Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Разработка метода определения дезоксиниваленола и зеараленона и изучение загрязнения ими пищевых продуктов

г г\

На правах рукописи

ЗАХАРОВА Людмила Павловна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА И ЗЕАРАЛЕНОНА И ИЗУЧЕНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ИМИ ПИЩЕВЫХ

ПРОДУКТОВ

14.00.07 - Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте питания Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, профессор Тутельян В.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Юдина Т.В. доктор медицинских наук, профессор Карплюк И.А.

Ведущая организация:

Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова

Защита состоится "_"_1996 г. в "_" часов

на заседании Диссертационного Совета Д.084.05.01 при Московском Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана по адресу: 141000, Московская область, г. Мытищи, ул. Семашко, д. 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук, профессор

Комарова А.А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Среди наиболее опасных загрязнителей пищевых про-дуктои особое место занимают микотоксины - вторичные метаболиты микроскопических грибов. Микроскопические грибы рода Fusarium являются широко распространенными токсинообразуюшими грибами, которые способны продуцировать ряд высокотоксичных метаболитов, среди которых наибольшим распространением отличаются дезоксиниваленол (ДОН или вомнтоксин) и зеараленон (3J1). Алиментарные микотоксикозы, связанные с загрязнением пищевых продуктов и кормов фузариотокеннами или их продуцентами, относятся к наиболее часто встречающимся микотоксикозам человека и сельскохозяйственных животных /Саркисов А.Х.,1954; Билай В.И.,1977; Тутельян U.A. и Кравченко Л.В., 1985; Miller J.,1995/. В последние годы резко возрос интерес к фузарпотокеннам в связи с появлением новых данных об их токсических свойствах, в частности, их способности даже в незначительных количествах нарушать процессы иммуногенеза /Blaylock B.L. et al., 1993; Holladay S.D. et al., 1995; Rotter B.A. et al., 1996/.

В связи с высокой биологической активностью ДОН и 3J1 в ряде стран введены регламенты на их содержание в продовольственном сырье /Scott P.M.,1990; Hietaniemi V. et al., 1991; Bergstrom G.S., 1993/. В нашей стране до 1995 г. предельно допустимая концентрация (ПДК) ДОН для продовольственного зерна пшеницы составляла 0,5 мг/кг, а с 1995 года - 0,7 мг/кг; ПДК 3JI для зерновых - 1,0 мг/кг /Тутельян В.А. и др., 1990; Госкомсан-эпиднадзор России, ГН 2.3.4. 034-95/.

Важной мерой профилактики попадания фузариотоксинов в пищу человека является систематический контроль за содержанием их в зерне и зерно-продуктах. Необходимым элементом в организации такого контроля служит разработка и внедрение в практику работы органов Госсанэпиднадзора высокочувствительных, селективных, доступных и надежных методов анализа фузариотоксинов. Несмотря на достаточное количество аналитических инструментальных методов определения ДОН и ЗЛ, остаются сложности с серийными определениями содержания фузариотоксинов в зерновых продуктах, снизанных с малой доступностью, высокой дороговизной современного аналитического оборудования /Kuronen Р., 1989/.

г

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла ь разработке высокочувствительных методов контроля, пршодных как дли серийных, тик п арбитражных анализов зерна п зерпо-нродуктов на содержание потенциально опасных для здоровья человека фуза-риотоксинов (ДОН, ЗЛ) и изучение частоты и уровнен загрязнения лнми токсинами отечественного и импортируемого зерна.

Были поставлены следующие задачи:

- разработать высокочувствительный и достоверный метод определения ДОН и ЗЛ в зерне и зерноиродуктах, пригодный для серийных анализов;

- разработать меюд выделения и очистки ДОН из зерна, искусственно зараженного в лабораторных условиях высокотоксигснным шгаммом-продуцентом этого токсина;

- изучить распространенность и степень контаминации ДОН и ЗЛ заготавливаемого зерна пшеницы и ячменя и изучить взаимосвязь уровней загрязнения зерна ДОН со степенью поражения его фузариозом;

- изучить распространенность и степень контаминации ДОН и ЗЛ зерновых, предназначенных на продовольственные цели;

- оценить реальную нагрузку ДОН на население России.

Научная новизна работы. Разработан новый метод обнаружения, идентификации и количественного определения ДОН и ЗЛ в зерне и зерноиродуктах; впервые выделен и получен в очищенном виде препарат ДОН из субстрата, искусственно зараженного высокотоксигенным штаммом-продуцентом этого токсина; изучена частота и уровни загрязнения ДОН и ЗЛ свеже-убранного (заготавливаемого) зерна пшеницы и ячменя из СевероКавказского региона; показано существование прямой корреляционной зависимости между концентрацией ДОН и содержанием фузариозпых зерен; впервые изучена частота и уровни загрязнения ДОН и ЗЛ зерна пшеницы, ячменя и ржи; установлено, что наибольшее количество загрязненных ДОН партий зерна производятся и потребляются в Северо-Кавказском регионе; впервые установлена величина реальной на1рузки ДОН на население России. Практическая значимость и внедрение результатов работы.

Разработан и внедрен в практику Госсанэпиднадзора России и Минсельхозпрода России новый высокочувствительный, селективный, количественный метод определения ДОН и ЗЛ, позволяющий проводить серийные

анализы. На ociioiiainiii рсзультатои настоящего исследования разработаны и утверждены "Методические указании по обнаружению, идентификации и определению содержании дезокешшваленала (иомитоксина) и зеараленона и зерне и зернопродуктах" /Минздрав СССР, N 5177-90/.

Выделен и получен в высокоочищенном виде препарат дезокеннивале-нола, который используется в качестве стандарта при определении ДОН центрами Госсанэпиднадзора России, Госстандарта России и при производ-стиенном контроле в системе Минсельхозпрода России.

Результаты диссертации были использованы прп разработке "Инструкции по выявлению фузариоза колоса и зерна пшенпцы и ячменя, контролю содержания в них дезоксиниваленола и зеараленона и использованию такого зерна" /Минсельхозпрод России, Госкомсанэпиднадзор России, Главная государственная хлебная инспекция при Правительстве Российской Федерации, М., 1996/.

С 1989 г. при участии диссертанта осуществляется мониторинг за загрязнением дезокенниваленолом и зеараленоном продовольственного зерна в 32 республиканских, краевых и областных центрах Госсанэпиднадзора России.

Апробация работы. Результаты работы доложены на научной конференции с международным участием " Питание: здоровье и болезнь" /Москва, 1990/; на 1-ом Международном научном конгрессе "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты" /Москва, 1994/; на 2-ой Всероссийской научно-практической конференции "Антропогенные воздействия и здоровье человека" /Калуга, 1995/.

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 10 синей в научных журналах н сборниках научных трудов, а также в сборниках меч одических указаний.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа*изложена на 182 страницах машинописного текста, содержит 49 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 210 источников, из которых 185 - иностранных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования явились 3272 пробы продовольственного и заготавливаемого зерна пшеницы, ячменя и ржи урожаев 1989-1994 гг. из различных регионов России. В том числе - 1338 образцов продовольственного зерна из Северо-Кавказского, Волго-Вятского, Поволжского, Центрального, Центрально-Черноземного, Западно-Сибирского, Уральского, ВосточноСибирского, Дальневосточного и Северо-Западного районов, предоставленные для анализа республиканскими и областными центрами Государственного санэпиднадзора (ГСЭН). Образцы заготавливаемого зерна пшеницы и ячменя - всего 1934, были получены из ареала фузариоза - преимущественно из Краснодарского края н предоставлены для анализа Всероссийским научно-исследовательским институтом зерна и продуктов его переработки (ВНИИЗ) и его Кубанским филиалом.

Формирование средней пробы, массой не менее 2 кг, проводили но ГОСТу 13586. 3-83 от однородных партий, хранящихся на хлебоприемных предприятиях.

Содержание фузариозных зерен в пшенице определяли в соответствии с "Методическими указаниями по учету фузариоза колоса и визуальному определению фузарнозного зерна пшеницы" /М., 1988/.

Изоляты грибов при изучении токсигенного потенциала были выделены из зерна пшеницы и ячменя урожаев 1989-1991 гг. из Северо-Кавказского региона и предоставлены для анализа лабораторией " Защиты от вредителей и санитарной охраны зернопродуктов" ВНИИЗ.

В работе по выделению и очистки ДОН использовался штамм Р. шасгосега5 - 579 а, выделенный из зерна пшеницы в лаборатории микробиологии Института питания РАМН. Культура гриба-продуцента поддерживалась в лаборатории на агаре Чапека.

При разработке метода определения ДОН и ЗЛ использовалось зерно, искусственно загрязненное микотоксинами в различных концентрациях.

На первом этапе исследования определение ДОН осуществляли согласно " Методическим указаниям по обнаружению, идентификации и опредс-

лснию содержании дезоксинпиллеиола (помитоксина ) n зерне и зернопродук-тах" /Тутсльян В.А. и др., 1985/.

В результате унификации метода дальнейшие исслелопания по количественному определению ДОН и ЗЛ в зерне проводили по разработанным нами "Методическим указаниям по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксипипаленола (вомнтокспнл) и зеараленона в зерне и зерпопродуктах". В разработанном методе содержание ДОН и ЗЛ оценивал» с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках "Силуфол" (ЧССР). Количественное определение ДОН и ЗЛ в экстрактах осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе "Altex" (США), модель 336, колонка с силикаге-лсм "Ultiasplicrc - Si" (в нормальнофазовом варианте) или "Ultraspliere OI)S"(n обрпщенпофачовом варианте), длина колонки 25 см, предколонка 4,5 см, внутренний диаметр 0,46 см и размер частиц 5 мкм, УФ-детектор "Kratos-757" (Англия), флуоримстрический детектор "Jasco 821-ГР"(Япония).

Вт,|дслспие и очистку ДОН осуществляли по метолу, разработанному нами п лаборатории энзпмолошн питания Институт питания РАМН. Выделенный токсин анашпиропали методом ТСХ в системе растворителей: гексан-п потоп (3:2), эфир-гексан-изопропанол-вода (77:18:4,5:0,5), хлороформ-лцетон-топропанол (78:12:10). Чистоту токсина определяли методом ВЭЖХ. Подвижная фаза для обращеннофазопой ВЭЖХ - метанол-вода (30:70), расход подвижной фазы 1,0 мл/мин; для нормальнофазовой ВЭЖХ - гексан-изопронанол-пода (85:25:1,5), расход подвижной фазы 1,5 мл/мин. С целью подтверждения структуры ДОН определяли масс-спектры как исходного ДОН, так п его триметилсилильного производного (ТМС) /Bennett G.A. et al., 1981/.

При приготовлении стандартного раствора ЗЛ использовали кристаллический препарат ЗЛ производства фирмы "International minerals & chemical corporation" (США). Для приготовления стандартного раствора ДОН использовали кристаллический, хроматогрлфически чистый препарат ДОН, полученный нами в лаборатории этимологии питания Института питания РАМН, и препарат ДОН производства фирмы "Sigma" (CUJA).

Статистически обработанные данные представляли п пнде медианы и 90% уропня. Средний уровень ДОН выражали как М ± т /Мслышк М., 1983/.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Разработка метода опрвделения дезоксиниваленола и зеагаленона в зерне и зернопродуктах

Большинство применяемых в настоящее время методов анализа не позволяют осуществлять количественное определение наиболее распространенных фузариотоксинов - ДОН и ЗЛ, используя один и тот же экстракт. Это значительно затрудняет аналитическую процедуру, увеличивает время анализа и требует повышенного расхода химических реактивов.

При разработке метода определения ДОН и ЗЛ из одного экстракта были решены такие вопросы, как подбор смеси растворителей, оптимальной для селективной экстракции этих микотоксинов, условий наиболее эффективного отделения примесей и высокочувствительного детектиропания пятен ДОН и ЗЛ при ТСХ. С целью повышения чувствительности, достоверности и точности метода определения ДОН и ЗЛ нами были разработаны условия проведения нормально- и обращеннофазовой ВЭЖХ.

Предлагаемый метод определения ДОН и ЗЛ в одном образце зерна и зернопродуктов включает следующие этапы: экстракцию ДОН и ЗЛ из образца смесью ацетонитрил-вода (84:16); очистку одной части экстракта на колонке со смесью угля с оксидом алюминия; определение ДОН в очищенном экстракте с помощью ТСХ с флуориметрическим обнаружением пятен или с помощью нормально- или обращеннофазовой ВЭЖХ с УФ-детектором при длине волны 224 им; обезжиривание второй части экстракта гексаном; разбавление экстракта водой и переэкстракцию ЗЛ в бензол; определение ЗЛ с помощью одномерной или двумерной ТСХ с флуориметрическим обнаружением пятен или с помощью нормально- или обращеннофазовой ВЭЖХ с УФ-детектором при длине волны 283 им или флуориметрическим детектором (дчина волны возбуждающего света 275 им, эмиссионного света-465 им).

I. /. Экаракцин

При разработке метода была проведена сравнительна» характеристика нескольких систем растворителе!!, таких как водный метанол и водный аце-топнтрнл в разных соотношениях исходных компонентов. Было найдено, что недостаточно селективная экстракция водным метанолом приводит к необходимости многостадийной очистки, связанной с возможностью потерь и снижающей в связи с этим степень извлечения ДОН и ЗЛ. Показано, что смесь ацетоннтрил-вода (84:16) дает в 40 раз большую степень извлечения фузарио-токсинов но сравнению с чистым ацетонитрнлом, извлекая при этом минимальное количество липпдов. Применение одной системы растворителей для выделения ДОН и ЗЛ позволило сократить время анализа, снизить трудоемкость и расход химических реактивов, что особенно существенно при проведении серийных определении.

1.2. Обнаружение, идентификация и определение содержания дезокси-нииапенача и экаракте

1.2.1. Очистка экстракта

Наиболее длительным этапом является очистка экстракта от мешающих анализу примесей. Для очистки экстракта ДОН используют такие методы, как жидкость-жидкостное распределение, комплексообразование, адсорбционная и ионообменная колоночная хроматография, препаративная ТСХ и др. В предложенной схеме анализа очистка ДОН проводилась на колонке со смесью угля н оксида алюминия. В результате, без использования сложных методических приемов, получен экстракт, степень очистки которого достаточна для проведения прямого ТСХ- и ВЭЖХ-оиределения ДОН.

1.2.2. Обнаружение и количественное определение дезоксиниилченола с помощью одномерной и двумерной ТСХ

При проведении одномерной ТСХ было исследовано несколько систем растворителей: этилацетат-эфир (1:1), хлороформ-ацстон-нзопропилоиый спирт (78:12:10) и гексап-ацетон (3:2). Наилучшей оказалась система гексан-ацегон (3:2), позволяющая эффективно отделить основные компоненты экстракта, обладающие флуоресцентными свойствами и хроматографнческой подвижностью, близкой к ДОН, от токсина.

Дл» идентификации и количественного определения ДОН с помощью двумерной ГСХ были исследованы девять систем растворителей. Из всех элюпрующих систем, применявшихся для разделения токсина, наилучшими оказались гексан-ацетон (3:2) - 1-е направление, и эфир-гексап-нзопропанол-вода (77:18:4,5:0,5) - 2-е направление. Эги системы обеспечивали более эффективное отделение шпна ДОН от прочих компонентов экстракта, обладающих флуоресцентными свойствами и хроматографической подвижностью, близкой к ДОН, минимальное определяемое количество ДОН в пягне составило 10 нг, что соответствует пределу обнаружения ДОН 0,2 мг/кг. При этом, по сравнению с ранее используемым методом, не только повысилась чувствительность метода, но и уменьшилась вероятность получения ложнопо-ложшельных результатов. Хромакмрафическая подвижность ДОН как в первой, так и во второй системах составляла 0,25-0,30.

1.2.3. Обнаружение и количеств!шое определение дезоксишшаясиола с помощью ВЭЖХ

Для расширения методических возможностей при обнаружении и количественном определении ДОН, помимо имеющегося нормальнофазового варианта ВЭЖХ, были разработаны условия проведения обращеннофазоиой ВЭЖХ. С этой целью проведена сравнительная характеристика нескольких систем растворителей, таких как водный метанол и ацетонигрил в различных соотношениях исходных компонентов. Было показано, что использование в качестве подвижной фазы системы растворителей метанол-вода (25:75) и аце-тонитрил-вода (10:90) позволяют эффективно отделить этот мнкотоксин от основных сопутствующих ему примесей. Минимальное определяемое количество ДОН во вколе составило 6,5 нг, что соответствует пределу обнаружения метода 0,05 мг/кг. Эго позволило определять ДОН в зерне и зернопродуктах в концентрации, в 10 раз меньше установленной ПДК для ДОН (0,5 мг/кг). Типичная хроматограмма ВЭЖХ разделения экстракта пшеницы, контамнни-рованной ДОН на уровне 0,25 мг/кг, приведена на рис 1.

1.3. Обнаружение, идентификация и определение содержании зеарале-иоиа в экстракте

1.3.1. Очистка экстракта

11ри анализе 3J1 проводили очистку ацетонитрильного экстракта nyieM

0 3 6 9

время удержиоания,

0 3 6 9

время удерживания, мин

Рис.1. Хроматограмма разделения стандарта ДОН (а) и экстракта пшеницы, содержащего ДОН в концентрации 0,25 мг/кг (б)

Условия

Колонка: силикагель "ШгаБрЬеге-ЗГ', размер частиц 5 мкм; Подвижная фаза: гексан-изопропанол-вода (75:25:1,5); Скорость подвижной фазы: 1,0 мл/мин; УФ-детектор, длина волны - 224 нм; Стандарт: ДОН 50 нг;

Количество ДОН в водимой алнквоте экстракта (10 мкл) - 63 нг

зл

Д.1

им

зп

О 3 Б 9

время удерживания, мин

О 3 Б 9 время удерживания, мин

Рис.2. Хроматограмма разделения стандарта ЗЛ (а) и экстракта пшеницы, содержащего ЗЛ в концентрации 0,45 мг/кг (б)

В Э ЖХ

Колонка: сшшкагель С18, размер частиц 7 мкм; Подвижная фаза: метанол-вода-ацетонитрил (61:35:4); Скорость подвижной фазы: 1,5 мл/мин; Флуориметрический детектор, длина волны: возбуждения - 275 нм, эмиссии - 465 нм; Стандарт: ЗЛ 10 нг;

Количество ЗЛ в водимой аликвоте экстракта (5 мкл) - 14 нг

обезжиривании гсксаном с последующим разбавлением водой II жидкость-жидкостной персэкстракцией и бензол.

1.3.2. Обнаружение л количсстешюс определение зеаршенона с помощью одномерной и двумерной ТСХ

При разработке метода обнаружения и количественного определения ЗЛ с помощью ТСХ мы отказались от многомерной ТСХ, включающей предварительное обезжиривание экстракта в 1-ом направлении и распределением ЗЛ во 2-ом и 3-ем направлении. Была проведена сравнительная характеристика шести систем растворителей для ТСХ-анализа и показано, что такие подвижные фазы как гексан-ацетон (7:3) - 1-е направление, и толуол-этилацетат-хлороформ-85% муравьиная кислота (45:25:25:5) - 2-е направление, позволяют наиболее эффективно отделить мешающие нримсси от токсина и обеспечивают необходимую степень разделения. Это позволило определить в пятне до 10 111", что соответствует пределу обнаружения ЗЛ 0,1 мг/кг, и в четыре раза повысить чувствительность предыдущего метода. Хроматогра-фическая подвижность ЗЛ как в первой, так и во второй системах составляла 0,4-0,5.

Для высокочувствительного и селективного обнаружения ЗЛ по флуоресценции в длинноволновом УФ-свете была применена обработка 'ГСХ-пластин раствором хлорида алюминия вместо реакции азосочетания со стабилизированными диазониевыми солями. Это позволило избежать получения ложноположительных результатов, что особенно актуально при анализе экстрактов пшеницы, содержащих вещество фенольной природы, близкое но хромат ографической подвижности и окрашиванию при реакции азосочетания к ЗЛ.

1.3.3. Обнаружение и количественное определение зеаршенона с помощью ВЭЖХ

Для дополнительного подтверждения наличия мпкотоксина в пробе и унифицирования метода определения ЗЛ были предложены условия проведения как нормально-, так и обращешюфазовых ВЭЖХ. Из 8 изученных подвижных фаз такие системы растворшелей как гексап-эфир-уксусная кислота (65:35:1) при нормальнофазовом варианте и метанол-вода-ацетонптрнл (61:35:4) при обращеннофазовом варианте обеспечивали более эффективное

отделение ЗЛ от сопутствующих веществ. При этом минимально выявляемое количество ЗЛ составило 0,5 нг во вколе, что соответствует пределу обнаружения 0,005 мг/кг и позволяет выявлять ЗЛ в концентрации в 200 раз меньше, чем установленная ПДК (1 мг/кг). Типичная хроматограмма ВЭЖХ разделения экстракта пшеницы, контаминированной ЗЛ на уровне 0,45 мг/кг, приведена на рис. 2.

При проведении в 1990 г. межлабораторной апробации метода, на гомогенно загрязненных микотоксинами образцах, были получены метрологические характеристики, показывающие высокую чувствительность, хорошую воспроизводимость-метода и высокую степень извлечения (табл.1).

Таким образом, разработан чувствительный, достаточно простой и надежный метод обнаружения, идентификации и количественного определения ДОН и ЗЛ в зерне и зернопродуктах.

2. Выделение очищенного препарата дезоксиниваленола из культуры гриба Fusarium ma cr оceras

Описанные в литературе методы выделения и очистки ДОН включают в себя несколько трудоемких и длительных этапов концентрирования и не позволяют получить аутентичный стандарт ДОН в достаточных количествах для токсикологических и аналитических исследований /Erlich К.С., Lillehoj Е.В., 1984; Witt M.F. et al.,1985; Altpeter F., Posselt U.K., 1994/.

В предлагаемом методе ДОН выделяли из культуры гриба F. macroceras 579 а, выращенной на рисе при 27°С в течение 30 суток. Зерно после стерилизации высушивали при 45°С до воздушно-сухого состояния и измельчали. В работе была использована селективная экстракция токсина из субстрата с использованием водного ацетонитрила, что позволило значительно снизить массу токсиновой фракции, наносимой на колонку и, тем самым, использовать лишь один этап адсорбционной очистки на силикагеле (без дополнительных стадий жидкость-жидкостного распределения и др.).

При проведении очистки ДОН, для увеличения адсорбционной емкости и эффективности хроматографтеской колонки, был использован силикагель для ТСХ. Колонку промывали смесью гексан-эфир (1:1), эфиром; ДОН элюировали смесью эфир-ацетон с градиентом концентрации ацетона от 8%

Таблица 1

Метрологические характеристики метода анализа дезоксиниваленола и зеараленона

Проводимые исследования Применяемый метод Среднее содержание ДОН в повторных пробах (мг/кг) Относительное стандартное отклонение Предел обнаружения метода, мг/кг Степень извлечения, %

Концентрация ДОН 0,4 мг/кг

ИнутрилаЬораторные исследования 1С\ 0,32 0,25 0,2 80,0

МежлаЬораторные исследования 1СХ и,и и,2У 82,Ь

БнутрилаЬораторные исследования вэжх 0,32 0,и8 0,05 80,0

МежлаЬораторн ые исследования БУЖХ и,Л4 0,0У о,оь »5,5

Концентрация ДОН 2 мг/кг

Инутрилаоораторные исследования 1СХ 1,62 и,25 и,2 81,0

МежлаЬораторные исследования 1СХ 1,62 0,30 0,2 81,0

ЬнутрилаЬораторные исследования иажл 1,68 и,и5 0,0Ь 8Ь,0 '

МежлаЬораторные исследования ИУЖХ 1,/и 0,0У 0,0Ь »5,и

Концентрация ЗЛ 0,1 мг/кг

ЬнутрилаЬораторные исследования 1СХ. 0,09 0,45 0,1 У0,0

МежлаЬораторные исследования 1СХ о,иу и,би 0,1 уи,о

ЬнутрилаЬораторные исследования БУЖХ и,иа/ и,об и.ииь «Ли

МежлаЬораторные исследования ВУЖХ 0,086 0,08 0,005 86,6

Концентрация ЗЛ 1,0 мг/кг

НнутрилаЬораторные исследования 1СХ 0,86 и,40 0,1 86,0

МежлаЬораторные исследования 1СЛ 0,8Ь и,41 0,1 8Ь,0

13нутрилаЬораторные исследования 13УЖЛ 0,8Ь и,ив о,ооь 8Ь,0

МежлаЬораторные исследования ИУЖХ и,88 и,иУ 0,005 88,0

до 15%. Элюнрованне осуществляли при слабом вакууме, что позволило снизить гидравлическое сопротивление колонки и осуществить селективное выделение ДОН. Трудность нанесения на колонку высокополярных компонентов экстракта (к которым относится ДОН), плохо растворимых в умереннопо-лярных растворителях, была преодолена путем нанесения на нее суспензии силикагеля с адсорбированным на нем экстрактом с последующим элюиро-ванием ДОН умереннополярной системой растворителей. При выделении ДОН было достаточно одного этапа адсорбционного концентрирования и выделенный таким образом ДОН мог быть легко закристаллизован. Количество выделенного чистого препарата ДОН составило приблизительно около 1,4 г.

Гомогенность выделенного токсина подтверждена методом ТСХ в различных системах растворителей, а также методами нормально - и обращен-нофазовой ВЭЖХ. После двух кристашшзаций содержание основного вещества в препарате ДОН, оцененное методами ТСХ, ВЭЖХ и хромато-масс-спектрометрии составило не менее 96-98%, при этом, в препарате не идентифицировано других трихотеценовых микотоксинов группы В. Полученный препарат ДОН имел температуру плавления 150,5°-153°С° (151°-153°С по литературным данным) /Уо5Ыга\уа Т., Могока 1973/, что также свидетельствовало о высокой степени его чистоты.

Структура выделенного токсина подтверждена масс-спектрами как исходного ДОН (молекулярная масса 296), так и его ТМС-производного (молекулярная масса 512), что полностью согласуется с литературными данными /Веппе! в.А. е1 а1., 1981/ и позволило идентифицировать выделенное вещество как токсин дезоксиниваленол и использовать его для аналитических целей, токсикологических и биохимических исследований.

3. Изучение частоты и уровней загрязнения дезоксшшваленолом и зеараленоном заготавливаемого зерна урожаев 1989-1994 гг.

Результаты изучения содержания фузариотоксинов в свежеубранной (заготавливаемой) пшеницы урожаев 1989-1994 гг. из ареала фузариоза показали, что ДОН присутствует в 84% из изученных 1617 образцов, причем 49% из них содержали ДОН в количестве выше ПДК (табл 2). Обращает на себя внимание высокий уровень контаминации ДОН пшеницы урожаев 1989, 1992

Таблица 2

Частота и уровни загрязнения дезоксиниваленолом заготавливаемого зерна пшеницы и ячменя из ареала фузариоза

в 1989-1994 гг.

Год Количество исследованных образцов Количество образцов, содержащих ДОН Количество образцов, содержащих ДОН с превышением ПДК Содержание ДОН в контамини-рованных образцах, мг/кг Содержание ДОН в образцах всего ряда, мг/кг

Среднее Медиана 90% уровень

Пшеница

1989 251 251 (100 %) 144 (57%) 0,10 - 5,8 0,68 ± 0,05 0,62 1,2

1990 214 124 (58%) 28 (13%) 0,10 - 3,52 0,43 ± 0,04 0,13 0,66

1991 159 120 (75%) 30 (19%) 0,05 - 3,80 0,52 ± 0,04 0,17 0,65

1992 296 295 (99 %) 205 (69%) 0,07 - 8,60 0,88 ± 0,05 0,67 1,60

1993 543 526 (97%) 383 (70%) 0,10 - 4,0 0,71 ± 0,02 0,50 1,20

1994 154 36 (23%) 8 (5%) 0,10 - 0,95 0,08 ± 0,05 0 0,18

Всего : 1617 1352 (84%) 798 (49%) 0,07 - 8,60

Ячмень

1989 43 38 (88%) 0,15 - 1,34 0,57 ± 0,04 0,45 0,82

1990 82 64 (78 %) 0,20 - 1,50 0,46 ± 0,05 0,39 0,95

1991 106 76 (72%) 0,19-2,84 0,40 ± 0,03 0,40 0,70

1992 21 9 (43%) 0,20 - 1,32 0,26 ± 0,08 0 0,74

1993 35 0 0 0 0 0

1994 30 0 0 0 0 0

Всего: 317 187 (59%) 0,15 - 2,84

м 1993 гг. - иочш нее наученные образцы содержали токсин (100%, 99% и 97%, соответственно), причем и концентрациях, превышающей 11ДК - 57%, 69% и 70%, соответственно, и характеризовались значительно более высокими значениями как медианы, так и 90% уровнем загрязнения по сравнению с другими годами.

Результаты настоящих исследований установили также наличие в заготавливаемом зерне пшеницы наряду с ДОН второго фузариотоксина - ЗЛ. По-видимому, неблагоприятные условия - затяжные дожди - в период уборки урожая пшеницы в Северо-Кавказском регионе в 1992 и 1993 гг. явились причиной увлажнения зерна в валках и на токах и реактивации или вторичного развития на зерновках грибов - продуцентов ДОН и ЗЛ. Как видно из полученных данных, из 60 исследованных проб пшеницы урожая 1992 г. в 41 пробе был найден ЗЛ, причем, одна проба содержала фузариотоксин в концентрации, превышающей ПДК. В 154 партиях пшеницы урожая 1993 г. только в 3-х случаях было установлено наличие зеараленона в количестве до 0,28 мг/кг. Ни в одной из 77 партий пшеницы урожая 1994 г. ЗЛ не был обнаружен (табл.3).

Таблица 3

Частота и уровни загрязнения зеараленоном заготавливаемого зерна пшеницы из ареала фузариоза в 1992 - 1994 гг.

Год Количество исследованных образцов Количество образцов, содержащих ЗЛ Количество образцов, содержащих ЗЛ с превышением ПДК Содержание ЗЛ в кон-тамини-рованных образцах мг/кг, Содержание ЗЛ в образцах всего ряда, мг/кг

Среднее Медиана 90% уровень

1992 60 41 (68%) I (2%) 0,01 - 1,48 0,18 ±0,02 0,09 0,40

1993 154 3 (2%) 0 0,06 - 0,28 0,003 ± 0,002 0 0

1994 77 0 0 0 0 0 0

Всего: 291 44 (15%) 1 (0,3%) 0,01 - 1,48

Результаты изучений загрязнения свежеубранного зерна ячменя также показали высокую от 43% до 88% частоту обнаружения ДОН в период 1989-

1992 гг. Величины среднего содержания ДОН варьировали от 0,26 до 0,57 мг/кг (табл.2).

Таким образом, в настоящем исследовании было показано, что в 19891994 гг. в Северо-Кавказском регионе наблюдался постоянный высокий уровень загрязнения ДОН зерна пшеницы. В годы массовых эпифитотий (1989,1992 и 1993 гг.) до 100% изученных партий зерна содержали ДОН. В отдельные годы установлена высокая частота обнаружения ДОН и в зерне ячменя. В зерне пшеницы, пораженной фузариозом, показана возможность накопления одновременно двух фузариотоксинов - ДОН и ЗЛ.

4. Изучение зависимости загрязнения дезоксиниваленолом заготавливаемого и продовольственного зерна пшеницы урожаев 1989-1994 гг. от уровня поражения его фузариозом.

Изучение зависимости накопления ДОН в зерне пшеницы урожаев 1989-1994 гг. от степени поражения его фузариозом показали четкую корреляцию между концентрацией ДОН и содержанием фузариозных зерен. Так, все изученные образцы заготавливаемого зерна пшеницы урожая 1989 с. были поражены фузариозом и все содержали ДОН. Уровень контаминации их возрастал от 0,24 до 2,70 мг/кг с увеличением фузариозных зерен в пробе от 0,01 - 0,30% до 2% (табл. 4).

Таблица 4

Зависимость загрязнения ДОН заготавливаемого зерна пшеницы урожая 1989 г. от уровня поражения фузариозом

Уровни содержания фузариозных зерен , % Количество исследованных образцов Количество образцов, содержащих ДОН Содержание ДОН в кон-таминиро-ванных образцах, мг/кг Среднее содержание ДОН в образцах всего ряда, мг/кг

0,01 >2,00 251 251 (100%) 0,10 - 5,80 0,68 +0,05

0,01 - 0,03 39 39 (100%) 0,10 - 0,37 0,24 ±0,01

0,31 - 0,50 55 55 (100 %) 0,25 - 0,52 0,44 + 0,01

0,51 - 0,70 59 59 (100%) 0,33 - 0,72 0,56 ± 0,01

0,71 -1,00 54 54 (100%) 0,36 - 1,38 0,70 ± 0,03

1,10 - 2,00 32 32 (100%) 0,60 - 1,80 1,10 ±0,07

>2,00 12 12(100%) 1,14 - 5,80 2,70 ± 0,36

При проведении регрессионного анализа данных, величина корреляционного коэффициента (г) составила 0,85 (рис. 3). Аналогичные данные были получены при изучении заготавливаемого и продовольственного зерна в 1990-1994 гг . При этом коэффициенты корелляцин варьировали от 0,80 до 0,96.

юн

Укг)

ь г с

и

Ь с

:.5 Е"

^ С

Ь'

С

I. г

ь.

• ■

• 1.-Ч

.У.«**

' >

п=г40 р=0,9г> г=0,85

1.6

М «.о 1.2

% фузариоза

Рис. 3. Зависимость загрязнения ДОН заготавливаемого зерна пшеницы урожая 1989 г. от уровня поражения фузариозом

5. Изучение частоты и уровней загрязнения дезоксиннваленолом продовольственного зерна урожаев 1989-1994 гг.

Изучение частоты и уровней загрязнения ДОН продовольственного зерна пшеницы урожаев 1989-1994 гг. позволило установить, что в среднем за весь период исследований ДОН был обнаружен в 20% из 750 образцов продовольственной пшеницы, в том числе в 10% образцов - в концентрациях, превышающих ПДК. Частота обнаружения ДОН в продовольственном зерне пшеницы коррелировала с уровнем контаминации заготавливаемого зерна пшеницы и варьировала от 6% в зерне урожая 1990-1991 гг. до 38% в зерне урожая 1992 г. Величины среднего содержания ДОН варьировали соответственно от 0,02 до 0,33 мг/кг, а количество образцов с содержанием ДОН выше ПДК - от 2 до 20% (табл. 5).

Таблица 5

Частота н уровни загрязнения дезоксиниваленолом продовольственного зерна пшеницы, ячменя и ржи

урожаев 1989-1994 гг. в России

Год •Количество исследованных образцов Количество образцов, содержащих ДОН Количество образцов, содержащих ДОН с превышением ПДК Содержание ДОН в кон-тамини-рованных образцах, мг/кг Содержание ДОН в образцах всего ряда . мг/кг

Среднее Медиана 90% уровень

Пшеница

1989 57 | 15 (26%) | 5 (9%) | 0.05 - 6.65 0.23 ± 0.13 0 0,44

1990-1991 67 4 (6%) 1 (2%) 0.05 - 0.74 0.02 ± 0.01 0 0

1992 190 72 (38%) 38 (20%) 0.05 - 5.63 0.33 ± 0,05 0 1,06

1993 169 39 (23%) 24 (14%) 0.10 - 3.95 0.20 ± 0.04 0 0,63

1994 267 18 (7%) 8 (3%) 0.17 - 1,13 0,03 ±0.01 0 0

Всего: 750 | Ш (20%) 76 (10% ) 0.05 - 6,65

Ячмень

1989 25 4 (16%) 0.05 - 0,38 0.03 ± 0.02 0 1 0,14

1990-1991 25 0 0 0 0 1 0

1992 44 6 (14%) 0.05 - 0,78 0.05 ± 0.02 0 • 0,14

1993 73 5 (7%) 0,1-7 - 0,91 0.03 ± 0.02 0 0

1994 166 1 (1%) 0,20 0,001 0 0

Всего: 333 16 (5%) 0.05 - 0.91 0 0 | 0

Рожь

1989 | 11 | 3(27%) 0,11 - 0,44 0.07 ± 0,04 0 0,18

1990-1991 1 2 | 0 0 0 0 0

1992 ( 47 ! 2 (4%) 0.09; 0,29 0.01 ± 0.006 0 0

1993 | 62 ! 2 (3%) I 0.95: 1,11 0.03 ± 0,02 0 0

1994 | 133 | 0 1 0 0 0 0

Всего: ! 255 ¡7 (3%) ! 0.09-1.11 1

Частота обнаружения ДОН п продовольственном зерне ячменя была значительно ниже, по сравнению с пшеницей, и была наибольшей (16%) п урожае 1989 г. В остальные годы частота обнаружения была незначительной и варьировала п урожаях 1992-1994 гг. от 14 до 1 %. Средний уровень содержания ДОН п изученных партиях в эти годы варьировал от 0,001 до 0,05 мг/кг (табл. 5).

Результаты, полученные при анализе продовольственного зерна ржи, также показали низкую частоту обнаружения и умеренную контаминацию ДОН ржи. Частота обнаружения ДОН варьировала от 3% в зерне урожая 1993 г. до 27% в зерне урожая 1989 г. при среднем содержании ДОН от 0,01 до 0,07 мг/кг (табл. 5).

Анализ данных распределения контаминированного зерна пшеницы урожаев 1989-1994 гг. по месту производства показал, что наибольшее количество загрязненных ДОН образцов продовольственного зерна пшеницы -74%, получены из Северо-Кавказского региона, который является основным ареалом фузариоза зерновых культур. Высокая частота загрязнения ДОН установлена для импортируемого зерна пшеницы, поступающей преимущественно из Каналы, США и Франции, доля которой в общем числе конта-мипировлнных партий составила 15%. На долю других регионов приходилось от 1 до 3% контаминированной ДОН пшеницы (рис.4).

(15.0П)

0.0-Ь

а(.о г.)

Северо-Кавказский

Центральна Поволжский

\//////Л Западяо-Си-'/////А бирский

ВВИ Волго-Вятский

Импортируемое

ЦентральноЧерноземный

эис.4. Частота обнаружения ДОН в зерне пшеницы урожаев

1989-1994 гг. из разякх районов России к импортируемом зерне ( в % от общего количества контамини-рованнкх партий)

Потребление контаминнрованпого ДОН зерна пшеницы, также было наиболее высоким в Северо-Кавказском регионе - 64% от общего числа загрязненных партий. Доля контаминированного зерна пшеницы, потребляемой в Центральном районе России, возросла до 20% от общего числа загрязненных партий. На долю остальных регионов приходилось от 1 до 6% потребления контамннированных партий зерна (рис.5)

Центральный

(1.0Я)

(20.0П)

IВолго-Вятский

Северо-Западный

ПОВОЛЖСКИЙ у/////У\ Западно-Сибирский Дальневосточный Уральский

Северо-Кавказский

Централъно-Черяо-земчкй

Рис. 5. Частота обнаружения ДОН в зерне пшеницы, потребляемой в разных районах России в период 1989-1994 гг. (в % от общего количества конташширозанякх партий)

При изучении содержания ЗЛ в продовольственном зерне пшеницы урожая 1992-1994 гг. токсин был обнаружен в 10% образцов пшеницы урожая 1992 г. в концентрации ниже 1 мг/кг. Случаев выявления ЗЛ в исследованных партиях зерна продовольственного назначения урожаев 1993-1994 гг. не было.

Высокая частота обнаружения ДОН в продовольственном зерне является прямым следствием широкого распространения в 1989, 1992 и 1993 гг. фуза-рноза колоса пшеницы, в то время как выявление достаточно большого числа партий с превышающим ПДК содержанием ДОН следует расценивать как результат недостаточного обеспечения производственного контроля за безопасностью продовольственного сырья. Эти данные указывают на вероятность постоянного поступления с пищей ДОН в количествах, которые, принимая во

пипмшшс выраженные иммуполепрессиппые свойства ДОМ, его тератогенное и мутагенное действие / 1Ъхоо1у Ь. с! п1, 1992; 1Л1{С, 1993/, в настоящее время нельзя считать абсолютно безопасными для здоровья человека.

6. Оценка реальной нагрузки дезоксшшпаленола на население России п период 1989-1994 гг.

На основании данных фактического потребления продуктов переработки пшеницы в среднем по России и собственных результатов анализа ДОН в продовольственном зерне пшеницы была рассчитана суточная нагрузка ДОН на человека.* Как видно из таблицы, суточная нагрузка ДОН на человека в среднем по России отличалась по годам и варьировала от 0,07 мкг/кг массы тела в 1990-1991 гг. до 1,4 мкг/кг массы тела в 1992 г. (табл.6).

Таблица 6

Суточная нагрузка ДОИ на человека п среднем по России

Год Средняя концентрация ДОН, мг/кг Суточная нагрузка ДОН, мкг/кг массы тела

1989 0,23 0,96

1990-1991 0,02 0,07

1992 0,33 1,40

1993 0,20 0,89

1994 0,03 0,12

Более подробный анализ опенки суточной нагрузки ДОН на человека в отдельных регионах в 1992-1994 гг. показал, что величины суточной нагрузки ДОН на человека в Северо-Кавказском районе были значительно выше, чем п среднем по России и варьировали от 0,29 до 4,1 мкг/кг массы тела.

Таким образом, полученные данные оценки рент,ной нагрузки ДОН на организм человека свидетельствуют о необходимости усиления контроля за содержанием ДОН в зерновых, особенно в регионах распространения фуза-риоза.

" Длимые Госкомстата России по среднегодовому потреблению продуктов переработки пшеиним прсдостапчспм лабораторией по изучению и планиропанто стр\тсгури питания населения Института питания РАМН.

22 ' ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые методы (ТСХ и ВЭЖХ) количественною определения дезоксиниваленола и зеараленона в зерне и зернопродуктах. Предел обнаружения методов составил: для дезоксиниваленола 0,2 мг/кг (ТСХ) и 0,05 мг/кг (ВЭЖХ), относительное стандартное отклонение - 0,25-0,30 и 0,05-0,09, соответственно; для зеараленона - 0,1 мг/кг (ТСХ) и 0,005 мг/кг (ВЭЖХ), относительное стандартное отклонение - 0,4-0,6 и 0,06-0,09, соответственно.

2. Разработан препаративный метод выделения и очистки дезоксиниваленола из зерна, искусственно зараженного штаммом-продуцентом (!•'. macroceras 579 а), в граммовых количествах, с содержанием основного вещества 96-98%. Чистота и структура дезоксиниваленола подтверждена совокупностью физико-химических методов анализа: ТСХ, ВЭЖХ, масс-и хрома-то-масс-спектрометрии.

3. Результаты мониторинга содержания фузариотоксинов в свеже-убранном (заготавливаемом) зерне ь период 1989-1994 гг. с применением разработанных методов выявляли постоянный высокий уровень загрязнения дез-оксиниваленолом зерна пшеницы в основном регионе ее производства - Северо-Кавказском. В годы массовых эпифитогии (1989, 1992 и 1993 гг.) до 100% изученных партий зерна содержали дсзоксиниваленол, в 57-70% случаев в количествах, превышающих Г1ДК. Установлена высокая частота обнаружения дезоксиниваленола (до 72-88%) в свежеубранном зерне ячменя. Показана возможность накопления в зерне пшеницы, пораженной фузариозом, одновременно двух фузарнотоксинов - дезоксиниваленола и зеараленона.

4. Выявлена прямая корреляционная зависимость между концентрацией дезоксиниваленола и процентным содержанием фузарпозных зерен в пшенице. Полученные коэффициенты корреляции незначительно различались но годам и варьировали в диапазоне от 0,80-0,96.

5. Данные о содержании фузарнотоксинов и зерне ншешшы, ячмени и ржи продовольственного назначения из 10 регионов России в период 19891994 гг. позволили установить превышение Г1ДК дезокснниваленола в 10% парши пшеницы, что свидетельствует о недостаточной эффективности системы производственного контроля за содержанием фузариотоксинои в зерне.

6. Проведен анализ распределения частоты и уровнен контаминации дезокспннваленолом продовольственного зерна пшеницы урожаев исследуемого периода по месту производства и по месту потребления. Установлено, что наибольшее количество загрязненных дезоксиниваленолом партий зерна производится (до 74%) и потребляется (до 64%) в Северо-Кавказском регионе.

7. Рассчитана реальная нагрузка дезокснниваленола на человека с учетом фактического потребления зерна и зернопродуктов. В среднем по России она варьировала от 0,07 мкг/кг массы тела в 1990-1991 гг. до 1,4 мкг/кг массы тела в 1992 г. и была значительно ниже установленной допустимой суточной дозы (3 мкг/кг). В то же время в Северо-Кавказском регионе она достигала 4,10 мкг/кг массы тела, что представляет определенную опасность для здоровья населения.

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. "Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезокснниваленола (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зерпоиродуктах" // Москва, Минздрав СССР, 1990, N5177-90 /Соавг. В.А. Тутсльян, К.И. Эллер, В.В. Пименова, П.И. Музыченко, B.C. Соболев /.

2. A survey of the occurrence of deoxynivalenol in wheat from 19S6-19SS harvests in the USSR // Food Additives and contaminants, 1990, vol. 7, N 4, p. 521-525 /V. A. Tutelyau, K.I. Eller, V.S. Sobolev, V.V. Pimenova, N.l. Mu^yclienko/.

3. A survey using some improved methods of mycotoxin analysis in foods / In Abstracts : Second asia-pacific congress on animal, plant and microbial toxins. India, 1990, p.86 /К.1. Eller, V.S. Sobolev, V.V. Pimenova/.

4. Микотоксины и пищевых продуктах: методы определения, контроль и мониторинг // Тез. докл. научной конференции с международным участием "Питание: здоровье и болезнь", Москва, 1990, с. 193 /Соавт. U.C. Соболев, В.А. Тугельян/.

5. Метод определения дезоксинивапенола ( вомитоксина) и его метаболитов // Вопросы питания, 1991, N5, с. 66-69 /Соавт. В.А. Тугельян, B.C. Соболев, И.Р. Катруш, Ф.А. Медведев/.

6. Проблема контаминации зерновых культур дезоксиннвалснолом в России // Вопросы питания, 1994, N3, с.40-44 /Соавт. О.Л. Обольский, Л.С. Львова, Л.В: Кравченко/.

7. Образование микотокспнов в фузариозной пшенице при неблагоприятных условиях уборки // Прикладная биохимия и микробиология, 1994, том 30, вып. 4-5, с. 686-693 /Соавт. Л.С. Львова, М.Д. Омельченко, В.В. Пимено-ва, О.Л. Обольский, Т.В. Аристархова, К.И. Эллер, З.К. Быстрякова/.

8. Микотоксины в пищевых продуктах // Тез. докл. 1-го Международного научного конгресса "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты", Москва, 1994, с.516 /Соавт. В.В. Ппмепоиа, О.Л. Обольский/.

9. Фузариотоксины в зерновых культурах в России. Ситуация в 1993 и 1994 годах // Вопросы питания, 1995, N2, с. 26-29 / Соавт. О.Л. Обольский, Л.С. Львова, З.К. Быстрякова, Л.В. Кравченко, В.А. Тутельян /.

10. Анализ результатов контроля за загрязнением пищевых продуктов фузариотоксинами // Тез. докл. 2-ой Всероссийской научно-практической конференции "Антропогенные воздействия и здоровье человека, Калуга, 1995, с.37 /Соавт. О.Л. Обольский, Л.В. Кравченко/.