Химико-токсикологический анализ тианептина и его метаболитов в биологических объектах

Петухов, Алексей Евгеньевич

Диссертации по медицине → Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Химико-токсикологический анализ тианептина и его метаболитов в биологических объектах

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Петухов, Алексей Евгеньевич Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 14.04.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Химико-токсикологический анализ тианептина и его метаболитов в биологических объектах

На правах рукописи

ПЕТУХОВ Алексей Евгеньевич

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ТИАНЕПТИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

14.04.02 — Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ИЮЛ

Москва-2010

004608863

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Раменская Галина Владиславовна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

кандидат фармацевтических наук Ведущая организация:

Белобородов Владимир Леонидович

Клюев Александр Евгеньевич

ФГУ «Российский Центр Судебно-медицинских Экспертиз Росздрава»

Защита диссертации состоится 13 сентября 2010 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии имени И.М.Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной Медицинской Библиотеке ММА имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан « 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор фармацевтических наук, профессор

Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время злоупотребления лекарственными средствами (ЛС) занимают одно из лидирующих мест среди употребления других наркотических средств (НС) и психотропных веществ (ПВ) [Холодов B.C. и соавт., 2007]. Список ЛС, злоупотребление которыми отмечается на территории РФ, ежегодно пополняется новыми медикаментами, поступающими на фармацевтический рынок.

В последнее время в России отмечается значительное увеличение немедицинского использования тианептина (Коаксила®). Наличие антидепрессивного, противотревожного и рединамизирующего эффектов доказано в целом ряде клинических исследований. По сравнению с другими трициклическими антидепрессантами, тианептин имеет менее выраженные побочные эффекты. При употреблении тианептина в дозах, в десятки раз превышающих терапевтические, наблюдается мощный стимулирующий эффект [Крупицкий Е.М. и соавт., 2007].

Одним из направлений борьбы с наркоманией является проведение медицинского обследования подозреваемых с целью установления факта употребления наркотика, результаты которого зависят от лабораторного исследования биологических проб. Значение такого исследования резко возрастает с увеличением сроков, прошедших со времени последнего употребления наркотика. Поэтому создание новых методик определения психоактивных препаратов в биологических объектах является актуальной задачей токсикологической химии.

В настоящее время для определения тианептина в биологических объектах в основном применяется высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-детектором (ВЭЖХ-УФ) или масс-селективным детектором (ВЭЖХ-МС) [Khedr А., 2007]. Эти методы являются подтверждающими методами при проведении химико-токсикологического анализа (ХТА), в то время как предварительного метода для обнаружения тианептина в биологических объектах нет.

Также методы ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС сложны в плане пробоподготовки, довольно дорогие, и далеко не в каждом регионе Российской Федерации в распоряжении химико-токсилогической лаборатории имеется такое оборудование.

Поэтому разработка методик анализа тианептина методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), газовой хроматографии (ГХ) и газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) является актуальным.

Все вышеизложенное определило цель и задачи исследования.

Цель исследования.

Разработать подходы к химико-токсикологическому анализу тианептина и его метаболитов в моче и волосах при недавнем и отдаленном употреблении.

Задачи исследования:

1) оценить возможность анализа тианептина иммунохимическими методами;

2) разработать методики пробоподготовки мочи и волос, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции;

3) подобрать оптимальные хроматографические условия для анализа тианептина и его метаболитов методами ТСХ, ГХ, ГХ-МС;

4) провести идентификацию метаболитов тианептина методом ГХ-МС;

5) на основании проведенных исследований предложить вероятную схему метаболизма тианептина в организме человека;

6) оценить возможность использования методик анализа в лабораторной практике путем их валидации.

Научная новизна.

Впервые разработаны оригинальные методики анализа тианептина и его метаболитов в моче и волосах методами ТСХ, ГХ, ГХ-МС.

Методами ГХ и ГХ-МС идентифицировано большинство метаболитов тианептина, описана их структурная формула и предложена вероятная схема метаболизма.

Практическое применение.

Подобраны оптимальные условия пробоподготовки с учетом доступных реактивов и материалов, оценены возможности использования различных систем растворителей и хроматографических пластинок (для анализа методом ТСХ), а также различных капиллярных колонок и условий температурного режима (для анализа методом ГХ и ГХ-МС).

Показано, что разработанные методики анализа тианептина и его метаболитов в моче и волосах могут использоваться для установления факта недавнего и отдаленного употребления для целей химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий.

Положения, выносимые на защиту:

1) разработанные методики пробоподготовки и хроматографического анализа тианептина и его метаболитов в моче и волосах;

2) схемы фрагментации и масс-спектры тианептина и его метаболитов;

3) вероятная схема метаболизма тианептина в организме человека.

Внедрение результатов в практику:

Разработанные методики анализа тианептина и его метаболитов в моче и волосах внедрены и используются в практике Химико-токсикологической лаборатории (ХТЛ) Наркологической клинической больницы № 17 ДЗ г. Москвы (акт внедрения от 23 марта 2010 г. № 14), ХТЛ Наркологического диспансера № 1 г. Тулы (акт внедрения от 22 декабря 2009 г.), ХТЛ ГУЗ «Ярославская областная наркологическая клиническая больница» (акт внедрения от 14 декабря

2009 г. № 1), ГУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт внедрения от 5 октября 2009 г.).

Апробация работы.

Апробация работы проведена на конференции кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО ММА имени И.М. Сеченова и Химико-токсикологической лаборатории Наркологической клинической больницы № 17 ДЗ г. Москвы 24 мая

2010 г.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (Шыкмент, 2009 г.), научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009 г.), научно-практической конференции с международным участием в рамках конгресса «Интерполитех» (Москва, 2009 г.), итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татья-нин день» (Москва, 2009 г.), конкурсе на лучший научный и инновационный проект студентов и молодых ученых ММА им.И.М.Сеченова (Москва, 2008 г).

Связь задач исследования с проблемным планом.

Диссертационная работа является частью исследований, которые разрабатываются на кафедре фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО ММА им. ИМ.Сеченова. Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова, № Государственной регистрации - № 01.2.006 06352.

Публикации.

По результатам диссертационного исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы из 82 источников (66 из которых зарубежные). Работа рирована 24 рисунками и 24 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Экспериментальные данные, представленные в настоящей работе, получены на биопробах лиц, употреблявших тианептин («Коаксил®») с немедицинскими целями и проходивших освидетельствование в кабинетах наркологических экспертиз Отделения медицинского освидетельствования на состояние опьянения (ОМОСО) НКБ № 17 ДЗ г. Москвы, а также лиц, находившихся на лечении в отделениях НКБ № 17 ДЗ г. Москвы.

В качестве стандартного образца использовали натриевую соль тианеп-тина (серия 56309) фирмы «Servier» (Франция) с чистотой 99,0 %. Готовили 0,5 % метанольный раствор (в мерной колбе на 100 мл растворяли 0,5 г препарата в 90 мл 99 % метанола и доводили 99 % метанолом до метки).

