Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Особенности аллельного полиморфизма генов HLA II класса в здоровой популяции Санкт-Петербурга и у больных тяжелой апластической анемией

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ

УДК 612. 118. 221. 2: 616. 155. 194. 7 (470.2) На правах рукописи

Капустин Сергей Игоревич

ОСОБЕННОСТИ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ НЬА II КЛАССА В ЗДОРОВОЙ ПОПУЛЯЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА И У БОЛЬНЫХ ТЯЖЕЛОЙ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИЕЙ

14.00,29 - гематология и переливание крови

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

М.Н. Блинов

доктор медицинских наук Л.Н. Бубнова

Санкт-Петербург -1998 г.

1. ВВЕДЕНИЕ.

Достигнутые за последние годы успехи в лечении целого ряда тяжелых заболеваний системы крови во многом связаны с применением современных технологий, в том числе, аллогенной трансплантации костного мозга (АТКМ). Совместимость донора и реципиента по антигенам (АГ) системы HLA (human leucocyte antigens) является обязательным условием при подборе донора костного мозга для проведения АТКМ. Это в равной степени относится как к AT HLA I класса (HLA-A, -В, -С), так и к АГ HLA II класса (DR, DQ, DP), поскольку каждый из перечисленных антигенов обладает высокой иммуногенностыо и способен стать причиной таких осложнений АТКМ, как отторжение трансплантата и РТГТХ (реакция "трансплантат против хозяина") Подобрать совместимого по антигенам системы HLA донора удается чаще всего среди ближайших родственников больного, а для однояйцовых близнецов вероятность HLA-идентичности составляет теоретически 100 %. Тем не менее, на практике число больных, имеющих HLA-идентичного сиблинга, не превышает 30-35 % пациентов, которым показана АТКМ (Бубнова JI.H. с соавт., 1995).

В связи с этим, в последние годы широкое распространение получает трансплантация костного мозга, полученного от неродственного индивида. Однако, в этом случае качественный подбор донора представляет серьезную проблему, что связано, прежде всего, с чрезвычайно высокой полиморфностью HLA-комплекса. Наличие для каждого из АГ HLA значительного числа различных изоформ (специфичностей) обусловливает уникальность HLA-фенотипов в популяции. Таким образом, о реальности проведения "неродственных" АТКМ можно говорить лишь при наличии значительного числа индивидов, потенциально готовых стать донорами костного мозга

* На сегодняшний день во многих развитых странах существуют регистры, содержащие информацию о десятках тысяч типированных по системе НЬА потенциальных доноров костного мозга (Зарецкая Ю.М., 1998). Обмен информацией между различными регистрами позволяет увеличить шансы на успех при поиске донора с определенным НЬА-фенотипом. Эффективность такого сотрудничества во многом зависит от генетической общности рассматриваемых популяций, которая определяется, в частности, степенью совпадения НЬА-профилей в этих группах. Наличие отличительных особенностей в распределении аллелей генов НЬА и их гаплотипических сочетаний у представителей разных рас, национальностей и жителей отдельных регионов может служить в ряде случаев серьезным препятствием для успешного взаимодействия донорских регистров. Таким образом,

^ популяционные исследования, посвященные изучению характера

распределения НЬА-профилей, представляют не только научный интерес, но и имеют огромное практическое значение, поскольку позволяют прогнозировать эффективность таких контактов как внутри страны, так и за ее пределами.

В течение длительного периода времени единственным подходом к идентификации полиморфизма АГ НЬА в рутинной практике оставались различные методы классической иммунологии. На основе серологического типирования были получены данные об особенностях полиморфизма АГ НЬА-А, -В, -С и В11 в здоровой популяции Санкт-Петербурга (Бубнова Л.Н. с соавт., 1995). Однако, в отличие от АГ НЬА I класса, использование серологических методов для идентификации специфичностей АГ НЬА II класса является, на сегодняшний день, недостаточным. Это связано с довольно высоким процентом ошибочных результатов, получаемых с помощью данных методов, а также с невозможностью определения всего спектра полиморфных детерминант

* (Блинов М.Н. с соавт., 1994; МуЫшеов 5. е1 а1., 1990). Альтернативой серологическому типированию являются методы молекулярной генетики,

•» позволяющие идентифицировать полиморфизм АГ HLA на уровне ДНК.

