 0,25 2,54 100 - -

Тебаин 2,06 0,06 2,91 26,33 0,28 1,06

Наркотин - - - 124,98 1,55 1,24

'Приведены средние значения. Здесь и далее Р=0,95

В табл. 4 представлены результаты сравнительных исследований экспертных образцов опия, выполненных по описанной выше методике. Относительная ошибка определения содержания всех HAK для образцов Л и L не превышает 4% и доверительные интервалы перекрываются. Это позволяет высказать предположение о том, что образцы ранее составляли единую массу. Доверительные интервалы содержания HAK в образцах В, С и Е отличаются как между собой, так и от образцов А и L, и не перекрываются. Можно сделать вывод, что образцы A-L и В-С-Е не составляли ранее единую массу. Таким образом, разработанная методика качественного и количественного определения наркотически активных компонентов и микропримесей опия позволяет выявить идентификационные признаки общности источника происхождения опия.

Таблица 4. Результаты сравнительных исследований экспертных образцов опия

Образец Массовая доля HAK в образце опня, ш% Относительиое содержание IIAK, Q

колени | морфин | Тебаин кодеин 1 тебаин 1 наркотин

Образец А

Хер 4,01 9,92 2,82 38,22 35,92 130,48

АХ 0,04 0,06 0,03 0,16 0,22 0,29

£CD 0,99 0,60 1,06 0,42 0,61 0,22

Образец L

Хер 3,94 9,83 2,77 37,89 35,83 129,14

АХ 0,15 0,31 0,05 0,22 0,69 2,46

3,81 3,15 1,81 0,58 1,93 1,90

Образец С

Хст> 5,36 14,18 3,46 35,69 30,76 123,45

АХ 0,13 0,26 0,08 0,26 0,34 2,07

£»со 2,43 1,83 2,31 0,73 1,11 1,68

Образец В

XCD 4,27 11,31 2,44 35,67 27,21 125,48

АХ 0,14 0,35 0,08 0,22 0,22 1Д1

3,23 3,10 3,31 0,63 0,82 0,97

Образец Е

Хер 4,66 9,68 2,81 45,51 36,65 137,09

АХ 0,11 0,22 0,06 0,04 0,15 0,80

2,29 2,27 2.31 0,08 0,41 0,58

3. Оптимизация методики ВЭЖХ-определения героина в наркотических средствах с целью установления обшностн источника происхождения и создания коллекции экспертных образцов

Сравнительное исследование героина для определения пути поступления и распространения НС в конкретном регионе в соответствии с требованиями методической литературы [Соркин В.И., 2002] путем многократного дискриминантного анализ [Mohana М., 2005] становится практически невыполнимо из-за большого числа образцов. Создание соответствующей базы данных требует значительных материальных и временных затрат.

Целесообразно вначале провести предварительный скрининг объектов анализа, а затем, если обнаружатся сходные по составу образцы, осуществить их комплексное всестороннее изучение. Это значительно ускорит сроки проведения исследований и снизит стоимость анализа.

К описанным выше критериям идентичности образцов НС нами предложен следующий подход. Каждый образец характеризуется цифровым значением, «критерием идентичности», который легко сравнить для разных объектов. Например, при сравнении площадей пиков (рис. 2) 6-моноацетилморфина (SiAS2A) и морфина (S1BS2B) двух образцов героина А и В получаем два вектора OS! и OS2. Тогда суммарный вектор S2S1 будет графически отражать различие образцов героина. Угол ф между векторами OSi и OS2 можно использовать как количественную меру идентичности образцов. Если образцы идентичны, то угол между векторами равен 0. Аналогичная процедура применялась в спектральном анализе для сравнения двух спектров при оценке их идентичности [Каламбет Ю.А., 2005].

В общем случае, для двух образцов героина А и В с числом компонентов, равным i, косинус угла между соответствующими векторами можно рассчитать по формуле:

где Бци Бщ- площади пиков всех компонентов (от 1-ого до ¡-ого) образцов А и В соответственно. Далее рассчитывают значение угла между векторами.

С целью увеличения надежности оценки идентичности объектов исследования следует сравнивать площади пиков не двух, а нескольких идентифицированных компонентов. Например, чаще всего в анализируемых образцах героина присутствуют диацетилморфин, 6-моноацетилморфин, морфин, кодеин и наркотин. В этом случае значения площадей пиков следует представлять в виде 5-мерного вектора.