Для создания pH образцов мочи использовали кислоту хлороводородную концентрированную и 5 М калия гидроксид. В качестве экстрагентоз при проведении пробоподготовки, а также при выборе подвижной фазы для метода ТСХ использовали следующие органические растворители: хлористый метилен, гексан, этилацетат, ацетон, изопропиловый спирт, изобутанол, петро-лейный эфир (марки 70 - 100), диэтиламин, уксусную кислоту ледяную, ди-этиловый эфир стабилизированный, гептан, хлороформ стабилизированный, 25 % раствор аммиака, бензол, циклогексан, метанол 99 %, этанол 96 %. Все реактивы и экстрагенты были марок х.ч., ч., или ч.д.а.

В качестве проявляющих реактивов при анализе методом ТСХ использовали: реактив Драгендорфа; реактив йодплатината подкисленный; реактив Марки; реактив Прочного черного К; 1 % раствор калия перманганата; серную кислоту концентрированную.

В качестве внутреннего стандарта при анализе методами ГХ и ГХ-МС использовали 0,05 % раствор дифениламина (Sigma) в метаноле. При проведении калибровки в качестве внешнего стандарта использовали 0,1 % раствор 17-а-метилтестостерона (Sigma) в метаноле.

В качестве дериватизирующих реактивов использовали уксусный ангидрид, TFA (трифторуксусный ангидрид), BSTFA (М,0-бис-(триметилсшшл)-трифторацетамид), MBTFA (Ы-метил-бмс-(трифторацетамид)), TBDMS (трет-бутил-диметилсилил), MSTFA (Ы-метил-ТЧ-триметилсилил-трифторацетамид) фирмы «Sigma» (США).

В работе использовали следующее оборудование: рН-метр «Mettler Toledo» МР-225 (Швейцария); шейкер «Sky Line» S-3.08M (Латвия); центрифуга «Eppendorf» 5804 (Германия); ультразвуковая водяная баня (Италия); вакуумный шкаф «Precisión» (Болгария); пульверизатор «Лабтех» (Россия); анализатор Axsym фирмы «Abbott» (США); тест-полоски для определения трицикли-ческих антидепрессантов в моче «КреативМП-ТСА» (Россия); хроматографи-сеские пластинки с алюминиевой металлической подложкой размером 10 х 10 см и закрепленным слоем сорбента Kieselge 60 F254 фирмы «Merck» (Германия); хроматографисеские пластинки со стеклянной подложкой 10 х 10 см и слоем сорбента Kieselge 60 фирмы «Merck» (Германия); газовый хроматограф «Agilent 6890N» с автоинжекгором «Agilent 7683» и азотно-фосфорным детектором (США); газовый хроматограф «Agilent 6890N» с масс-селективным детектором «Agilent 5973» и автоинжектором «Agilent 7683» (США); газовый хроматограф «Trace GC Ultra» с масс-селективным детектором «DSQII» и автоинжектором «TriPlus» (Италия).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Microsoft Office Excel 2007 в соответствии с требованиями ГФ XI.

Для оценки пригодности хроматографической системы рассчитывали следующие параметры: коэффициент емкости (к% число теоретических тарелок (N), коэффициент асимметрии (As), селективность (а) и степень разделения (R). Для вычисления этих показателей использовали алгоритмы программы обработки хроматографических данных ChemStations, Agilen и общие фармакопейные статьи USP29 и ВР2007.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Физико-химические характеристики тианептина.

Предположение того, что тианептин и его метаболиты будут изолироваться из мочи как при кислых, так и при щелочных значениях рН нами было подтверждено, при расчете зависимости логарифма очевидного распределения в системе октанол/вода LogD от рН среды с помощью программного пакета ACD/ChemSketch фирмы Advanced Chemistry Development Inc (Канада), V. 12 (рис. 1) и далее при анализе полученных экспериментальных данных. Ui!'ШАШШШИИИИИИИИИИИИИИИИИЯ^ ЫЯ. 'йВ ййй«? _

°J F

с = 9б.Э%, с(НЗО) = 85.В%; с(огд) =

Рисунок 1. Зависимость 1^0 тианептина от рН.

Этот факт подтверждается значениями рКа тианептина - 7, 47 и 4,75.

То же самое можно сказать про основные метаболиты тианептина - МС5 и МС3, так как в их структурах присутствуют группировки как кислого, так и основного характера.

В отличие от самого тианептина продукты его К-деметилирования, де-алкилирования и дезаминирования наоборот обладают либо кислотными, либо основными свойствами, что также было подтверждено при анализе полученных экспирементальных данных.

Кроме того, тианептин имеет довольно высокую молекулярную массу (436 а.е.м.) и в его молекуле присутствует длинный липофильный алифатический «хвост». Все эти факторы создают затруднения при анализе биожидкостей на факт присутствия тианептина методами ГХ и ГХ-МС и в тоже время идеально подходят для анализа методами жидкостной хроматографии. Именно этот факт обуславливает наличие довольно большого количества методик ана-

лиза методами жидкостной хроматографии.

2. Анализ мочи иммунохимическими методами.

Предварительный иммунохимический анализ (скрининга) мочи на наличие тианептина и его метаболитов проводили методами:

• иммунохроматографического анализа (ИХА);

• поляризационного флуорометрического иммунного анализа (ПФИА).

Для определения тианептина методом ИХА отбирали 2 мл мочи в пени-

циллиновые флаконы, для проведения ПФИА 200 мкл мочи помещали в специальные пробирки, производимые фирмой «Abbott» для анализатора Axsym.

Для проведения ИХА использовали наборы (тест-полоски) «КреативМП - ТСА» для обнаружения трициклических и других антидепрессантов. Положительный или отрицательный результат анализа оценивали по отсутствию или появлению окрашивания в тестовой зоне, соответственно.

Для проведения ПФИА использовали анализатор Axsym фирмы «Abbott», предварительно откалиброванный на трициклические антидепрессанты по имипрамину в диапазоне концентраций от 100 яг/мл до 1 ООО нг/мл.

Методами ИХА и ПФИА было проанализировано 290 проб мочи на наличие тианептина.

При проведении ИХА тест-полосками на трициклические антидепрессанты положительный результат наблюдался в 21 случае (7,24 %). При этом в 19 случаях (6,55 %) положительный результат был обусловлен наличием в моче амитриптилина и его метаболитов, которые дают положительный результат при анализе тест-полосками на трициклические антидепрессанты. Остальные 2 положительных результата (менее 1%), скорее всего, можно рассматривать как ложноположительные.

При исследовании этих же проб методом ПФИА на анализаторе «Axsym» при использовании наборов на трициклические антидепрессанты положительный результат наблюдался в 22 случаях. При этом обнаруженные концентрации находились в интервале от 195 нг/мл до 2511 нг/мл и концентрации выше 320 нг/мл соответствовали пробам, в которых помимо тианептина и его метаболитов содержался амитриптилин и его метаболиты. А пробы, в

которых определились концентрации ниже 320 нг/мл, можно расценивать как результат кросс-реактивности тианептина к наборам на трициклические антидепрессанты, так как даже в результате анализа стандарта тианептина с концентрацией 1 мкг/мл была получена концентрация 210 нг/мл.

Таким образом, использование иммунохимических методов в качестве предварительных методов анализа при исследовании на тианептин является нецелесообразным ввиду их низкой селективности и чувствительности.

