Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:HLA-ДНК генотипирование в клинике трансплантации аллогенной почки (иммунологические и организационный аспекты)

Г;-.

А- На правах рукописи

СЕЧКИН Александр Васильевич

НЬА-ДНК ГЕНОТИПИРОВАНИЕ В КЛИНИКЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННОЙ ПОЧКИ (ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ)

14.00.36 - Аллергология и иммунология 14.00.33 - Социальная гигиена и организация здравоохранения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1998 г.

Работа выполнена в ГНЦ Институте иммунологии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Л.П. АЛЕКСЕЕВ Доктор медицинских наук, профессор В.З. КУЧЕРЕНКО

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор А.А. ЯРИЛИН

Доктор медицинских наук, профессор B.C. ПРЕОБРАЖЕНСКАЯ

ущая организация

Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится " 25 " ноября 1998г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 115478, г.Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан "_"_ 1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Л.С.Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Одним из наиболее ярких проявлений внедрения иммунологии и, в частности, такого ее направления как иммуногенетика, является разработка методов подбора тканесовместимых доноров и реципиентов. Именно это в первую очередь обеспечило развитие клинической трансплантологии практически во всех странах мира. Так в наиболее массовом виде трансплантации — пересадке почки сегодня участвуют почти 600 центров, которыми на сегодняшний день выполнено более 400 тысяч трансплантаций (J.M.Cecka, P.J.Terasaki, 1997).

При этом следует отметить, что годовая выживаемость трансплантатов почки уже в конце 80-х годов в передовых трансплантационных центрах мира, входящих в международные программы по обмену тканесовместимыми трансплантатами, приблизилась к 90%, а десятилетняя выживаемость — к 60%.

Достижения фундаментальной иммуногенетики человека последнего десятилетия, в первую очередь, в области молекулярной генетики главного комплекса тканевой совместимости человека — (системы HLA) и в частности, разработка и совершенствование метода HLA-DNA генотипирования не только кардинально расширили представления о системе HLA, но и открыли совершенно новые возможности в практическом использовании этих достижений в трансплантологии.

К настоящему времени это особенно ярко проявилось при пересадке костного мозга «не родственного происхождения», где благодаря внедрению метода HLA-DNA генотипирования, эффективность трансплантации возросла почти в 8 раз (J.Hansen, 1997).

Однако, в клинике пересадки почки метод HLA-DNA генотипирования до настоящего времени еще не нашел широкого

использования в России, и для этого существует целый ряд объяснений.

Во-первых, время генотипирования должно быть, во

всяком случае, не больше чем время «классического» серотипирования, а это возможно при использовании отнюдь не всех распространенных до настоящего времени методов ША-БИА генотипирования.

Во-вторых, важным обстоятельством явилась значительно более высокая себестоимость нового метода, включая стоимость наборов коммерческих диагностикумов и принципиально нового оборудования для постановки реакции полимеразной цепной реакции (ПЦР) - основы НЬА-ДНК-типирования.

И, наконец, для клиницистов-трансплантологов имел значение тот факт, что до настоящего времени абсолютное большинство работ, доказывающих более высокую, по сравнению с серологическими методами, эффективность ША-БЫЛ-селекции, были выполнены на ретроспективном материале, что традиционно имеет более низкую доказательность для клиницистов.

Все вышесказанное, естественно, относится и к нашей стране, где до настоящего исследования не было проведено ни одной работы, посвященной использованию НЬА-ОЫА-генотипирования, как при ретроспективной, так и перспективной селекции органных доноров.

Таким образом, можно сказать, что к моменту настоящего исследования как в отечественной, так и зарубежной клинической трансплантологии сложился «определенный замкнутый круг», при котором отсутствие клинических данных, в первую очередь, при перспективной селекции доноров приводило к отсутствию должного внимания к методу НЬА-ОНА-генотипирования, уже зарекомендовавшему себя при трансплантации костного мозга и открывающему принципиально новые возможности в трансплантации солидных органов..

Исходя из вышесказанных соображений, являлось целесообразным провести исследование, посвященное изучению возможностей использования метода НЬА-ОЫА-генотипирования в условиях работы трансплантологической службы г.Москвы, являющейся крупнейшей в России. Данная трансплантологическая служба с 1995 года в соответствии с законом РФ о трансплантации органов и/или тканей, принятом в 1993 году, работает на принципиально новой структурной основе, которая включает в себя независимый координационный центр органного донорства, осуществляющий не только забор органов и НЬА-типирование доноров, но и их селекцию и распределение, на основе последнего, по 9 трансплантологическим центрам г.Москвы, где находятся НЬА-типированные реципиенты, входящие в лист ожидания г.Москвы и Московской области.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Данная работа ставила перед собой следующие цели: осуществить выбор из числа существующих в настоящее время методов HLA-DNA генотипирования наиболее полно соответствующий условиям клиники трансплантации солидных органов с учетом особенностей развития клинической трансплантологии в России; установить степень эффективности селекции пар донор-реципиент по специфичностям Н1-А-ОКВ1 гена, выявляемым с помощью HLA-DNA генотипирования; на основании полученных данных предпринять попытку оптимизации программы, применяемой в компътерной практике, практической селекции тканесовмесгимых доноров.