Для решения вопроса о значении угла <р в случае идентичности образцов, был проведен многократный межлабораторный анализ одного и того же образца героина (табл. 5 и 6). Результаты получены на трех приборах, находящихся в разных лабораториях. Как видно, значения ср для одного и того же образца, находятся в пределах 0,1°-0,7°.

eos (Ф) = IX5" ^s)

О 5.Л 5

Рисунок 2. Векторная интерпретация идентичности двух образцов героина А и В по двум

компонентам.

Оси координат (За, 5 о) — площади хромато графических пиков 1-ого (6-моноацетилморфии) и 2-ого компонентов

(морфин).

Таким образом, если два сравниваемых образца имеют значения <р от 0,0° до 0,7°, то они одинаковы. Можно использовать любые сочетания площадей пиков пяти основных компонентов героина, выявить пары образцов, имеющих значения ф < 0,7°, и далее работу сосредоточить имешго на этих образцах, проводя подтверждающие исследования согласно методическим рекомендациям.

Таблица 5. Результаты расчёта относительного содержания основных компонентов образца героина и значений угла <р между векторами для навесок №1 и 2

№ навески Компоненты ■Чло (е.о.п. *.нкл) О (по Героину) <Р°

Лаборатория 1

№1 6-МАМ 17,582 18,53

Героин 94,868 100

Кодеин 0,465 0,49

Морфин 3,75 3,95

Наркотин 6,247 6,58 0,335

№2 6-МАМ 17,795 19,12

Героин 93,073 100

Кодеин 0,463 0,50

Морфин 3,804 4,09

Наркотин 6,219 6,68

В качестве примера в табл. 7 представлены результаты расчета относительного содержания <3 основных компонентов разных образцов героина и значений угла <р между 5-мерными векторами. Как видно, для образцов 3 и 9 относительные содержания компонентов очень близки и значение ср стремится к 0°, следовательно, образцы идентичны. Образцы 6 и 23 значительно разнятся по содержанию компонентов, в особенности по наркотину. Одновременно угол ср превышает установленный предел идентичности и имеет значение 3,37°. Можно сделать

заключение, что образцы разные, т.е. имеют неодинаковый источник поступления и/или изготовления.

Таблица 6. Результаты расчета значений угла <р между векторами _для образца героина (межлабораторный аналнз)_

№ навески Ф .V» навески Ф X» навески <Р

Лаборатория 1 Лаборатория 2 Лаборатория 3

№1 №2 №3 №4 №6 №7 №8 №9 №11 №12 №13 №14

№2 0,35 0,21 0,34 0,55 0,24 0,47 0,34 0,25 0,17 0,34 №7 0,35 . 0,09 0,27 0,21 0,15 0,16 0,21 0,43 0,19 0,35 №12 0,33 0,33 0,12 0,73 0,41 0,42 0,24 0,13 0,12 0,51

№3 №8 №13

№4 №9 №10 №14

№5 №15

Нами показано, что если при распространении НС по региону произошло разбавление образца нейтральными добавками, значение угла <р остается постоянным, так как взаимное соотношение компонентов не меняется.

Таблица 7. Относительное содержание основных компонентов _образцов героина н значение угла (р_

Компоненты 0 (по героину), % Угол <р,0 образцы 3 и 9

№ образца 3 | 9

6-МАМ 18,56 18,66

Героин 100 100

Кодеин 0,50 0,48 0,07

Морфин 4,16 4,15

Наркотин 6,89 6,83

№ образца 6 | 23 Угол ф,0 образцы 6 и 23

6-МАМ 14,47 16,22

Героин 100 100

Кодеин 0,53 0,28 3,37

Морфин 2,71 2,65

Наркотин 1,05 6,78

4. Оптимизация методики определения дезоморфина при экспертно -криминалистических и химико-токсикологических исследованиях

Дезоморфин (4,5-эпокси-3-гидрокси-Ы-метилморфинан) - синтетическое наркотическое средство, получаемое кустарным способом из кодеина. Токсичность для мышей дезоморфина (1ЛЭ50 - 27 мг/кг) значительно выше, чем у его производных (для морфина 1ЛЭ50 -135 мг/кг).

Основные проблемы при исследовании дезоморфина связаны с недостатком информации об особенностях химического анализа этого соединения. Отсутствуют или практически недоступны его стандартные образцы сравнения этого. В литературе не описаны возможные побочные продукты превращения кодеина в дезоморфин. Разработка методики ВЭЖХ для исследования дезоморфина при экспертно -криминалистических и химико-токсикологических исследованиях была одной из основных задач данной работы.

Хроматограмма извлечения образца, содержащего дезоморфин, имеет пик со временем удерживания 7,49 мин, который идентифицирован как дезоморфин, а со временем удерживания 7,53 мин. - как 7,8-дидегидродезоморфин.

