Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка метода мультипраймерной ПЦР для типирования генов HLA класса II

Г'ГЗ ОА 1 1 иоа ^

На правах рукописи

ТРОФИМОВ Дмитрий Юрьевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДА МУЛЬТИПРАЙМЕРНОЙ ПЦР ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ГЕНОВ НЬА КЛАССА II

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена в Институте иммунологии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

кандидат биологических наук И.М. УНДРИЦОВ доктор медицинских наук Х.Р. ЛАНГ

Официальные оппоненты:

академик АЕН, доктор медицинских наук, профессор А.А. ЯРИЛИН доктор биологических наук Н.В. ГНУЧЕВ

Ведущая организация - Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится " 27 " ноября 1996г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 1 15478, г.Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.С.Сеславина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Молекулы H LA второго класса - это мембранные гликопротеины, имеющие гетеродимерное строение. Они принимают участие в контроле иммунного ответа, презентируя фрагменты антигена Т-лимфоцитам. Система HLA класса II характеризуется высокой степенью аллельного полиморфизма и играет ключевую роль в совместимости тканей при трансплантации. В настоящее время также показана ассоциация конкретных генотипов H LA с рядом патологий (заболеваний), в первую очередь аутоиммунных, что может быть положено в основу формирования групп риска, доклинической диагностики и прогноза течения заболеваний. Кроме того, являясь одной из наиболее полиморфных систем, позволяющих идентифицировать разных индивидуумов, HLA представляет интерес для судебно-медицинских и других исследований.

При типировании комплекса HLA до сих пор в основном применяли серологические и клеточные методы. Однако отсутствие специфических сывороток на многие аллельные вариации, а также принципиальные ограничения, связанные с полиморфизмом обоих цепей молекул HLA класса II, часто приводят к недовыявлению антигенов и к неоднозначному типированию.

В последнее время активно развиваются альтернативные методы типирования, основанные на детекции нуклеотидных замен в генах HLA. Это, прежде всего, такие методы, как: (a) SSP (sequence specific primers) -типирование с помощью набора различных пар праймеров, каждая из которых амплифицирует определенную группу аллелей либо единичную аллельную вариацию; (б) SSO - (sequence specific oligonucleotide) метод, основанный на гибридизации олигонуклеотидных праймеров с амплифицированным участком ДНК (A.Abe и соавт. 1992, T.H.Eiermann и соавт. 1991); (в) метод RFLP (restriction fragment length polymorphism), использующий разницу длин фрагментов ДНК, полученных в результате

перевара продуктов амплификации набором рестриктаз (J.J.Hyldig-Nielson и соавт. 1987, H.Inoko 1988); (г) SSCP (single-strand conformation polymorphism), отличающий аллели по разности электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов ДНК, обусловленной характерными элементами вторичной структуры (P.Patel и соавт. 1992), и другие методы.

Несмотря на определенные преимущества каждого из уже существующих методов, все они обладают по-крайней мере одним из следующих недостатков: а) длительное (более 4-5 часов) время типирования; б) высокая трудоемкость; в) высокая стоимость типирования; г) повышенные требования к качеству образцов ДНК. Указанные недостатки затрудняют использование методов генотипирования в условия? клинической лаборатории и не позволяют проводить ургентнос типирование, что имеет принципиальное значение при подбор« совместимых пар донор-реципиент при органной трансплантации.

Все изложенное выше определяет актуальность данной работы.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состоит в разработке метод; мультипраймерной ПЦР (MSSP - mixture of sequence specific primers) дл) типирования генов HLA класса II, позволяющего в условиях клиническо] лаборатории в течение 2,5 - 3 часов проводить типирование генов HL/ класса II. .

В соответствии с намеченной целью в процессе работ! предполагалось решение следующих задач:

1. Отработать нетрудоемкую и недорогую методику выделения ДНК позволяющую в короткое время (порядка 30 мин) выделять ДНК и образцов крови,

2. Разработать схему амплификации и анализа ПЦР-продукто обеспечивающую надежное типирование с возможно менее жестким]

требованиями к качеству образцов ДНК и общим временем типирования менее 3 часов.

3. Проанализировать аллельный полиморфизм генов НЬА класса I! и выбрать систему праймеров позволяющих надежно амплифицировать все известные аллельные варианты генов Н1А - DR.ni, О0А1 и дифференцировать их по разнице длин ПЦР-продуктов.

4. Провести проверку специфичности разработанной системы типирования на международной стандартизированной панели Н1А-типированных образцов ДНК.

Научная новизна.

Впервые для типирования генов НЬА был использован принцип мультипраймерной ПЦР с последующей детекцией в полиакриламидном или агарозном геле и дискриминацией аллелей генов НЬА по разнице длин продуктов амплификации.

Впервые в России разработан оригинальный метод НЬА-генотипирования, позволяющий в течение 2,5 - 3 часов в условиях клинической лаборатории проводить типирование образцов крови.

Впервые, с использованием разработанного метода генотипирования, стало возможным проводить перспективное ургентное ДНК-типирование доноров при подборе НЬА-совместимых пар донор-реципиент для органной трансплантации.