Для достижения поставленных целей предполагалось решение следующих задач:

1. Исходя из современного состояния трансплантологической службы России, провести выбор метода НЬА-ОЫА генотипирования, адекватного для клинической трансплантологии по своей эффективности, технической

доступности, себестоимости при наличии официального лицензирования МЗ РФ.

2. Провести сравнительное исследование (технической эффективности ДНК и серологического НЬА-ОЯ типирования).

3. Осуществить Н1А-ОЯВ1 генотипирование реципиентов, входящих в лист ожидания Московского координационного центра органного донорства (700 чел).

4. Исследовать распределение Н1_А-011В1 специфичностей в контрольной группе — здоровой московской популяции.

5. Провести ретроспективный анализ для установления эффективности трансплантаций в НЬА-ОШМ-несовместимой группе донор-реципиент.

6. Провести анализ эффективности трансплантации почки в группах с различной степенью НЬА-БКВ1 совместимости при перспективной селекции на основе Н1А-ОЫА генотипирования.

7. Создать и апробировать новую структуру - трансплантологической службы — лабораторию НЬА-БЫА

селекции тканесовместимых доноров, перспективную как для использования в других трансплантационных центрах России, так и при создании национальной трансплантационной программы.

8. Разработать организационные мероприятия, способствующие эффективному использованию возможностей НЬЛ-БИА генотипирования в практической трансплантологии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые установлена возможность для повышения выживаемости аллогенных трансплантатов почки использования в селекции донора эффекта НЬА ОЯВ1 гомозиготности реципиентов и доноров трансплантата.

Разработана принципиально новая компьютерная программа для более эффективной селекции пар донор-реципиент на основе HLA DNA-DRB1 генотипирования.

Установлено двукратное увеличение количества HLA DRB1 гомозигот среди реципиентов аллотрансплантата почки, что открывает принципиально новые возможности для клинической трансплантологии и разработки проблемы «HLA и болезни».

Выбрана, апробирована и внедрена оптимальная для условий Москвы и России система HLA DNA —DRB1 генотипирования (фирма ДНК-технология, лицензированная МЗ РФ).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые в клинике трансплантации почки.установлен уровень преимущества в эффективности выявления HLA специфичностей методом HLA-DNA генотипирования, по сравнению с серологическим HLA типированием.

Впервые, благодаря использованию HLA-DNA генотипирования, в России достигнута эффективность трансплантации почки, превышающая таковую в передовых трансплантологических центрах мира.

Разработана новая организационная структура HLA типирующей лаборатории, использующей различные методы HLA селекции донора в трансплантационном центре.

Впервые получены данные об абсолютном приоритете специфичностей HLA класса II, по сравнению с классом I, при селекции донора в трансплантационных центрах с "коротким" листом ожидания.

ПУБЛИКАЦИИ.

Материалы диссертации опубликованы в 8 печатных работах, изданных в России и за рубежом, а также доложены на: 11th European Congress of Histocompatibility, 2-5 April 1997, Budapest; The 4Ih International Society for Organ Sharing Congress, Washington DC, July 8-

13. 1997; I Всероссийский съезд по трансплантологии и искусственным органам, 8-10 октября 1998 года, г.Москва.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на полстраницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, указатель цитируемой литературы. Содержит 12 таблиц и 8 рисунков. Библиография состоит из 105 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалом диссертации явились результаты, полученные при HLA DNA генотипировании следующих групп: 272 реципиента, которым была проведена аллотрансплантация почки, 828 реципиентов, входящих в «лист ожидания», 488 доноров трансплантата почки (трупного происхождения) и 130 «здоровых» представителей популяции г.Москвы.

Серологическое тканевое типирование, проведено на основе микролимфоцитотоксического теста (Kissmejer-Nelsen, Thorsby 1971), в модификации лаборатории иммуногенетики (Ю.М.Зарецкая, А.Г.Долбин 1975 г.). Лимфоциты для постановки указанного теста выделяли из дефибринированной и гепаринизированной крови в градиенте плотности верографин-фикола по Воут (1968 г.). При типировании использовалась "панель" высокоспецифических иммунных анти-HLA сывороточных образцов (88-116) производства фирмы GTI (США). Применялся «батарейный» метод, когда для выявления каждого антигена использовались 2-4 сыворотки, благодаря которому открывался практически полностью спектр антигенов серологических сублокусов HLA (34-38) Интенсивность цитотоксического теста оценивалась визуально под микроскопом с увеличением 10x20.