Практически во всех экспертных образцах и биологических жидкостях, кроме дезоморфина, было обнаружено вещество с молекулярной массой 269 а.е.м., которое методом масс-спектрометрии было идентифицировано как 7,8-дидегидродезоморфин (рис.4). В образцах мочи, кроме дезоморфина, также обнаруживали разное содержание 7,8-дидегидродезоморфина.

Перед исследованием дезоморфина и 7,8-дидегидродезоморфина методом ВЭЖХ проводили очистку образцов методом ТСХ. Вещества элюировали с пластинки и исследовали методом ГХ-МС. В образцах были выявлены 7,8-дидегидродезоморфин, кодеин, дезоморфин. Далее элюат с ТСХ-пластинки исследовали на жидкостном хроматографе.

еоооосю

0} соооооо

4000000

2000000

"по оеэсжгао

Э.ЗО 1 ОО 4.БО 5-00 Э.50 в.ОО в.ВО 7.00 7.50 8.00 в.ВО ООО Э.(50 МИН.

Рисунок 3. Хроматограмма извлечения образца, содержащего дезоморфин.

Бовп 2174

Рисунок 4. Масс-спектр и структурная формула 7,8-дидегидродезоморфина. В образце были обнаружены: 7,8-дидегидродезоморфин (1018 мкл), кодеин (1033 мкл) и дезоморфин (1146 мкл) ( табл. 8). Таблица 8. Результаты обработки хроматограмм элгоата образца, содержащего

дезоморфин

^МКЛ Спектральные отношения Б^гю Название

$220 5230 §240 §250 $260 $280 8зоо

1018 0,352 0,191 0,111 0,036 0,017 0,050 0,002 7,8-Дидегндродезоморфин

1033 0,674 0,241 0,201 0,128 0,042 0,072 0,008 Кодеин

1146 0,251 0,164 0,081 0,001 0,005 0,040 0,000 Дезоморфин

Таким образом, разработана методика определения дезоморфина, занимавшего почти одну четверть всех наркотических средств на нелегальном рынке до запрещения свободной продажи кодеин-содержащих ЛС.

5. Усовершенствование методики ВЭЖХ определения морфина и кодеина в биологических объектах

Для нахождения оптимального варианта экстрагирования мы использовали смеси хлороформа со спиртами, взятыми в различных соотношениях. Установлено, что повышение доли полярного растворителя приводило к увеличению концентрации соэкстрактивных веществ. Для исследования на жидкостном хроматографе в качестве экстрагирущей смеси мы выбрали хлороформ - изопропанол в соотношении 9:1.

Было установлено оптимальное время гидролиза - 2 часа. С увеличением продолжительности гидролиза в пробе возрастало количество соэкстрактивных веществ, затрудняющих определение НС.

Применение внутреннего стандарта является одним из основных способов контроля процесса изолирования и количественного определения наркотических веществ из биоматериала. В качестве внутреннего стандарта были опробованы следующие вещества: налоксон, налтрексон, буторфанол (стадол). Налтрексон был применен [РасШа Я., 1995] для определения героина и его метаболитов в сыворотке крови при фармакокинетических исследованиях. Дейтерированные производные морфина и кодеина [01'епез-Ыа§у А., 1999;Тоуо'ока Т, 2001], а также синтетические опиаты с морфиноподобной химической структурой - налорфин [РамЯм Я., 1995], применяемые в качестве ВС в рутинном анализе трудно доступны для лаборатории.

Установлено, что налоксон и стадол эшоируются из колонки в зоне соэкстракивных веществ. Налтрексон на хромагограмме элюируется в зоне кодеина, но достаточно хорошо отделяется от него. Раствор налтрексона стабилен и может храниться в холодильнике более 3 месяцев. Для определения возможности применения налтрексона в качестве ВС были исследованы гидролизаты мочи с добавлением модельной смеси морфшга и кодеина.

По результатам хроматографирования модельных смесей установлено, что относительная погрешность среднего результата (£ср), рассчитанная по площадям пиков, составляет более 29%. (£ср), рассчитанная по отношениям площадей пиков морфина (кодеина) и налтрексона, составляет не более 12% и превышает 20% только при содержании морфина меньше 0,9 мкг/мл.

Таким образом, при определении морфина и кодеина методом ВЭЖХ впервые в судебно- химическом анализе был применен налтрексон в качестве внутреннего стандарта.

Для повышения степени извлечения примесей впервые была применена очистка от соэкстрактивных веществ последовательно: амиловым спиртом и диэтиловым эфиром.