Практическая значимость.

Практическая значимость данной работы определяется, прежде всего, двумя факторами:

1) разработанная система генотипирования позволила использовать перспективное генотипиропание локуса Н1Л класса II при подборе пар донор-реципиент для органной трансплантации, что значительно улучшило индекс совместимости и дает основания предполагать существенное увеличение эффективности трансплантации;

2) Простота, минимальная трудоемкость и относительно низкая цена разработанной системы позволяет внедрить методы генотипирования в клиническую практику для формирования групп риска ряда заболеваний, для которых показана ассоциация с определенными HLA-генотипами (инсулин-зависимый сахарный диабет и др.), а также расширить исследования проблемы "HLA и болезни" на генетическом уровне.

Публикации.

Материалы диссертации опубликованы в 18 печатных работах, изданных в России и за рубежом, а также доложены на: 12tli European Immunology Meeting (Barcelona, Spain, 1994), International Conference 'The major histocompatibility complex in medicine" (Adelaide, Australia, 1994), Joint Meeting of British Society for Histocompatibility and Immunogenetics and European Foundation for Immunogenetics (Brighton, 1995), 12th International Histocompatibility Workshop and conference (Paris, France, 1996)..

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, указатель цитируемой литературы. Содержит таблиц и рисунков. Библиография состоит из наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАЬОТЫ

Материалы и методы исследований.

Синтез олигонуклеотидных праймеров проводили на ДНК-синтезаторе фирмы Applied Biosystems модель 380В твердофазным фосфоамидитным методом. Снятие защитных групп (изобутирильных и бензоильных) осуществляли аммонолизом в течение 12 часов при 60'С. Синтезированные олигонуклеотиды очищали ВЭЖХ хромотографией на носителе с обращенной фазой (Сепарон С-16) в градиенте концентрации ацетонитрила 0% - 50% в присутствии 0.05 М ацетата аммония. DMTr-фракцию собирали, детритилировали 2% трифторуксусной кислотой в течение 30 сек., кислоту нейтрализовывали добавлением соответствующего обьема 2М нетитрованного Триса.

Выделение ДНК проводили по методу Higuclii (R.Higuchi H.Erlicli, 1989) с некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, взятой с EDTA в качестве антикоагулянта, смешивали п 1,5 мл микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф с 0,5мл лизируюшего раствора, состоящего из 0.32М сахарозы, 10 мМ Трис - HCI рН 7,5, 5мМ MgCI2 , 1% Тритона Х-100, центрифугировали в течение 1 мин. при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза промывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50мМ KCI, ЮмМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5мМ MgCI2 , 0,45% NP40, 0,45% Твина 20 и 250мкг/мл протеиназы К при 37°С в течение 20 мин. Инактивиропали протеиназу К кипячением в течение 5 мин в водяной бане. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при -20°С. Концентрация ДНК определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-минифлуориметре (Hoefer, США) составляла в среднем 50-100 мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 мин.

Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2мМ каждого дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), , 67мМ Трис-HCl рН 8,8, 2,5мМ MgCI2, 50мМ NaCl, 1мМ 2-меркаптоэтанол, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Концентрацию праймеров подбирали отдельно для каждой смеси. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "МС2" (АО "ДНК-Технология", Москва).

Детекцию продуктов амплификации и их идентификацию по длинам проводили в ультрафиолетовом свете (ЗЮнм) после электрофореза в течение 15 мин либо в 10% ПААГ, 29:1 при напряжении 500В либо в 3% агарозном геле при напряжение 300В ( в обоих случаях пробег составлял 3-4 см) и окрашивания бромистым этидием. В качестве маркера длин использовали перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp I.

Результаты исследований и их обсуждение.

Выбор метода SSP (sequence specific primers) в качестве основы для разработки системы быстрого рутинного генотипирования определялся прежде всего тремя критериями: I) при использовании метода SSP время затрачиваемое на анализ продуктов амплификации сведено к минимуму и ограничивается временем проведения обычного электрофореза; 2) SSP позволяет обеспечить необходимый и достаточный для практического применения в клинике уровень разрешения HLA-специфичностей; 3) метод SSP не требует применения дорогостоящих реагентов.

В то же время классический вариант метода SSP (рис.1) имеет два существенных недостатка - он весьма трудоемок, т.к. для каждой выявляемой специфичности необходима постановка отдельной ПЦР-реакции, и чувствителен к качеству ДНК. Последнее обуславливается тем, что для надежной детекции единичных нуклеотидных замен условия амплификации должны быть достаточно "жесткими", но в таких условиях

Рис. I. Классический вариант метола SSP

амгтлификлиия образцов ДНК низкого качества часто проходит не достаточно эффективно, и это может приводить к неловыявлению HLA-специфичностей. Предлагаемый в данной работе вариант метода SSP в значительной мере позволяет преодолеть указанные недостатки.