Выделение ДНК проводили по методу Higuchi (R.Higuchi Н.Erlich, 1989) с некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, взятой с EDTA в качестве антикоагулянта, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф с 0,5мл лизирующего раствора, состоящего из 0,32М сахарозы, 10 мМ Трис -HCl pH 7,5, 5мМ MgCl2 , 1% Тритона Х-100, центрифугировали в течение 1 мин. при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза промывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50мМ KCl, ЮмМ Трис-HCl pH 8,3, 2,5мМ MgCl2 , 0,45% NP40, 0,45% Твина 20 и 250мкг/мл протеиназы К при 37"С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К кипячением в течение 5 мин в водяной бане. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при -20°С. Концентрация ДНК определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-минифлуориметре (Hoefer, США) составляла в среднем 50-100 мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 мин.

Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2мМ каждого дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), , 67мМ Трис-HCl pH 8,8, 2,5мМ MgCl2, 50мМ NaCl, 1мМ 2-меркаптоэтанол, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Концентрацию праймеров подбирали отдельно для каждой смеси. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "МС2" (АО "ДНК-Технология", Москва).

Детекцию продуктов амплификации и их идентификацию по длинам проводили в ультрафиолетовом свете (ЗЮнм) после электрофореза в течение 15 мин либо в 10% ПААГ, 29:1 при напряжении 500В, либо в 3% агарозном геле при напряжение 300В ( в обоих случаях пробег составлял 3-4 см) и окрашивания бромистым

этидием. В качестве маркера длин использовали «перевар» плазмиды pUC19 рестрикгазой Msp I.

Основной особенностью использованного при HLA-DNA DRB1 генотипировании метода (Д.Ю.Трофимов, 1996; Л.П.Алексеев и др. 1995) является использование во время одной амплификации смеси из нескольких (до 9) праймеров различной специфичности (Mixture of Sequence Specific Primers). Праймеры выбирали так, что при амплификации различных аллелей генов HLA класса II образуются продукты различной длины. Такой смесью можно одновременно амплифицировать различные аллельные варианты исследуемого гена и идентифицировать их по положению PCR-продукта в обычном полиакриламидном геле. Таким образом, в отличие от традиционного метода SSP, данный подход позволяет различать сразу несколько специфичностей используя одну пробирку во время амплификации и одну дорожку на геле

Используемая в данной работе схема двухстадийной амплификации позволяет решить проблемы надежной амплификации и специфичности независимо на различных стадиях.

Таблица!

Специфичности пар праймеров и длины ПЦР-продуктов (DRB1).

Пара праймеров Специфичность Длина ПЦР-продукта

1-й раунд

DRB_sen + DRB_as Все аллели локуса DRB 247 пн

DR3568s + DRBas DR3, DR5, DR6, DR8 243 пн

2-й раунд, смесь N1

DR_S + DR_la DR1 117 пн

DR_S + DR_2a DR2 (DR15, DR16) 66 пн

DR_S + DR_4a DR4 145 пн

DR_S + DR_7a DR7 96 пн

DR_S + DR_9a DR9 48 пн

DR_S + DR_10a DR10 53 пн

2-й раунд, смесь N2

DR_36s + DR_3a DR3 (DR17, DR18) 58 пн

DR_1 Is + DR_3a DR17 115 пн

DR_1 Is + DR_lla DR11 (5) 71 пн

DR_812s + DR_12a DR12 (5) 86 пн

DR_3a + DR_14a DR14 (6) 50 пн

DR_812s + DR_8a DR8 98 пн

Смесь N3

DR2_sen + DR15_AS DRI5 (2) 205 пн

Смесь N4

DR2_sen + DR16_AS DR16 (2) 209 пн

Смесь N5

DR_13s ' + DR_13al DR13, DR3 175 пн

DR_13s + DR_13a2 DR13, DR11(5) 221 пн

Во время первого раунда используются праймеры "общей специфичности", амплифицирующие все аллели исследуемого гена. На этой стадии условия амплификации подбирали так, чтобы обеспечить максимальную эффективность и надежно амплифицировать любой образец ДНК. На втором раунде происходит собственно типирование с помощью смеси специфических праймеров в условиях, позволяющих различить однонуклеотидные замены.

Исходя из перечисленных критериев, были созданы смеси праймеров, позволяющие типировать локус ОЯВ1 на уровне 14-ти субтипов и локус Б(5А1 на уровне аллелей. В случае локусов 0<ЗВ1 и БРВ1 расположение нуклеотидных замен не позволяет достоверно различать аллельные вариации по длинам продуктов амплификации.

Подбор тканесовместимых пар донор-реципиент осуществлялся с помощью компьютерной программы, основанной на вычислении индекса совместимости. Индекс совместимости (ИС) определялся в соответствии с данными, приведенными в табл.2,, ранее представленной в «руководстве по трансплантологии» под ред.В.И.Шумакова (Москва, 1995 год). Расчет по таблице N2.