Открытие технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) привело к тому, что к настоящему времени молекулярно-биологические подходы прочно вошли в клиническую практику типирования AT HLA П класса. Более того, использование ДНК-типирования для идентификации полиморфизма антигенов HLA-DR, -DQ и -DP является официальным требованием Евротранспланта при рассмотрешш вопроса об аккредитации регистра типированных доноров. Таким образом, внедрение современных методов типирования антигенов HLA и изучение на их основе популяционных особенностей аллельного полиморфизма соответствующих генов является, на сегодняшний день, одной из актуальных задач на пути повышения эффективности АТКМ как метода лечения целого ряда гематологических заболеваний. ^ Наряду с трансплантологией, важной областью клинического применения

HLA-типирования является изучение заболеваний иммунопатологической природы. К настоящему времени известен широкий спектр заболеваний, для каждого из которых установлена ассоциация с определенным HLA-маркером, т.е. серологической специфичностью какого-либо антигена HLA. Применение методов ДНК-типирования позволило конкретизировать маркеры генетической предрасположенности к некоторым HLA-ассоциированным заболеваниям, а также выдвинуть новые гипотезы о возможных путях вовлечения антигенов HLA в патогенетические механизмы становления некоторых болезней (Nepom G.T. and Erlich Н., 1991).

Тяжелая апластическая анемия (АА) является одним из наиболее сложных, с точки зрения этиологии и патогенеза, заболеваний системы крови. Успешное лечение некоторых случаев АА с помощью иммуносупрессивной терапии позволило сделать предположение о вовлечении иммунных ♦ механизмов в патогенез АА, которое было подтверждено позднее обширными

клиническими данными, а также результатами экспериментов in vitro. Анализ

• данных литературы, посвященной изучению возможной ассоциации АА с комплексом НЬА, показал, что наиболее часто исследователи обнаруживают увеличение частоты встречаемости антигена в группе этих больных (СЬаршз В. а!., 1986; №тег Б.О. е! а1., 1994). Некоторые авторы высказывают тезис о зависимости между ответом больных АА на специфическую иммуносупрессивную терапию и НЬА-фенотипом (Яи^ап Р.Р.е1 а1., 1990; Какао et а!., 1992а). Однако, следует отметить, что в большинстве работ статистическая достоверность этих предположений оставалась недоказанной, что связано, в основном, с небольшой численностью обследованных в каждом случае. Молекулярно-генетическое типирование АГ НЬА П класса у больных АА было использовано только в работах японских авторов (Ыакао 8. е( а1., 1994; Иакао 8. & а!., 1996).

^ Имеющиеся данные об особенностях полиморфизма антигенов НЬА П

класса у больных АА, с одной стороны, представляют большой научный интерес, а с другой стороны, являются совершенно недостаточными для ответа на вопрос о значимости их клинического использования. Это свидетельствует о важности проведения более тщательного анализа полиморфизма АГ НЬА II класса у больных АА на основе современного метода ДНК-типирования и сопоставления его результатов с некоторыми клиническими особенностями течения заболевания.

Цель и задачи ¡работы:

Пель работы:

Изучить с помощью высокоразрешающего метода ДНК-типирования аллельный полиморфизм генов НЬА II класса у больных тяжелой апластической анемией и в здоровой популяции Санкт-Петербурга и на основании полученных

• данных:

# а) выявить НЬА-маркеры генетической предрасположенности к тяжелой

апластической анемии, а также взаимосвязь между характером течения заболевания и особенностями НЬА-генотипа;

б) оценить с позиции иммуногенетики возможность эффективного сотрудничества с зарубежными регистрами доноров костного мозга с целью подбора доноров для проведения "неродственных" АТКМ.

Задачи работы:

1. Провести анализ распределения аллелей генов НЬ А-БИВ1, -ЭС>А1, -О0В1, -ОРВ1, а также их гаплотипических сочетаний в здоровой популяции Санкт-Петербурга в сравнении с аналогичными данными для некоторых других популяционных групп.

2. Изучить особенности распределения аллелей генов НЬА-ОКВ1, -1Х^А1, -1Х2В1, -ОРВ 1, их гапло- и генотипических сочетаний у больных тяжелой апластической анемией с целью установления НЬА-маркеров генетической предрасположенности к данному заболеванию.