3. Выбор оптимальных условий изолирования тианептина из мочи.

Для подбора оптимальных условий изолирования тианептина и его метаболитов пробы мочи по 3 мл доводили до значений рН, находящихся в интервале 1 - 2, 3 - 4, 7 и 9 - 10 (п = 10). Для создания рН в интервале от 1 до 4 . использовали хлороводородную кислоту концентрированную, а для рН 9-10 -5 М раствор калия гидроксида.

В качестве внутреннего стандарта к пробам мочи прибавляли 20 мкл 0,05 % раствора дифениламина в метаноле.

После создания рН ко всем пробам прибавляли в качестве экстрагента 3 мл диэтилового эфира (так как этот экстрагент используется по общей схеме проведения пробоподготовки в ХТЛ).

После прибавления эфира все пробы встряхивали на шейкере при 60 об/мин 10 мин (во избежание образования эмульсии) и далее центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Далее верхний органический эфирный слой отбирали в виалы на 2 мл (предварительно промытые метанолом и высушенные) и упаривали в вакуумном шкафу при комнатной температуре до сухого остатка. После упаривания сухой остаток смывали 200 мкл этилацетата.

Конечные экстракты анализировали методом ТСХ и ГХ. В качестве подтверждающего метода анализа использовали ГХ-МС.

Анализ экстрактов, полученных как при кислых, так и при щелочных значениях рН, показал наличие метаболита тианептина МС5 во всех зкстрак-

тах. В процессе анализа методами ГХ и ГХ-МС детектируется метаболит МС5, а сам тианептин и его метаболит МСз не детектируется.

Учитывая, что процесс ввода пробы в инжектор хроматографа, а также процесс хроматографического разделения компонентов проводится при относительно высоких температурах. Исходя из этого, нами было сделано предположение о том, что метаболит МС5 в этих условиях теряет воду с образованием лактонного производного МС5-Н2О. Схема образования лактона приведена на рис. 2.

Рисунок 2. Процесс образования лактона метаболита МСз.

Структура метаболита МС5 подтверждается масс-спектрометрическим анализом, а также тем фактом, что обработка как кислых, так и щелочных экстрактов мочи уксусным или трифторуксусным ангидридами, метилйодидом в щелочной среде или силилирующими реактивами (ВБТРА, МЭТРА, ТВБМБ) не приводит к уменьшению или полному исчезновению метаболита.

Кроме основного метаболита (МС5), в экстрактах, полученных при рН 3-4 также присутствуют дезалкилдезаминотианептин и дезалкилдезаминонор-тианептин, а в экстрактах, полученных при рН 9-10 - дезалкилтианептин и метаболит, в котором карбоксильная группа восстановлена до гидроксильной (далее - гидрокситианептин).

В некоторых образцах мочи, после пробоподготовки при щелочных значениях рН, детектируется еще ряд метаболитов, структурная формула которых на сегодняшний день пока не установлена.

При анализе методом ГХ число теоретических тарелок для всех метаболитов тианептина оказалось более 50000, селективность составила от 1,036 до 1,717, а степень разделения для большинства соединений от 2,60. Таким обра-

зом предложенная методика ГХ анализа может быть использована для идентификации метаболитов тианептина.

При анализе методом ГХ-МС эффективность колонки для всех метаболитов тианептина составила более 25000 теоретических тарелок, селективность колонки была более 1,053, а степень разделения для большинства соединений от 5,56. Таким образом, предложенная методика ГХ-МС может быть использована для идентификации метаболитов тианептина.

В целом выход метаболита МС5 при использовании пробоподготовки с созданием щелочных значений рН мочи статистически достоверно выше, чем при кислых значениях.

В экстрактах, полученных при рН 1 - 2, присутствуют также как и в экстрактах, полученных при рН 3-4, дезалкилдезаминотианептин и дезалкилде-заминонортианептин. Поэтому в данной ситуации не имеет особого значения с созданием каких кислых интервалов рН будет проводиться пробоподготовка. Но следует учитывать тот факт, что экстракты полученные при рН 1 - 2 содержат большее количество эндогенных соэкстрактивных веществ, что приводит к преждевременному износу колонки и затруднению в обработке хромато-грамм.

В экстрактах, полученных при нейтральных значениях рН обнаруживается только ЬМСг, хотя выход его по сравнению с другими видами пробоподготовки статистически достоверно выше.

На практике целесообразнее проводить пробоподготовку мочи с созданием рН в интервалах либо 3-4, либо 9 - 10. Но так как при щелочных значениях рН изолируются большинство НС и ПВ, то целесообразнее по общей схеме проводить пробоподготовку при этих условиях.

Для подбора органического растворителя, обладающего наилучшей экстрагирующей способностью в отношении тианептина и его метаболитов пробы мочи по 2 мл доводили до значений рН, находящихся в интервале 9-10, добавлением 5 М раствор калия гидроксида. Экстракцию проводили 3 мл одним из следующих экстрагентов (п = 10): хлористый метилен; гексан; хяори-

стый метилен - гептан - изопропанол (7:2:1); диэтиловый эфир; этилацетат; хлороформ. В качестве внутреннего стандарта к пробам мочи прибавляли 20 мкл 0,05% раствора дифениламина в метаноле. После прибавления экстраген-та все пробы встряхивали на шейкере при 60 об/мин 10 мин (во избежание образования эмульсии) и далее центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Затем верхний органический эфирный слой отбирали одноразовой пластиковой пипеткой в виалы на 2 мл (предварительно промытые метанолом и высушенные) и упаривали в вакуумном шкафу при комнатной температуре до сухого остатка. После упаривания сухой остаток смывали 200 мкл этилацетата.

Конечные экстракты анализировали методом ГХ. В качестве подтверждающего метода анализа использовали ГХ-МС.

- . Экстрагирующая способность различных органических растворителей оценивалась методом ГХ после экстракции из мочи при щелочных значениях рН по отношению площадей пиков метаболита МС5 и гидрокситианептина к пикам этих же метаболитов при экстракции эфиром (площади пиков метаболитов при экстракции эфиром были приняты за единицу - 100 %). Наилучшей экстрагирующей способностью обладает диэтиловый эфир, но в тоже время при изолировании метаболитов тианептина гексаном экстракты и, соответ-свенно, хроматограммы получаются более чистыми.

При описанных условиях анализа ГХ и ГХ-МС не происходит наложения пиков метаболитов тианептина с пиками другими токсикологически значимых соединений.

4. Применение метода хромато-масс-спектрометрии в анализе тианептина

и его метаболитов.

Масс-спектры тианептина и его метаболитов не представлены ни в одной библиотеке масс-спектров (АМОК, МБТ), поставляемых с программным обеспечением к оборудованию. Поэтому для достоверной идентификации метаболитов тианептина методом ГХ-МС необходимо было охарактеризовать масс-спектр для каждого метаболита.

Исходя из общепринятых правил идентификации веществ методом масс-спектрометрии, в химико-токсикологическом анализе необходимо для идентификации наличие не менее двух характеристических ионов, в судебно-химическом анализе - не менее четырех.

Как уже было описано ранее, метаболитом, который присутствует как в кислых, так и в щелочных экстрактах, является метаболит МС5, который методами ГХ и ГХ-МС детектируется как лактонное производное (LMC5).