Таблица 2

Определение индекса совместимости

Степень совместимости 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15

Кол-во оа несовпадений 0 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 1 2 2

Кол-во А+В 0 1 0 2 1 0 3 2 1 4 3 2 4 3 4

Несовпадений

Максимально возможная степень совместимости — 1 при отсутствии несовпадений как по НЬА ОИ (класс И), так и по Н1А А

и В (класс I). Минимальная степень совместимости — 15 несовпадения по НЬА БЯ - 2 и по Н1А А и В - 4.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ В соответствии с целями, поставленными в начале настоящей работы, первой из задач являлся поиск метода Н1_А-генотипирования, наиболее полно соответствующего условиям работы и требованиям центра органного донорства, осуществляющего селекцию пар донор-реципиент при трансплантации аллогенных почек в г.Москве или аналогичном ему по объему трансплантаций региональному центру.

В качестве такого метода был выбран метод шБЗР, разработанный в Институте иммунологии МЗ РФ (А1ехееу Ь. е1 а1., 1995) с использованием в качестве генотипирующих реагентов наборов НЬА-ОЯВ1 - генотипирующих праймеров фирмы "ДНК-технология" (Россия), разрешенных к применению Комитетом по новой технике МЗ РФ :

Данный выбор был обусловлен следующими соображениями. Первое - указанный набор позволяет идентифицировать 14 групповых специфичностей НЬА-ВЯВЬгена, что является абсолютно достаточным для эффективной селекции солидных органных трансплантатов (Tongio е1 а1., 1995).

Второе - данный набор, являющийся единственным лицензированным МЗ РФ для НЬА-ОЯВ генотипирования в России, в то же время в несколько раз дешевле зарубежных НЬА-ОЯВ1 генотипирующих наборов, выпускаемых зарубежными фирмами (Биотест, Динал, 1ппояепеИс и др.). Вместе с тем указанный отечественный набор прошел успешное испытание по контролю качества в программе XII Международного совещания по НЬА (Париж, 1996).

Третье - метод тББР, также прошедший контроль качества в программе XII 1Н\УС и отличающийся от классического варианта 55Р большей простотой и надежностью, обладает также таким важнейшим

п

преимуществом как чрезвычайная экспрессность. Так для его постановки необходимо лишь 2,5 часа, что является минимальным на сегодняшний день для НЬА-генотипирования по генам класса II. (Л.П.Алексеев 1995; Д.Трофимов, 1996).

Таблица 3

Сравнение эффективности 2-х методов типирования Н1А класса II

(НЬА)

437 реципиентов (лист ожидания).

Метод типирования Кол-во выявленных специфичностей Ошибочное выявление специфичностей Выявление НЬА-БЫ гомозигот

2 1 0

Серотипирование 28% 47% 15% 10% -

ДНК типирование 100 % - - - 32,3

При проведении Н1А-генотипирования реципиентов, входящих в лист ожидания пересадки почки (табл.3) и Доноров почки (табл.4) (за период 1995-1998) с использованием метода швБР и указанных наборов праймеров во всех случаях был установлен "полный" Н1А-Б11В1 генотип (табл.3,4), в то время как при серологическом типировании процент случаев, где был установлен полный НЬА ОЯ генотип, составил 30% для доноров трансплантата почки (табл.3) и 28% (табл.4) для реципиентов, входящих в «лист ожидания».

Таблица 4

Сравнение эффективности 2-х методов типирования НЬА класса II

(НЬА)

136 доноров трансплантата почки.

Метод типирования Кол-во выявленных специфичностей Ошибочное выявление специфичностей Выявление ША-ОЯ гомозигот

2 1 0

Серотипирование 30% 44% 13% 13% -

ДНК типирование 100 % - - - 16,7

Данное различие является вполне обьяснимым, и оно определяется, в первую очередь, чисто техническими возможностями этих 2-х методов.

Это связано со следующими обстоятельствами:

1) НЬА-ЭЫА-генотипирование является значительно более точным, объективным и воспроизводимым методом по самому своему существу.

2) Серологическое Н1А типирование не возможно при наличии клеток с низкой жизнеспособностью, что зачастую имеет место у доноров.

3) Даже в лучших международных наборах отсутствуют высокоактивные сыворотки (или моноклональные антитела) против всех известных Р11 антигенов, а процесс совершенствования этих наборов практически прекратился из-за наличия и внедрения в передовые лаборатории более совершенного метода генотипирования — ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Таким образом, применяемые в настоящее время наборы НЬА-типирующих сывороток, в том числе и набор ОТ1 (США), признанный как один из наиболее совершенных, принципиально не способен выявлять все ША-ОЯ антигены.