3. Проанализировать коррелятивные связи между некоторыми клиническими особенностями течения тяжелой апластической анемии и НЬА-генотипом больных для определения возможности использования данных типирования антигенов НЬА П класса в прогностических целях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Распределение аллелей генов НЬА-ОКВ1, -ЕХ^А!, -ЕХ}В1, -ОРВ1 и их гаплотипических сочетаний в здоровой популяции Санкт-Петербурга, в целом, соответствует аналогичным данным для лиц европеоидной расы. Вместе с тем, изученной группе присущ ряд специфических особенностей, в частности, ^ чрезвычайно высокий полиморфизм гена ЭЯВ1, а также значительное число гаплотипов с "необычным" характером сцепления генов НЬАII класса.

• 2. Для обеспечения эффективной работы донорских регистров в Северо-Западном регионе России с целью проведения "неродственных" АТКМ целесообразным является максимальный охват жителей региона в качестве потенциальных доноров костного мозга, сотрудничество с аналогичными регистрами стран Европы и США, а также использование для типирования антигенов НЬА П класса современных "высокоразрешающих" методов молекулярной биологии.

3. Распределение аллелей генов НЬА П класса, их галл о- и гено-тииических сочетаний у больных тяжелой апластической анемией имеет ряд характерных отличий как в труппе больных в целом, так и у лиц с высокой скоростью прогрессии заболевания.

4. Эффективность лечения больных тяжелой апластической анемией с ^ помощью ЦА коррелирует с НЬА-ОЯВ1 генотипом.

Научная новизна:

В ходе выполнения диссертационного исследования впервые проведен анализ аллельного полиморфизма генов НЬА П класса в здоровой популяции Санкт-Петербурга на основе современного метода ПЦР-генотипирования. При обследовании группы 200 доноров выявлен ряд характерных особенностей в распределении аллелей генов НЬА II класса и их гаплотипических сочетаний, а именно:

• определен спектр основных аллельных вариантов генов НЬА-ОКВ1, -ГХ^А! ,-ВС>В 1 ,-ОРВ 1, встречающихся среди жителей Санкт-Петербурга с частотой не менее 0,25%.

• выявлен ряд редких аллелей гена ОЯВ1, среди них - ОЯВ1*0407, *0410, 01Ш1*1405, »1406, »1414, »1415.

* » установлены особенности распределения наиболее характерных для популяции Санкт-Петербурга трехлокусных гаплотипов ОЛВ1 -БрА 1 -1Х}В 1.

• выявлено значительное число двух- и трехлокусных гаплотипов с "необычным" для кавказоидов характером сцепления генов НЬА-ОК/ОС) области, в том числе, специфических для изученной популяционной группы.

Впервые получены данные об особенностях распределения аллелей генов НЬА II класса, их гапло- и генотипических сочетаний у больных тяжелой апластической анемией - представителей Северо-Западного региона России. Установлено, что генотип 0112-1X^1*0102 / ОЯВ! *11-0()А1 *05 О ЫХ^В1*0301 характеризуется максимальным относительным риском развития АА у представителей Северо-Западного региона России. Показано, что гаплотип ОЯВ1*15-Е)ОА1*0102-0(2В1*0602 ассоциирован с более поздним дебютом заболевания; напротив, групповая специфичность ОЯВ1*13 встречается, преимущественно, у больных детского возраста.

Показано, что типирование гена ОИВ1 у больных тяжелой апластической анемией может быть использовано в прогностических целях, поскольку:

• характер ответа больного на терапию циклоспорином А коррелирует с его ОИВ1 -генотипом.

• наличие в генотипе больного групповой специфичности 011В1*04 достоверно ассоциировано с высокой скоростью прогрессии заболевания.

Практическая значимость:

1. Данные о распределении аллелей генов НЬА-ОКВ1, -ОС?А1, -1Х)В1, -ОРВ1 и их сочетаний в здоровой популяции Санкт-Петербурга могут быть использованы в качестве контрольных при изучении НЬА-ассоциированных патологий.

2. Полученные в результате исследования данные о генотипах НЬА П класса у кадровых доноров РосНИИГТ включены в состав Республиканского регистра и Объединенного регистра типированных доноров.

