Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Теоретическое и экспериментальное обоснование применения генетического маркирования возбудителей инфекционных болезней животных в молекулярной эпизоотологии

На правах р> копией

0030643 1Э

Cl MI 1П1ХИ11 ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ

11 ОРПИЧ1 СК01 И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО! ОБОСНОВАНИИ ПРИМЕНЕНИЯ ЕЕНЕТИЧЕСКОЕО МАРКИРОВАНИЯ ВОЗБУДИГЕЛСИ ИНФЕКЦИОННЫХ Ь0Л1 ЗНЕЙЖИВОШЫХ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ 011И300 IOJIOI ИИ

16 00 03 - ветеринарная микробиология, пир\сотогия )пи юотоюгия,

микотогия с мпкотоксикологией и имм\ iiojioi пя 03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

iHCLepianHii па соискание ученой cienenu юмора биоло! ическнч на\ к

D 2 АВГ2007

Новосибирск - 2007

003064319

Рабсил вынотнепа в I НУ Инсии} i экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальне! о Восюка СО Россельхозакадечии

Научный консу ibiam домор ветеринарных паук, профессор,

академик Россе ть\о ¡академии, «служенный деятель науки РФ Донченко Александр Семенович

Официальные опгюнеигы докюр вегерипарных наук, профессор

Димов Сергеи Копсгап тинович I i 1У ЮВС иДВ С О Россетьхо ¡академии

докюр био 101 нческнх наук, ciapunin на\ чныи coipy чип к Ьетявская Валентина Александровна, Ф1 УН I 1Щ ВЬ «Вектор»

докюр биологическич наук, профессор Об}\ов Miорь Леонидович, ФГУ ВГНКИ

Ведущая организация Всероссийский паучно-песпедовате 1ьскпй илстшу i вегеринарнои вирусо юг ни и микробиологии (ВНИИВВиМ, г Покрои)

Загтпа сосгоигся «_»_200_ г в «_» часов на заседании

чиссерганионного совета Д 006 045 01 в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока С О Россетько¡академии но адрес) 630501, Новосибирская обгаегь Новосибирский район, и Краснообск, СО Россечьхозакацемии ГПУ ИЭВСнДВ

С диссергацией можно ошакомиться в ЦНСХЬ СО Россельхо ¡академии

Авгорефераг pasocian «_»_200_ г

Ученый секретарь ___

диссертационного совета í Г М Стеблева

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Основными объектами и точками приложения молекулярной эпизоотологии являются индикация, дифференциация и полиморфизм патогенных микроорганизмов В изучении их структуры мРНК и ДНК получили распространение методы генетического маркирования, основанные на полимеразной цепной реакции ДНК (Б Льюин, 1987, Ю П Алтухов, 1989, Ю П Алтухов, JT И Корочкин, Ю Г Рычков, 1996, Забаровский Е Р , 2001)

В последние годы список ДНК-маркеров был заметно увеличен, благодаря привлечению молекулярных маркеров, основанных на различных модификациях ПЦР (С Wong, W Wilson, A J Jffereys, S L Thein, 1986, IO П Алтухов, 1989, С A Булат, H В Мироненко, 1989, ГЕ Сулимова , Г О Шайхаев, Э M Берберов, А Ю Маркарян, Л Г Кандалова, 1991, Ю П Алтухов, 1995, J Chen, Р D Hebert, 1998)

Молекулярно-генетическое маркирование заключается в выявлении специфических последовательностей ДНК, способных охарактеризовать организм с одной стороны как набор отдельных генов, отвечающих за те или иные признаки, а с другой как целостную генетическую структуру, отличающуюся от других на молекулярном уровне (Г Е Сулимова, Г О Шайхаев, Э M Берберов, А Ю Маркарян, Л Г Кандалова, 1991, ЕР Забаровский, 2001, ER Zabarovsky, L Petrenko, A Protopopov, O Vorontsova О et al, 2003)

C\ mecí в\ ici мономорфное и иопиморфное мРНК и ДНК маркирование, При мономорфном маркировании помимо обычной двух праймерной ПЦР для трудно амплифицирусмых участков ДНК, а также в тех случаях, когда матричная ДНК прису rcib\ci в следовых количествах, ПЦР проводят в два ра\>нда, ю есть иснолыую! систему, i ак на!ываемы\ вложенных (nested) праимеров (I A üioisman, 11 Othman, 1993, В F Clieetham, M h Kat/, 1995, IO M Романова, AJI 1 шибург, 1999 Kl МоЦыналиев, В M I оворун, 2000) I tin возникает необходимой ь icnei нческого маркирования по нескольким генам в одной реакционной сре ге, ю проводится му н.тииранмерная ПЦР с использованием нсскотьких пар праимеров Таким образом, осуществляется скрининг сразу по нескот),ким генам (С Рagira, M Morcante, 1998)

Другим вариантом ДНК-маркеров являются полиморфные маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs) с помощью ПЦР-ПДРФ анализа (Г Е Сулимова, Г О Шайхаев, Э M Берберов и др , 1991, ГЕ Сулимова, ИГ Удина, Г О Шайхаев, И А Захаров, 1995, ИГ Удина, Е Е Карамышева, С О Туркова и др , 2003)

Особый класс полиморфных ДНК-маркеров основан на использовании праимеров, имеющих множественную локализацию в геноме Это может быть достигнуто при использовании одного короткого праймера с произвольной последовательностью, так называемый RAPD-анализ (M Р Snyder, D Kimbrell , M Hunkapiller, 1982, E Nevo, A Beilis, R Ben-Shlomo, 1984, CA Булат, О К Кобаев, HB Мироненко, ФМ Ибатулин и др , 1992, RD Ward, D О F Skrbmski, M Woodwark, 1992, J G К Williams, M К Hanafey, JA Rafalski, SV Tingey, 1993, И А Шагинян, АЛ Гинцбург, 1995, ЮП Алтухов, 1995) В доступной отечественной литературе на начало наших исследований отсутствовали сообщения по мРНК и ДНК-маркированию вирусов КЧС и ВД КРС, а также

культур РизоЬааепшп песгорЬогит и МусорЫт с целью их дифференциации по родам, что и определило цель и задачи исследований

Цен, и ¡¡пачи исследований является теоретическое и экспериментальное обоснование применения различных типов генетического маркирования ну кчеошдных пос ледова гелънос1 ей возбудителей инфекционных болезней животных на примере ктассической чумы свиней, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, нскробактериозаи микоплазмоза

Для достижения посгавпеннои цепи определены спедующие задачи

1 Теорешчсски обоснован использование различных гшюв генетическою маркирования нукпеотидных поспедовательностей возбудителей инфекционных бопезнсн животных и области их применения

2 Разрабоипь способы СБТ-РНК мономорфного маркирования мРНК вируса классической чумы свиней и вируса вирусной шарен крупною ро1 а 101 о ско1а