4) Наконец, серотипирование по своим возможностям без семейного анализа, (который не возможен в клинической ситуации) не может устанавливать НЬА-гомозиготы, которые, как следует из наших данных, у доноров составляет 16,7%, что весьма близко к данным, полученным при Н1А генотипировании представителей «здоровой» популяции г.Москвы.

Все эти факторы в сумме и дают описанные выше эффект преимущества НЬА-ОЫА генотипирования.

Для реципиентов эта цифра оказались значительно более высокой — 32,3%, и значение этого факта для клинической трансплантологии будет обсуждено ниже.

Естественно, что обнаруженное в настоящем исследовании двукратное увеличение количества НЬА ОЯВ1 гомозигот среди реципиентов, входящих в лист ожидания, является неслучайным явлением. И наиболее вероятным объяснением этого факта является повышение гомозигот по Н1А специфичностям, и в частности, по специфичностям класса II, связано с известным фактом увеличения НЬА гомозигот среди больных аутоиммунными заболеваниями (Бо Я. 1994).

Это предположение тем более вероятно, что основным контингентом реципиентов (более 90%) являются больные терминальной стадией хронической почечной недостаточности, явившейся следствием хронического гломерулонефрита.

Таким образом, полученные в настоящем исследовании данные не только имеют значение для развития клинической трансплантологии, но и открывают новые перспективы в развитии проблемы "НЬА и болезни".

Учитывая все это, а также тот факт, что серотипирование по НЬА антигенам класса II требует более 8 часов (в отличие от ДНК-генотипирования), становится очевидным, что уже по чисто техническим параметрам использованный в работе вариант Н1_А-ДНК-БЯВ! генотипирования значительно превосходит использовавшийся во всех трансплантационных центрах России и стран СНГ до настоящего времени метод НЬА-ОЯ серотипирования.

54,8%

47.5Х,

31,6'

22,6%

7,5%

0,0%

94,3%

#

81,5%

Ранние кризы Некупированные Годовая отторжения кризы выживаемость

Группа Несовместимость по Н1А-ОИВ1 Кол-во случаев

' 1 0 28

1 66

3П 2 42

Рис. 1 Эффективность селекции трансплантата аллогенной почки на основе Н1А-ОШ31 генотипирования

Следующей и основной задачей настоящей работы явилось исследование вопроса о клинической эффективности селекции доноров с помощью HLA-DRB1 генотипирования. Результаты этой части работы, представленные в рис.1, основанные на результатах трансплантаций почки, также свидетельствуют о значительной эффективности НЕЛ-ДИК селекции.

Так, в группе реципиентов, совместимых с донором по 2 HLA-DRB1 специфичностям (установленным на основании ДНК-генотипирования) все клинические показатели и, в первую очередь, годовая выживаемость значительно превосходят (различия достоверны при р<0,005) таковую в группе HLA-DRB1 "несовместимых" трансплантаций. В частности, годовая выживаемость трансплантата в группе полностью идентичных доноров составила 94,3%, что не только почти на 20% превосходит аналогичный показатель в группе HLA-DRB1 полностью несовместимых трансплантатов, но и соответствует показателям, достигаемым в настоящее время в передовых трансплантологических центрах мира. Относительно эффективной (по сравнению с группой полностью совместимых по HLA DRB1 специфичностям) оказалась и совместимость по 1 HLA DR специфичности (выживаемость - 81,5%). Различия достоверны при р<0,005.

Более того, все сказанное о преимуществах HLA DRB селекции касается и кризов отторжения как ранних, которые в группе HLA-DRB1 совместимых трансплантатов наблюдались лишь у 1/3 реципиентов, в то время как в группе полностью HLA-DRB1 несовместимых реципиентов они были зарегистрированы в половине случаев, так и при поздних кризах, которых в первой из указанных групп было почти в два раза меньше, чем во второй. При этом на указанные различия в результатах трансплантации не могли повлиять такие важные для клинических результатов пересадки факторы, как

уровнь предсуществуюших антител и время ишемии трансплантата, поскольку данные показатели существенно не различались в сравниваемых группах. Всем реципиентам, входящим в п>уппы сравнения была выполнена первая пересадка почки и среди них не было больных с высоким (более 10%) уровнем предсуществующих антител.

И наконец не менее важным было также и то, что группы НЬА-ОЯВ1 совместимых с донором по 1 и 2 специфичностям реципиентов были практически идентичны и по уровню совместимости с донором по НЬА антигенам класса I (табл.5).

Таблица 5

Уровень несовместимости по антигенам класса I (Н1Л-А,В) в группах реципиентов, различающихся по НЬА-ОЛВ! специфичностям

N Группы Кол-во случаев Кол-во Н ГА-СНЫ несовместимых специфич-ностей Кол-во Н1А-А,В несовместимых антигенов (%) в группе

0 1 2 3 4

1 28 0 - 25 46 18 11

2 66 1 1 25 39 23 12

3 42 2 - 7 67 21 5

Относительно худшая совместимость по НЬА антигенам в группе 3 является естественным следствием дисэквилибрической

связи между антигенами класса I и II. В результате несовместмиость по HLA специфичностям класса II увеличивает вероятность и несовместимости по классу I.