Хроматограммы извлечений из мочи, содержащих морфин и кодеин, без предварительной очистки амиловым спиртом (хроматограмма А) и с дополнительной

очисткой (хроматограмма Б) позволяют сделать вывод о том, что относительное содержание морфина (внутренняя нормализация относительно суммы площадей всех пиков) выше в пробе после очистки амиловым спиртом (рис.5, табл.9). Это свидетельствует о меньшем содержании соэкстрактивных веществ. Очистка солянокислого гидролизата от соэкстракивных веществ амиловым спиртом приводит к снижению числа суммарных площадей посторошшх пиков на хроматограмме, что свидетельствует об увеличении доли извлеченного морфина.

кодеин (2) и налтрексои (3). А- без предварительной обработки пробы амиловым спиртом, Б-после обработки.

Воспроизводимость результатов количественного определения морфина сильно зависит от рН раствора. При апробации разных способов нодщелачивания гидролизата наилучшие результаты (минимальное значение относительной погрешности среднего результата) показал следующий способ: к солянокислому гидролизату биоматериала добавляли небольшой избыток 30-40% раствора едкого натра до щелочной реакции (рН 11). Затем к щелочному раствору добавляли избыток твердого гидрокарбоната натрия до рН 9.4.

Таблица 9. Результаты хроматографического определения НС в моче до н после

очистки амиловым спиртом.

Вещество о,% О), %

Без очистки амиловым спиртом

Кодеин 9,62 0,34

Морфин 18,11 0,63 110,5

Налтрексон 28,63

После очистки амиловым спиртом

Кодеин 9,87 0,45

Морфин 23,07 1,06 79,8

Налтрексон 21,86

О - относительное содержание компонента, % (метод внутренней нормализации, где сумма всех пиков равна 100%);

ш% - массовая доля морфина и кодеина, определенная методом внутреннего стандарта; 15/ - сумма площадей всех размеченных пиков.

Образующаяся буферная система НС03" / С032" обладает необходимой буферной емкостью в интервале рН=10,3±1. Пршпмая во внимание, что для фенольного гидроксила морфина рКа=10, а для протонированного атома азота в гетероцикле рКа=8, можно утверждать, что при выбранном нами значении рН=9,0 морфин преимущественно находится в молекулярной (неполярной) форме и поэтому полностью экстрагируется в органический растворитель.

Для идентификации веществ проводили сравнение спектральных отношений стандартного образца и исследуемого образца при 7 длинах волн, рассчитывая косинус угла соэф 6-мерного вектора. В наших исследованиях при идентификации, как морфина, так и кодеина, угол ср не превышал 5 градусов.

Таблица 10. Валидационные характеристики методики определения _морфниа н кодеина в биологическом материале._

Статистические параметры Градуировочные данные для мочи

Морфин Кодеин

С, Mtr/ыл 0,18 0,37 2,15 4,30 0,30 1,50 2,15 4,30

Хер 0,120 0,233 1,124 2,291 0,175 0,868 1,159 2,512

+ АХср 0,005 0,021 0,079 0,137 0,003 0,093 0,032 0,138

£ср 4,17 9,01 7,03 5,98 1,71 10,71 2,76 5,49

Статистические параметры Градуировочные данные для желчи

Морфин Кодеин

С, мкг/мл 0,18 0,37 2,15 4,30 0,30 0,61 1,50 2,15

Хер 0,087 0,170 1,218 2,52 0,174 0,363 0,946 1,387

+ ДХср 0,012 0,019 0,078 0,121 0,020 0,034 0,072 0,060

£ср 13,79 11,18 6,40 4,80 11,49 9,37 7,61 4,33

С юг/«], - концентрация вещества, добавленного к моче или желчи (мкг в мл биоматериале); Хер ~

среднее (из 5 повторов) значение отношений тощадей пиков вещество/налтрексон; £ср - относительная погрешность среднего результата; граничные значения доверительного интервала среднего результата отношения площадей +Ахср при р=0,95.

Относительная погрешность среднего результата определения морфина и кодеина находится в интервале 5-6% для средних значений концентраций, а для низких концентраций не превышает 10-14% (табл.10), что свидетельствует о хорошей воспроизводимости результатов.

Таблица 11. Результаты статистической обработки линейной зависимости

морфина и кодеина в биоматериалс.