Молекулярная масса лактонного производного метаболита МС5 (C19H19CIN2O3S) равна 390 а.е.м., следовательно, молекулярному иону соответствует m/z 390. Ион m/z 325 [М-65]+ соответствует потере сульфоксидной группы с разрывом азепинового цикла. Далее происходит фрагментация иона m/z 325 - отщепление бензоилхлорида с образованием иона m/z 215 и отщепление лактонного кольца с образованием иона m/z 228. Ион m/z 228 имеет наибольшую интенсивность в масс-спектре. Также в ионе m/z 325 происходит разрыв лактонного кольца по связям 2 и 6 с образованием иона m/z 255, который в дальнейшем претерпевает фрагментацию с образованием характеристических ионв m/z 152 и 228. Схема фрагментации LMC5 и его масс-спектр представлены на рис. 3.

Дезалкилтианептин, который детектируется в щелочных экстрактах имеет молекулярную массу 307 а.е.м. (C14H12CIN2O2S), следовательно, молекулярному иону соответствует m/z 307. Молекулярный ион в спектре дезал-килтианептина имеет наибольшую интенсивность. Также как и в LMC5 вначале будет идти фрагментация с потерей сульфоксидной группы и разрывом азепинового цикла, приводящие к образованию иона m/z 243 [М-65]+. Затем следует фрагментация иона m/z 243 с потерей амоногруппы и образованием иона m/z 228, который в свою очередь фрагментирует с потерей СН2-группировки, приводящей к образованию иона m/z 214.

uvi J«D СцИцСЖ,0»$

Рисунок 3. Масс-спектр метаболита MC5.

Аналогично были интерпретированы масс-спектры дезалкилдезамино-тианептина (молекулярная масса - 293 а.е.м.) и дезалкилдезаминонортианеп-тина (молекулярная масса - 279 а.е.м.).

В щелочном экстракте методами ГХ и ГХ-МС помимо LMC5 и дезал-килтианептина также детектируется еще один метаболит, структурную формулу которого долгое время не удавалось установить из-за отсутствия в масс-спектре интенсивного молекулярного иона.

Исходя из того, что этот метаболит экстрагируется из мочи при щелочных значениях pH, нами было сделано предположение, что в молекуле присутствует вторичный атом азота. В тоже время, этот метаболит обладает большей полярностью, чем дезалкилтианептин и LMCj, так как время удерживания у него самое большое (по сравнению с дезалкилтианептином и LMC5). Такую полярность может придать веществу наличие одной или нескольких гидроксильных групп.

Помимо этого, в масс-спектре данного метаболита присутствуют фрагменты с m/z 307 и m/z 292, что может косвенно свидетельствовать о неизме-

ненной в процессе биотрансформации дибензазепиновой структуры и наличи-ии аминогруппы.

Исходя из общих закономерностей фрагментации метаболитов тианеп-тина, в процессе фрагментации из молекулярного иона [М+] образуется ион [М-65]+, который соответствует потере сульфоксидной группы с разрывом азепинового цикла. Таким ионом в масс-спектре метаболита, скорее всего, является ион m/z 357.

Таким образом, нами была установлена структурная формула метаболита, который в процессе биотрансформации образуется путем восстановления карбоксильной группы до гидроксильной.

Как показывает практика, в случае употребления тианептина с целью получения наркотического эффекта, в моче присутствуют продукты его метаболизма или распада. Для их идентификации методами ГХ и ГХ-МС нет необходимости проводить дериватизацию.

Несмотря на это, для интерпретации результатов необходимо проведение количественной оценки по нативному веществу. Также идентификация нативного вещества необходима при анализе волос, так как в них, как правило, накапливаются исходные вещества, а не их метаболиты.

Для этих целей нами была предложена пробоподготовка с проведением дериватизации смесью MSTFA - аммония иодид - этанэтиол (1000:2:6) по массе (далее - WADA). Для этого к сухому остатку после упаривания прибавляли 50 мкл смеси WADA и дериватизировали при 60°С в течение 20 мин.

Такая методика дериватизации отличается от обычного силилирования тем, что процессы силилирования в этих условиях протекают наиболее глубоко и полно. Данный факт имеет немаловажное значение при анализе веществ в низких концентрациях и при проведении количественной оценки.

При проведении дериватизации смесью WADA атом водорода в карбоксильной, гидроксильной и амино- группах замещается на триметилсилильный остаток с образованием триметилсилильных производных (TMS-

производных), что приводит к уменьшению полярности исходного соединения и повышению летучести дериватизированного производного.

В щелочных экстрактах после проведения дериватизации идентифицируется сам тиаяептин (в виде TMS-производного), а также ряд его метаболитов. LMC5) дезалкилтианептин и гидрокситианептин (которые идентифицируются в прямой экстракции) и метаболиты МСз и МС5 в виде TMS-производных.

Интересен тот факт, что в дериватизированных экстрактах также детектируется LMC5, хотя его интенсивность значительно уменьшается по сравнению с прямой экстракцией. Следовательно, можно сделать предположение, что лактонное производное метаболита МС5 образуется в процессе биотрансформации тианептина в организме человека.

В спектрах TMS-производных тианептина и его метаболитов МС5 и МСз можно выделить характеристические ионы m/z 307, 292, 228. Наличие иона m/z 73 характерно для всех без исключения TMS-производных. Молекулярному иону TMS-производного тианептина будет соответствовать ион m/z 509.

Характер фрагментации тианептина-TMS аналогичен ранее описанным фрагментациям метаболитов дезалкилтианептина и LMC5.

Калибровка ГХ-МС по TMS-производному тианептина была проведена методом внешнего стандарта. В качестве внешнего стандарта использовали 17-а-метилтестостерон в концентрации 100 мкг/мл в метаноле. Калибровочные растворы готовили следующим образом. Из исходного раствора тианептина с концентрацией 100 мкг/мл в метаноле путем разведения готовили растворы с концентрациями 10 мкг/мл, 7,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 5 мкг/мл, 3,75 мкг/мл, 2,5 мкг/мл. К 1 мл раствора каждой концентрации прибавляли 100 мкл раствора внешнего стандарта и упаривали в вакуумном шкафу до сухого остатка. К сухому остатку прибавляли 50 мкл смеси WADA и проводили дерива-тизацию при 70°С в течение 25 мин. 1 мкл полученного деривата вводили в инжектор хроматографа. Концентрация внутреннего стандарта во всех пробах была 20 нг/мкл конечного экстракта.

Калибровочный график, отражающий зависимость отношения площади пика тианептина к площади пика внутреннего стандарта от концентрации тиа-нептина представлен на рис. 4 (у = 0,9354*х; т1- 0,9987).

Концентрация тианептина, мкг/мл

■ Исстинные значения отношения площадей пиков

——Калибровочная кривая, построенная методом наименьших квадратов

Рисунок 4. Калибровочный график зависимости отношения площади пика тианептина к площади пика внутреннего стандарта от концентрации тианептина.