Эти данные с одной стороны еще раз подтверждают представления о первостепенной роли в развитии реакции отторжения совместимости по специфичностям HLA класса II, по сравнению с классом I, приведенные в работах (Opelz, 1994), а с другой стороны, они свидетельствуют о целесообразности пересмотра самой стратегии селекции трансплантата аллогенной почки, во всяком случае, применительно к центрам трансплантации, аналогичным или близким по величине листа ожидания Московскому координационному центру органного донорства.

Суть этого пересмотра может состоять в переоценке значения роли HLA специфичностей класса I (А и В локусов) и II (DRB1 гена) при практической селекции донора. И хотя в используемых в настоящее время программах (или схемах) подбора, приоритет уже отводился антигенам HLA DR, переход на HLA-DRB1 DNA типирование открывает, как следует из настоящих данных, абсолютно новые возможности. А именно своевременно и целесообразно ставить вопрос о переходе селекции донора трансплантата почки ( во всяком случае при первичной трансплантации, без высокого уровня предсуществующих антител) исключительно на селекцию по специфичностям класса II, т. е. на HLA DRB1 селекцию.

Такой переход может не только резко повысить эффективность трансплантации за счет достижения большей HLA совместимости и быстроты селекции, но и сделает данную процедуру более результативной в плане более эффективного использования каждого донора.

Разумеется, можно считать, что наиболее обоснованной альтернативой данной точки зрения может быть другая, а именно -типирование по HLA классу I на основе ДНК генотипирования. Однако, поскольку методические аспекты HLA-DNA-

генотипирования по аллелям класса I, в отличие от класса II, еще находятся в стадии разработки и совершенствования, и именно они станут основной задачей программы очередного XII Международного рабочего совещания по HLA (1998-2001), в настоящее время в клинической трансплантологии по-видимому трудно ожидать широкого внедрения метода HLA-DNA генотипирования ранее, чем в ближайшие 3-5 лет.

При этом следует отметить, что уже сейчас появляются новые работы, свидетельствующие, что и более углубленный анализ результатов типирования по HLA классу I у реципиентов свидетельствует о существенном приоритете HLA класса II при селекции доноров трансплантата почки (JM Thomas, 1996).

Результаты выполненных в течение 1996-1998 г.г. пересадок почек "подобранных" в Московском центре органного донорства неоспоримо свидетельствуют о высоком клиническом эффекте от применения этого метода.

Представленные в настоящей работе, данные на наш взгляд, являются не только прямым доказательством необходимости перехода селекции донора в клинике пересадки аллогенной почки на HLA-DNA генотипирование, но и являются еще одним серьезным аргументом в продолжающейся и по сегодняшний день дискуссии о целесообразности использования H LA типирования (вне зависимости от метода типирования) в клинической трансплантологии на фоне проводимой иммунодепрессии, включающей циклоспорин А.

После доказательства в процессе выполнения данного исследования высокой эффективности HLA DRB1 селекции донора встал вопрос организационной структуры центра, способной обеспечивать эффективное круглосуточное HLA-DRB1 генотипирование.

Наболее приемлемым вариантом представляется обучение трех-четырех сотрудников из лаборатории тканевого типирования, входящей в состав центра, методу HLA-DNA генотипирования, что

позволяет, практически не изменяя штатное расписание лаборатории и центра, обеспечить возможность круглосуточного Н LA- DNA генотипирования. Разработанная и предлагаемая для использования в других трансплантационных центрах России схема работы сотрудника, осуществяющего тканевое типирование по HLA специфичностям.

Следующий организационный аспект, также направленный на повышение эффективности селекции донора трансплантации почки, вытекает из данных о высоком проценте (более трети) среди реципиентов, входящих в лист ожидания, HLA-DRB1 гомозигот.

Дело в том, что как указывалось в разделе «Материалы и методы исследования» в основу компьютерной программы, используемой в настоящее время при практической селекции, был заложен принцип подбора донора по антигенам HLA класса I и II с учетом приоритета антигенов класса II, в котором, естественно (поскольку метод программы не был ориентирован на реальное установление HLA-гомозигот), не учитывалась возможность того, что могут целенаправленно подбираться HLA DRB1 идентичные донор и реципиент, имеющие одну и ту же DRB1 специфичность в гомозиготном состоянии.