Объекты Моча Желчь

Вещество Морфин Кодеин Морфин Кодеин

Коэффициент корреляции (г) 0,998 0,998 0,999 0,998

Угловой коэффициент линейной зависимости (Ь), 0,524 0,585 0,592 0,658

Свободный член линейной зависимости (а), 0,021 -0,030 -0,040 -0,034

Минимальное значение отношений площадей пиков (Упнп) 0,059 0,031 0,002 0,004

Пределы обнаружения исследуемых веществ (Хпи'п), мкг/ мл 0,20 0,18 0,16 0,08

При статистической оценке параметров линейной зависимости вида у = а+Ьх для морфина и кодеина в моче и желчи получены коэффициенты корреляции, близкие к

единице (табл.11). Пределы количественного определения морфина и кодеина находятся в интервале 0,1-0,2 мкг в 1 мл биожидкости. Предел обнаружения зависит от чистоты полученных извлечений.

Среднюю площадь пика налтрексона Хср „1Тгр. для мочи и желчи (табл. 12) рассчитывали по градуировочной зависимости.

Диапазон значений площадей пиков внутреннего стандарта можно использовать, как меру контроля правильности экстракции каждого образца. При использовании разработанной методики в любом извлечении площадь пика налтрексона должна находиться в этом интервале.

Проведено более 100 определений морфина и кодеина в моче и желчи человека. Среднее значение площади пика налтрексона в моче составило 33,95 с доверительным интервалом 3,14, для кодеина - 34,41 с доверительным интервалом 2,75, что хорошо коррелирует с результатами определения модельных смесей (табл. 12). Только 5% хроматограмм имели значения отношений площадей меньше контрольных значений, представленныхв табл. 12. Данный способ меры контроля правильности экстракции анализируемого вещества из образца представлен впервые.

Таблица 12. Средние значение площадей пиков иалитрсксона и доверительный

интервал средпего значения (р=0,95).

Биожидкость Средняя площадь Доверительный интервал Диапазон площадей

Моча 43,458 19,20 62,66. 24,26

Желчь 29,818 8,98 48,80 30,84

Для оценки количества соэкстрактивных веществ, попадающих в пробу, исследовали 83 образца мочи и желчи. Концентрация соэкстрактивных веществ рассчитывали как относительную концентрацию от суммы всех размеченных пиков по формуле:

Ссоэк =(5сумма" 5иден)*100/ Б сумма >

где Ссетк - содержание соэкстрактивных веществ, %; — сумма площадей всех пиков; Яидект - сумма площадей пиков морфина, кодеина и налтрексона.

Концентрация соэктрактивных веществ в моче составило от 0,06 до 60 %, в желчи -0,08 до 42%; в пробах, не содержащих морфин и кодеин - от 2 до 33%.

Более 30% соэкстрактивных веществ обнаружено только в 7 образцах из 83, при этом спектральные отношения исследуемых веществ были в допустимых пределах.

Для оценки результатов судебно-химического исследования морфина и кодеина в моче и желчи использовали следующие данные: угол ф идентифицированных компонентов не должен превышать 5 градусов, отношение площадей пиков морфина (кодеина)/внутренний стандарт должно быть в интервале 0,05 до 3; площадь хроматографического пика натрексона - от 25 до 70.

Таким образом, оптимизированы этапы изолирования, обнаружения и количественного определения морфина и кодеина при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследовании биологического материала. Разработанная методика позволяет изолировать из биоматериала 40-60% общего морфина и кодеина. Предел обнаружения равен 0,1-0,2 мкг вещества в 1 мл биоматериала.

6. Исследование опиатов с применением жидкостного хроматографа с масс - селективным детектором

Для судебно-медицинской оценки отравления опиатами, кроме мочи и желчи, необходимо исследовать кровь. Однако представленная выше методика, разработанная для определения на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором, по уровню чувствительности позволяет идентифицировать сравнительно высокие концентрации опиатов 0,1- 0,2 мкг/мл и выше. Для расширения возможности применения разработанной методики были проведены исследования с применением жидкостного хроматографа с масс-селективным детектором (Agilent Technologies 1200).

В качестве детектора использовали одноквадрупольный масс - селективный детектор (QS) Agilent 6110 Quadrupole LC/MS. Источник ионизации -электрораспыление, что обусловлено физико-химическими свойствами исследуемых веществ. При сравнительно меньшей стоимости такой детектор обладает высокой чувствительностью, специфичностью, имеет широкий линейный диапазон.

Предварительно были исследованы оптимальные режимы работы детектора, позволяющие получить высокий отклик на исследуемые вещества при наилучшем соотношении сигнал/шум. Были разработаны два режима работы детектора по выбранным ионам (SIM-метод):

- режим SIM-1 - использовали для идентификации исследуемых веществ. Изменяя напряжение на фрагментаторе (220 В), проводили частичную диссоциацию молекулярного иона с образованием 5-6 дополнительных дочерних ионов: для морфина - m/z 153, 181, 227, 229, 286, 287; для кодеина - m/z 153, 181, 243, 300, 301 (рис. 6). Идентификацию веществ проводили с использованием экстракционных спектрограмм с помощью алгоритма программы AMDIS. Это позволило автоматизировать процесс идентификации и снизить субъективность оценки результатов исследования.