3 Разработать Ь7 8ь-Д11К мономорфного маркирования геномной Д11К РивоЬайепшп песгорЬогит на основе мобильного элемента с помощью гнездовой ПЦР, а также способ нитрования цпаммов и изолягов РизоЬасЧегшт песгорЬогит при помощи ПДРФ-ПЦР

4 Разработать способ для мономорфного ЬТЬб-ДПК генотипирования с помощью мутьгипраимерион ПЦР для выявления генетических признаков культур РичоЬас1епшп песгорЬогит

5 Разработать БМ^-маркирование на основе КАРО-ПЦР с праймерами имеющими множественную локализацию в геномах ГизоЬайепшн песгорЬогит и Мусор1ачт

6 Изучить полиморфизм мономеров культур РизоЬайепит песгорЬогит

Научная новизна

- разработай способ СЯТ-РНК мономорфного маркирования нуклеотидиои последовательности в консервативной обласш мРНК вируса классической чумы свиней с помощью ОТ-ПЦР, позволяющий выявлять большее чиспо вариантов вирусов циркулирующих как в I вропеиеких, так и в Дальневосточных регионах РФ (патент №2120994 от 27 октября 1998 )

- разработан способ РЯ1-РНК мономорфного маркирования нуклеотпдной посаетоватепьности в консервативной обтастп мРПК вируса вирусной тиареи крупного рогатого скота с помощью ОТ-ПЦР позволяющий чиффереицированно по 01 ношению к ктассическоп чуме свиней выявлять персистепцию ною вируса у свиней (патент №2158306 01 27 октября 2000 т )

- впервые в РФ разработан способ STSs-ДI Пч мономорфного маркирования пукпеогидных поспедовательностей ГггчоЬасГепит песгорЬогит на основе мобильного элемента с помощью гнездовой ПЦР, но ¡воняющий выявчягь патогенные подвиды I иьоЬааепит песгорЬогит (патент №2203951 от 10 мая 2003 г )

- впервые в РФ разработан способ мономорфного ЬТБя- генотипирования I нчоЬасГепштг песгорЬошт с помощью мулминраймерной ПЦР, позвопяющий проводить обнаружение генетических признаков характерных дтя патогенного подвида ГшоЬас1егшт песгорЬогит виЬзрестея песюрЬогит, обладающих патогенным свойством агглютинировать эритроциты (патент №2294374 01 27 февраля 2007 г)

- впервые в РФ разработаны способы КАР1)-!1ЦР для полиморфного маркирования купьтур ГиБоЬасТегшт песюрЬогит и МусорЬэт с номощыо

праимеров №38/1 и №39, позволяющих разграничивать их по кластерам с мипима 1ьнымн [енегическммн дистанциями

- впервые в РФ изучен полиморфизм мономеров кулылр 1 usobacterium necrophorum, данные которого помогут в определении изменчивости под воздействием раничных факторов и закономерностей в циркуляции эпизоотических штаммов в стадах

- дана биологическая и генетическая характеристика депонированным штаммам бамерий rusobacterium necrophorum subspecies necrophorum 12TSK630501 НИИ KKM ГНЦ ВБ «Векюр» В-1076 и 8TS630501 НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» В-1075 приточных для изготовления диагностических и защитных препаратов против некробактериоза животных ( Справка ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» № 1805 or 8 сети 2005 г на цп 12TSK630501 Справка ФГУП ГНЦ ВБ «Векюр» № 1705 01 8 сеш 2005 i на шг 81S630501)

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как создают перспективы применения молекулярных маркеров для мономорфного и полиморфного маркирования, основанные на различных модификациях ПЦР (ОТ-ПЦР, гнездовая ПЦР, ПДРФ-ПЦР, мультиплексной ПЦР и RAPD-ПЦР) для использования в молекулярной эпизоотологии, где главной точкой приложения является изучение изменчивости патогенных микроорганизмов Сведения^получаемые с помощью генетического маркирования составляют научную основу молекулярной эпизоотологии Мономорфное и полиморфное маркирование применяется не только в диагностике, но и при идентификации, генотипировании изолятов и генетическом картировании культур возбудителей болезней животных, в том числе классической чумы свиней, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, некробактериоза и микоплазмозов

Потучены ипаммы бактерий rusobacterium necrophorum subspecies neciophorum I2ISK630501 НИИ KKM I НЦ ВБ «Вектор» В-1076 и 8IS630501 НИИ KKM I НЦ ВБ «Вектор» В-1075 Указанные штаммы расширили арсенал ипаммов бактерий Tusobactcnum necrophorum subspecies necrophorum, которые MOiyi бьиь испопьзованы для изюювлеиня диагностических и профилактических препарате против некробактериоза животных На ич основе можно прово птть дифференцирование выделенных иютятов от других анаэробов, морфологически схожих с rusobacterium necrophorum, проводить разграничение па подвиды subspecies neciophorum и subspecies lundulifoime и прово лиь подбор производственных культур для изготовления защитных препаратов

Получаемые данные с помощью ДНК- маркирования на основе ПЦР с праймерами, имеющими множественную локализацию (RAPD- анализ) в геноме культур Fusobacterium necrophorum и Mycoplasm и белковому полиморфизму на основе 10% Ds-Na-ПААГ анализов возможно использовать в популяционной генетике и молекулярной эпизоотологии для оптимизации противоэпизоотических мероприятий, подбора референтных штаммов

Материалы диссертации нашли отражение в нормативных документах инструкции «Тест-система для выявления Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum методом полимеразной цепной реакции с помощью гнездовых праймеров» и ТУ 9388-001-05095732-2006 (Свидетельство о государственной регистрации № ПВР-1-2 6/01846 от 20 февраля 2007 г Учетная серия 35-1-2 61495) и были использованы при составлении методических рекомендаций

- «Взятие и доставка проб сыворотки и патологичебского материала для лабораторной диагностики вирусных болезней животных» рассмотрены и утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (1987),

- «Выдепение геномной ДНК rusobacteuum necrophorum из биологических образцов» рассмотрены н у гверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (протокол Л!>1 ог 22 февраля 2002 г) и подсекцией секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадсмни «Проблемы инфекцтюннои патологии животных в регионе Сибири и Дальнею Востока» (прогоко г №3 ог 22 февраля 2002 i )

- « Выделение РНК вируса вирусной диареи крупного рогатого скота и индикация методом позерн-блот гнбридизапиен» рассмотрены и утверждены Ученым совеюм ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и подсекцией секции инфекционпои иатоюнш отделения ветеринарной медицины Россе гько;гка гемии «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе С ибнрп и Дальнего Востока» (2002),

- «Применение тест-системы для выявления патогенных Fusobactenum necrophorum методом совмещенной гнездовой полимеразггой цепной реакции (two m one nested PCR» рассмотрены и утверждены Ученым соретом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (2006),