Для расчета оценки выхода тианептина при экстракции (% экстракции) готовили калибровочные растворы на фоновой моче (заведомо не содержащей тианептин). К 3 мл мочи добавляли 10 мкг, 7,5 мкг, 6,25 мкг, 5 мкг, 3,75 мкг и 2,5 мкг тианептина (100 мкл, 75 мкл, 62,5 мкл, 50 мкл, 3,75 мкл и 25 мкл стандартного раствора тианептина с концентрацией 100 мкг/мл, соответственно). После создания рН = 9 - 10 ко всем пробам прибавляли в качестве экстрагента 3 мл диэтилового эфира. Далее поступали, как указано выше. В среднем % экстракции составил 72,84 ± 3,21 %.

Предел обнаружения ТМС-производного тианептина составил 0,75 мкг/мл, предел количественного определения 2,25 мкг/мл, диапазон линейных концентраций 0,75-50,00 мкг/мл.

6. Выбор оптимальных условий анализа методом ТСХ.

Экстракты, полученные после пробоподготовки с созданием рН в интервале 3 - 4 и 9 - 10 упаривали, сухой остаток растворяли в; 500 мкл хлороформа и наносили в количестве 20 мкл на хроматографические пластинки фирмы «Мегск» (Германия). Экстракты наносили в две зоны - А и Б. Использовали пластинки с алюминиевой металлической подложкой размером 10 х 10 см и закрепленным слоем сорбента Kieselge 60 F254 и хроматографические пластинки со стеклянной подложкой 10 х 10 см и слоем сорбента Kieselgel 60. В качестве стандарта в зону В наносили 5 мкл 0,5 % раствора тианептина в метаноле.

При выборе растворителей в качестве подвижной фазы учитывали их элюирующую способность. Основным критерием для выбора подвижной фазы служила наибольшая разделяющая способность в отношении метаболитов тианептина. После детектирования зон А и В измеряли Rf и отмечали окраску пятен. В зоне Б проводили элюирование метанолом и затем проводили подтверждающий анализ элюатов методом ГХ-МС.

По результатам эксперимента в качестве подвижной фазы для метода ТСХ можно рекомендовать следующую систему растворителей: изобутанол -ледяная уксусная кислота - вода (16:4:1), так как в этой подвижной фазе происходит наиболее полное разделение метаболитов и получаются четкие пятна после детектирования с оптимальными значениями Rf. Тианептин образует пятно с Rf = 0,55, метаболиты из кислых экстрактов - Rfl = 0,24 (метаболит МС3); Rq = 0,33 (дезалкилдезаминонортианептин и дезалкилдезаминотианеп-тин), метаболиты из основных экстрактов Rn = 0,24 (метаболит МС5).

Для детектирования использовали реактивы, представленные в табл. 1. В этой же таблице представлены окраски пятен тианептина и его метаболитов.

Таблица 1

Реактивы для детектирования и окраска пятен

Реактив Окраска

Реактив Драгендорфа Тианептин и его метаболиты - оранжево-коричневая

Реактив йодплатината подкисленный Коричнево-фиолетовая

Реактив Марки Нет окраски

Реактив Прочного черного К Тианептин - розовое; Метаболиты - от желто-бурого до розового

1% раствор перманганата калия Нет окраски

Концентрированная серная кислота, УФ-свет Нет окраски

Наиболее оптимальным на наш взгляд является использование реактива 1% водного раствора Прочного черного К. Тианептин образует пятно с розовой окраской, окраска пятен метаболитов - от розовой до желто-бурой.

В образцах мочи тианептин при анализе методом ТСХ не детектируется ни в кислых экстрактах, ни в щелочных. Скорее всего, это связано с довольно низкой концентрацией неметаболизированного вещества в пробе. Использование пластинок для ВЭТСХ также не дало положительного результата.

При направленном анализе на тианептин методом ТСХ целесообразнее анализировать кислые экстракты, так как уменьшается вероятность возникновения ложноположительных результатов при детектировании. Так, например, в щелочных экстрактах при детектировании реактивом Прочного черного К розовую окраску дают производные амфетамина, малиновую окраску - мета-дон. Хотя Яг тианептина и его метаболитов в системе изобутанол - ледяная уксусная кислота - вода (16:4:1) не совпадает с амфетамина и метадона.

Число теоретических тарелок для тианептина и его метаболитов составило более 700, а степень разделения соединений от 12,73, за исключением де-залкилдезаминотианептина и дезалкилдезаминонортианептина, которые в данной хроматографической системе не разделяются. Таким образом, предложенная методика может быть использована для идентификации метаболитов тианептина.

7. Анализ волос методом ГХ-МС.

Предварительно проводили «отмывку» волос 96% этанолом. Весь объем волос заливали спиртом и встряхивали на шейкере в течение 2 ч при 150 об/мин. Затем волосы высушивали и отбирали навеску 50 мг, которую измельчали сначала ножницами, а затем истирали в ступке пестиком. Измельченную навеску волос переносили во флакон на 10 мл, заливали 5 мл 99,9% метанола и ставили на ультразвуковую водяную баню на 2 ч при 80°С. Полученный спиртовой экстракт фильтровали через бумажный фильтр, прибавляли в качестве стандарта 50 мкл 0,1% раствора 17-а-метилтестостерона и упаривали в вакуумном шкафу при 80°С до сухого остатка. Сухой остаток дериватизировали смесью WADA 25 мин при 70°С. Параллельно готовили «холостую» пробу волос. Конечные экстракты анализировали методом ГХ-МС.

8. Схема метаболизма тнанептина на основании полученных экспериментальных данных.

Исходя из полученных экспериментальных данных нами предложена вероятная схема метаболизма тианептина в организме человека, которая представлена на рис. 5.

Де»*лкилд«ммиюи0ргиамвлтин

ИН2

Деаалкиламииотиамвгттн

Двзалкилдвааминотианелги»-

Рисунок 5. Схема метаболизма тианептина.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. При определении тианептина в моче методами ИХА и ПФИА показана их неспецифичность, что исключает возможность их использования в качестве предварительных при проведении химико-токсикологического или судебно-химического анализа.

2. Разработаны методики пробоподготовки мочи и волос. Показано, что основной метаболит тианептина ЬМС5 изолируется из мочи как при кислых (рН 3 - 4), так и при щелочных значениях рН (рН 9-10). Кроме основного метаболита (МС5), в экстрактах, полученных при рН 3-4 также присутствуют дезалкилдезаминотианептин и дезалкилдезаминонор-тианептин, а в экстрактах, полученных при рН 9-10 - дезалкилтианеп-тин и гидрокситианептин, метаболиты МСз и МС5. При этом на практике последние экстракты могут использоваться для выявления продуктов распада тианептина методами ТСХ, ГХ и ГХ-МС, а кислые, при необходимости, для подтверждения полученных результатов.

3. Подобраны оптимальные условия анализа тианептина и его метаболитов в моче методами ТСХ, ГХ и ГХ-МС, причем, возможно использование как кислых, так и щелочных экстрактов; в экстрактах из волос - методом ГХ-МС. При этом на практике ТСХ возможно использовать в качестве предварительного метода, а методы ГХ и ГХ-МС - в качестве подтверждающих.

4. Идентифицировано семь основных метаболитов тианептина масс-спектрометрическим анализом.