- режим SIM - 2 - применяли для количественного определения морфина (кодеина). При иопизации образовывался только молекулярный ион морфина (кодеина), по которому проводили количественное определение, что значительно увеличило предел определения методики. Напряжение на фрагментаторе составляло (150 В).

Представленные алгоритмы идентификации и количественного определения позволили компенсировать отсутствие системы МС/МС, значительно увеличить отношение сигнал/шум для исследуемых веществ, снизить фон соэкстрактивных примесей.

| Library Hit Ш: Morphine 220

:s6

10U

75

50

153 1S1

25 | 227 II

125 150 175 2D0 225 250 275

| Library Hit 1/2: Codeine 220

300

1UU

Vi-

sa

25- T ? ;f

TL'T. 125 150 175 200 225 250 275 300

Рисунок 6. Экстракционная масс - спектрограмма морфина и кодеина в режиме 1.

А - морфин; Б - кодеин.

Для иллюстрации результатов проведенных исследований представлены хроматограммы извлечения крови, содержащей 0,14 мкг/мл морфина и 0,02 мкг/мл кодеина, и хроматограмму извлечения крови, содержащей 0,08 мкг/мл морфина, (рис. 7). Хроматограммы получены в режиме SIM-2. На рис. 7 представлена также экстракционная спектрограмма морфина (М) с пиком при 4,31 мин и кодеина (К) с пиком при 7,11 мин. Пик со временем удерживания 7,81 мин. соответствует налтрексону (внутренний стандарт). Там же представлены экстракционные спектрограммы морфина (МО с пиком при 4,84 мин. и спектрограмма стандартного образца морфина (Мп). Пик со временем удерживания 8,16 мин. соответствует налтрексону. Как видно из рис. 7, низкие концентрации исследуемых веществ хорошо идентифицируются, фон соэкстрактивных веществ не оказывает значительного влияния на хроматографические профили пиков. Масс - спектрограммы морфина и кодеина практически совпадают с библиотечными масс-спектрами, что позволяет надежно идентифицировать аналиты в концентрациях от 0,02 мкг/мл.

На основании проведенных исследований была разработана методика качественного и количественного определения морфина и кодеина в крови, печени и моче. Количественное определение проводили методом внутреннего стандарта с использованием стандартных растворов морфина, кодеина и налтрексона (внутренний стандарт), которые добавляли к навеске крови, мочи, печени после гидролиза и затем изолировали.

Количественное определение морфина и кодеина проводили по масс - ионам 286; 300 и 342 (налтрексон). Расчет содержания морфина (кодеина) проводили по уравнению Y=m*xb, где: у - концентрация вещества в мкг/мл, m и b - коэффициенты, х - отношение площадей (вещество/внутренний стандарт).

Наилучшая воспроизводимость наблюдается при исследовании образцов с высоким содержанием определяемых соединений: £ср. находится на уровне 5-10%. Максимальная погрешность до 21% наблюдается при определении низких содержаний исследуемых веществ в биологическом материале.

21! ■ . т - . .. т т +

15.7

10.5 5.2

Г1ше: 1.47 2.60 3.72 4.85 5.58 7.11 8.25 РЗв

Мшп&тсе [10Л| 100

Рисунок 7. Хроматограммы и спектрограммы извлечения крови, содержащей

морфин и кодеин.

А - извлечение крови, содержащий морфин и кодеин; Б - извлечение крови, содержащей морфин; М и М1 -экстракционная спектрограмма морфина; Мст- экстракционная спектрограмма стандартного образца морфина; К - экстракционная спектрограмма кодеина.

Идентификация тех же соединений в модельных системах («введено-определено») возможна с точностью около 100%. Потери при изолировании, в зависимости от количества добавленных веществ находятся на уровне 40 - 60%. Коэффициент корреляции для мочи и печени более 0,99, для крови - более 0,98.

По описанной выше методике были исследованы более 170 образцов биоматериала, поступившего в отделение общих химических методов исследования Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы.