- «Применений тест-системы для генотипирования культур Fusobactenum necrophorum методом мультиплексной одношаговой полимеразггой цепной реакции (ПЦР)» рассмотрены гг утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСггДВ СО РАСХН и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (2006),

«Применение КАРГМЩР апатии дня чолекхлярно-генетического

картирования культур [ usobacteuum necrophorum» рассмотрены »утверждены Ученым совеюм ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и подсекцией «Инфекционная лаю'ютпя животных в pcnioiit Сибири и Дальнего Востока» отделения вегеринарнои медицины Россельхозакадемии (2006)

Апробация работы Материалы диссертационной работы доложены на заседаниях Учсного совета ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН ( Новосибирск 1999-2005), 111 Всесоюзной конференции гго эпизоотологии (Новосибирск 1991) Международной научно-прак птчсской конференции (Новосибирск, 1999), Паучно-пракшческои конференции (Новосибирск, 1998, 1999), З-си Международная научно-практическая конференции (Алматы 2000), Научно-практической конференции «Внедрение ресурсосберегающих технологий в сельскохозяйственном производстве» (Новокузнецк 2000), Научно-практической конференции «Болезни сельскохозяйственных животных вирусной и друтих ллолоптй п меры борьбы с ними» (Иркутск 2001) Меж iy наро той научно-практической конференции «Ьнолото-экологические проблемы заразных болезней диких животных гг их роль в патологии сспьскохозяиственных животных и людей» (Покров, 2002), На 5-ои Меж г\ наро той нау чно-нракт ической конференции «Научное обеспечение АПК Сибири Монголии, Казахстана bciap\cii и Башкортостана» (Новосибирск, 2002) 1- ом Меж чу народном котирессе «Актуальные проблемы в развития ветеринарной пауки и пракшкп» (Алмагы, 2002) Международной пау чпо-гтрактическои конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооагротгонозов» (Покров 2003) Ме/кд\ народной научно-практическом конференции «Современное состояние и актуальные проблемы в развитии ветеринарной науки и практики» (Алматы, 2005), На П-ой Международной конференции моюдык Ученых

«Новеишпе направления развития аграрной пауки в работах молодых ученых (Новосибирск, 2006)

Плбчмклии» пезх и.таюв исследования I lo теме диссертации опубликовано 44 печашых рабены^ в том числе 17 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрдювания РФ («Доклады Российской академии се тьскохозяйственныч наук», «Мо текулярная генетика, микробиология и вирусология», «Сибирский вестник сетьскохозяйственных наук»), в которых полностью отражено содержание работы, а также в Сборниках научных трудов и друтнх па\чиых трудах и изданиях

Oói.cm и cip\ki\pn чнссегпаини Диссертация пложена на 418 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуж тения, выводов практических предложений, списка литературы и при южения Работа иллюстрирована 43 рисунками и 2С?таблицами Список титерагуры включает 409 отечественных и зарубежных источников Основные положении, выносимые на защип

- Теоретическое и экспериментальное обоснование ДНК-маркирования в теистических исследованиях типы маркеров их свойства и области применения,

- Способ 1 ST-P11K моиоморфного маркирования экспрсссирующихся нос тсчовагельностеи мРПК вируса классической чумы свинеп с использованием 01-ПЦ1',

Способ для SlSs-ДНК мономорфнот о маркирования нуклеогндных нос те тователтлюстеп rusobacterium necrophoium на основе мобильного эчемента (транснозона) с использованием шездовои и мулыитт тскснои ПЦР,

- Способ SNPs-MjpMiponjHiw на основе RAPD-IIHP с пранмерами, имеющих мпо/ксстветпту то тока птзацпю в геномах husobactenum necrophoium и Mycoplasm

Теорегттческпи анализ, обобщение результатов, экспериментальные исследования выполнены автором самостоятечьно

Автор выражает глубокую благо ырность за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертации А А Самоловову, СФ Орешковой, ДА Хузину. N4 А Фипппепко С Храиову, А В Мокеевой, а также сотрудникам лаборатории С А Юрик и Н В Некрасовой

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2 1. Материалы и методы

Работа выношена в 1991-2006 тг в лаборатории генной инженерии ГНУ ЮВСпДВ

Культивирование клеток РК-15, заражение их вакцинным штаммом вируса классической чумы евинеи (КЧС) ЛК-ВНИИВВиМ осуществляли согласно «Методическим указаниям по иммуиофлуоресцентной диагностике классической ч\'мы свписи» (Москва, 1984) и «Методическим указаниям но табораторпой диагностике классической чумы свинеи» (Москва, 1996) Также использовали перепиваемую ку тыуру клеток MDBK Культивирование кпеюк, заражение их вакцинными штаммами вирчеа вирусной диареи ВК-1 - ВЮВ и Орегон С-24 V осмцсст впяли cor таено рекомендациям по серодиагностике вирусных инфекции (Сторин В Н , Ье юу сова Р В , Фомина II В , 1991)

В нача те исследовали культуры Ь necrophorum, выделенные сотрудниками лаборатории по изучению некробактсриоза животных Самотововым А А, Лопатиным С В и переданные в лабораторию теиной инженерии ГПУ ИЭВСиДВ Культуры были иол\чены ог больных животных на территории Западной Сибири

№1 - Кемеровская область - К (Кемерово), №3 - ГНУ ИЭВСиДВ - М2, №4 -Новосибирская обтасть, Коченевсксно района - Кр, №5 и №6 - НСО, Новосибирского района - 5Р и 6Р (Раздольное), Л1>7 - Алтайский край - Атт № 8 -Томская обтасть - 42ТС (свинокомплекс), а также изо тят «Чик-1020» oi ботыюн коровы Коченевскот района НСО В качестве реферешиыч использовали культуру №2 из ВИ1В - 21? тюбезно представленную Караваевым и купьгуру №3430 ВГНКИ В дальнейшем исследовали 40 культ\р i necrophoium любезно представтенные нам сотрудниками сектора конгротя и сгандаргизацнн бионренараюв Всероссийскою паучно-нсследовательског о Beiepnnapnoio института (г Казань) Макаевым и X II, Ху зиным Д А Бактерийные культуры были выделены от животных на территории Татарстана, Башкортостана, Марий 'Ж Удмуртии, Ульяновской и Самарской обласгей по клиническим показаниям Для подтверждения специфичное! и гютимеразной ценной реакции непочьзовали референтные штаммы Е sehcrichia coll АТСС 25922, Streptococcus, pyogenes (гр А), Staphylococcus aureus АТСС 25923, Pioteus vulgaris (полевой штамм) Bacillus subtihs ТНП-3 Salmonella dublin 373 315/52 предаав темные соф\дннками лаборатории по изучению болезней молодняка сельскохозяйственных животных ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН

При Д111<-маркирова1иш микоплазм использовали референтные штаммы М bo\igenitahum, М bovimastitidis М bovirhmis, М alcalescens, М mycoides М aigmini, потученные из лаборатории по изучению болезней молодняка сетьскохозянстиснных животных ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН а также культуры, вылеченные от коров с патологией воспроизводигелытоп функции в ОПХ «Этитное» №6-01,11-01,12-01 выделены в 2001 г, а № 15-03, 16-03 9-03 01-03 в 2003 г Культивирование микоптазм осуществили в соответствтги с методическими указаниями но лабораторной диагностике, приведенные в «Справочнике по мнкробиоло! ическим и вирусологическим меюдам исследования» пот ред М О Ьиргсра (1982) Все мпаммы и кутьтуры были протестированы 11ЦР - системой «М1-1К-КОМ» кат №VLT-4 ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ

Выдепение геномной РНК вирусов классической чумы свиней п вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) проводили с применением 6 М Оанидннтиоционата и дополнительпоп тепротеинизациеи смесью фенола с хпороформом и осаждением мРНК эшпопом

Выделение ДНК F necrophorum из биологических образцов проводили в двух вариантах В первом варианте при выделении суммарной ДНК с использовали нротеипазу К (10 мг/мч) Во втором гарианте выдепение суммарной ДНК проводили 10% СТАВ Качество полччаемою npenapaia нуклеиновых кислот проверяли путем тндроптза _>нтонуклеавами, приобре!енных в ООО «СибЭнзим», в рс/кнмах, рекомендуемых производитетем

Выделение ДНК Mycoplasm проводили путем лизиса ткани гуанидинизошоцпоанатом с тгое геиующеп сорбцией ДНК на стеклянном носителе

Для определения н\ктеоттпной посте юватетьности и анализа праймеров при маркировании мРНК вирусов КЧС и ВД КРС был применен пакет программ Alignment Seivice V4 0 OL1GO 4 0 и GENCNCR , а также отобранные опубликованные тхлеошдные not'кчова тельной и некоторых штаммов вир\сов КЧС штамм Alfort (Meyers G Rucmenapt T and Thiel II-I, 1989), штамм Biescia (Moormann R I, Wannerdam P A , van der Mcer В Schaper W M , Wensvoort G and Ilulst MM, 1990), штамм "WEIBRID NCBI gi 297783"( Muyldeimans G,

San Gabriel M , Caij Л , De Smet A and Hamers R , 1993), изолят MChV с Таивапя (Chang Y 1993), н BVDV шгамм Osloss(De Moerlooze L Lecomte С M , Brown-shimer SI et al. 1993), штамм SD-l(Dcng R, Brock KV, 1992) штамм NADHCollct MS, Larson R, Gold С et al, 1988), штамм Oiegon (Pellenn С, Mon S Lecomte 1 Ti]ssen P 1993)

Анализ фрагментов нуклеотидных последовательностей I usobacterium necrophorum и определение последовательностей праймеров для гнездовой 11ЦР проводили с помощью тех же программ

Уаанов îeime д 1Я му шптилекспои ПЦР пос ¡едова¡ельностем праймеров №210-220 с целью выявления фрагмента i сна белка оболочки (гроВ) в 906 нп, №215-2Î6GN гена фермента ДНК-гиразы (DNA- gyrase В protein gene, lonoiiîOMepaîa П) в 370 un, №180-191 тепа i емап лтопшина (ompH) в 645 нп и №17-19 спенсера (вставки) I6S-23S леикотоксина F necrophorum в 228 нп проводили rio алгоритму выравнивания нуклеотидных последовательностей в программах BLAST с использованием базы данных GenBank Одновременно в реакции применяли две или три пары праймеров Одна пара праймеров д ш выявления гемагыюшнина была постоянна, а другие менялись

При проведении RAPD-анализа ДНК rusobactenum necrophorum «произвольные» прапмеры длиной в 10 пук1сотпдов выбирали, взяв за основу пук 1соп1дную последовательность тейкотокстша F necrophorum штамма А25 (AI 3 12861)"

Д тя R APD-чаркнрования ДНК штаммов и культур микоппазм использовали «произвольные» праимеры со с1учайнои нуклеогидной носледовательное 1ыо ллиноп в 10 нук1сотщов сконструированные на основе ДНК генов mhp3 mgp (оттерон MgPa) Mycoplasma bovigenitahum

Химическим синтез всех специфических и произвольных праймеров был осуществлен амидофосфтпным методом па автоматическом синтезаторе ASM-102U (Biosset Ltd, Новосибирск) в отделе химии природных соединений ФГУН I НЦ ВЬ "Вектор" Россельхозпотрсбиадзора МЗ РФ

Постановку иолнмеразиои цепной реакции осуществляли на амплификаюрах "Ьнс" М-105 и " Герцик" по общепринятым методикам (Р С'анкн и др , 1990, В Г Дсбанов 1990, А Ь Вартапетян, 1991)

Анализ полученных результатов в ПЦР проводили методом электрофореза в 1 5-2 0"|> aiapo3iio\i теле при силе тока 25-40 мА в течение 30-50 мин (Т Маниатис и др 1984) В качестве маркера использовали ДНК plJClS тидролизованную AluI (на фрагменты 667, 521, 251, 226 п 131 нп) или маркер ООО «СибОнзим» 100 bp ' 1,5 Kb, также маркером си\жила ДНК pQPR гидро тизовапиая Пае!П Документирование полученных результатов проводили с помощью цифровой фотокамеры

Количественную оценку различий между изолятами проводили путем попарного сравнения паттернов Расчет индексов подобия D осуществляли аналогично, используя формулу Dab = 2Nah/(Na + Nb), где Na и Nb - число фрагментов ДНК в дорожках а и b соответственно, a Nab _ число совпадающих по электрофоретической подвижности фрагментов в дорожках а и b (V Miteva, A Abadijeva, R Grigorova, 1991) Для проведения статистического анализа были составлены бинарные матрицы, которые использовали для построения дендрограмм методом кластерного анализа (STATISTICA 6) В результате получали дендрограмму генетических расстояний

Полиморфизм очигомсров Г necrophorum Биодогические пробы на белых мышах провочн ш couiacno «Меюдическим указаниям по чабораюриоп диагностике нскробактериоза» (Москва 1487) В каждой из 3-х групп было по 3 животных весом 18-29гр Заражение бе íbix мышеи осуществляли подкожной инъекцией в области корня хвосга в объеме 0,6мл 16 часовой культурой Г neciophorum в еле ту тотцич варкам тах 1 опыт - культу ральной средой с бактериями, 2 опыт - бактериями отмытых физтточогпческнм раствором, 3 опыт -культу ральной средой без бактерии В каждом опыте животным контрольной группы I вводили физнолотический раствор, а кош рольной труппы 2 -культуральную среду без выращивания в ней бактерий Наблюдение дчнчось 1 !днен Затем животных выводили из опыта