5. На основании полученных собственных экспериментальных данных предложена вероятная схема метаболизма тианептина в организме человека.

6. Показана возможность использования методик анализа тианептина и его метаболитов в практике химико-токсикологической лаборатории и Бюро судебно-медицинской экспертизы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петухов А.Е., Смирнов A.B., Симонов Е.А., Крылова E.H. Некоторые статистические данные работы химико-токсикологической лаборатории Наркологической клинической больницы № 17 ДЗ г. Москвы // Тезисы Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа». - Пермь, 2009. - с.33-36.

2. Петухов А.Е., Раменская Г.В., Симонов Е.А., Морозова Е.Б., Дорогохупец О.Б., Тюрин И.А., Смирнов A.B. Разработка методики хромато-масс-спектрометрического анализа тианептина в моче // Вестник ВГУ. - 2009. - № 2 (серия: химия, биология, фармация) - с.174-180.

3. Раменская Г.В., Петухов А.Е., Симонов Е.А., Морозова Е.Б., Дорогокупец О.Б., Крылова E.H. Химико-токсикологический анализ тианептина и его метаболитов в моче // Клиническая фармакология и терапия. - 2009. - №6 (дополнительный). - с.18-19.

4. Петухов А.Е., Раменская Г.В., Симонов Е.А., Смирнов A.B. Химико-токсикологический анализ тианептина и его метаболитов в моче методом тонкослойной хроматографии // Материалы международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства». - Шымкент, 2009. - т. 1. - с. 148-151.

5. Петухов А.Е., Раменская Г.В., Симонов Е.А., Крылова E.H., Тюрин И.А. Анализ тианептина и его метаболитов в моче методом газовой хроматографии // Фармация. - 2010. - №3. - с.15-18.

6. Petuhov A., Ramenskaya G., Simonov Е., Morozova Е., Dorogokupets О., Krilo-va E. GC/MS analysis of tianeptine and its metabolites in human urine // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology - 2009. - № 105(1) - p. 121.

Подписано в печать: 28.06.2010

Заказ № 3926 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Оглавление диссертации Петухов, Алексей Евгеньевич :: 2010 :: Москва

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Применение тианептина в медицине, клинические эффекты, фармакодинамика и фармакокинетика. Немедицинское использование.

1.1.1. Тианептин и его предшественники.

1.1.2. Механизм действия и клинические эффекты тианептина.

1.1.3. Фармакодинамика и фармакокинетика.

1.2. Физико-химические характеристики тианептина и методы анализа.

1.2.1. Физико-химические характеристики тианептина.

1.2.2. Методы анализа тианептина.

1.3. Валидация методик анализа.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Оборудование и материалы.

2.3. Обработка результатов исследования.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение.

3.1. Физико-химические характеристики тианептина.

3.2. Анализ мочи иммунохимическими методами.

3.3. Выбор оптимальных условий изолирования тианептина из мочи.

3.4. Применение метода хромато-масс-спектрометрии в анализе тианептина и его метаболитов.

3.5. Метрологическая характеристика методики хромато-масс-спектрометрическго определения ТМС-производного тианептина.

3.6. Выбор оптимальных условий анализа методом тонкослойной хроматографии.

3.7. Анализ волос на наличие тианептина методом ГХ-МС.

3.8. Схема метаболизма тианептина на основании полученных экспериментальных данных.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Петухов, Алексей Евгеньевич, автореферат

Отличительной чертой современного оборота наркотиков в России является расширение их ассортимента, поскольку на рынке присутствует большое количество лекарственных средств (ЛС), обладающих одурманивающим действием при использовании их в больших дозах.

В настоящее время злоупотребления ЛС занимают одно из лидирующих мест среди употребления других наркотических средств (НС) и психотропных веществ (ПВ) [4, 7].

Список ЛС, злоупотребление которыми отмечается на территории РФ, ежегодно пополняется новыми медикаментами, поступающими на фармацевтический рынок [7].

В последнее время в России отмечается значительное увеличение немедицинского использования тианептина (Коаксила®), наличие антидепрессивного, противотревожного и рединамизирующего эффектов которого, доказано в целом ряде клинических исследований. По сравнению с другими трицикличе-скими антидепрессантами, тианептин имеет менее выраженные побочные эффекты. При употреблении тианептина в дозах, в десятки раз превышающих терапевтические, наблюдается мощный стимулирующий эффект [6].

На сегодняшний день для определения тианептина в биологических объектах в основном применяется высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ- (ВЭЖХ-УФ) или масс-селективным детектором (ВЭЖХ-МС).

Эти методы являются подтверждающими методами при проведении химико-токсикологического анализа (ХТА), в то время как предварительного метода для обнаружения тианептина в биологических объектах нет. Также методы ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС являются сложными в плане пробоподготовки и, довольно дорогими. Далеко не в каждом регионе Российской Федерации в распоряжении химико-токсилогической лаборатории имеется такое оборудование.

Поэтому разработка методик анализа методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), газовой хроматографии (ГХ) и газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) является актуальным.

Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось разработать подходы к химико-токсикологическому анализу тианептина и его метаболитов в моче и волосах при недавнем и отдаленном употреблении.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) оценить возможность анализа тианептина иммунохимическими методами;

2) разработать методики пробоподготовки мочи и волос, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции;

4) на основе результатов анализа ГХ-МС идентифицировать метаболиты тианептина;

6) оценить возможность использования методик анализа в лабораторной практике путем их валидации.

Научная новизна.

Практическая значимость.

Внедрение результатов в практику:

Описанные методики анализа тианептина и его метаболитов в моче и волосах внедрены и используются в практике Химико-токсикологической лаборатории (ХТЛ) Наркологической клинической больницы № 17 ДЗ г. Москвы (акт внедрения от 23 марта 2010 г. № 14), ХТЛ Наркологического диспансера №1 г. Тулы (акт внедрения от 22 декабря 2009 г.), ХТЛ ГУЗ «Ярославская областная наркологическая клиническая больница» (акт внедрения от 14 декабря 2009 г. № 1), ГУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт внедрения от 5 октября 2009 г.).

Публикации результатов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Разработанные методики пробоподготовки и хроматографического анализа тианептина и его метаболитов в моче и волосах.

2) Схемы фрагментации и масс-спектры тианептина и его метаболитов.

3) Вероятная схема метаболизма тианептина в организме человека.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы из 82 источников (66 из которых зарубежные). Работа иллюстрирована 24 рисунками и 24 таблицами.

Заключение диссертационного исследования на тему "Химико-токсикологический анализ тианептина и его метаболитов в биологических объектах"

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

2. Разработаны методики пробоподготовки мочи и волос. Показано, что основной метаболит тианептина ЬМС5 изолируется из мочи как при кислых значениях рН (рН 3 - 4), так и при щелочных (рН 9 - 10). Кроме основного метаболита (МС5), в экстрактах, полученных при рН 3-4 также присутствуют дезалкилдезаминотианептин и дезалкилдезаминонортианептин, а в экстрактах, полученных при рН 9 - 10 - дезалкилтианептин и гидрокси-тианептин, метаболиты МСз и МС5. При этом на практике последние экстракты используются для выявления продуктов распада тианептина методами ТСХ, ГХ и ГХ-МС, а кислые, при необходимости, для подтверждения полученных результатов.