Результаты проведенной работы показывают, что одноквадрупольный масс-детектор, сопряженный с ВЭЖХ-системой, может применяться для определения опиатов в биологическом материале. Предложенный алгоритм идентификации веществ компенсирует технические недостатки детектора по сравнению с тандемной масс-спектрометрией. Для судебно-химических исследований морфина и кодеина в крови, моче и печени разработана и статистически обоснована методика их качественного и количественного определения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны и оптимизированы методики определения опийных алкалоидов и их производных в наркотических средствах и биологических материалах

с использованием микроколоночной ВЭЖХ для проведения экспертно-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических исследований.

2. Оптимизирована и унифицирована процедура подготовки образцов НС для определения в 1шх опиатов путем подбора эффективного экстрагента (20% этанол) и оптимальной продолжительности экстракции ( 2 ч). Хроматографический режим включал использование обращено-фазовых сорбентов при линейном градиентном элюировании и многоволновом детектироовшши , позволяющем характеризовать определяемые вещества и примеси.

3. Разработаны методики качественного и количественного определения наркотически активных компонентов и микропримесей в образцах опия и героина при проведении их сравнительного исследования. В качестве идентификационных признаков использованы: объём удерживания; площадь хроматографического пика; значения спектральных отношений; относительное содержание веществ; содержание морфина, кодеина, тебаина в опии и диацетшшорфина в героине.

4. Для доказательства идентичности образцов героина предложен подход, основанный на методе многофакторного анализа: сравнение значений углов для пятимерных векторов, соответствующих площадям хроматографических пиков пяти основных компонентов. По результатам межлабораторных испытаний определено граничное значение угла, характеризующее идентичные образцы: <р<0,7°. Разработанные критерии идентичности образцов позволяют оперативно устанавливать источники их происхождения.

5. Впервые идентифицирован 7,8-дидегидродезоморфин как продукт превращения кодеина при кустарном изготовлении дезоморфина. Дезоморфин и 7,8-дидегидродезоморфин изолированы из мочи лиц, употреблявших дезоморфин. Определены времена удерживания и спектральные отношения 7,8-

дидегидродезоморфин и дезоморфин в условиях режима хроматографического разделения.

6. Разработана методика ВЭЖХ определения опиатов в, биологических материалах (кровь, моча, ткани печени): подобран оптимальный экстрагент для изолирования морфина и кодеина из биологического материала, позволяющий снизить содержание соэкстрактивных веществ и повысить чувствительность определения; впервые в качестве внутреннего стандарта предложено использование ненаркотического опиоида — налтрексона. Для ВЭЖХ-УФ: предел количественного определения морфина и кодеина 10-20 мкг в 1 мл биожидкости; для ВЭЖХ-МС: предел количественного определения - 2 мкг в 1 мл (г) биоматериала. Относительная погрешность - 9,5%.

Список сокращений: ВС - внутренний стандарт

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

НАК наркотически активные компоненты

НС - наркотические средства

ПХЛ - перхлорат лития

ТФУ - трифторуксусная кислота

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Барсегян С.С., Барсегян И.Б.. Исследование некоторых условий изолирования морфина и кодеина из биоматериала // Материалы Всеросийской научно-практической конференции «Современные проблемы химико-токсикологического анализа наркотических средств», Санкт-Петербург, 1999. - с. 45.

2. Барсегян С.С., Барсегян И.Б., Щамовский Г.Г. Оптимизация методики анализа опийных алкалоидов / Тез. докл. научно-практической конференции посвященной ХХ-летию фармацевтического факультета КГМА // В кн. «Фармацевтическая наука и практика». -Кемерово, 2000. - с. 27.

3. Барсегян С.С., Барсегян И.Б. Применение налтрексона в качестве внутреннего стандарта при количественном определении морфина и кодеина в моче методом ВЭЖХ // Научно-практический журнал «Вестник Межрегиональной Ассоциации «Здравоохранение Сибири», Новосибирск.-№4.-2003.-с. 114-115.

4. Литовская С.Б., Барсегян И.Б., Барсегян С.С. Определение морфина и кодеина в моче при химико-токсикологическом исследовании на жидкостном хроматографе «МИЛИХРОМ-А-02» // Сборник трудов научно-практической конференции «Непрерывное последипломное образование - инвестиции в здравоохранение России» посвященной 25-летию факультета последипломного образования провизоров 9-10 июня 2005 г. - Москва, 2005.-с. 69-70.

5. Барам Г.И., Барсегян С.С. Качественный н количественный состав опия как уникальная характеристика его партии // Наркология. - № 1. - 2007. - с. 24-27.

6. Барсегян С.С., Савчук СЛ., Барам Г.И, Барсегян И.Б., Гелемеев В.Ф. Комплексное исследование экспертных объектов, содержащих дезоморфин // Наркология - № 2. -2007.-с. 13-21.