Основной особенностью разработанного метода является использование во время одной амплификации смеси из нескольких (до 9) праймеров различной специфичности (Mixture of Sequence Specific Primers). Праймсры выбирали так, что при амплификации различных аллелей генов HLA класса II образуются продукты различной длины. Такой смесью можно одновременно амплифицировать различные аллельные варианты исследуемого гена и идентифицировать их по положению PCR-продукта в обычном полиакриламилном геле. Таким образом, в отличие от

традиционного метода ЗБР, данный подход позволяет различать сразу несколько специфичностсй используя одну пробирку во время амплификации и одну дорожку на геле (рис 2).

Рис.2. Схема типировання локуса ОЯВ1 методом \1SSP

Вторым важным отличием предлагаемого метода ин.шсчси двухстадийная схема амплификации (рис 2). Несмотря на кажущееся усложнение, использование двух последовательных раундов амплификации позволяет значительно повысить надежность типирования и решить проблему "низкокачественных" образцов ДНК. Дело в том, что при типировании с помощью праймеров возникают два противоречащих друг другу требования. С одной стороны необходимо обеспечить надежную амплификацию любого образца ДНК, для чего условия амплификации должны быть максимально эффективными ("мягкими"). С другой стороны для обеспечения специфичности и надежной дифференцировки различных аллельных вариантов амплификация должна проходить в максимально "жестких" условиях. При использовании классического варианта 5БР амплификация проводится в один раунд и часто невозможно удовлетворить одновременно обоим требованиям, особенно в тех случаях, когда необходимо детектировать отличие в один нуклеотид. Используемая в данной работе схема двухстадийной амплификации позволяет решить проблемы надежной амплификации и специфичности независимо на различных стадиях.

Во время первого раунда используются праймеры "общей специфичности", амплифицирующие все аллели исследуемого гена. На этой стадии условия амплификации подбирали так, чтобы обеспечить максимальную эффективность и надежно амплифицировать любой образец ДНК. На втором раунде происходит собственно типирование с помощью смеси специфических праймеров в условиях, позволяющих различить однонуклеотидные замены.

Критерии выбора праймеров.

При разработке метода мультипраймерной ПЦР (МББР) возникают следующие важные критерии выбора праймеров : (¡) фрагменты, образующиеся при амплификации различных групп должны иметь достоверно различимую разницу длин (предлагаемые в данной работе смеси

праймеров обеспечивают разницу длин не менее 10%); (п) праймеры, образующие продукт определенной длины должны обладать достаточной специфичностью и амплифицировать только те аллели, которые принадлежат к соответствующей группе (ША-специфичности); (ш) ни какие два праймера входящие в смесь не должны образовывать димеры; (¡V) возможные дополнительные продукты амплификации должны лежать в диапазоне длин, отличном от диапазона специфических продуктов; (V) праймеры, входящие в смесь должны иметь максимально близкую эффективность отжига во время амплификации; (у1) при выборе праймеров и оптимизации их концентраций необходимо учитывать взаимное влияние реакций амплификации, которые могут одновременно идти в одной реакционной смеси.

Кроме специальных критериев необходимо также учитывать общие требования к выбору специфических праймеров, такие как:

а) ОС-состав. Одним из основных параметров праймеров является ОС-состав. При этом важны два момента. Во-первых, процентное содержание О/С пар сильно влияет на температуру плавления праймеров и, следовательно, на эффективность отжига. Во-вторых, при выборе праймеров лучше избегать монотонных по составу ОС-кластеров (например, поли-О), т.к. их гибридизационные характеристики мало предсказуемы, и праймеры, содержащие ОС-кластеры, часто обладают низкой специфичностью. Что касается первого замечания, то выравнивание праймеров по эффективности отжига в данной работе достигали за счет разницы длин праймеров и/или разницы концентраций праймеров в смеси. В то же время, в случаях, когда не удавалось избежать ОС-кластеров в праймеры вводили "слабые" мисматчи - Т/О или А/С (например праймер ОЯ_За, Ь и др.). Однако выбор праймеров с близким к 50% ОС-составом и равномерным распределением А/Т и О/С пар был наиболее предпочтительным.

б) Положение и количество мисматчей (под мисматчем понимается отличие праймера и матрица в один нуклеотид). Специфичность праймеров прежде всего определяется количеством и, положением мисматчей. И шестно

(S.Kwok и соавт. 1990, О.Загкаг и соавт. 1990), что при амплификации надежная детекция нуклеотидных замен, может быть достигнута лишь при соблюдении не менее одного из двух условий: 1) один или более мисматчей должны быть расположены непосредственно на 3'-конце праймера либо во второй позиций от З'-конца; 2) в средней части праймера должно быть не менее трех мисматчей. В остальных случаях эффективность отжига праймера может быть достаточной для детектируемой неспецифической амплификации.