Как следует из полученных в работе данных, представленных в табл.6, при использовании «стандартной» программы селекции донора почки (описанной в разделе «Материалы и методы») от 14 HLA DRB1 гомозиготных доноров в 10 случаях были пересажены реципиентам, для которых у донора отсутствовала несовместимая HLA DRB1 специфичность. Однако, только в 3-х случаях была использована возможность подобрать полностью HLA DRB1 совместимую как в направлении донор -реципиент, так и реципиент-донор пару. Еще в 7 случаях HLA-DRB1 гомозиготную почку получили реципиенты, гетерозиготные по специфичности, аналогичной HLA-DRB1 гомозиготе-донору.

Таблица 6

Реальный уровень "использования" Н1А-ОЯВ1 эффекта гомозигота ости при трансплантации почек

N Группа Общее Кол-во Кол-во Кол-во Кол-во

группы реципиен- кол-во HLA- реципиентов HLA- HLA-

тов рецип. DRB1 HLA-DRB1 DRB1- DRB1

гомози- гетерозигот идентич- гомозигот.

гот в совместимых ных пар доноров в

группе с донором — донор- группе

рецип. HLA-DRB1-гомозиготой реципиен т

HLA-DRB1-

1 совместимые по 2 специфич. 28 9 7 3 10

HLA-DRB1-

2 совместимые по 1 специфич. 66 21 - - 4

Реципиенты

3 в листе ожидания 178 48 - - 34

Но в 4 случаях HLA-DRB1 гомозиготные доноры попали а группу 2, то есть были пересажены полностью HLA DRB1 несовместмимым реципиентам, за счет хорошей совместимости по HLA классу I, а также потому, что принималась во внимание несовместимость только по 1 HLA DRB1 специфичности.

Эти данные с несомненностью свидетельствуют о том, что программа, созданная исходя из возможностей серологического HLA

типирования, не позволяет полностью использовать возможность HLA-ДИК генотипирования в клинике трансплантации почки.

Еще более наглядно это видно при анализе HLA-DRB1 генотипов реципиентов, у которых из исследованных генотипов 32,3% оказались HLA DRB1 гомозиготными (см.табл.З).

Ретроспективный сопоставительный анализ показал, что в 75% случаев в момент выявления HLA DRB1 гомозиготных доноров в листе ожидания имелся HLA DRB1 гомозиготный (по идентичной с донором специфичности) реципиент, т.е. полностью HLA DRB1 совместимый с ним.

Таким образом имелась принципиальная возможность за счет уменьшения количества трансплантаций реципиентам, совместимым с донором по 1 HLA. DRB1 специфичности, увеличить количество трансплантаций в группе, где реципиент и донор полностью совместимы по HLA DRB1 специфичностям и где годовая выживаемость превысила первую из обследуемых групп почти на 13%.

Следует также принять во внимание следующее: используемая до настоящего времени компьютерная программа селекции не только не позволяла оптимальным образом использовать HLA-DRB1 генотипированных доноров, но ставила HLA DRB1 гомозиготных реципиентов в более «невыгодные» условия, по сравнению с HLA DRB1 гетерозиготными реципиентами.

Последнее определяется тем, что реципиент, у которого выявляется меньшее количество специфичностей, заведомо будет иметь при подборе с использованием «классической» программы селекции, худший по HLA DR специфичности индекс совместимости. Результатом этого и явилась пересадка «несовместимых» HLA DRB1 "гомозиготных" трансплантатов.

Для ликвидации данного пробела программы и ее адаптации к использованию HLA DRB1 генотипирования было проведено ее дополнение условием, обеспечивающим 2-х стадийную селекцию.

1 стадия включается только в том случае, если при HLA DRB1 генотипировании донора устанавливались его HLA DRB1 гомозиготность. В этом случае программа обеспечивает первоначальную селекцию донора только среди реципиентов HLA DRB1 гомозигот. В случае, если их несколько, подбирается наиболее совместимый по HLA антигенам класса I.

Использовавшаяся до настоящего времени версия программы подбора реципиентов была составлена на языке высокого уровня VB3 для операционной системы Windows 3.1. Она осуществляет подбор реципиентов по заранее заданному жесткому алгоритму.

Новая программа написана на современном языке высокого уровня VB5 для операционной системы Windows 95/NT/98. В программе применена объемная технология по хранению и обработке данных, за счет чего программа позволяет настраивать параметры алгоритма подбора реципиентов в соответствии с последними наблюдениями результатов выполненных пересадок.

При формировании рекомендаций на пересадку новый алгоритм подбора рассматривает более детально имеющуюся комбинацию генов донора и реципиента, с учетом возможности 100% выявления гомозигот среди доноров и реципиентов, а также учитывает сплиты.

Эффективность работы новой программы проверена при ретроспективном анализе 66 трансплантаций, выполненных при совместимости донора и реципиента по 1 HLA DR специфичности.

Оказалось, что если бы перспективная селекция осуществлялась бы с помощью этой программы, то из 66 реципиентов 21 могли бы переместиться бы в группу 1, где получили бы полностью HLA DRB1 совместимую почку.