Изучение попиморфнзма бе ikob с помощью 10% Ds-Na-ПЛАГ ана тизов, основанное на определении молекулярной массы мономеров, получаемых при диссоциации исходного отигомера (белка) поч возденетвнем денатурирующего агента ДСП (додецилсульфата натрия) проводили по общепринято» методике в описании Маниатис Т , Фрич Э , Сэмбрук Д , ¡984 и Гловер Д (1989)

Схемы проведения экспериментов и меточики исследовании приведены по мере издоления материапов собственных исследовании в начале соотвсгствутощих подраздетов диссертации

2 2. Результаты исследований

2 2 1. Теорсгнчсскос обоснование применения различных птпов генетического маркирования нукчеотидных иоследоватсчышстен возбудителен инфекционных бочезнеи животных

Молекулярная эпизоотология, предметом изучения которой являются молекулярные механизмы, составляющие основу развития эпизоотического процесса, входит в контекст общей эпизоотологии Основными объектами приложения молекулярной эпизоотологии являются индикация, дифференциация и полиморфизм патогенных организмов

Теоретической базой ДНК-маркирования является концепция комплементарное™, где основным механизмом выявления полиморфное™ является гибридизация Это позволяет тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генов, а не на уровне продуктов генов, как в случае использования метода белкового полиморфизма Применение ДНК-маркеров решает проблему насыщения генома маркерами, и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе не кодирующие Кроме того, эта маркерная система дает возможность использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма и имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими типами маркеров Для этого применяются молекулярные маркеры мономорфного и полиморфного вариантов, основанных на различных модификациях ПЦР ОТ-ПЦР, гнездовая ПЦР, ПДРФ-ПЦР, мультиплексной ПЦР и RAPD-ПЦР

За прошедшие годы было доказано, что полиморфизм в природных популяциях поддерживается известными микроэволюционными факторами -точковыми мутациями, микроделециями, миграцией, случайным генетическим дрейфом и естественным отбором, взаимодействующими в различных сочетаниях В дальнейшем спектр возможных причин был расширен, и в настоящее время основная роль отводится таким факторам, как крупные делеции и вставки,

трансверсии, транслокации, но также присутствием отдельных фрагментов ДНК, так называемым мигрирующими или подвижными элементами Они имеют специальную структурную организацию, которые могут перемещаться в геноме (MP Snyder, D Kimbrell , М Hunkapiller, 1982, E Nevo, A Beilis, R Ben-Shlomo, 1984, RD Ward, DOF Skibinski, M Woodwark, 1992, ЮП Алтухов, 1995, Забаровский E P , 2001)

При анализе опубликованных нуклеотидных последовательностей микроорганизмов было установлено, что по ряду компонентов геномной ДНК разные виды и подвиды бактерий имеют совпадения, несмотря на значительные различия в основных проявлениях вирулентности Поэтому эти компоненты не могут служить элементами маркирующих тест-систем с высокой специфичностью и не вполне пригодны для генетического маркирования внутри вида и подвида Поэтому было обращено внимание на нуклеотидные последовательности подвижных элементов (транспозонов) и вставок (IS-элементы) между генами (Е A Groisman, Н Ochman, 1993, BF Cheetham, ME Katz, 1995, ЮМ Романова, А Л Гинзбург, 1999)

По сравнению с фенотипическими и белковыми маркерами молекулярные ДНК-маркеры затрагивают саму основу всех процессов происходящих в живых организмах В целом, молекулярно-генетическое маркирование заключается в выявлении специфических последовательностей ДНК, способных охарактеризовать организм с одной стороны как набор отдельных генов, отвечающих за те или иные признаки, а с другой как целостную генетическую структуру, отличающуюся от других на молекулярном уровне Использование подобных маркерных последовательностей имеет большие перспективы связанных с изучением генетических ресурсов организмов и их использованием

Landegren U, Kaiser R, Caskey С, Hood L (1988), Вартапетян А Б (1991), Аксенов M IO , Гинцбург А Л (1993), Сулимова Г E , Удина И Г , Шайхаев Г О, Захаров И А (1995), Моиыналиев KT , Говорун В М (2000), Орешкова С Ф (2002), Алтухов Ю А , Салменкова Е А (2002), Жимулев И Ф (2006) в своих публикациях сообщили о принципах и использовании возможных вариантов ПЦР в маркировании нуклеиновых последовательностей Различные модификации метода ПЦР легли в основу создания разнообразных типов ДНК-маркеров, широко используемых в настоящее время в различных областях биологии и медицины ДНК- маркеры можно разделить на две группы Рассмотрим несколько вариантов ДНК-маркеров, основанных на полимеразной цепной реакции

Мономорфные ДНК-маркеры STSs-маркеры (Sequence Tagged Sites) Для данного типа маркеров необходима известность нужной последовательности нуклеотидов и не^-встречаемость ее в других геномах Например, транспозоны (IRAP - Inter-retransposon amplified polymorphism), IS- вставки, ДНК повторы можно рассматривать как мономорфные ДНК-маркеры Их используют в экспериментах, когда наличие полиморфизма не требуется и часто используют при разработке диагностических тест-систем по выявлению специфического фрагмента ДНК Варианты STSs-маркирования - это гнездовая и мультипраймерная ПЦР при маркировании ДНК Fusobacterium necrophorum

EST-маркеры (Expressed Sequence Tags) Одной из разновидностей STSs-маркеров являются EST-маркеры и представляют собой маркеры к экспрессирующимся последовательностям генов При создания EST-маркеров использовали нуклеотидные последовательности комплементарные мРНК кДНК,

получаемые с помощью обратной транскриптазы на основе изолированной из вирусов геномной РНК вирусов КЧС и ВД КРС

Полиморфные ДНК-маркеры ПДРФ-ПЦР (полиморфизм длин

рестрикционных фрагментов ампликона) метод основанный на тестировании однонуклеотидных замен в синтезируемых ампликонах и применяли при идентификации культуры F necrophorum

RAPD-ПЦР анализ К этому типу полиморфных маркеров принадлежат ДНК-маркеры на основе ПЦР с праймерами, имеющими множественную локализацию в геноме Использовали в популяционной генетике Fusobactenum necrophorum и Mycoplasm

Таким образом, применение в эпизоотологии молекулярного маркирования генетического материала и оценке его на новой теоретической основе составляет предмет специальной отрасли знания - молекулярная эпизоотология Основными объектами и точками приложения молекулярной эпизоотологии являются индикация, дифференциация и изменчивость патогенных организмов В последние годы в изучении структуры мРНК и ДНК получил распространение методы генетического маркирования, основанные на полимеразной цепной реакции ДНК В экспериментальных исследованиях на примерах разного типа патогенных микроорганизмов была показана возможность с помощью разного типа генетического маркирования осуществлять их индикацию, идентификацию и изучать изменчивость

2 2 2 Экспериментальное обоснование пршшпнов мономорфною и полиморфного маркирования возбуди гелеи бопезнн животных

2 2 2 1 LST-маркирошшнс экспрессчрующихси последовательностей мРНК iciioB вирусов КЧС н ВД КРС

Ьыла выбрана область послелователыюстсй генома вируса КЧС и вируса ВД КРС, соответственно кодирующие белыт-прелшественники i пикопротенна gp44/48 и g33 3aieM провели выравнивание нуклеотпдных последовательностей gp44/'48 фрагментов из i еночов различных штаммов КЧС Несмотря па ю, что при сравнении друг с другом различные штаммы вируса обнаруживают гетерогенность, были выбраны наиболее томоютпчпые участки тепома вируса для синтеза олш онуклеошдных пранмеров (рис 1), применение которых в методе ОТ-ПЦР

llamp 5'-ataactcaatggaacctg-3'

ALFOPT AGCCGAGAACATA^TCAATGGAACCTGAGTGACAACGGC 1200

PRESCI? A T A T 1197

Ь EIЕРID A T 11Q6

TAJVAN ---- AT T 36

12rev 3'-gcatcagtgggtccggtc-Ь'

AT.-ORT TACCGATGTCAACGTGGTCACCCAGGCCAGGAATAGGCCA 1560

c СIA G T CA T А С 1557

WEIBRID G T CA T А ГС 155C

'ГА'VAN CG T CA.. А С 3 96

Рис 1 - Фрагменты выравненных ну к теотидных последовательностей вируса КЧС, имеющих наибольшее сходство между собой

позвочичо бы выявить все доступные нам изоляты вируса КЧС Выбрав с учеюм коми 1еменгарносп1 и \ровня свободной энергии ираймеры №12Яеу 3'-дсаЬсад1ддд!-с::дд1:с-!: и №1 1Аптр 5 1 -а!аас.1;саа1ддаасс^д-3 ' и проведя реакции ОТ-ПЦР, мы получит специфические для мРНК вируса КЧС протукты синтеза- фрагменты кДНК в 252 нп Затем провели тестирование вируса в пробах полученных от свиней различных свинокомплексов "Кудряшовскии" Новосибирской, "Север" Тюменской обчастеи и "Красный Октябрь" Красноярскою края Пагочогическли материал (образцы селезенки, лимфатических у зтов, ночек и легких) был взят от животных, у которых наблю тачась кчтгническая картина заболевания классической чумой свиней Выявление вируса вели методом ОТ-ПЦР, исгючьзуя ираймеры №12 и №11 в сравнении с РПИ па культуре клеюк РК-15 Во всех анализируемых пробах быч выявпен вирус КЧС Результаты выдечения вирусов на культуре клеток совпачи с данными, полученными в ОТ-ПЦР (табл 1)

Рсзулыаты, проведенных экспериментов показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР почучают только ют да, когда в качестве матрицы испочьзуют кДПК классической чумы свиней Аначизы были отрицательными, когда использовали кД11К вируса вирусной диареи крупного рогатого скота

Табчица 1 Резучьтаты сравнительного исследования биологических образцов

в РПИ на культуре клеток РК-15 и ОТ-ПЦР

Наименование Исследовано Мегочы исслешвлиил

хозяйства проб ОТ-ПЦР Культ клег РК-15 в РПИ

С-з «Север» 2 1 И010Ж1ПСТЫ10 1 положительно

С-з«1\р Октябрь» 5 3 по юли le 1ыю 3 положи т елыю

С-з «Кудряшовскии» 10 10 по то<кте 1ьно 10 почожителыю

Вир\с ВД КРС ни Í5K-1 ВИОВ 3 3 отрицате 1ьно не нее течовл'ш

Вирус КЧС un ЛК-НПИИИИиМ 3 3 почожпге 1ыю 3 по ЮЖ1ПСЛЫЮ

Конгрои.- к\ n.Tvpa РК- 15 2 отрииатечьно 2 отрииатечьно

Да iee в комиссионных опытах от евннен из Новосибирской об т , Красноярского края и Хакаской республики подозреваемых в заболевании КЧС при исследовании одного и того же биоматернала от свинси с помотныо ОТ-ПЦР и кучьтуры клеток РК-15 в РПИ на 47 биообразцах быча подтверждена специфичность разработанной тест-системы rST-маркирования вируса КЧС Было опреде тепо, что при генетическом маркировании мРНК вируса КЧС в консервативной в области, котирмотцеп бечки-предтнеетвенники гликопротсина gp44/48 с помопгыо проб на 27% бочьше, чем при испочьзовапии ку чьгуры к геюк

При маркировании мРПК вируса ВД КРС (рис 2) праимср Л»1гсу исттотьзовалн д 1я сшпеи первой цепи кДНК, комплементарной вирусной РНК ВД КРС, в реакции обратной транскрипции а нтькипи праймер - №4атр1 в но шмеразпои реакции дчя синтеза второй цепи кДНК Затем оба праимера

№4лпр1 5'-ggaagggatacaacgggc-j'

MADL IGGGACGGAAGGGATACAACGGGCAAT1254

bDl A 1254

OREGON А 12 54

STP9U С С A G Í5 T 1251

1SLOS3 А С 1251

№lie\ Ь ' -cccagccagaccttagat- J '

HADL TACCAGGGTCGGTCTGGAATCTAGG^APAT 22 3?

SD1 T 2238

OREGON T 2238

ST890 Д A G С G G 2238

C8LOSS T AT T 0 223 f

Рис 2 - Участки выравненных нуклеотидных последовательностей вируса ВД КРС, имеющих наибольшее сходство

испольюва 1и тля амплификации участка тенома вируса в иолнмеразнои ценной реакции Анализ считали положнтечьным, если протуктПЦР соответствовал ожидаемому рлзмерч фрагмента в 997 нуклеотидпые пары Результаты, проведенных экспериментов показали, что но юл-стие тытые анаитзы продуктов ГЩР полу чаш тотько тогда когда в качестве матрицы использовали кДНК вируса вирусной тиареи Анализы были отрицательными, когда использовали кДИК вируса ктассическои чумы евинеи

Сконструированные маркерные системы с помощью ОТ-Г1ЦР обладают высокой специфичностью Сокращают время нсслечозания биотоптческнч образцов с 192 часов на м н.т\ ре к теток до 28-30 часов

2 2 2 2 SI Ss-мартснровлнне нукчеотн iin,i\ после товдте тт.ностен Fusob.ictci nun neerophoi um

2 2 2.2.1. Выделение суммарной ДНК F iiecropliorum из биообразцов с использованием нротенпазы К (10 мг/мл) и 10% СТАВ

Нами разработаны гье мо тифнкацнп по вычел .чтию геномной ДНК rusobacierium nectophorum В первой - основная ипрогениизания ДНК rusobdcteiium доститается обработкой нротенназои К при ■4-55°С в течение 18-20 часов с постечующсн дополните тыюи обработкой фено т-\ юроформеннои смссыо п осажтенисм этанотом (рис!) Во второй - основная тенротстиш зацпя ДНК осмцсствпяется обработкой 10% С ГВ при 180еС в течение 1,5 часов с нос телу ющен юно пште п>пои обработкой фенол-хлорос] орменнон смесыо и осаж тенисм этанотом Д тя качественной оценки выделенной ДНК проводили рестрикцию ферментами 1 coRl Akil, llindlll llaclll, Bamlll, Salí XBal, MspI

затем j гекчрофорез в 1% агарозе с нанесением в "карман" 5 мкл гнчро нтзованнои ДНК Вт.ие тение считали у довтетворшемтытым носкочт.ку пашвная ДНК быта

видна в виде полосы, а после гидролиза эндйнуклеазами EcoRl. A luí. i lindlll, I laelll - iî виде нескольких фра! ментов разной длины.