в) Тип мисматча. Другим важным критерием является тип мисматча. Все возможные варианты мисматчей между праймером и матрицей можно условно разбить на три группы (Р.СоосЬпап и соавт., 1992) : ¡) "сильные", которые значительно дестабилизируют комплекс праймер/матрица, а, находясь в первом положении на З'-конце праймера, полностью блокируют амплификацию (к таким мисматчам относятся АД}, А/А, О/С и С/С); "средние", которые существенно понижают эффективность амплификации, но при определенных ("мягких") условиях могут допускать ложное праймирование (мисматчи С/Т и Т/Т); "слабые"- мисматчи, которые почти не влияют на эффективность амплификации (Т/С и А/С). При создании системы типирования важно избегать использования праймеров, специфичность которых определяется единичным "слабым" мисматчем.

г) Длина праймеров. Для обеспечения надежной амплификации любых образцов ДНК на первом раунде предпочтительно использование длинных (25-30 п.н.) праймеров, тогда как на втором раунде для обеспечения "жестких" условий амплификации длина праймеров должна быть в диапазоне 19-23 п.н., в зависимости от в/С состава. В некоторых случаях для обеспечения надежно детектируемой разницы длин продуктов амплификации праймеры удлиняли некомплементарным фрагментом от 4 до 26 п.н. (ОЯ_Юа, ОЯ_4а и др.)

Проблема дополнительных копий генов Н1А Другим моментом, существенно осложняющим создание системы типирования локуса НЬА класса II является наличие псевдогенов

(неэкспрессирующихся копий генов), а, в случае локуса ОЯВ, помимо псевдогенов, второго активного гена. Последовательности дополнительных копий генов НЬА класса II необходимо принемать во внимание при для обеспечения специфичности системы.

Названия праймероп Последовательность 5'-► 3'

1-й раунд

ОЯВ Беп ТСО ТГС ТТО ТСС ССС СЛС САС стт тс

ОЯВ а.«! САС стс всс ест осл сто тел лес тст

ОЯ3568я ССС АСА вСА СОТ ТТС ТГС ОАО ТАС Т

2-й раунд, смесь N1

ОЯ 8 ТСв ТТС ТТС ТСС ССС СЛС СА

ОЯ_1а АТС ТАС ТАС С/ГЛ САСО ТАТ ЛОЛ ТСС АТС ТТТ ССА ее

О И 2а ТОТ ТСА ТТО ААО ААА ТОЛ САС ТСС С

ОК4л АТв ТАС ТАС вАС ОТС СТА СТА ООТ ААОС АСО ТАС ТСС ТСТ ТО в ТО

ОЯ 7а ОАА ОАО ТСТ ТТС САО ОАА СТ

01* 9а в АС АСТ САА АСТ ТАТ ССТ ОСТ Т

01* 10а ОАТ ОСТ ОАС АСТ САА АСТ ТАЛ ССТ С

2-й раунд, смесь N2

ОЯ 812я ТТС ТТО ОАО ТАС ТСТ АСО вв

ОЯ 8а ААС АСО ТАС ТСС ТСТ ТОО ТТА ТА

ОЯ 12а ОТС ТОО ТТА ТОО ААО ГОТ СТС

ОЯ Зб.ч СТО ОАА САв ТСА ОАА ООА СС

ОЯ 14а ТОТ ССА ССТ ТвА ССС всс Т

ОЯ За ТАв САА ТАО ТТО ТСС ААС Свв С

01* вАС ЛвС ОАС ОТО ОТО ОАО ТТ

ОЯ 11а СТО ест ОТТ ССЛ СТА СТС СТ

Дополнительные праймеры (типиропание ОЯ15(2), ОШ6(2), ОЯ13(6)

0Я2 яеп ТСС ТОТ вве АО С СТА АвА ОО

0Я15 ая АСС всо ОСС ТОС ОСС ТОС Т

0Я16 ал ОТС САС САС ООС ОСС ССТ ОТС Т

ОЯ 13.ч ОТТ СТТ ООА СТА СТС ТАС ОТС

ОЯ 13а1 АОв ОСТ СТТ ССА СТА СТС вв

ОЯ 13а2 ОАС АТТ АО О ТОТ ССА ССО СОО

Табл.1. Последовательности гтраймеров для типирования локуса ГЖВ1.

!

Исходя из перечисленных критериев, были созданы смеси праймеров позволяющие типировать локус ОЯВ1 на уровне 14-ти субтипов и локус О0А1 на уровне аллелей. В случае локусов 0(}В1 и ОРВ1 расположение нуклеотидных замен не позволяет достоверно различать аллельные вариации по длинам продуктов амплификации.