4. Идентифицировано семь основных метаболитов тианептина масс-спектрометрическим анализом.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Петухов, Алексей Евгеньевич

1. Анализ тианептина и его метаболитов в моче методом газовой хроматографии / А.Е. Петухов и др.. // Фармация. - 2010. - №3. - с.15-18.

2. Гнойно-некротические и сосудистые осложнения после парентерального введения «Коаксила» (тианептина) у больных с наркотической зависимостью / В.А. Ступин и др. // Наркология. 2008. - № 3. - с. 49-56.

3. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., - М.: Медицина, 1989.-400 с.

4. Злоупотребление «Коаксилом» (тианептином) в качестве заместительного средства больными с героиновой зависимостью / B.C. Холодов и др. // Материалы Научно-практической конференции «Актуальные проблемы наркоманий», Москва, 29 30 марта 2007 г.

5. Инструкция по медицинскому применению препарата «Коаксил».

6. Крупицкий Е.М., Бураков A.M. Зависимость от «Коаксила»: сообщение о случае // Наркология. 2007. - № 1. - с.73-75.

7. Приказ МЗиСР РФ от 13 октября 2006 г. №703 «О внесении изменения в приказ МЗиСР РФ от 14 декабря 2005 г. №785».

8. Приказ МЗиСР РФ от 14 декабря 2005 г. № 785 «О порядке отпуска лекарственных средств» (в ред. Приказов Минздравсоцразвития РФ от2404.2006 № 302, от 13.10.2006 № 703, от 12.02.2007 № 109, от1202.2007 № 110, от 06.08.2007 № 521).

9. Разработка методики хромато-масс-спектрометрического анализа тианеп-тина в моче / А.Е. Петухов и др. // Вестник ВГУ. 2009. - № 2 (серия: химия, биология, фармация) - с. 174-180.

10. Рябцева A.A., Бардеева Ю.Н. Токсическое поражение органа зрения у инъекционных потребителей «Коаксила» (тианептина) // Наркология.2008. -№ 1. — с. 48-54.

11. Фармакология / Под ред. Р.Н. Аляутдина. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. -591 с.

12. Химико-токсикологический анализ тианептина и его метаболитов в моче / Г.В. Раменская и др. // Клиническая фармакология и терапия. 2009. -№6 (дополнительный). - с.18-19.

13. Шевцова Ю.Б. Особенности формирования зависимости от тианептина («Коаксила») // Наркология. 2008. - № 2. - с. 56-59.

14. ACD/ChemSketch (Advanced Chemistry Development, Inc), V. 9.05 DVDROM. (ограниченная доступность).

15. Acute and chronic tianeptine treatments attenuate ethanol withdrawal syndrome in rats / T. Uzbay et al. // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2006. - № 30(3). - p. 478-485.

16. Addictive potential of Tianeptine the threatening reality / D. Vadachkoria et al. // Georgian Med. News. - 2009. - № 174. - p. 92-94.

17. A division of the American Chemical Society. URL: http://www.cas.org (дата обращения 21.12.2008).

18. Analgesic effect of tianeptine in mice / I.T. Uzbay et al. // Life Sci. 1999. -№64(15).-p. 1313-1319.

19. Barrick C.B. Sad, glad, or mad hearts? Epidemiological evidence for a causal relationship between mood disorders and coronary artery disease // J. Affect. Disord. 1999.-№53(2).-p. 193-201.

20. Baselt R.C. Disposition of toxic Drugs and Chemicals in Man // Biomedical Publications. 2004. - № 415(14). - p. 1105-1106.

21. Basic mechanisms of augmentation of antidepressant effects with thyroid hormone / T. Lifschytz et al. // Curr. Drug Targets. 2006. - № 7(2). - p. 203210.

22. Boyce P., Judd F., Hindmarch I. The behavioural toxicity of antidepressants: effects on cognition and sexual function // Int. Clin. Psychopharmacol. 1998. -№ 13(6).-p. 5-8.

23. British Pharmacopoeia (2007).

24. Bruce G., Charlton M.D. The malaise theory of depression: Major depressive disorder is sickness behavior and antidepressants are analgesic // Medical Hypotheses. 2000. - № 54. - p. 126-130.

25. Chronic administration of tianeptine balances lipopolysaccharide-induced expression of cytokines in the spleen and hypothalamus of rats / N. Castanon et al. // Psychoneuroendocrinology. 2004. - № 29(6). - p. 778-790.

26. Clark E.G.C. Analysis of drug and poisons. Vol 1-2. London: Pharmaceutical Press, 2004.

27. Clinical efficacy of tianeptine in patients with ischemic heart disease and com-orbid depression / G.V. Pogosova et al. // Kardiologiia. 2004. - № 44(3). -p. 20-24.

28. Delbende C. Effect of chronic treatment with the antidepressant tianeptine on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis / C. Delbende et al. // Eur. J. Pharmacol. 1994. - № 251(2-3). - p. 245-251.

29. Dopamine agonist amineptine prevents the antidepressant effect of sleep deprivation / F. Benedetti et al. // Psychiatry Res. 1996. - № 65(3). - p. 179-184.

30. Effect of chronic treatment with the antidepressant tianeptine on the hypotha-lamo-pituitary-adrenal axis / C. Delbende et al. // Eur. J. Pharmacol. 1994. -№251(2-3).-p. 245-251.

31. Effect of repeated treatment with tianeptine and fluoxetine on central dopamine D(2)/D(3) receptors / M. Dziedzicka-Wasylewska et al. // Behav. Pharmacol. -2002.-№13(2).-p. 127-138.

32. Effect of tianeptine and fluoxetine on the levels of Met-enkephalin and mRNA encoding proenkephalin in the rat / M. Dziedzicka-Wasylewska et al. // J. Physiol. Pharmacol. 2002. - № 53(1). - p. 117-125.

33. Endogenous opioids mediate basal hedonic tone independent of dopamine d-1 or d-2 receptor activation / S. Narayanan et al. // Neuroscience. 2004. - № 124(1).-p. 241-246.jL

34. European Pharmacopoeia, 4 ed. (2002)

35. Evidence that serotonin reuptake modulators increase the density of serotonin innervation in the forebrain / L. Zhou et al. // J. Neurochem. 2006. - № 96(2). - p. 396-406.

36. Ewen B.S., Chattarji S. Molecular mechanisms of neuroplasticity and pharmacological implications: the example of tianeptine // Eur. Neuropsychopharma-col. 2004. - № 5. - p. 497-502.

37. Eye-blink rates and depression. Is the antidepressant effect of sleep deprivation mediated by the dopamine system? / D. Ebert et al. // Neuropsychopharma-cology. 1996. - № 15(4). - p. 332-339.

38. Fatal intoxication with tianeptine (Stablon®) / P. Proenca et al. // Forensic Science International. 2007. - № 170. - p. 200-203.

39. GC/MS analysis of tianeptine and its metabolites in human urine / A. Petuhov et al. // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 2009. - № 105(1) -p.121.

40. Guillem E., Lepine J.P. Does addiction to antidepressants exist? About a case of one addiction to tianeptine // Encephale. 2003. - № 29(5). - p. 456-459.