7. Барам Г.И., Барсегян С.С. Применение жидкостного хроматографа "Миллихром А02" при создании коллекции наркотических средств в экспертно-криминалистическнх подразделениях // Эксперт-криминалист. -№ 3.-2006. - с. 23-25.

8. Барсегян С.С. Способ очистки гидролизатов биоматериала при количественном определении морфина и кодеина методом ВЭЖХ с помошыо амилового спирта / Удостоверение на рационализаторское предложение № 116 от 25.06.2007, Бюро судебно-медицинской экспертизы ДОЗН Кемеровской области.

9. Барсегян С.С., Никитин П.В. Способ подщелачивания кислотных гидролизатов биоматериала при судебно-химическом исследовании на алкалоиды опия / Удостоверение на рационализаторское предложение № 115/2 от 28.05.2007, Бюро судебно-медицинской экспертизы ДОЗН Кемеровской области.

10. Азарова И.Н., Барсегян С.С., Барам Г.И. Новые возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии: Базы данных "ВЭЖХ-УФ" // Сборник "Хроматография на благо России". Под ред. Курганова A.A. - М: "Граница", 2007. - с. 653-665.

11. Азарова И.Н., Барсегян С.С., Барам Г.И., Расширение возможностей высокоэффективной жидкостной хроматографии при работе с базами данных "ВЭЖХ-УФ"// Материалы VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока ». Томск 13-18 октября 2008 г. с 160-161.

12. Азарова И.Н., Барсегян С.С., Барам Г.И., Применение базы данных «ВЭЖХ-УФ» для «паспортизации» образцов сложного состава // Всероссийский симпозиум «Хроматография и хромаю- масс-спектрометрия» (К 100-летию со дня рождения профессора A.B. Киселева). Москва - Клязьма 14-18 апреля 2008 г. с.27»

13. Савчук С.А., Барсегян С.С., Барсегян И.Б., Колесов Г. М. Хроматографическое исследование экспертных и биологических образцов, содержащих дезоморфин // Журнал аналитической химии. - Т. 63. - № 4. - 2008. - с. 396-405.

14. Барсегян С. С., Барсегян И. Б., Мирочник Е.М. Об определении морфина и кодеина в моче и желчи с применением тонкослойной и высокоэффективной жидкостном хроматографии. Информационное письмо. Утверждено директором ФГУ РЦСМЭ Минздравсоцразвития России проф. Колкутиным В.В. - Москва, 2010. - с. 25.

15. Барсегян С.С. Сравнительная оценка, возможности применения жидкостных хроматографов «Agilent 1200» и «Милихром А-02» в судебно-химической практике / Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора О.Х. Поркшеяна // Сборник «Судебно медицинская экспертиза и медицинское право: Проблемы и перспективы». - М.: МГСУ, 2010. - с. 149.

16. Барсегян С.С., Свиридова Т.Л., Федорова Т.Н. О возможности применения одноквадрупольного масс - селективного детектора, сопряженного с ВЭЖХ -системой для определения морфина и кодеина при судебно-химических исследованиях // Медицинская экспертиза и право. - № 6. - 2012. - с. 49-52.

17. Барсегян С.С., Пурвнна ЕЛ., Саломатнн Е.М., Свиридова Т.А., Федорова TJI. Определение морфина и кодеина при судебно - химических исследованиях с применением одноквадрупольного масс-селективного детектора, сопряженного с ВЭЖХ - системой // Судебно медицинская экспертиза. -Л» 6.-2012.-е. 33-37.

18. Басрегян С.С., Максимова Т.В., Морозова МЛ., Саломатнн Е.М., Елизарова Т.Е., Сыроешкнн A.B., Плетенева Т.В. Методы факторного анализа для выявления идентичности образцов многокомпонентных смесей //Химико-фармацевтический журнал. Том 47, Л»8,2013. - с. 49-51.

19. Savchuk, S. A.; Barsegyan, S. S.; Barsegyan, I. В.; Kolesov, G. M. "Chromatographic Study of Expert and Biological Samples Containing Desomorphine". Journal of Analytical Chemistry 2008.63 (4): p. 361-370.

20. Barsegyan S. S., Maksimova T.V., Morozova M. A., Salomatin E. M., Elizarova Т. E., Syroeshkin A. V., Pleteneva Т. V. Factor Analysis Methods for Assessment of the Identity of Samples of Multicomponent Mixtures. Pharmaceutical Chemistry Journal. November 2013, Volume 47, Issue 8, p. 451-453.

Подписано в печать:

05.05.2014

Заказ № 10026 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru