Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Изучение частоты и уровня контаминации продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки некоторыми фузариотоксинами

На правах рукописи

СЕДОВА ИРИНА БОРИСОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ЧАСТОТЫ И УРОВНЯ КОНТАМИНАЦИИ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОГО ЗЕРНА КУКУРУЗЫ И ПРОДУКТОВ ЕЕ ПЕРЕРАБОТКИ НЕКОТОРЫМИ ФУЗАРИОТОКСИНАМИ

14.00.07-Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2005

Л

ц

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте питания Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Тутельян Виктор Александрович Львова Лилия Степановна

Капцов Валерий Александрович Малышева Алла Георгиевна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится «16» июня 2005 г. в 11—на заседании Диссертационного Совета Д 001.009 01 в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А Н Сысина Российской академии медицинских наук по адресу 119992, г. Москва, Погодинская ул., 10/15, строение 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н Сысина РАМН

Автореферат разослан «15» мая 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

Н Н Беляева

W Ъ№

Актуальность темы

Проблема биобезопасности на современном этапе непосредственно связана с предотвращением попадания в пищевую цепь природных контаминантов биологического происхождения, воздействующих на здоровье человека. Среди наиболее опасных природных загрязнителей пищевых продуктов особое место занимают микотоксины, которые являются продуктами жизнедеятельности повсеместно распространенных микроскопических плесневых грибов, способных поражать пищевые продукты на всех этапах производства, переработки и хранения.

Микотоксины - это высокотоксичные, высокостабильные соединения, некоторые из которых являются сильными канцерогенами (афлатоксины, охратоксин), большинство из них - иммунодепрессанты. По данным ФАО, более 25% всего производимого в мире зерна контаминировано микотоксинами [Mannon J., Johnson Е., 1985]. Невозможность полного предотвращения образования токсинов в растительном сырье и попадания их в организм приводит к необходимости организации контроля за уровнем их содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах, а в ряде случаев, введения гигиенических регламентов.

Проведенные исследования показали, что наиболее часто зерно загрязняется микотоксинами, продуцируемыми грибами рода Fusarium, среди которых наибольшим распространением отличаются дезоксиниваленол (ДОН, вомитоксин) и зеараленон (3JI) [Билай В.И., 1977; Тутельян В.А , Кравченко Л.В., 1985; Bhat R. 1999; Miller J.D., 1995; Schuh М., 2001]. В отличие от других микотоксинов, фузариотоксины накапливаются в зерне колосовых культур, пораженных фузариозом колоса в период созревания, и интенсивность их синтеза зависит в значительной степени от климатических и погодных условий. Основным возбудителем фузариоза колоса и продуцентом ДОН и 3JI является Fusarium graminearum Schwabe [Scott P.M 1990; Львова Л.С. и др., 1992, 1993, 1994; Parry D.W., et al., 1995]. Исследования, проводимые в ГУ НИИ питания РАМН в течение 16 лет, показали высокую частоту обнаружения микотоксина ДОН, главным образом в зерне пшеницы из СевероКавказского региона, причем в отдельные годы частота выявления ДОН в пшенице в ареалах фузариоза варьировала от 60 до 100% обследованных партий. Помимо ДОН, в фузариозной пшенице был обнаружен также ЗЛ [Соболев B.C., и др., 1990; Львова Л.С. и др , 1992, 1994; Захарова Л.П. и др , 1994, Кравченко Л.В. и др., 1998; Tutelyan V.A. et al, 1990;Tutelyan V.A., 1998, 2004].

Количество идентифицированных фузариотоксинов постоянно увеличивается. В последнее время особое внимание уделяется фумонизинам Фумонизины - новый класс микотоксинов, образуемых грибами рода Fusarium. Наиболее часто в природных условиях встречается фумонизин Bi (ФВ1), значительно реже и в меньших

количествах - фумонизины В2 (ФВ2) и ЕЦ (ФВ3) Основными продуцентами этих токсинов являются F moniliforme Sheldon (син. F verticillioides (Sacc. Nirenberg) [Nelson P.E., et al., 1993, Marasas W F.0, 1994]. Установлена высокая частота обнаружения фумонизинов в зерне кукурузы и продуктах ее переработки в США, Австралии, в ряде стран Европы [Miller J.D., et al, 1993, Nelson P E , et al., 1993, Norred W P, et al., 1999, Thiel P.G., et al, 1993, Turner P С, et al, 1999]

Фумонизины обладают выраженными токсическими свойствами. В экспериментах показано, что фумонизины поражают печень и почки, легкие, поджелудочную железу и центральную нервную систему у разных видов животных Доказано, что они также обладают канцерогенным действием на крыс и мышей. Кроме того, эти токсины являются причиной лейкоэнцефаломаляции у лошадей и отека легких у свиней [Marasas W.F О , et al., 1984, 1992] Международное агентство по изучению рака относит фумонизины к соединениям, вероятно канцерогенным для человека (группа 2В) [IARC 1993, 2002].

Учитывая выраженное токсическое действие фумонизинов и отсутствие каких-либо сведений о возможности загрязнения этими токсинами зерна и продуктов его переработки в Российской Федерации, была сформулирована основная цель этой работы.

Цель и задачи исследования Цель исследования: изучение возможности загрязнения продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки фумонизинами, а также возможности одновременного загрязнения этих продуктов другими фузариотоксинами Задачи исследования:

1. Изучить пораженность зерна кукурузы и продуктов его переработки F moniliforme и токсигенный потенциал штаммов, выделенных с отечественного и импортного зерна;

2 Исследовать частоту загрязнения фумонизинами продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки с помощью адаптированного скринингового иммуноферментного метода;

3. Разработать на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии метод количественного определения содержания ФВ] и ФВ2 в зерне кукурузы и продуктах ее переработки.

4 Установить частоту и уровни загрязнения продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки другими фузариотоксинами - ДОН и 3JI

- • 1 ' ' " 4 ..".«, !■

« .« 1гЧж

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые в России проведен скрининг продовольственного зерна кукурузы на содержание микотоксинов фумонизинов и обнаружена высокая частота загрязнения этими микотоксинами кукурузы продовольственного назначения.

Результаты количественного анализа содержания микотоксинов ФВ) и ФВ2 в отечественном продовольственном зерне кукурузы и основных продуктах его переработки впервые выявили высокую частоту и широкую вариабельность уровней их загрязнения фумонизинами

На основе системного анализа исследована распространенность Fusarium momliforme в отечественном зерне кукурузы и установлена высокая токсинообразующая способность этого вида.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Разработан новый высокочувствительный, селективный, количественный метод определения ФВ[ и ФВ2, основанный на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющий проводить серийные анализы. На основании результатов работы разработаны «Методические указания по определению фумонизинов Bj и В2 в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (МУК 4 1 1962-05. М : Роспотребнадзор России, 2005).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертационной работы доложены на Третьем Симпозиуме «100-летие хроматографии» (Москва, 2003), Первом (Москва, 2003), Втором (Москва, 2004) и Третьем (Москва, 2005) Всероссийских Конгрессах по медицинской микологии.

ПУБЛИКАЦИИ

По результатам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 17 публикаций в сборниках научных трудов; 1 Методические указания (Роспотребнадзор России, МУК 4.1.1962-05)

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования (глава), результаты собственных исследований (8 глав), заключение, выводы, список внедрений в практику и приложения.

Указатель литературы содержит 23 отечественных и 279 зарубежных источников.

Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста, включает 38 таблиц и 10 рисунков.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

• Грибы вида Fusarium moniliforme являются основными представителями полевой микофлоры зерна кукурузы, о чем свидетельствует анализ внутренней и поверхностной микофлоры Все 111 выделенных штаммов F. moniliforme являлись продуцентами фумонизинов.

• Выявлено высокое содержание фумонизинов в зерне кукурузы и основных продуктах ее переработки как скрининговым иммуноферментным методом, так и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

• Фумонизины - приоритетные природные загрязнители зерна кукурузы и продуктов ее переработки по сравнению с другими фузариотоксинами - ДОН и 3JI

• Расчет поступления фумонизинов с кукурузой и основными продуктами переработки кукурузы позволяет отнести население, регулярно потребляющее продукты переработки кукурузы, и детей раннего и дошкольного возраста к группе риска.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании распространенности и токсигенного потенциала F. moniliforme - продуцента фумонизинов, были использованы общепринятые микологические методы

Поверхностную микофлору определяли в 10 пробах зерна кукурузы и 39 пробах продуктов переработки кукурузы методом посева смывов с измельченных продуктов на агар Чапека и сусло-агар Идентификацию грибов проводили по Пидопличенко, Нелсону и др. и Бусу [Пидопличенко Н.М, 1953, Booth С, 1971, Nelson P.E., et al., 1983]

Внутренняя микофлора была изучена в 158 пробах зерна кукурузы, в том числе в 138 - отечественного происхождения и в 20 - импортированных из разных стран Из каждой пробы был произведен посев 100 стерильных зерен кукурузы на поверхность агара Чапека Посевы культивировали при 25°С в темноте в течение 7-10 сут, после чего проводили количественный учет и определение рода и вида выросших колоний грибов

Для изучения токсигенного потенциала штаммов грибов F. moniliforme из зерна кукурузы урожаев 1999-2002 гг были выделены 111 изолятов грибов рода Fusarium и была установлена их видовая принадлежность к виду Fusarium moniliforme Sheldon,. Идентифицированные штаммы культивировали на смеси рисовой и кукурузной крупы (3:1 по весу) в темноте при 25°С в течение 25 сут

Для определения содержания суммы фумонизинов (ФВ1+ФВ2+ФВЧ) в культурах F. moniliforme, а также при скрининге за содержанием этих токсинов в зерне кукурузы применяли тест-систему для иммуноферментного анализа (ИФА) Ридаскрин Фаст Фумонизин ("R-Biopharm», Германия) с пределом обнаружения суммы фумонизинов 0,1 - 0,222 мг/кг При скрининге за содержанием ФВ1+ФВ2+ФВ) 6

в продуктах переработки кукурузы была использована более чувствительная тест-система Ридаскрин Фумонизин Фаст той же фирмы (предел обнаружения - 0,009 мг/кг). Перекрестная чувствительность обеих тест-систем для ФВ^ФЬ^ФВз составляет 100:40:100%.

При изучении содержания фузариотоксинов (фумонизины, ДОН и 3JI) объектами исследования являлись пробы продовольственного зерна кукурузы урожаев 2000 - 2003 гг. из Северо-Кавказского региона (Краснодарский край, Ростовская область, Ставропольский край) и поступившие по импорту (Украина, США, КНР, Франция, Венгрия) Пробы для анализа были предоставлены республиканскими, областными и краевыми центрами Госсанэпиднадзора (ЦГСЭН), Российской ассоциацией производителей крахмалопаточной продукции и Государственной хлебной инспекцией при Правительстве РФ Часть проб поступила из ГНУ ВНИИЗ РАСХН и его Краснодарского филиала.

Отбор и формирование средней пробы зерна кукурузы, массой не менее 2 кг, проводили по ГОСТ 13586.3—83 от однородных партий, хранящихся на хлебоприемных и перерабатывающих предприятиях

Объектами исследования являлись также основные продукты переработки кукурузы (крупа, мука), продукты питания на кукурузной основе (консервированная кукуруза, попкорн, кукурузные палочки и колечки), продукты детского питания, содержащие кукурузу, в том числе хлопья, детские каши и печенье. Полученные пробы продуктов переработки кукурузы (отечественного и импортного происхождения) были отобраны согласно ГОСТ 26312 1—84 и ГОСТ 27668—88 на перерабатывающих предприятиях, а также приобретены в сети розничной торговли города Москвы и Московской области.

Количественное определение содержания ФВ1 и ФВ2 проводили согласно разработанным нами «Методическим указаниям по определению фумонизинов Bi и В2 в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом ВЭЖХ»* Система ВЭЖХ, состояла из насоса высокого давления, инжектора типа Rheodyne-7125 (США) с объемом петли-дозатора 20 мкл, спектрофлуориметрического детектора, обеспечивающего возбуждение флуоресценции в спектральной области 330 - 340 нм и регистрацию эмиссии флуоресценции при длине волны 440 нм и системы для сбора и обработки данных типа Мультихром (Амперсенд, Россия) или аналогичной, хроматографической колонки (250x4,6 мм), заполненной сорбентом Kromasil С18 (MetaChem Texnologies, США), размер частиц 5 мкм или подобным сорбентом.

* Методические указания разработаны совместно с д х н К И Эллером, к х н М Г. Киселевой, к б.н. Л.П. Захаровой, академиком РАМН, дин В.А. Тутельяном.

Определение содержания ДОН и 3J1 проводили согласно "Методическим указаниям по обнаружению, идентификации и определению содержания ДОН (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зернопродуктах" [МУК № 5177-90 M 4 Минздрав СССР, 1990]

Статистическую обработку полученных данных проводили методами, принятыми в биологии [Лакин Г Ф, 1980], с использованием компьютерных программ "Excel" ("Microsoft", США) и SPSS 8 0 (Statistical Package for Social Sciences, США).

Статистически обработанные данные представляли в виде медианы и 90% уровня Средний уровень микотоксинов в исследуемых пробах выражали как M -среднее арифметическое и Sd - среднеквадратичное отклонение (M ± Sd)

Всего в работе проведено 410 анализов содержания ДОН, 410 анализов содержания 3JI и 998 анализов содержания ФВ| и ФВ2.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение распространенности и токсигенной активности штаммов грибов

Fusarium moniliforme Изучение распространенности грибов Fusarium moniliforme Микробиологический анализ 158 проб зерна урожаев 1999-2002 г г. показал, что самьм распространенным видом во внутренней микофлоре кукурузы является полевой гриб F moniliforme, который поражал 98% проб отечественного зерна (табл. 1). Прочие виды фузариев встречались в единичных случаях. Из грибов хранения значительное распространение получили представители вида Aspergillus flavus -потенциальные продуценты афлатоксинов (86% проб) и мукоровые грибы (84%) В импортированной кукурузе F. moniliforme и A flavus встречались реже, чем в отечественной- они поражали 85 и 65% исследованных проб, большее распространение имел ксерофитный вид - Aspergillus glaucus Полученные результаты подтвердили существующее мнение о преимущественной взаимосвязи F moniliforme с кукурузой [Tngo-Stockli D M , et al, 1996]

Анализ поверхностной микофлоры был проведен в 10 пробах зерна и 39 пробах продуктов переработки кукурузы. Согласно данным, представленным в табл 2, средняя пораженность грибами отечественного зерна была 56 тыс КОЕ/г, полевая микофлора кукурузы состояла в основном из F moniliforme (18,8 тыс КОЕ/г) Анализ поверхностной микофлоры зерна кукурузы и продуктов ее переработки не выявил отличий по видовому составу от внутренней микофлоры, тем не менее, были установлены различия в соотношении разных групп грибов.

Распространенность основных видов грибов во внутренней микофлоре кукурузы урожаев 1999-2002 гг.

Количество Количество проб, пораженных грибами, %

Происхождение исследован- Fusarium Aspergillus Aspergillus Pemcilhum Mucoraceae

ных проб mowltforme glaucus flavus spp. spp

Россия 138 98 28 86 64 84

Импорт 20 85 70 65 75 60

Таблица 2.

Поверхностное поражение отечественного зерна кукурузы и продуктов его переработки Fusarium monihforme и грибами хранения ____ (тыс. КОЕ/г)_

Общее количество Грибы хранения Среднее

Продукт Показатели* Fusarium monihforme Aspergillus glaucus Aspergillus flavus Penicillium spp. Mucoraceae spp. содержание ФВ1+ФВ2, мг/кг

М 18,8 53,6 2,1 9,2 20,4 1,9 1,98

Зерно Sd 32,7 66,7 3,5 13,1 44,4 2,2

% проб 100 100 33 100 100 78

М 4,7 6,1 0 0,29 0,92 0,05 0,80

Крупа Sd 8,4 8,4 - 0,38 1,53 0,06

%проб 100 100 0 85 89 70

М 4,2 10,4 0,07 1,0 4,9 0,12 1,09

Мука Sd 4,0 7,0 0,09 1,2 3,1 0,08

%проб 100 100 50 83 100 83

Зародыш кукурузный М 16,2 55,8 0,17 22,2 8,2 1,8 14,7

Sd % проб 13,3 100 25,8 100 0,29 33 24,1 100 4,8 100 2,4 67

* М - среднее содержание, Sd - среднеквадратичное отклонение; % проб - пораженность проб грибами.

F monihforme присутствовал во всех пробах зерна, крупы, муки и зародыша, на его долю приходилось 35,1% от общего числа грибов в зерне, 77,0% - в крупе, 40,4% -в муке и 29,0% - в зародыше (табл 2) Доминирующей группой грибов в зерне и муке были пенициллы (38,1 и 47,1% от суммы грибов), в крупе преобладал F. momliforme и только в зародыше -A.flavus (39,8%)

В крупе и муке в процессе переработки количество F. momliforme сокращалась примерно в 4 раза, в зародыше оставалась на уровне, определяемом в зерне Крупа являлась наиболее «чистым» продуктом' численность грибов хранения в ней составляла всего 1,4 тыс. КОЕ/г (4,1% от микофлоры зерна) Зародыш по степени зараженности грибами хранения и A. flavus превышал зерно (116,1 и 241,3%, соответственно), поскольку, ввиду своей высокой питательной ценности и доступности поражался сапрофитными грибами в первую очередь (табл 2)

Аналогично количеству грибов, в продуктах переработки кукурузы снижалось и суммарное содержание фумонизинов (ФВ!+ФВ2) (табл. 2)

Импортированная кукуруза и зернопродукты были значительно слабее обсеменены F. momliforme и грибами хранения (как и в случае внутренней микофлоры). Если в отечественной кукурузе численность F momliforme составляла в среднем 18,8 тыс. КОЕ/г, то в импортированном зерне - всего 1,4 тыс. КОЕ/г В крупе и муке разница была еще более заметной (4,2 - 4,7 и 0,03 тыс. КОЕ/г) Таким образом, полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

Гриб F. monihforme, являющийся основным продуцентом фумонизинов, был одним из доминирующих грибов в микофлоре как зерна кукурузы, так и продуктов его переработки. На долю F. monihforme в зерне приходилось до 53,6% от общего числа грибов во внутренней микофлоре и до 35,1% - в поверхностной микофлоре Высокие уровни загрязнения отмечены и в продуктах переработки кукурузы - крупе, муке и зародыше (4,2 - 16,2 тыс КОЕ/г), что, наряду с накоплением фумонизинов, является дополнительным фактором инвазивной микотической инфекции, поскольку F momliforme относится к условно патогенным грибам

Изучение токсигенного потенциала Fusarium moniliforme При изучении микофлоры зерна кукурузы урожаев 1999-2002 г г были выделены в чистые культуры 111 типичных штаммов секции Liseola, которые были идентифицированы по макро- и микроморфологическим признакам как F. monihforme Sheldon (табл 3) Прочие виды секции, упоминаемые зарубежными исследователями как продуценты фумонизинов (F proliferatum и др.) нами не были обнаружены.

Токсигеиная активность штаммов Fusarium moruliforme разного географического происхождения

(данные скрининг-метода)

Географическое Количество Количество % штаммов, Содержание фумонизинов в

происхождение иссл. токсигенных продуцирующих кулмуральном субстрате, мг/кг

штаммов штаммов штаммов более 10000 мг/кг Предельные Среднее Медиана

фумонизиноа значения

Северо-Кавказский регион, 103 103 21,4 0,93 - 33000 5320±7480 1780

в том числе

Краснодарский край 84 84 25,0 1,00 - ЗЗООО 5860±8020 1830

Ставропольский край 11 11 9,1 0,93 - 12100 3680±4190 2040

Ростовская область 8 8 0 1,73 - 6020 2120+2250 1220

Зерно, поступившее по импорту 8 8 25,0 14,4 -18100 5360±7800 2340

ИТОГО 111 111 21,6 0,93 - 33000 5320±7380 1730

* М - среднее содержание, Sd - среднеквадратичное отклонение

Анализ токсигенной активности F momliforme показал, что все исследованные штаммы обладали способностью синтезировать фумонизины, причем интенсивность их образования варьировала в широких пределах от 0,93 до 33000 мг/кг, а 21,4% штаммов грибов синтезировали более 10000 мг/кг фумонизинов (табл 3) Большинство исследованных штаммов были выделены из кукурузы, выращенной в Северо-Кавказском регионе, для этих штаммов среднее содержание фумонизинов составило 5360 мг/кг, а величина среднеквадратичного отклонения - 7800 мг/кг

Следует отметить, что как отечественные штаммы, так и штаммы, выделенные из зерна, полученного по импорту, были токсигенными в одинаковой степени

Все исследованные 111 штаммов, отнесенные к виду F momliforme, были неоднородны по ряду морфологических признаков: величине и виду колоний, характеру воздушного и субстратного мицелия, способу образования микроконидий в цепочках или ложных головках, наличию спородохий Различие культуральных признаков позволило в дальнейшем разделить 86 исследованных по этим показателям штаммов на три типа' мицелиальный (I), спородохиальный (II) и пионнотальный (III), существенно различяющиеся по интенсивности токсинообразования Наибольшая токсигенная активность была отмечена у штаммов типа I, наименьшая - у типа III, тип II занимал промежуточное положение. Так, штаммы типов I, II и III в среднем накапливали 7460, 1550 и 227 мг/кг фумонизинов соответственно. Более четко различия в токсигенной активности штаммов заметны при сравнении показателей медиан, которые составили - 5390, 105 и 9 мг/кг.

Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что

- во-первых, все изученные штаммы F momliforme обладали способностью синтезировать фумонизины, интенсивность которой варьировала от 0,93 до 33000 мг/кг.

- во-вторых, штаммы из районов с более засушливым прохладным климатом (Ростовская область и Ставропольский край) были менее токсигенными, чем из Краснодарского края Штаммы, выделенные из кукурузы, полученной по импорту, по уровню токсигенности совпадали со штаммами из Краснодарской популяции.

- в-третьих, по морфологическим признакам были выделены три типа штаммов F. momliforme, достоверно различающиеся по токсигенности Наиболее токсигенным был мицелиальный тип I, наименее токсигенным - пионнотальный тип III, тип II (спородохиальный) занимал промежуточное положение

2. Изучение контаминации зерна кукурузы и продуктов ее переработки фумонизинами методом иммуноферментного анализа

Скрининг за загрязнением фумонизинами кукурузы и зернопродуктов выявил высокую частоту загрязнения как зерна кукурузы, так и основных продуктов ее

переработки Более 90% (157 из 172) исследованных партий зерна кукурузы содержали фумонизины (ФВ1+ФВ2+ФВ3) от 0,1 до 63,6 мг/кг (табл 4). Частота обнаружения фумонизинов в пробах кукурузной крупы и муки была также очень высока, практически все пробы были загрязнены токсинами, однако уровни загрязнения фумонизинами были ниже, чем в пробах зерна, и максимальное их содержание не превышало 5,12 мг/кг

Результаты анализа пищевых продуктов из кукурузы (попкорн, сладкие палочки) показали, что эти продукты реже содержали токсины, в 74% проб были обнаружены фумонизины. Уровень загрязнения этих проб варьировал от 0,02 до 3,66 мг/кг, среднее содержание фумонизинов в этих пробах было на уровне загрязнения кукурузных круп (0,78 мг/кг).

Обращает на себя внимание факт обнаружения фумонизинов в 95% пробах кукурузных хлопьев, часто используемых в питании детей, и в 50% специализированных продуктов детского питания.

Таблица 4.

Скрининг загрязнения зерна кукурузы и продуктов ее переработки фумонизинами

(ФВ1+ФВ2+ФВ3).

Пробы Количество проб Содержание фумонизинов в контаминированных пробах, мг/кг Среднее содержание фумонизинов* в пробах, мг/кг

исследовано содержащие фумонизины

Зерно кукурузы 172 157 (91%) 0,10-63,60 2,80±5,73

Крупа 150 148 (99%) 0,02-5,12 0,77±0,97

Мука 12 12(100%) 0,05 - 4,84 1,01±1,36

Кукурузные хлопья 98 93 (95%) 0,01 - 1,12 0,19±0,24

Продукты, содержащие кукурузу 34 25 (74%) 0,02 - 3,66 0,78±1,13

Продукты детского питания 22 11(50%) 0,01-0,78 0,13±0,21

* М - среднее содержание, вё - среднеквадратичное отклонение

Результаты определения содержания фумонизинов в зерне кукурузы методом ИФА выявили чрезвычайно высокую частоту обнаружения фумонизинов (ФВ1+ФВ2+ФВ3), как в зерне кукурузы (91%), так и основных продуктах переработки кукурузы - крупе и муке (99-100%). 50% изученных продуктов детского питания содержали эти токсины.

Сухой помол кукурузы обеспечивал заметное снижение средних уровней загрязнения крупы и муки, которые составляли 27,5 и 36,1% по отношению к зерну

Технологическая обработка при производстве кукурузных хлопьев приводила к дальнейшему существенному снижению концентрации фумонизинов

3. Разработка метода количественного определения фумонизинов Bt и В2 в кукурузе и продуктах ее переработки с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии

Данные скрининга, показавшие высокую частоту обнаружения фумонизинов, явились основанием для разработки высокоточного, надежного количественного метода определения фумонизинов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

При разработке метода определения ФВ] и ФВ2 были решены такие задачи, как подбор смеси растворителей, позволяющей селективно извлекать ФВ! и ФВ2 с высоким выходом; подбор условий для проведения очистки экстракта с помощью колоночной хроматографии (иммунно-афинные и С18 - патроны), а также системы растворителей, позволяющей эффективно отделить фумонизины от фоновых примесей, подбор дериватизационных агентов для получения флуоресцирующих производных; разработка условий проведения обращенно-фазовую (ОФ) ВЭЖХ для обеспечения достаточного отделения фумонизинов от фоновых компонентов, содержащихся в экстракте зерна кукурузы.

На основании полученных результатов был разработан метод определения фумонизинов, включающий в себя следующие этапы (табл 5)

Таблица 5.

Основные этапы определения ФВ, и ФВ2 методом ВЭЖХ.

I (однокомпонентные смеси) II (многокомпонентные смеси)

Экстракция

Ацетонитрил ' вода(11), 90 мин. Ацетонитрил метанол:вода(11-2),120мин

Твердофазная очистка

С-18 патроны Rida С18, R-Biopharm (Германия),

ш=100 мг, d=58 m, содержание _углерода - 18,5%__

Иммуно-афинные колонки Fumoniprep, R-Biopharm (Германия)

Предколоночная дериватиза

Обработка О-фталевым альдегидом + 2-меркаптоэтанолом

ВЭЖХ определение Колонка: Кромасил С18 или Луна С18 (2) (250x4,6 мм), 5 мкм Подвижная фаза.

Ацетонитрил метанол 0,08М фосфатный буферный раствор (50:10 40), рН=4,5 Детектирование Флуориметрическое XBnla = 335 нм, л.,ми<. =440 нм_

В табл 6 приведены метрологические характеристики разработанного метода ВЭЖХ определения ФВ, и ФВ2

Таблица 6.

Метрологические характеристики ВЭЖХ метода определения ФВ, и ФВ2

I (однокомпонентные смеси) II (многокомпонентные смеси)

Предел определения

для ФВ| - 0,01 мг/кг, для ФВ2 - 0,04 мг/кг для ФВ, - 0,01 мг/кг, для ФВ2 - 0,04 мг/кг

Средняя степень извлечения

для ФВ, - 89,8%, для ФВ2 - 89,5% для ФВ, - 84,8%, для ФВ2 - 81,3%

Относительная погоешность измерений

для ФВ, - 7 -13%, для ФВ2 - 3 - 18% для ФВ, - 8-31%, для ФВ2 - 13 - 29%

Сравнение результатов, полученных ИФА и ВЭЖХ методами, выявило, что при использовании ИФА-метода в 6,4% проб были выявлены ложноотрицательные результаты; наблюдались заниженные результаты, особенно в отношении ФВ2 (более чем в два раза), показаны завышенные результаты, особенно в отношении ФВ, (до двух раз) и в 57,2% проб данные ИФА превышали данные ВЭЖХ в 1,2-3 раза

4. Изучение содержания фумонизинов В, и В2 в кукурузе и продуктах ее переработки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Изучение содержания ФВ, и ФВ2 в зерне кукурузы и продуктах ее переработки методом ОФ ВЭЖХ подтвердило высокую частоту загрязнения зерна кукурузы и продуктов ее переработки фумонизинами (табл 7) Согласно полученным результатам частота загрязнения ФВ1 и ФВ2 как зерна (93 и 59%), так и основных продуктов переработки кукурузы - муки (100 и 50%) и крупы (96 и 44%) были самыми высокими по сравнению с прочими продуктами из кукурузы Среднее содержание и медиана в партиях продовольственного зерна кукурузы составили 1,55 и 0,74 мг/кг для ФВЬ и 0,40 и 0,12 мг/кг для ФВ2 Значительные различия в значениях медианы и среднего содержания объясняются тем, что полученные результаты не подчинялись закону нормального распределения, наибольшее количество проб находилось в области низких концентраций Уровни загрязнения ФВ] и ФВ2 зерна кукурузы в несколько раз превышали уровни загрязнения основных продуктов ее переработки, о чем свидетельствуют величины медианы, 90% уровня, среднее содержание и максимальные уровни загрязнения Для всех партий зерна и основных продуктов переработки кукурузы наблюдалось превышение содержания ФВ1 над ФВ2 в соотношении 3:1.

Содержание фумонизинов В, и В2 продовольственном зерне кукурузы и продуктах ее переработки

Проба Количество проб Фумо-низин Кол-во проб, содержащих фумонизин Содержание фумонизина в контаминиро-ванных пробах, мг/кг Содержание фумонизина в пробах всего ряда, мг/кг

среднее среднеквадратичное отклонение медиана 90% ур.

Зерно 147 В| 137(93%) 0,01 - 17,91 1,55 2,35 0,74 4,09

в2 87(59%) 0,04 - 8,50 0,40 0,85 0,12 1,01

Крупа 113 в, 109 (96%) 0,03 - 3,99 0,49 0,59 0,25 1,25

в2 50 (44%) 0,04 - 0,76 0,09 0,17 0 0,33

Мука 10 В] 10(100%) 0,07 - 1,77 0,61 0,54 0,45 1,16

в2 5 (50%) 0,04 - 0,23 0,10 0,14 0,02 0.22

Прочие* 10 В, 6 (60%) 0,01-0,05 0,013 0,018 0,010 0,04

в2 0 (0%) 0 0 0 0 0

Хлопья 64 в, 39(61 %) 0,01-0,40 0,049 0,083 0,010 0,170

в2 6 (9 %) 0,04 - 0,06 0,004 0,013 0 0

Детское питание 55 в, 25 (45%) 0,01-0,16 0,025 0,040 0 0,085

В2 0 0 0 0 0

* - Консервированные кукурузные продукты, палочки, тортилы.

Обращает на себя внимание факт высокой частоты загрязнения фумонизннамн продуктов детского питания, но уровни загрязнения этих продуктов были значительно ниже, чем в кукурузной крупе и муке ФВ| был обнаружен в 45% продуктов детского питания для детей до 3 лет в количестве от 0,01 до 0,16 мг/кг при средней концентрации ФВ[ - 0,025 мг/кг; ФВ2 в этих пробах обнаружен не был 61% проб кукурузных хлопьев были загрязнены ФВ| в концентрациях от 0,01 до 0,40 мг/кг; в 11% случаев они содержали ФВ2 - от 0,04 до 0,06 мг/кг

Уровни загрязнения консервированных продуктов из кукурузы (от 0,01 до 0,05 мг/кг) и продуктов детского питания были значительно ниже уровней загрязнения основных продуктов переработки кукурузы (табл 7)

Заслуживает внимания факт установления более низкого уровня загрязнения фумонизинами генетически модифицированного зерна кукурузы (устойчивого к вредителям (кукурузному мотыльку) и/или к глифосату, и к глюфосинату аммония) по сравнению с кукурузой, выращенной с применением традиционных технологий Это связано с тем, что в большинстве случаев, благодаря приобретенной устойчивости кукурузы к вредителям и гербицидам ослабляется поражение зерна микроскопическими грибами рода Ь\>чапит и, следовательно, загрязнение продуцируемыми ими фумонизинами

5. Изучение содержания ДОН и ЗЛ в кукурузе и продуктах ее переработки.

Изучение содержания фузариотоксинов дезоксиниваленола (ДОН) и зеараленона (ЗЛ) в зерне кукурузы и продуктах ее переработки показало, что эти токсины присутствовали лишь в единичных партиях зерна кукурузы в низких концентрациях ДОН в 2,3% исследованных партий от 0,05 до 0,40 мг/кг, ЗЛ - в 3,2% партий - от 0,05 до 0,11 мг/кг. Ни одна из исследованных проб продуктов переработки кукурузы не содержала ДОН и ЗЛ В 2,7% партий зерна кукурузы наряду с фумонизинами был обнаружен ДОН, еще 2,7% наряду с фумонизинами содержали ЗЛ; 0,7% исследованных партий содержали все четыре фузариотоксина (ФВЬ ФВ2, ДОН и ЗЛ).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что как природные контаминанты фумонизины имеют первостепенное значение по сравнению с другими фузариотоксинами.

6. Расчет суточной нагрузки фумонизинами В] и В2 на население России С целью оценки риска, связанного с употреблением загрязненных фумонизинами пищевых продуктов из кукурузы проведен расчет возможной нагрузки фумонизинами на человека в среднем по России, для регулярных потребителей продуктов переработки кукурузы, а также для детей (табл 8)

Таблица 8

Расчетные уровни потребления ФВ|+ФВ2 разными возрастными группами населения

Расчетное Среднее Расчетный

потребление содержание уровень % от

Группа риска продуктов из ФВ,+ФВ2 потребления ПСП*

кукурузы, в продуктах, ФВ|+ФВ2 в сутки,

г/сут мг/кг мкг/кг массы тела

Взрослые

В среднем по Крупа - 0,46 0,58 0,0045 0,225

России Мука - 0,02 0,71 0,0002 0,010

Прочие - 0,48 0,013 0,0001 0,005

сумма 0,0048 0,240

Регулярные Крупа-47,8 0,58 0,46 23,0

потребители Мука - 95,7 0,71 1,13 56,5

(0,03 - 1,45% Прочие - 44,5 0,013 0,01 0,5

обследованного

населения)

Дети раннего

возраста

(до 3 лет)

5-12 мес. Продукты

прикорма - 40 0,025 0,13-0,10 6,5 - 5,0

1,5-3 года Крупа - 25 0,58 1,29-1,01 64,5 - 50,5

Дети

дошкольного

возраста

3-6 лет Крупа - 40 0,58 1,62-1,15 81,0-57,5

* - ПСП фумопизинов - 2 мкг/кг массы тела

На основании данных по потреблению кукурузы и продуктов ее переработки в среднем по России и собственных результатов анализов фумонизинов была рассчитана суточная нагрузка ФВ!+ФВ2 на человека*

* Данные по среднесуточному потреблению продуктов переработки кукурузы предоставлены Лабораторией по изучению и планированию структуры питания населения ГУ НИИ питания РАМН (руководитель лаборатории д.м.н. Батурин А К ).

Учитывая, что за период с 2000 по 2003 г г среднее потребление кукурузной крупы - 0,46 г/сут, муки - 0,02 г/сут и прочих продуктов из кукурузы - 0,48 г/сут, расчетное суточное потребление фумонизинов населением России с этими продуктами составляет 0,0048 мкг/кг массы тела в сутки, что соответствует 0,24% от рекомендованного комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам (ШСРА) переносимого суточного потребления (ПСП) фумонизинов - 2 мкг/кг

Согласно эпидемиологическим исследованиям только 0,79% обследованного населения России в среднем за сутки потребляют 47,8 г кукурузной крупы; 0,03% -95,7 г кукурузной муки и 1,4% - 44,5 г прочих кукурузных продуктов Исходя из данных по загрязнению этих продуктов фумонизинами, была рассчитана суточная нагрузка ФВ1+ФВ2 на человека Для лиц, регулярно потребляющих кукурузную крупу, она составила 0,46 мкг/кг массы тела в сутки, кукурузную муку - 1,13 мкг/кг массы тела и другие кукурузные продукты - 0,01 мкг/кг массы тела, что соответствует 23, 56,5 и 0,5% от ПСП ФВ|+ФВ2 (табл 8) Следует отметить, что не было установлено превышения величины ПСП фумонизинов ни для одной из рассмотренных групп взрослого населения

Расчет нагрузки ФВ1+ФВ2 на детей был произведен, основываясь на допущении, что дети раннего возраста (от 5 до 12 месяцев), могут потреблять в качестве прикорма ежедневно по 40 г специализированного детского питания В этом случае нагрузка фумонизинами может составить от 0,10 до 0,13 мкг/кг массы тела в сутки, или 5 - 6,5% от ПСП фумонизинов (2 мкг/кг массы тела)

Исходя из того, что дети раннего (от 1,5 до 3 лет), и дошкольного возраста могут потреблять ежедневно по 25 и 40 г кукурузной крупы соответственно, был произведен расчет суточной нагрузки ФВ|+ФВ2 на детей этих возрастных групп Эта величина высока для детей в возрасте от 1,5 до 3 лет, - 1,01 - 1,29 мкг/кг массы тела в сутки, что соответствует 50,5 - 64,5% от величины ПСП фумонизинов Наибольшая суточная нагрузка фумонизинами приходится на детей дошкольного возраста - от 1,15 до 1,6 мкг/кг массы тела в сутки, те от 57,5 до 81,0% от величины ПСП фумонизинов

Полученные величины суточной нагрузки фумонизинами на детей значительно выше суточной нагрузки фумонизинами на взрослое население России в целом Это позволяет отнести детей и группу населения, регулярно потребляющую продукты переработки кукурузы (0,03 - 1,45% от обследованного населения), к группе риска.

выводы

1 Впервые в Российской Федерации проведен анализ загрязнения фумонизинами зерна кукурузы и продуктов ее переработки с использованием методов иммуноферментного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии Установлено, что более 90% исследованных партий зерна кукурузы и основных продуктов ее переработки загрязнено фумонизинами.

2 Показано, что Fusarium moniliforme является основным доминирующим грибом зерна кукурузы и продуктов ее переработки Анализ внутренней микофлоры зерна кукурузы выявил загрязнение F. moniliforme в 97 - 100% проб отечественного зерна. В поверхностной микофлоре зерна кукурузы и основных продуктах ее переработки микроскопические грибы F. moniliforme составили 35,1% от общего числа грибов в зерне кукурузы.

3 Установлено, что все 111 исследованных штаммов F. moniliforme являются продуцентами фумонизинов, причем 21,6 - 25% из них относятся к высокотоксигенным Показано, что токсигенная активность F moniliforme находится в четкой зависимости от морфотипов: она максимальна у высокомицелиальных и минимальна у безмицелиальных морфотипов.

4 Разработан высокочувствительный, селективный метод количественного определения фумонизинов В] и В2 с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в зерне кукурузы и продуктах ее переработки с пределом обнаружения - 0,01 мг/кг для ФВ] и 0,04 мг/кг для ФВ2; относительным стандартным отклонением - 0,06 и 0,08; и степенью извлечения - 89,8 и 89,5 % соответственно.

5 Методом ВЭЖХ выявлены чрезвычайно высокие уровни загрязнения зерна кукурузы ФВ] (до 17,91 мг/кг, средняя концентрация - 1,55 мг/кг); ФВ2 - (до 8,5 мг'кг, средняя концентрация - 0,40 мг/кг) Установлено, что уровни загрязнения основных продуктов переработки кукурузы - муки и крупы, в 3 - 5 раз ниже уровней загрязнения зерна (от 0,03 до 3,99 мг/кг) ФВ] и (от 0,04 до 0,76 мг/кг) ФВ2 45% продуктов детского питания с включением кукурузы содержали ФВ] в концентрациях от 0,01 до 0,16 мг/кг (среднее содержание - 0,025 мг/кг)

6 Установлено, что в качестве природных контаминантов кукурузы и продуктов ее

переработки фумонизины имеют первостепенное значение по сравнению с другими фузариотоксинами - ДОН и 3JI, которые обнаружены в единичных партиях зерна кукурузы в низких концентрациях. В 2,3% партий зерна кукурузы наряду с ДОН обнаружены ФВ1 и ФВ2; еще 2,3% партий зерна одновременно содержали 3JI, ФВ| и ФВ2. Только 0,7% партий кукурузы содержали одновременно все анализируемые фузариотоксины (ДОН, ЗЛ, ФВ] и ФВ2).

7 Расчет нагрузки фумонизинами В] и В2 на население России показал, что в среднем по России суточное потребление ФВ1+ФВ2 (по данным потребления продуктов переработки кукурузы за 2000-2003 г г) составило 0,0048 мкг/кг массы тела (0,24% от величины ГТСП), для постоянных потребителей (от 0,03 до 1,45 % обследованного населения) - от 0,01 до 1,13 мкг/кг массы тела (0,5 - 56,5 % от величины ПСП); для детей до года - от 0,10 до 0,13 мкг/кг массы тела (5 -6,5% от величины ПСП); для детей старше года - от 1,01 до 1,60 мкг/кг массы тела (50,5 - 81,0% от величины ПСП фумонизинов), что позволяет отнести постоянных потребителей кукурузы и детей к группе риска

Внедрение в практику

1 «Методические указания по определению фумонизинов В| и В2 в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (МУК 4 1.1962-05). М.. Роспотребнадзор, 2005, 17 с / Академик РАМН, профессор В А Тутельян, д х н К И Эллер, к х н М Г Киселева, к б н Л П Захарова, И Б Седова /

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Обольский О.Л., Захарова Л.П., Седова И Б. Фузариотоксины -контаминанты продовольственного сырья и пищевых продуктов // Материалы IV Всероссийской конференции «Здоровое питание' воспитание, образование, реклама» - Москва, 2001 -С 143-144

2. Седова И.Б., Львова Л С Фузариотоксины как контаминанты продовольственного зерна кукурузы // Сборник докладов IV научно-практической конференции «Реализация федерального закона «О качестве и безопасности пищевых продуктов» от 02.01.2000 г. № 29-ФЗ». - Омск, 2001. - С. 129 - 132

3. Львова Л.С., Седова И.Б., Ремеле В.В, Кизлеико О.И. Фумонизины -новые микотоксины грибов рода Fusarium и связанные с ними вопросы гигиенической безопасности зерна кукурузы // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию Независимости Республики Казахстан» - г. Астана, 2001 г. - С 83-85

4 Тутечъяп ВА, Захарова Л П, Обольский ОЛ, Седова И Б Результаты мониторинга за загрязнением продовольственного сырья фузариотоксинами // Научные труды Федерального центра гигиены им Ф Ф Эрисмана «Вопросы обеспечения санэпидблагополучия населения в центральных регионах России» -Воронеж- Минздрав России, 2002 - Вып 6 - С 668-670

5. Захарова Л.П., Седова ИБ, Обольскш О,Л. Фузариотоксины в продовольственном зерне и продуктах его переработки. // Материалы пленума Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации. - Москва, 2002 - С. 94 - 96.

6 Львова JT С, СеОова И Б, Китенка О.И, Тутелъян RA Образование фумонизинов штаммами Fusarium momliforme, выделенными из зерна кукурузы // Прикладная биохимия и микробиология - 2003 - Т 39, № 2 - С 222 - 227

7 Sedova I.B , Kiseleva M.G. HPLC determination of fumonisins in maize. // 3rd Int Symposium on Separation in BioSciencies «100 years of chromatography». -Moscow, 2003 - P. 338

8 Седова И Б., Захарова Л П., Львова Л.С., Кизленко О.И., Киселева М.Г. Фумонизины - природные загрязнители продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки // Материалы VII Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения Россию) - Москва, 2003. - С. 467 - 468.

9 Седова И Б Изучение частоты и уровня загрязнения пищевых продуктов микотоксинами Fusarium momliforme - фумонизинами // Материалы научной конференции «Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха» и конференция молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи - объект постоянного внимания В А Рязанова» -Москва, 2003. - С 319-351

10 Львова Л С., Седова И Б, Кизленко О И Безопасность зерна и продуктов его переработки Основные микробиологические показатели и факторы, их регулирующие. // Сборник трудов «Развитие научных идей академика Петра Ивановича Лисицына». - Москва, 2003. - С. 233-243.

11. Захарова Л.П, Обольский О.Л, Седова И.Б. Фузариотоксины в продовольственном зерне и продуктах его переработки // «Гигиена и санитария» -2003.-С. 51-52.

12. Львова Л С., Кизленко О.И., Седова И.Б., Захарова Л.П. Деконтаминация и обеззараживание зернопродуктов в процессе переработки зерна, загрязненного микотоксинами // Материалы Второго Всероссийского конгресса по медицинской микологии - Москва, 2004. - Т. 3 - С. 276 - 278.

13 Седова ИБ, Захарова ЛП, Львова JIC, Кизленко О И Синтез фумонизинов грибами Fusarium momliforme при хранении сырой кукурузы. // Материалы Второго Всероссийского конгресса по медицинской микологии -Москва, 2004 - Т 3 -С 291 -292.

14 Седова ИБ, Киселева M.F., Сафронова AM Оценка риска, связанного с фумонизинами в кукурузе и продуктах ее переработки. // Материалы Второго Всероссийского конгресса по медицинской микологии - Москва, 2004. - Т. 3. - С. 293 - 295.

15. Захарова Л.П, Седова И.Б., Тутельян В.А. Дезоксиниваленол -контаминант продовольственного зерна // Материалы Второго Всероссийского конгресса по медицинской микологии - Москва, 2004. - Т 3 - С 298 - 300.

16. Седова И Б, Киселева MF., Захарова Л.П., Эллер К И., Тутельян В.А. Оптимизация условий определения фумонизинов В, и В2 в кукурузе и продуктах ее

переработки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журнал аналитической химии. - 2004 - Т. 59, № 8 - С. 819 - 825

17 Львова Л С , Кизленко О И , Захарова Л П , Седова И Б Микотоксины и проблема безопасности зерна и зернопродуктов // Материалы Второй Международной конференции Зерновая индустрия в XXI веке. - Москва, 2004 - С 151 - 153.

18. Седова И.Б, Львова U.C., Захарова Л.П., Кименко О И, Киселева M Г., Тутельян В.А Загрязнение зерна кукурузы и продуктов ее переработки фумонизинами - микотоксинами гриба Fusarium moniliforme II Материалы Международной научно-практической конференции «Национальная политика здорового питания Республики Казахстан» - г Алматы, 2004 г - С 197-201

19 Львова Л С, Кизченко О И, Седова И Б, Захарова Л П, Киселева M Г, Тутельян В А Загрязнение зерна и продуктов переработки кукурузы фумонизинами - микотоксинами Fusarium moniliforme И Материалы Научно-практической конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов». - г. Углич, 2004 г. - Часть 1. - С. 236 - 239.

20. Седова ИБ, Захарова ЛП, Kuceneea MF, Львова ЛС Изучение загрязненности зерна кукурузы и продуктов ее переработки фузариотоксинами // Материалы Третьего Всероссийского конгресса по Медицинской Микологии -Москва, 2005 г. - Т. 5. - С 153 - 156.

21 Львова Л С, Кизленко О И, Седова И И, Захарова Л П Изучение микофлоры зерна кукурузы и продуктов ее переработки // Материалы Третьего Всероссийского конгресса по Медицинской Микологии - Москва, 2005 г - Т. 5 - С 141-143

22. «Методические указания по определению фумонизинов Bi и В2 в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (МУК 4.1.1962-05). M • Роспотребнадзор, 2005, 17 с. / Академик РАМН, профессор В.А. Тутельян, дх.н. К.И Эллер, кх.н. M Г Киселева, кбн Л.П. Захарова, И.Б. Седова /

Для заметок

Для заметок

Для заметок

*

Заказ N° 793 Подписано в печать 13 05 05 Тираж 130 экз Усл. пл. 1

ООО "Цифровичок", тел. (095) 797-75-76 www.cfr.ru

®î (Ш®

РНБ Русский фонд

2006-4 10664

i

Проблема биобезопасности на современном этапе непосредственно связана с предотвращением попадания в пищевую цепь природных контаминантов биологического происхождения, воздействующих на здоровье человека. Среди наиболее опасных природных загрязнителей пищевых продуктов особое место занимают микотоксины, которые являются продуктами жизнедеятельности повсеместно распространенных микроскопических плесневых грибов, способных поражать пищевые продукты на всех этапах производства, обработки и хранения.

Микотоксины - это высокотоксичные, высокостабильные соединения, некоторые из которых являются сильными канцерогенами (афлатоксины, охратоксин), большинство из них - иммунодепрессанты. По данным ФАО, более 25% всего производимого в мире зерна контаминировано микотоксинами [Mannon J., Jonson Е., 1985]. Невозможность полного предотвращения образования токсинов в растительном сырье и попадания их в организм приводит к необходимости организации контроля за уровнем их содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах, а в ряде случаев, - введения гигиенических регламентов.

Проведенные исследования показали, что наиболее часто обнаруживаемыми микотоксинами являются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium, среди которых наибольшим распространением отличаются дезоксиниваленол (ДОН, вомитоксин) и зеараленон (3JI) [Билай В.И., 1977; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; Bhat R. 1999; Miller J.D., 1995; Schuh М., 2001]. В отличие от других микотоксинов, фузариотоксины накапливаются в зерне колосовых культур, пораженных фузариозом колоса в период созревания, и интенсивность их синтеза зависит в значительной степени от климатических и погодных условий. Основным возбудителем фузариоза колоса и продуцентом ДОН и ЗЛ является Fusarium graminearum Schwabe [Scott P.M. 1990; Львова Л.С. и др., 1992, 1993, 1994; Parry D.W., et al., 1995]. Исследования, проводимые в ГУ НИИ питания РАМН в течение 16 лет, показали высокую частоту обнаружения микотоксина ДОН, главным образом в зерне пшеницы из Северо-Кавказского региона, причем в отдельные годы частота выявления ДОН в пшенице в ареалах фузариоза варьировала от 60 до 100% обследованных партий. Помимо ДОН, в фузариозной пшенице обнаруживался также 3JI [Соболев B.C., и др., 1990; Львова JI.C. и др., 1992, 1994; Захарова Л.П. и др., 1994, Кравченко Л.В. и др., 1998; Tutelyan V.A. et al, 1990;Tutelyan V.A., 1998, 2004].

Количество идентифицированных фузариотоксинов постоянно увеличивается. В последнее время особое внимание уделяется фумонизинам. Фумонизины - новый класс микотоксинов, образуемых грибами рода Fusarium. Наиболее часто в природных условиях встречается фумонизин Bi (ФВ0, значительно реже и в меньших количествах - фумонизины В2 (ФВ2) и Вз (ФВ3). Основными продуцентами этих токсинов являются F. moniliforme Sheldon (син. F. verticillioides (Sacc. Nirenberg) [Nelson P.E., et al., 1993, Marasas W.F.O., 1994]. Установлена высокая частота обнаружения фумонизинов в зерне кукурузы и продуктах ее переработки в США, Австралии, в ряде стран Европы [Miller J.D., et al., 1993, Nelson P.E., et al., 1993, Norred W.P., et al., 1999, Thiel P.G., et al., 1993, Turner P.C., et al., 1999].

Фумонизины обладают выраженными токсическими свойствами. В экспериментах показано, что фумонизины поражают печень и почки, легкие, поджелудочную железу и центральную нервную систему у разных видов животных. Доказано, что они также обладают канцерогенным действием на крыс и мышей. Кроме того, эти токсины являются причиной лейкоэнцефаломаляции у лошадей и отека легких у свиней [Marasas W.F.O., et al., 1984, 1992]. Международное агентство по изучению рака относит фумонизины к соединениям, вероятно канцерогенным для человека (группа 2В) [IARC, 1993, 2002].

Учитывая выраженное токсическое действие фумонизинов и отсутствие каких-либо сведений о возможности загрязнения этими токсинами продуктов переработки зерна в Российской Федерации, основной целью этой работы было изучить возможность загрязнения продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки фумонизинами, а также возможность одновременного загрязнения этих продуктов другими фузариотоксинами.

В связи с вышеизложенным, в настоящей работе были определены следующие задачи:

1. Изучить пораженность зерна кукурузы и продуктов его переработки F. moniliforme и токсигенный потенциал штаммов, выделенных с отечественного и импортного зерна;

2. Исследовать частоту загрязнения фумонизинами продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки с помощью адаптированного скринингового иммуноферментного метода;

3. Разработать на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии метод количественного определения содержания OBi и ФВ2 в зерне кукурузы и продуктах ее переработки.

4. Установить частоту и уровни загрязнения продовольственного зерна кукурузы и продуктов ее переработки другими фузариотоксинами - ДОН и 3JL

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые в России проведен скрининг продовольственного зерна кукурузы на содержание микотоксинов фумонизинов и обнаружена высокая частота загрязнения этими микотоксинами кукурузы продовольственного назначения.

Впервые на основе системного анализа исследована распространенность инфекции Fusarium moniliforme в отечественном зерне кукурузы и установлена высокая токсинообразующая способность этого вида.

Впервые в России проведен количественный анализ содержания микотоксинов ФВ) и ФВ2 в продовольственном зерне кукурузы и основных продуктах ее переработки, результаты которого свидетельствуют о высокой частоте и широкой вариабельности уровней загрязнения объектов этими фумонизинами.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Разработан новый высокочувствительный, селективный, количественный метод определения ФВ1 и ФВ2, позволяющий проводить серийные анализы. На основании результатов работы разработаны «Методические указания по определению фумонизинов В1 и В2 в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (МУК 4.1.1962-05. М.: Роспотребнадзор, 2005).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы доложены на: Третьем Симпозиуме «100-летие хроматографии» (Москва, 2003), Первом (Москва, 2003), Втором (Москва, 2004) и Третьем (Москва, 2005) Всероссийских Конгрессах по медицинской микологии.

ПУБЛИКАЦИИ

По результатам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 18 публикаций в сборниках научных трудов, разработаны 1 Методические указания (Роспотребнадзора России, МУК 4.1.1962-05).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 302 источника, из которых - 279 иностранных авторов.

6.ВЫВОДЫ

1. Впервые в Российской Федерации проведен анализ загрязнения фумонизинами зерна кукурузы и продуктов ее переработки с использованием методов иммуноферментного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что более 90% исследованных партий зерна кукурузы и основных продуктов ее переработки загрязнено фумонизинами.

2. Показано, что Fusarium moniliforme является основным доминирующим грибом зерна кукурузы и продуктов ее переработки. Анализ внутренней микофлоры зерна кукурузы выявил загрязнение F. moniliforme в 97 - 100% проб отечественного зерна. В поверхностной микофлоре зерна кукурузы и основных продуктах ее переработки микроскопические грибы F. moniliforme составили 35,1% от общего числа грибов в зерне кукурузы.

3. Установлено, что все 111 исследованных штаммов F. moniliforme являются продуцентами фумонизинов, причем 21,6 - 25% из них относятся к высокотоксигенным. Показано, что токсигенная активность F. moniliforme находится в четкой зависимости от морфотипов: она максимальна у высокомицелиальных и минимальна у безмицелиальных морфотипов.

4. Разработан высокочувствительный, селективный метод количественного определения фумонизинов Bi и В2 с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в зерне кукурузы и продуктах ее переработки с пределом обнаружения - 0,01 мг/кг для ФВ1 и 0,04 мг/кг для ФВ2; относительным стандартным отклонением - 0,06 и 0,08; и степенью извлечения - 89,8 и 89,5 % соответственно.

5. Методом ВЭЖХ выявлены чрезвычайно высокие уровни загрязнения зерна кукурузы ФВ1 (до 17,91 мг/кг, средняя концентрация - 1,55 мг/кг); ФВ2 -(до 8,5 мг/кг, средняя концентрация - 0,40 мг/кг). Установлено, что уровни загрязнения основных продуктов переработки кукурузы - муки и крупы, в

3-5 раз ниже уровней загрязнения зерна (от 0,03 до 3,99 мг/кг) ФВ1 и (от 0,04 до 0,76 мг/кг) ФВ2. 45% продуктов детского питания с включением кукурузы содержали ФВ1 в концентрациях от 0,01 до 0,16 мг/кг (среднее содержание - 0,025 мг/кг).

6. Установлено, что в качестве природных контаминантов кукурузы и продуктов ее переработки фумонизины имеют первостепенное значение по сравнению с другими фузариотоксинами - ДОН и ЗЛ, которые обнаружены в единичных партиях зерна кукурузы в низких концентрациях. В 2,3% партий зерна кукурузы наряду с ДОН обнаружены ФВ1 и ФВ2; еще 2,3% партий зерна одновременно содержали ЗЛ, ФВ1 и ФВ2. Только 0,7% партий кукурузы содержали одновременно все анализируемые фузариотоксины (ДОН, ЗЛ, ФВ1 и ФВ2).