Пара праймеров Специфичность Длина ПЦР-продукта

1-й раунд

DRB sen + DRB as Все аллели локуса DRB 247 пн

DR3568s + DRB as DR3, DR5, DR6, DR8 243 пн

2-й раунд, смесь N1

DR S + DR la DR1 117 пн

DR S + DR 2a DR2 (DR15, DR16) 66 пн

DR S + DR 4a DR4 145 пн

DR S + DR 7a DR7 96 пн

DR S + DR 9a DR9 48 пн

DR S + DR 10a DR10 53 пн

2-й раунд, смесь N2

DR 36s + DR 3a DR3 (DR17, DRI8) 58 пн

DR Us + DR 3a DR17 115 пн

- DR Us + DR Ua DRU (5) 71 пн

DR 812s + DR 12a DR12 (5) 86 пн

DR 3a + DR 14a DR14 (6) 50 пн

DR 812s + DR 8a DR8 98 пн

Дополнительные смеси Оптирование DR15(2), DR16(2), DR13(6)

смесь N3

DR2 «п + DR15 AS DR15 (2) 205 пн

смесь N4

DR2 sen + DR16 AS DR16 (2) 209 пн

смесь N5

DR 13s + DR 13al DR13, DR3 175 пн

DR_13s + DR_13a2 DRU, DR11(5) 221 пн

Габл.2. Специфичности пар праймеров и длины ПЦР-пролуктов (DRB1).

ОНВ Бен

РП_2а

РЯ 9а

РЯ.Юа

10 20 соттстаотссссса10слсот,Х"1ггготао<^осттА*оттто**тотсАТ|1ч|ст|гсААТо<асАсоо*осооа

< РЯ_7а_)

_РГЦа_

^_Рй_4а_

30 40

ттсовттостввлллалтосктстхтл&ссллаловдатссатососттсвхслвсалсатвовссхотАссв

ЫИ5 -------с-----с---#л-т----------а-------------------------------------т

БШБ -------С-----С----А-Т----------в--------------------------------------

ОЛ17 ------АС-----С----А-Т—С-------в------II-----------------------------Т

сяю -------С-----в----А-Т—С-------в------АА------------------------------

ОКИ -------С-----С----А-Т—I-----—I------II-----------------------------т

ОК12 -------А-----а---СА-Т—с-------о------ст-с---------------------------т

Ы(13 -------С-----С----А-Т—I-------1------1|-----------------------------1

0К14 -------С-----С----А-Т—С-------О------II-----------------------------1

ОК7 ---[А---С--------СГГ-Т—I--------в-------Т------------------------------

ОИ8 -------о-----С----А-Т—I-------------1-А------------------------------

от ------АТ---С-С---а--------------------АА------------------------------

РЯ10 -----------------С—О—С---------------А—С-----А---------------------

Рис. 3. Положение праймеров смеси №1 для типирования локуса ОЯВ1.

и - позиции, в которых сущесвуют различия между аллелями одного субтипа.

ШЖ - некомплементарныи участок праймера (введен для увеличения лины продукта амплификации).

I_РЙ_13б | ) Р0_12а_

I РВ_В125 ( ) Рй_8а_ | РЯ. 11 э

10 20 30 40

ссАСстттсттмлатлстстлсбТСталататслтттсттсмтввдлссвлтсшгствсмттсстод '

-И-

о»1» ---------------».»»».»»»♦♦-------«-«-----------------------------------1------------------------

ОН17 СК18

спи __

оке ------------------------во-------------------------------------------------------¡1------»-------—

РИ 13а1_! < РР1 13а2

Р^-^Зв 0р 14а

) РЯ 11а_! ^ РЯЗа_

50 СО 70 во

хаттссоо<иаотолсоа*остоов<иа<к:сталт<исалат*сггмхАСАОсслалАмхсхтсстоаААа^

ВН14 —«-------------------------------------3-------> I ♦ Иа----- ♦ I-----1----«—-------------------М—

ОХ18 ---А----------------------------------------------------------С-------ОС-ОЛ------в-СО--------А--------------------------И —

они---1--------------------------------¡ЛЯ-----------1-------«-------МИМ-----1-Н--------1---*-------------------1—М—

ОИ12 ---------------------------------тс-------с-------------------*-----------АО---1-----------------Т-------------------»-.....

ЧМ ---*----------------------------Ш—1---1--------------------1-----------АО-------1«-----------------------------------И —

Рис. 4. Положение праймеров смеси №2 для типирования локуса ОЯВ1. # - позиции, в которых сущесвуют различия между аллелями одного субтипа.

Типирование локуса ID RBI.

В соответствии с приведенными выше доводами о повышении надежности типирования, амплификации проводилась в два этапа. Во время первого раунда геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках (рис. 2). В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRB1 (праймеры DRB sen и DRB_as, табл.1), а во второй - пара праймеров амплифицирующая только аллели входящие в группы DR3, DR5, DR6, DR8 (праймеры DR_3568s и DRB_as, табл.1). В обоих случаях температурный режим амплификации (для термоциклера "МС2" с активным регулированием) был следующим:

1. 94°С - 1 мин.

2. 94°С - 20 сек. 1 60°С - 5 сек. J

3. 92°С - I сек. 1 65°С - 1 сек. J

7 циклов 28 циклов

Продукты амплификации первого раунда (в пробирке с праймерами DRB sen и DRB as продукт образовывался всегда, а в пробирке с праймерами DR_3568s и DRB as лишь в тех случаях, когда в образце присутствовал один из аллелей групп DR3, DR5, DR6, DR8) разводили в 10 раз и использовали на втором раунде в амплификации со смесями праймеров N1 и N2, соответственно. Последовательности праймеров, их положение, специфичности и длины ПЦР-продуктов, показаны в табл.1,2 и на рис.3,4.