M

Рис, 3. - Геномная Д1Ж F. пес гор ho ru m шт. «Чнк-1020», выделенная с помощью протеиназы К ( 10 мг/мл); M -маркер плаз ми да pUC18 гидролизованная AluI;

! - ДНК F.necrophorum, внесено в «карман» 5 мкл; 2 - ДНК F.necrophorum, внесено в «карман» 3 мкл

I ¡роверка чистоты выделенной ДНК, Проверку качества выделения ДМ К по двум вышеописанный методикам осу пест идя л и по Маниатис Т., Фрич Э„ С) мору к Д. (1984). Делали два замера плотности раствора ДНК пробы на спектрофотометре марки СФ-26 при длине волн: Ш60 им и 13280 им. Если соотношение величин плотности 0260/0280 равно 1,8. то это показатель свободной от белков выделенной ДНК. При использовании

модифицированных нами методик получали соотношение величин плотности раствора ДНК 1)260/0280 равное 1.74-1.75.

2. 2, 2.2.2. Конструирование полимеразион цепной реакции для выявлении Fu sob а с te riu ru necrophoriim

1 IpH разработке маркерной тест-системы столкнулись с тем, что в отечественной литературе мы не нашли описания ии одного референтного штамма ¡5йзных подвидов F uso bacterium necrophpnim. на что указывали в своих работах р.И. Соломаха, Л.В. Кирилов. Н.Н. Кружков, Е.Г. Лавченко, З.М Межнева (2000). Поэтому экспериментальные исследования проводили, ос новы в а яйь на данных по последовательности l'usobactcrium miclealum subsp. nucléatum шт. А ТСС 25586. 1 la м и были синтезированы несколько пар прайм еров к нуклеотидным л ос ледо вателъноетям повторов (транспозонои|) в разных областях генома: TR 1001088- 1002569. TR 1443345 - 1443968, TR 369003 - 370178, TR 483480 -484138 и TR 896181 - 896900, которые Прилегают к нескольким генам кодирующих гемолизин. I Доведенные разведочные 11ЦР показали перспективность области TR 483480 - 484138 и эти результаты согласуются с исследованиями A.L.M. Hodgson, L.A. Nicholson, TJ. Doran. L.A. Córner (1993).

С учетом опубликованных данных но секвенированию отдельны*

фрагментов ДНКГ Fuso bacterium necrophorum были вы бра..... и синтезированы

праПмеры в области, характерной для вирулентных штаммов Fusobacteríum, которая отсутствует в сопутствующей микрофлоре, такой как стафилококки, стрептококки, микрококки, кишечная палочка, 11 рай мер №1 I и №12 для синтеза с помощью фермента Tag-полимеразы, фрагмента в 558 нп геномной ДНК в

полимеразпой цепной реакции. Внутри рнигеь.'ро.чаиного фрагмента был заила-пиронац сайт рестрикции МI, но которому нарабощнный фрагмент после [ идро.тнча должен образовать два меньших фрагмента в 197 и 358 нгт,

С помощью (наружных) праймеров №1! и №22 в ПЦР синтезировали фрагмент и 55К ни. ил матрще ДНК кульг.ры ¥. Ж'ОГорЬогчт «Чик-!020|, Оаиак« при постановке III [I1 с наружными праймерами полоса синтезированного фрагмента ДНК" в геле 1% агарозы была очень слабой. В то же время общее количество суммарной ДИК микроорганизмов. выделяемых из проб патологического материала было значн тельным. Это свидетельствовало о большом примеси Д1 !К сопутствующей микрофлоры п о малом содержании в образце ДНК I". песгорйошт. 11отгому после синтеза, клонирования и секвеппроиаппя фрагмента Д11К культуры «Чнк-1020» сиитезиШвйл внутренние (гнездовые) пранмеры: №01] и №022. Их йШОльзонали для усиления положительного сигнала при проведении реамп.тифишшп, С помощью прайм еров №01 I и №022 синтезировали фрагмент внутри первого и 289 и.п.

I !ри проведении испытании гест-системы на специфичность выделили ДНК из культур микроорганизмов (рис. -I в табл. 2), наиболее часто встречающихся при

4 % ... Ж,,. . 6 7

Si 9 ЮМ II

Рис, 4. - Результат ы проверки па специфичность праймеров №1 I и №22; 1 - E.eoli; 2- ¡..сой J И103; 3- Str. pyogenes; 4- Prot, vulgaris; 5- Bac.subtilis; G- Si.aureus; 7-1. necroph. M5/1; 8- Г. necroph. M5/2; 9- V. necroph. M5/3: >0- !■". necroph. «Чик>>; 1 I-дисти лд вода. М- pUCI8/Alul

кекробактериозных поражениях, а также имеющих схожую клиническую картину: Staphylococcus aureus. Staphylococcus album, Streptococcus pyogenes, Streptococcus epidermitis, Escherihia coli, Saimonela dublin, Proteus vulgaris.

Таблица 2, Результаты исследований на специфичность, прайме ров тест-системы

К». п/п Наименование культуры ПЦР с п ран мерами

наружные Внутренние

1 Staphylococcus aureus Отрицательно Отрицательно

2 Staphylococcus albus Отрицательно Отрицательно

3 Streptococcus pyogenes Отрицательно Отрицательно

Streptococcus eptderfnims Отрицательно Отрицательно

5 Escherihia coli Отрицательно Отрицательно

6 Salmonella Dublin Отрицательно Отрицательно

7 Proteus vulgaris Отрицательно Отрицательно

К «Чик-1020»» ГПУ ИЗВСиДВ Положительно Положительно

9 I-. necrophorum. ВИЭВ-J Отрицательно Положительно

К) F, necrophorum, ВИЭВ-2 Отрицательно I !оложительно

N F. necrophorum, ГНУ ИЭВСиДВ Отрпцател ьно Положительно

12 Дистиллированная вода Отрицательно Отрицательно

Для дополнительной проверки специфичности гнездовой IIII!' осуществили идентификацию культуры «Чик-1020» ГНУ ИЭВСнДВ, отнесенного к ¡:. пеегарИошт с Помощью ПДРФ-ПЦР анализа (рис. 5). С этой целью провели гидролиз большего фрагмента эпдонуклсачой М^р| и получили генетический профиль (паттерн), состоящий из двух фрагментов длиной и 359 и.п. и ЮТ н.п. 11ослс

Рие.5. Гидролиз ам л ли кона эндонуклеазой Mspl: М - плазмида pUC18, гидролизованная Alul (маркер).