41. High-performance liquid chromatographic determination of tianeptine in plasma applied to pharmacokinetic studies / J.M. Gaulier et al. // J. Chromatogr. B 2000. - № 748(2). - p. 407-414.

42. Ion-pair extraction and high-performance liquid chromatographic determination of tianeptine and its metabolites in human plasma, urine and tissues / G. Nicot et al. // J. Chromatogr. 1986. - № 381(1). - p. 115-126.

43. Khedr A. High-performance liquid chromatographic stability indicating assay method of tianeptine sodium with simultaneous fluorescence and UV detection // J. Chromatogr. Sci. 2007. - № 45(6). - p. 305-310.

44. Kinetic profiles of tianeptine and its MC5 metabolite in plasma, blood and brain after single and chronic intraperitoneal administration in the rat / W. Couet et al. // Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet. 1990. - № 15. - p. 6974.

45. Labrid C., Mocaer E., Kamoun A. Neurochemical and pharmacological properties of tianeptine, a novel antidepressant // Br. J. Psychiatry Suppl. 1992. - № 15.-p. 56-60.

46. Local, but not systemic, administration of serotonergic antidepressants decreases hippocampal nitric oxide synthase activity / G. Wegener et al. // Brain Res. 2003. - № 959(1). - p. 128-134.

47. Lucassen P.J., Fuchs E., Czeh B. Antidepressant treatment with tianeptine reduces apoptosis in the hippocampal dentate gyrus and temporal cortex // Biol. Psychiatry. 2004. - № 55(8). - p. 789-796.

48. Magarinos A.M., Deslandes A., Ewen B.S. Effects of antidepressants and benzodiazepine treatments on the dendritic structure of CA3 pyramidal neurons after chronic stress // Eur. J. Pharmacol. 1999. - № 371(2-3). - p. 113-122.

49. Metabolic activation of the new tricyclic antidepressant tianeptine by human liver cytochrome P450 / D. Larrey et al. // Biochem. Pharmacol. 1990. - № 40.-p. 545-550.

50. Misuse of tianeptine: five cases of abuse / L. Leterme, et al. // Ann. Med. Interne (Paris). 2003. - № 154 (2) - p. 58-63.

51. Neurotransmitter changes by interferon-alpha and therapeutic implications / M. Schaefer et al. // Pharmacopsychiatry. 2003. - № 36(3). - p. 203-206.

52. Noväkovä E. Detection of new antidepressive agents using thin-layer chromatography // Soud Lek. 2004. - № 49(1). - p. 2-6.

53. Nucleus accumbens muscarinic receptors in the control of behavioral depression: antidepressant-like effects of local Ml antagonist in the Porsolt swim test / D.T. Chau et al. // Neuroscience. 2001. - № 104(3). - p. 791-798.

54. Oluyomi A.O., Datla K.P., Curzon G. Effects of the (+) and (-)-enantiomers of the antidepressant drug tianeptine on 5-HTP-induced behaviour // Neuropharmacology. 1997. -№ 36. - p. 383-387.

55. Paul I.A., Skolnick P. Glutamate and depression: clinical and preclinical studies // Ann. N.Y. Acad. Sei. 2003. - № 1003. - p. 250-272.

56. Plasticity at hippocampal to prefrontal cortex synapses is impaired by loss of dopamine and stress: importance for psychiatric diseases / T.M. Jay et al. // Neurotox Res. 2004. - № 6(3). - p. 233-244.

57. Pharmacokinetics and bioavailability of tianeptine in the elderly / D. Carlhant et al. // Drug Invest. 1990. - № 2. - p. 167-172.

58. Pharmacokinetics of the antidepressant tianeptine at steady state in the elderly / F. Demotes-Mainard et al. // J. Clin. Pharmacol. 1991. - № 31. - p. 174178.

59. Rosen R.C., Lane R.M., Menza M. Effects of SSRIs on sexual function: a critical review // J. Clin. Psychopharmacol. 1999. - № 19(1). - p. 67-85.

60. Saatcioglu O., Erim R., Cakmak D. A case of tianeptine abuse // Turk. Psikiya-tri Derg. 2006. - № 17(1). - p. 72-75.

61. Settle E.C. Antidepressant drugs: disturbing and potentially dangerous adverse effects // J. Clin. Psychiatry. 1998. - № 59(16). - p. 25-30.

62. SSRIs and cognitive performance in a working sample / E.J. Wadsworth et al. // Hum. Psychopharmacol. 2005. - № 52(12). - p. 121-127.

63. Switching to tianeptine in patients with antidepressant-induced sexual dysfunction / M. Atmaca et al. // Hum. Psychopharmacol. 2003. - № 18(4). - p. 277-280.

64. Synaptic plasticity and tianeptine: structural regulation / E. Fuchs et al. // Eur. Psychiatry. 2002. - № 3. - p. 311-317.

65. Tatar Ulu S. Determination of tianeptine in human plasma using highperformance liquid chromatography with fluorescence detection // J. Chroma-togr. B 2006. - № 834(1-2). - p. 62-67.

66. The metabolic pathways of tianeptine, a new antidepressant, in healthy volunteers / L. Grislain et al. // Drug. Metab. Dispos. 1990. - № 18. - p. 804-808.

67. Thyroid hormones in the rat amygdala as common targets for antidepressant drugs, mood stabilizers, and sleep deprivation / G. Pinna et al. // Biol. Psychiatry. 2003. - № 54(10). - p. 1049-1059.

68. Tianeptine and its main metabolite. Disposition in chronic renal failure and haemodialysis / C. Salvadori et al. // Fundam. Clin. Pharmacol. 1990. - № 4.-p. 663-671.

69. Treatment with tianeptine of depressive disorders in drug addicts under withdrawal. Assessment of efficacy and study of dependence / H. Loo et al. // Encephale. 1987. - № 13(5). - p. 295-299.

70. Tzschentke T.M. Glutamatergic mechanisms in different disease states: overview and therapeutical implications // Amino Acids. 2002. - № 23(1-3). - p. 147-152.

71. Ulu S.T. Determination of tianeptine in tablets by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection // J. AOAC Int. 2007. - № 90(3). - p. 720-724.

72. United States Pharmacopoeia, 29th revision (2008)

73. Vyas A., Bernal S., Chattarji S. Effects of chronic stress on dendritic arborization in the central and extended amygdale // Brain Res. 2003. - № 965(1-2). - p. 290-294.

74. WADA Technical Document TD2003IDCR, v. 1.2, January 1, 2004

75. Wagstaff A J., Ormrod D., Spencer C.M. Tianeptine: A review of its use in depressive disorders // CNS Drugs. 2001. - № 15(3). - p. 231-259.

76. Wilde M.I., Benfield P. Tianeptine: a review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy in depression and coexisting anxiety and depression // Drugs. 1995. - № 49. - p. 411-439.

77. Wise T.N., Arnold L.M., Maletic V. Management of painful physical symptoms associated with depression and mood disorders // CNS Spectr. 2005. -№ 10.-p. 1-13.

78. Wojciech L. Complex intoxication by tramadol and tianeptine: a case report // XLIV. — 2000. № 17.-p. 130-139.