7. Расчет нагрузки фумонизинами В1 и В2 на население России показал, что в среднем по России суточное потребление ФВ1+ФВ2 (по данным потребления продуктов переработки кукурузы за 2000-2003 г.г.) составило 0,0048 мкг/кг массы тела (0,24% от величины ПСП); для постоянных потребителей (от 0,03 до 1,45 % обследованного населения) - от 0,01 до 1,13 мкг/кг массы тела (0,5 - 56,5 % от величины ПСП); для детей до года -от 0,10 до 0,13 мкг/кг массы тела (5,0 - 6,5% от величины ПСП); для детей старше года - от 1,01 до 1,60 мкг/кг массы тела (50,5 — 81,0% от величины ПСП фумонизинов), что позволяет отнести постоянных потребителей кукурузы и детей к группе риска.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди природных контаминантов пищевых продуктов в настоящее время первостепенное внимание уделяется микотоксинам - вторичным метаболитам микроскопических грибов. Экономический ущерб, наносимый микотоксинами, определяется не только прямыми потерями продовольственного сырья и кормов, но и гибелью, снижением привесов и воспроизводства сельскохозяйственных животных; возрастанием их чувствительности к инфекционным заболеваниям. По данным ФАО, более 25% всего производимого в мире зерна контаминировано микотоксинами [Mannon J., Johnson Е., 1985].

В системе мероприятий по обеспечению биобезопасности центральное место занимает система контроля за содержанием микотоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктов и установление гигиенических регламентов их содержания в отдельных видах пищевых продуктов. Но, учитывая, что проведение этих мероприятий требует больших экономических затрат, введение гигиенических регламентов должно быть строго научно обосновано. Для обоснования такой необходимости нужно накопить достаточный объем информации, характеризующей с одной стороны, степень токсичности и опасности данного микотоксина для человека и животных, с другой стороны, накопить данные о частоте и уровнях контаминации микотоксинами продовольственного сырья и пищевых продуктов. Важным звеном в этой последовательности является создание надежной методической базы, позволяющей обнаруживать, идентифицировать и количественно определять микотоксины в пищевых продуктах.

Данная работа была посвящена созданию методической базы определения фумонизинов, а также на получение данных по частоте и уровне контаминации ими продовольственного сырья и пищевых продуктов.

В частности, в настоящей работе удалось разработать высоко чувствительный и надежный количественный метод определения OBj и ФВ2 в продовольственном зерне кукурузы и продуктах ее переработки. Количественное определение токсинов осуществлялось в условиях ОФ ВЭЖХ при использовании в качестве подвижной фазы смеси растворителей: ацетонитрил - метанол - 0,08М фосфатный буферный раствор (50:10:40), рН=4,5. Полученные методики позволили добиться высокой степени извлечения токсинов: 89,8 % для ФВ! и 89,5% для ФВ2. Предел обнаружения метода составил 0,01 мг/кг (для ФВ1); 0,04 мг/кг (для ФВ2). Относительное стандартное отклонение измерения времен удерживания составило - 0,02 (для ФВ1) и 0,03 (для ФВ2), высот хроматографических пиков - 0,05 (для ФВ1) и 0,08 (для ФВ2), площадей хроматографических пиков - 0,06 (для ФВ0 и 0,08 (для ФВ2). Общая погрешность измерений не превышала 31%.

В процессе работы был проведен сравнительный анализ методов определения фумонизинов: ИФА и ВЭЖХ. В 21,8% случаев были получены сходные результаты, однако, в 57,2% случаев было выявлено превышение данных ИФА по сравнению с ВЭЖХ. Таким образом, показано, что метод ИФА может быть рекомендован для проведения скрининговых исследований. Разработанный метод количественного определения ФВ1 и ФВ2 должен быть обязательным для подтверждения полученных методом ИФА результатов и использоваться для вынесения соответствующих решений в спорных вопросах.

Разработанный метод положен в основу «Методических указаний по определению фумонизинов В1 и В2 в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (МУК 4.1.1962-05. М.: Роспотребнадзор, 2005). Этот метод предназначен для специалистов санэпидемслужбы, испытательных центров и производственных лабораторий других ведомств, занимающихся исследованием качества и безопасности пищевых продуктов.

Предложенный в работе метод количественного определения фумонизинов позволил решить поставленную задачу по изучению загрязнения фумонизинами пищевых продуктов. Так, впервые в России были получены данные о загрязнении фумонизинами зерна кукурузы и продуктов ее переработки, включая продукты детского питания. Весь накопленный материал должен быть учтен при решении вопроса о введении соответствующих регламентов за содержанием этого токсина.

Полученные в данной работе результаты показали высокую частоту и высокий уровень загрязнения фумонизинами зерна кукурузы: 93% партий зерна кукурузы содержали ФВ! в количестве от 0,01 до 17,91 мг/кг при средней концентрации ФВ1 - 1,55 мг/кг, 59% проб были контаминированы ФВ2 - от 0,04 до 8,50 мг/кг при среднем содержании 0,40 мг/кг.

Обнаружена чрезвычайно высокая частота загрязнения фумонизинами основных продуктов переработки кукурузы - крупы (95%) и муки (100%), при этом уровни загрязнения этими фузариотоксинами были в несколько раз ниже, чем в зерне кукурузы. Содержание ФВ1 в пробах кукурузной муки варьировало от 0,03 до 3,99 мг/кг, средняя концентрация составила 0,61 мг/кг; уровень загрязнения ФВ2 - от 0,04 до 0,23 мг/кг при среднем содержании - 0,10 мг/кг. Диапазон загрязнения ФВ1 кукурузной крупы находился в пределах от 0,07 до 1,77 мг/кг, средней концентрации 0,49 мг/кг; ФВ2 - от 0,04 до 0,76 мг/кг при среднем содержании 0,09 мг/кг. Обнаруженные уровни загрязнения фумонизинами (ФВ1+ФВ2) в большинстве случаев не превышали 1 мг/кг, что сравнимо с величиной допустимого содержания фумонизинов, установленного в Швейцарии [МагаБаБ 2001].

Обращает на себя внимание высокая частота загрязнения фумонизинами продуктов детского питания, но уровни загрязнения этих продуктов были значительно ниже, чем в кукурузной крупе и муке. ФВ1 был обнаружен в 45% продуктов детского питания для детей раннего возраста в количестве от 0,01 до 0,16 мг/кг при средней концентрации ФВ! - 0,025 мг/кг, ФВ2 в этих пробах в пределах обнаружения метода выявлен не был. В 61% проб кукурузных хлопьев был обнаружен ФВ1 - от 0,01 до 0,40 мг/кг при среднем содержании 0,049 мг/кг; в 11% случаев ФВ2 - от 0,04 до 0,06 мг/кг на низких уровнях загрязнения.

Данные исследования показывают необходимость осуществления дальнейшего изучения содержания фумонизинов в продовольственном зерне кукурузы и продуктах ее переработки с целью оценки степени опасности их для здоровья населения и введения в случае необходимости соответствующих регламентов.

Нужно отметить, что согласно зарубежным публикациям уровни фумонизинов в продуктах детского питания, а также сырье, предназначенном для их приготовления [Cirillo T., et al., 2003а,b; de Castro M.F.P., et al, 2004; Henningen M.R., et al, 2000; Lombaert G.A., et al, 2003; Machinski M.Jr., Soares L.M.V., 2000], были соизмеримы с полученными в настоящей работе данными. Например, в продуктах детского питания в Канаде среднее содержание фумонизинов составило 0,033 мг/кг, в то же время в Бразилии эти величины были в несколько раз выше (среднее содержание - 0,355 мг/кг) [Cirillo T., et al., 2003а,b; de Castro M.F.P., et al, 2004].

В целом следует отметить более высокую частоту обнаружения фумонизинов в кукурузе отечественного производства по сравнению с данными для других стран [WHO, 2001], хотя уровни загрязнения были близки к описанным в литературе.

Наряду с фумонизинами проводилось изучение загрязнения зерна кукурузы и продуктов ее переработки ДОН и 3JI. Частота обнаружения этих токсинов была низкой по сравнению с частотой обнаружения фумонизинов. Так, наряду с фумонизинами были обнаружены другие фузариотоксины -ДОН (в 2,3% исследованных партий зерна, среднее содержание 0,14 мг/кг), 3JI - (в 2,3% партий, среднее содержание 0,071 мг/кг). Только одна партия зерна кукурузы содержала все анализируемые фузариотоксины (ДОН, ЗЛ, OBj и ФВ2). Ни в одной из исследованных проб продуктов переработки кукурузы фузариотоксины ДОН и ЗЛ обнаружены не были.

Согласно данным литературы за рубежом распространенность ДОН и 3JI в кукурузе выше, чем в отечественных продуктах. В ряде случаев наряду с этими фузариотоксинами в кукурузе обнаруживали фумонизины [Cirillo Т., et al., 2003а,b; Henningen M.R., et al, 2000; Machinski M.Jr., Soares L.M.V., 2000].