Такое изменение не только могло бы уравнять шанс реципиентов этой группы, но и, как указывалось ранее, в случае наличия совместных доноров означает полную HLA DRB1 совместимость.

Таким образом, результаты работы явились обоснованием для внесения серьезнейших дополнений в функционирующую программу селекции донора трансплантата почки. Они уже внесены в практическую работу Московского координационного центра, а также разработаны несколько новых математических моделей, проходящих в настоящее время практическую проверку.

Следует еще раз подчеркнуть следующее: полученные в данном исследовании результаты и сделанные на их основании заключения и выводы могут быть характерными для трансплантационных центров с ограниченным листом ожидания (500-800 чел.), поскольку при более крупных листах ожидания, характерных для международных и национальных программ, может играть определенную роль селекция по антигенам HLA класса I.

Необходимо напомнить также, что в условиях России, где в настоящее время не существует единого листа ожидания, а региональные трансплантационные центры, например, Санкт-Петербургский, Челябинский и др. также оперируют ограниченными листами ожидания реципиентов, выводы настоящего исследования также являются полностью адекватными.

ВЫВОДЫ

1.Селекция донора на основе HLA-DNA DRBl-генотипирования повышает годовую выживаемость трансплантата и улучшает основные клинические показатели реципиента.

2.Селекция при HLA-DNA DRB1 генотипировании технически высоко эффективна — 100% полное выявление DRB1 специфичностей при 28-30% полного выявления HLA-DR антигенов при серологическом HLA типировании.

3.Использование HLA-DNA генотипирования позволяет использовать метод селекции по HLA класса II как основной (или единственный) по сравнению с "серологической селекцией" по HLA класса I.

4.Установлен высокий уровень HLA-DRB1 гомозигот — 32,3%, по сравнению с 16,7% в популяции, что имеет большое значение как для клинической трансплантологии, так и для проблемы «HLA и болезни».

5. Разработана и внедрена новая компьютерная программа селекции доноров почки, основанная на возможностях HLA-DNA генотипирования, в первую очередь на возможности 100% выявления HLA гомозигот среди доноров и реципиентов.

6.Разработана новая структура трансплантационного центра с учетом круглосуточного обеспечения HLA DNA генотипирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Первый отечественный опыт селекции донора аллогенной почки на основании HLA DRB1 генотипирования// Иммунология, 1997, N5,

C.21-23.(В соавторстве с Л.П.Алексеевым, М.Н.Болдыревой, Д.Ю.Трофимовым, А.Г.Долбиным, Р.М.Хаитовым).

2. Использование молекулярно-генетического HLA-типирования генов класса II в клинической трансплантологии.// Иммунореабилитация, 1997, N6, С.6-19.(В соавторстве с Л.П.Алексеевым , Р.М.Хаитовым, Р.Г.Василовым).

3.HLA-DRBl-genotyping in perspective selection of kidney donor.// Transplantation Proceedings, 1997, vol.29, p.3610-3612 (В соавт. с A.G.Dolbin, P.Ya.Filiptsev, A.S..Sokolovsky, M.N.Boldyreva,

D.Yu.Trofimov, R.M.Khaitov)

4. Experience in MMSP used for urgent selection of allogenic kidney's donor//Eur.J.Immunogen, 1997, vol.24, N.2, P.113 (В соавт. с L.P.Alexeev, M.N.Boldyreva, D.Yu.Trofimov, N.G.Dmitrieva, R.M.Khaitov, and A.G.Dolbin).

5.The Expedience of HLA-DRBl-genotyping in perspective kidney donor selection for transplantology centres with "short" waiting lists. // 1st Balkan and Southeastern European Congress on Histocompatibility and lmmunogenetics, 1997, Thessaloniki, Hellas, Abstracts, p.45.( В соавт. с L.P.Alexeev, D.Yu.Trofimov)

6. Двухлетний опыт селекции с использованием HLA DRB1 генотипирования при трансплантации почки в Московском регионе. Материалы 1 Всероссийского съезда по трансплантологии и искусственным органам, г.Москва, 1998, с. 14 (В соавторстве с Л.П.Алексеевым, Х.Р.Лангом, Д.Ю.Трофимовым).

7.Достижения иммуногенетики в медицине// Иммунология, 1998. Принято к печати. (В соавторстве с Л.П.Алексеевым, Р.М.Хаитовым, И.И.Дедовым).

8.Genetic testing and organizing of donor organs' selection in their distribution for further transplantations among the clinics of Moscow region// The 12th World Congress of Medical Law. Hungary, Siofok, 1999-Принято к печати (В соавт. с A.G.Dolbin, L.P.Alexeev, D.Yu.Trofimov, M.N.Boldyreva, L.I.Benenson, N.F.Plavunov).

да. ,-W. 22 8