При амплификации на втором раунде использовали следующий температурный режим:

! С£К- 1 12 «иклов 64°С - 1 сек. J

Примеры результатов разгонки в 10% ПААГ специфических продуктов .1М1Пификании второго раунда покакшы на рис.5 и б.

145

/> гЛ Л А 0°.0 Jb _NX О О О' v ^ v О О

Рис. 5. Результаты типирования локуса DRB1 методом MSSP (смесь N1)

х4

N

t N* Л /Л

Рис. 6. Результаты типирования локуса DRB1 методом MSSP (смесь N2)

Название Последовательность ( 5'—-► 3* )

1-й раунд

ООА Беп вСС ТСТ ТАТ ОСТ вТА ААС ТТО ТАС САв Т

РОА алп САв Свв ТАО АОТ ТвТ АОС вТТ ТАА ТСА

2-й раунд, смесь N1

ООА 1я СТО ССТ оос вот вое СТО Ав

ЭОЛ 1а.«; ОвТ ОСА СТО АСА ААС АТО вС

Э(}А 2я ОАО ОАА ООА ОАС ТО Г СТО ОА

ООА 2аб • ТОС ООО ТСА ААТ СТА АОТ СТО Т

ООА 35 ТОО ТСС СТС ТОО ОСА вТА САО

00А ЗаБ САА АТТ вСО ООТ САА АТС ТГС Т

ООА 456я вОТ ОТТ ТвС СТ О ТТС ТСА ОАС

ООА 46а5 АОв АТО ТТС ААв ТТО ТОТ ТТТ ОТ

ООА 45в ТАС ввТ ССС ТСТ (ЮС САО ТА

ООА 535 ОАО ТТО ТАв СОТ ТТА АТС АСА С

Дополнительные праймеры (2-й раунд)

ООА ЮОая ААА ССТ ССА ААТ ТТО СТО ААС ТС

ООА 10 и САТ ОАА ТТТ ОАТ вОА ОАТ ОАО в

ООА 102« САТ ОАА ТТТ ОАТ вОА ОАТ ОАО С

ООА 103$ АСО ОТС ССТ СТО ССС АОТ Т

Табл. 3. Последовательности праймеров для типирования локуса О0А1

Пара праймеров Специфичность Длина ПЦР-продукта

1-й раунд

ООА 5еп + ООА ах Все аллели локуса ООА 229 пн

2-й раунд, смесь N1

ООА 15 + ООА Ы ООА 1*0101/2/3/4 70 пн

ООА 25 + ООА 2а5 ООА 1*0201 57 пн

ООА Зв + ООА За5 О0А1*03011/12/2 128 пн

ООА 4565 + ООА 46а5 О0А1*0401, ООА 1*0601 88 пн

ООА 4565 + БОА 5ая ООА1*05011/12/13 106 пн

Дополнительные смеси (2- й раунд)

смесь N2

ООА 101.5 + О0А ЮОая ООА1*ОЮ1/4 92 пн

ООА ЮЗв + ООА 100а5 ООА1*ОЮЗ 115 пн

смесь N3

ООА 455 + ООА ЮОа.5 ООА1*ОЮ1/2/4 116 пн

ООА 1025 + ООА 100а5 ООА1*ОЮ2/3 92 пн

смесь N4

ООА 455 + ООА 46ая О0А1*0401 173 пн

смесь N5

ООА 1035 + ООА 46а5 ООА1*0601 172 пн

Табл. 4. Специфичности пар праймеров и длины продуктов ПЦР.

ООА 1035

ь

РОА-35 , , РОА_2з

I_РОА_5еп_^ | РОА_455 | РОА_101з

10 10 30 40 1-

ооа1 • о 1 о 1 / 4 оттосстсттоттетстАААСттотАССАОттттАсмтссстстатссАстАсдсс^тсААГТтеАтгаАаАТСА^

ООА1*ОЮ2 ------------------------------------------------------------------------------С______________________________I__-_____—

00*1»0103 ----------------------------------——--------------"Д-------------------------С_____________________X_________________

00X1*0201 ----------АС-------------------С--------------------т---------------------С-----------Т---------------—-----т-"-*

О0А1«0301/2 ----------АС-------------------С—-----------О------3------------------С-----------Т-------------------------Т----

00*1*0401 ---—---А—----—-———-~С—".----------------1---------------------с—с------------------а--------------Т—--Ч

□оа1*0501 —с-------а--------------------с----------------------------------------------с------------------а______________т——т

00*1 *0601 •»*»*••••*!»•!»»•«»#•»(»!»»•»••»••_£____________________—_____________________с _ _ _ с__________________О-______________Т____Г

С УА 2 —___ _ _ _ ______________________________ с _ _ ____ _ ____т——___________с___Л_______Т_____