¥ 3. Данные об особенностях аллельного полиморфизма генов НЬА II

класса в здоровой популяции Санкт-Петербурга могут быть использованы для прогнозирования эффективности контактов Республиканского регистра типированных доноров с аналогичными регистрами внутри страны и за рубежом с целью подбора неродственных доноров для проведения АТКМ.

4. Результаты НЬА-ОКВ! генотипирования у больных АА могут быть использованы в гематологических клиниках с целью прогнозирования ответа на терапию циклоспорином А и выявления группы повышенного риска.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Ш Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996), 4-ой международной конференции "Спид, рак и ^ родственные проблемы" (Санкт-Петербург, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 25 таблицами. Список литературы включает 202 публикации.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Общая характеристика структурно-функциональной организации HLA-комплекса.

Главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex, МНС - англ.) является одной из наиболее сложных и полиморфных систем генома позвоночных. Главный комплекс гистосовместимости у человека (чаще для его обозначения используется аббревиатура HLA - human leucocyte antigens) локализован на коротком плече 6-ой хромосомы (6р.21.31 - 6p.21.33), занимая значительную ее часть - около 4106 пар нуклеотидов (п.н.) (Francke U. and Pellegrino M.А., 1977). Комплекс HLA образован группой тесно сцепленных генов, наследуемых, как правило, вместе и образующих, таким образом, единую генетическую систему (Bodmer W.F, and Bodmer J.G., 1978).

В HLA-комплексе условно выделяют 3 отдельные области, в состав которых входят, соответственно, гены I, И и Ш классов. Область генов HLA I класса, кодирующих а-гтолштептидные цепи классических антигенов тканевой совместимости (HLA-A, -В, -С), расположена наиболее близко к теломере 6-ой хромосомы, р-полипептидная (легкая) цепь антигенов HLA I класса - рг-микроглобулин, кодируется геном, расположенным на 15-ой хромосоме, т.е. вне HLA-комплекса. В норме антигены HLA I класса экспрессированы на мембране всех ядросодержащих клеток человека (Шабалин В.Н., Серова Л.Д., 1988). С иммунологической точки зрения, их главная функция заключается в представлении эндогенных антигенных детерминант на поверхность клетки, с целью их последующей идентификации определенными иммунокомпетентными клетками - С08-позитивными Т-лимфоцитами (Townsend A. and Bodmer H., 1989).

Помимо генов HLA-A, -В и -С, в области HLA I класса картированы гены HLA -Е, -F и -G, кодирующие а-цепи белковых продуктов, обладающих,

и

возможно, некоторыми функциями, характерными для классических трансплантационных антигенов. В отличие от генов HLA-A, -В и -С, гены -Е, -F и -G характеризуются меньшей степенью разнообразия аллельных форм и тканеспецифической экспрессией. Антигены HLA -Е, -F и -G играют, по-видимому, важную роль для достижения иммунной толерантности на ранних сроках постэмбрионального развития (Carosella E.D. et al., 1996).

Наиболее удаленной от теломеры 6-ой хромосомы частью HLA-комплекса является так называемая HLA-D область, занимающая примерно 106 п.н. геномной ДНК, т.е. 25% всего HLA-комплекса (Hardy D.A. et al., 1986). Функциональное значение HLA-D области определяется, прежде всего, наличием в ней генов, кодирующих а- и Р-полипептидные цепи антигенов HLA II класса (DR, DQ, DP). В отличие от антигенов HLA-A, -В и -С, конститутивная экспрессия антигенов HLA II класса наблюдается лишь на определенных иммунокомпетентных клетках - макрофагах, зрелых В-лимфоцитах, активированных Т-лимфоцитах (Kaufman J.F. et al., 1984). Однако, при определенных условиях экспрессия AT HLA II класса может быть индуцирована на эпителиальных, эндотелиальных и некоторых других клетках (Nickoloff B.J. and Turka L.A., 1994).

Другое функциональное отличие молекул HLA-DR, -DQ, -DP от антигенов HLA I класса состоит в том, что представляемые ими на клеточную поверхность антигенные детерминанты образованы, как правило, в результате гидролиза экзогенных, т.е.