_Р(ЭА_100аз_

1 ~ I __ РОА эбп

00 А-15 , _РОА_2а5 , РОА_1аз РОА_46а* *-

РОА 456«____РОА^Зав__7"1 РОА 5ав

-----О « ■ "—I « ■ I

50

00*1 «0101/4 мт<юссаодгтаю<ацмттааматгт£оАс^осА«от<га

00*1*0102--———-1----------------------------------------------------------------------------------------------------------

130А1*0103 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

00*1*0201 А--Т----СТ----С*—О-С—А— —-------*ТТ—------С------С------СТ------Т------------С---

00*1*0301/2 А—Т----СТ----С---а----»—«-1- и ----АТТ^------С------С------СТ------т------------а-—

СОА1*0401 -Т-Т---ТТС——АС|-----А— -----------АТТ--------С------С------А------------—С-1—

СОА1*0501 -Т-Т-----ТТС----АС-----А— -----------АТТ--------С------С-----ССТ------Т----------атс—

00*1 • 0 6 01 -Т-Т"—-ТТС——АС——А— -----------АТТ--------С------С—----А--------------------С—----------С-*•*••*•«•

О0 А2 А—Т----АТ---Т---------АТ- А--------------А-------------Т----------О--------С----О-АТ-------О-О—АО-С •*••••*•»•

Рис. 7. Положение праймеров для типирования локуса 0(}А1 методом \1SSP

В случае необходимости дифференцировки DR-специфичностей DRI5 и DR16, а также в некоторы случаях для подтверждения специфичности DR13, дополнительно ставили реакции ПЦР с праймеров, приведенными в табл.1.

Общее время типирования методом MSSP, включая стадию выделения ДНК и короткий (5-10мин.) электрофорез после первого раунда, составляло 2,5-3 часа.

Типирование локуса DQA1

Анализ аллелыюго полиморфизма показал, что метод мультипраймерной ПЦР может быть также эффективно использован для типирования локуса DQA1 на уровне аллелей. Последовательности праймеров для первого и второго раундов приведены в табл.3 и 4., положения праймеров показаны на рис.7. Условия амплификации были аналогичны используемым для типирования локуса DRB1.

Стандартизация разработанного метода MSSP.

Разработанный метод MSSP для типирования генов DQA1 и DRB был тестирован на международной стандартизованной панели ДН1< международного обмена (UCLA) в 1994г, а также в "слепом" тестировании i рамках Первого рабочего совещания по контролю качества лаборатори: тканевого типирования центральной Европы (1995) и XII Международного рабочего совещания - конференции по гистосовместимости (1996).

Клиническая апробация

Начиная с ноября 1995г. в Институте иммунологии МЗ РФ, согластно договору о научном сотрудничестве с Координационным центром органного донорства г.Москвы, осуществляется генотипирование методом \1SSP "листа ожидания", включающего перспективных реципиентов трансплантата почки московского региона. Кроме того, с февраля 1996г. метод МББР используется также для ургентного перспективного типирования доноров. За прошедший период проведено генотипирование более 400 перспективных реципиентов и более 60 доноров, причем средний индекс совместимости при совпадении не менее одной НЬА-БЯ специфичности составил 6,9, что значительно лучше ранее существовавшего значения равного »11.

ВЫВОДЫ

• I. Метод мультипраймерной ПЦР (МЗБР) может служить эффективной основой для создания системы типирования генов ОЯВ1 и О0А1 комплекса НЬА класса II.

2. При использовании метода МБ8Р полное время генотипирования локуса ОЯВ1 на уровне субтипов с момента забора крови составляет 2,5-3 часа, что позволяет успешно применять .этот метод для ургентного типирования доноров при подборе пар донор-реципиент при органной трансплантации.

3. Благодаря надежности, малой трудоемкости и низкой стоимости, метод М88Р может быть широко использован как в научных целях так и в клиническом тестировании для формирования групп риска заболеваний ассоциированных с локусом Н1А класса II, для подбора совместимых пар донор-реципиент, а также для задач, связанных с идентификацией личности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Undritsov I., Shepelev V., Trofimov D., Boldyreva M., Yakusheva L., Pavlitchenkov A., Oskina I., Timoshenkova I., Vasilov R., Khaitov R., Alexev L. Computer-assisted HLA-DNA typing with optimized sets of oligonucleotide probes - 11th International Histocompatibility Workshop and conference, Yokohama 1991 ,Abs. PS-F-3,pp. 110.

2. L.Alexeev, I.Undritsov, M.Boldyreva, D.Trofimov, L.Yakusheva, I.Oskina, A.Gritcenko, V.Yazdovski, R.Vasilov, R.Khaitov. Frequencies of class II-gene alleles in some Euroasian population groups - 8th International Congress of Immunology, Budapest, Hungary, August 23-28,1992, Abs. W-51-2, pp.300.

3. I.Undritsov, M.Boldyreva, D.Trofimov, L.Yakusheva, I.Oskina, L.Alexeev, I.Dedov, R.Vasilov, R.Khaitov. DQA,DQB- genotypes and IDDM susceptibility - 8th International Congress of Immunology, Budapest, Hungary,August 23-28, 1992, Abs.W-53-3, pp.313.

4. I.Undritsov, M.Boldyreva, D.Trofimov, V.Shepelev, L.Yakusheva, R.Vasilov, L.Alexeev. Optimized system for HLA class II genotyping - 8th Iternational Congress of Immunology , Budapest, Hungary, August 23-28, 1992, Abs.W-51-38, pp.306.

5. I.Undritsov, D.Trofimov, R.Vasilov, M.Boldyreva, L.Alexeev. HLA polimorphism in different population groups of the former USSR. Proceedings of the International Symposium on HLA in health and Disease: Current State of the Art, New Dehli, 1993

6. I. Undritzov, L. Yakusheva, M. Boldyreva, D. Trofimov, I. Dedov, I. Guskova, R. Vasilov, L. Alexeev. HLA-DQ genotypes and IDDM susceptibility.-12th European Immunology Meeting, 14- 17 June, 1994, Barcelona, Spain, W40-26, P.363.

7. R.Vasilov, L.Alexeev, L.Yakusheva, D.Trofimov, M.Boldyreva, I.Guskova, I.Undritsov. The peculiarity of distribution of the IDDM-associated HLA-DQ alleles in different population of the former SU.-International

Conference "The major histocompatibility complex in medicine". Adelaide, Australia, 1994, HLA, Immunogenetics and disease,Abs.N41.

8. L. Alexeev, M. Boldyreva, D. Trofimov, I. Undritzov, A.G.Dolbin. New variant of SSP trechnique for clinical application.- EurJ.of Immunogenetics.-

1995,- Vol.22.- No.l.- pp.87, Abs.261.

9. I. Undritzov, L. Yakusheva, M. Boldyreva, D. Trofimov, I. Dedov, I. Guskova, R. Vasilov, L. Alexeev, R. Khaitov. HLA-DQ genotypes and IDDM susceptibility.- Eur.J.of immunogenetics.- 1995.- Vol.22.- No.l.- pp.66, Abs.126.

10. D.Trofimov, M.BoIdyreva, I.Undritsov, I.Guskova, LAlexeev. New variant of SSP-DRB1 and DQA1 genotyping. - Human Immunology. - 1996.-Vol.47. - No.l-2. - p.101.

11. LAlexeev, A.Akopyan, M.BoIdyreva, D.Trofimov, I.Guskova, L.Pospe!ov, V.Yazdovsky, R.Khaitov. The diversity of the class II HLA allele frequencies in two ethnics - buriats and armenians.- Human Immunology. -

1996.-Vol.47. - No.l-2. - p.142.

12. R.Vasilov, LAlexeev, M.BoIdyreva, D.Trofimov, I.Undritsov, L. Yakusheva. The diabetogenic HLA DQ alleles in 3 Orient populations. - Human Immunology. - 1996.-Vol.47. - No.l-2. - p.154.

13. M.BoIdyreva, D.Trofimov, I.Guskova, I.Demidova, A.Zilov, I.Dedov, LAlexeev. HLA genetic markers of IDDM in buriat population. - Human Immunology. - 1996.-VoI.47. - No.l-2. - p.156.

14. И.М.Ундрицов, Алексеев JI.П., Якушева JI.M., Панличенков А.В., Зыков Ю.В., Трофимов Д.Ю. Разработка метода мультиплексного генотнпирования на модели HLA-локуса человека - I Всесоюзная планово-отчетная конференция "Генная и клеточная инженерия", 1991, г.Пущино-на-Оке,тезисы докладов стр.6.

15. И.М.Ундрицов, М.Н.Болдырева, Л.П.Алексеев, Д.Ю.Трофимов, Л.М.Якушева, С.ВЛучин, И.А.Оськина, А.В.Гриценко, В.В.Шепелев, И.В.Тимошенкова, С.Г.Фесько. Разработка метода мультиплексного генотнпирования на модели HLA-локуса человека - II Всесоюзная планово-

отчетная конференция "Генная и клеточная инженерия", 1992, г.Пущино-на-Оке,тезисы докладов стр.54.

16. Алексеев Л.П., Ундрицов И.М., Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю., Якушева Л.М., Гуськова И.А., Василов Р.Г. Аллельный полиморфизм генов II класса НЬА у 4 популяций различной расовой принадлежности. Иммунология, - 1994, - N5,- стр.18-21.

17. Л.П.Алексеев, М.Н.Болдырева, Р.Г.Василов, Д.Ю.Трофимов, И.М.Ундрицов, Р.М.Хаитов, Л.М.Якушева, В.В.Яздовский. Молекулярно-генетические подходы к изучению системы Н1А: новые возможности в фундаментальных и прикладных исследованиях. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994,- N10, - стр.436-439.

18. И.М.Ундрицов, Л.М.Якушева, И.И.Дедов, М.Н.Болдырева, Д.Ю.Трофимов, И.А.Гуськова, И.В.Тимошенкова, Р.Г.Василов, Л.П.Алексеев. НЬА-ОСЗ генотипы и предасположенность к инсулин-зависимому сахарному диабету. Иммунология, - 1995. - N2, - стр. 18-23.