1. Продукт амплификации изоляiа "Чшс"

2. Продукт гидролиза ам пли ко на Mspl

• * *

гидролиза внутреннего фрагмента ДНК в 289 н.п. получали генетический профиль (паттерн), состоящий из двух фрагментов длиной в 121 н.п. н 178 н.п. Размеры этих фрагментов совпадали с ожидаемыми. На основании вышеизложенного можно заключить, что фрагмент, синтезируемый па матрице ДНК культуры F. necrophorum

«Чик-1020» ГНУ ИЭВСиДВ по последоватедытосгп обеич пар праимеров (наружных и виу ipennnx) п местоположению сайта рестрикции можно отнести к вирулентному подвиду Г neciophorum subsp пссгор1тогит Далее провели опреде юние пукпеотидпои последовательности по двум цепочкам ДНК, иснолыуя общепринятую методику Максама-Гилберта При сравнении фрагмента ДНК ку тьтуры «Чик-1020» I НУ НЭВСиДВ (AY241175 gi 31087943) с последовательностью ДИК hit FnSI установили что они совпадают с последовательностью шт FnSI Г necrophorum subsp necrophorum за исключением одной дсчецин G в позиции 15 и двух вставок соответственно Л и G в позициях 441 и 538 нп Чувствительность разработанного способа гнездевой ПЦР для диагностики некробактериоза составида 12,0 пг/мкл суммарной ДНК

Было обращено внимание на то, что практически в большинстве случаев фрагмент ДНК Fusobacterium necrophorum, где были животные с хроническим инфицированием, визуализируется только после использования двух пар праймеров наружных и внутренних Исключение составляли случаи после острого заболевания некробактериозом (без медикаментозного вмешательства), при которых после проведения ПЦР с наружными праймерами визуализировался больший фрагмент Однако после нескольких пассажей на печеночной среде культуры Fusobacterium утрачивали это качество и визуализировались только после проведения дополнительно ПЦР с внутренними праймерами Это ориентировало на малое число копий тестируемого фрагмента в полной последовательности ДНК Fusobacterium necrophorum

2 2 2 2 3 Совмещенная гнездовая иолимеразиая цепная реакция (two in one nested PCR) для выявления rniroi еипых Fusobacterium nccropboruni

По пшеразную цепную реакцию проводили в два этапа в объеме 25,0 мкт

Первый паи - ПЦР с наружными праймерами проводили аналогично, чю и при раз тельном проведении гнездовой реакции при следующем режиме прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл затем денатурация при 94°С - 0 3 мин, отжиг - при 5б°С - 0 4 мин и синтез - при 72°С -

0 6 мни - 30 цикдов Далее один цикл - пауза 5,0 мни при 72°

В юрой нап - во время паузы в 5 мин в каждую пробирку вносит по 3,0 мкл смеси второй пары праймеров №№ 011-022 Амплификацию продолжали при температуре отжига 60°С С помощью наружных праимеров №11 и №22 синтезировали фрагмент в 558 и п, а с помощью внутренних праимеров №011 и №022 -фрл1меш внмри первою в 289 н п

Результаты исследовании учитывали по наличию специфических фрагментов ДНК в подожительном контроле размером в 558 н п или в 289 н п Исследуемые пробы счшапи отрицательными, если в них не быдо выявдено никаких полос, иди полосы не соответствуют по размеру фрат менту в контрольной пробе Документирование поименных результатов проводили с помощью цифровой фотокамеры

Совмещенное проведение гнездовой ПЦР но выявлению naioieniibix

1 usobactenum neuophoium позволило сократить время выделения геномной ДНК при использовании 10% СТАВ с 22ч до 5ч снизить стоимость выдепения в 3 раза, сократить время проведения реакции на 2 5 часа и сэкономить реакшвы на проведение 50 реакций ПЦР

2.2.2, 2. 4. Мулыиилбксиая полнмеразная цепная реакция для ген отпирован и я культур Fusobaeterium пес гор h и г um

Одним из немногих признаков, позволяющих дифференцировать подвиды Fusobaeterium пес го pli о rum, является способность F.n. subspecies necrophorum агглютинировать эритроциты птиц (T.Shinjo, К. Hiraiwa and S. Miyazato, 1990; T.Shinjo, T. Fiijisawa and S. Miyazato, 1991 ; L.A. Nicholson, C.J. Morrow, L.A. Corner and L.M.Hodgson, 1994; Z.L. Tan, T.G. Nagaraja and M.M. Chengappa, 1994; О.И. Солом axa, J],В. Кирилов. H.M, Кружков и др., 2000).

Достоверным критерием по выявлению Fusobaeterium necrophorum и разграничению их на подвиды будет определение у них общих генов и гена гемаплютинина с помощью мультиплексной одношаговой ПЦР, В реакции в объеме 25 мкл при температуре отжига в 56°С использовали в одном варианте одновременно три пары праймеров: №210-220, №180-191 и №2I5-2I6GN (рис. 6, 7). В другом варианте в реакции участвовали две пары праймеров: №17-19 и №¡80-191.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 (0 11 12 13 14

I4ic.ii.- Генотип к рование культур Fusobaeterium nccroplwrum с помощью мультиплексной ПЦР по трем генам: протеина оболочки, ДНК-гиразы, гемагглютинина: -Л I - №1. 2 - №2. 3 - №3, 4-№4, 5 - №5, 6 - №8. 7 - №9, 8 - К- , 9 - №12. Ю- №13, 11- №15,12 - Staf. aureus, 13 -Strepi .albus, .14- Ii.coli (фрагмент исследований)

36 37 38 39 4« 41 42 43 44 К- M

Рис.7.- Генотипирование

культур Fusobaeterium с помощью ПЦР по трем генам: протеина оболочки,

гемагглютинина. ДНК-гиразы; 36 - №4Км, 37 - №2В, 38 -М2, 39 - №7Кр. 40 - №5Р, 41 -№6Р, 42-ЮАл, 43 - №11 Чк, 44 - №12Кр, К- дистилл, вода, М pUC18/Alul. (фрагмент исследований)

Анализ считали положительным, если размеры амтикопов

соответствовали соответственно в 906, 645, 370 и 645 228 и п Маркером служила ДНК pQPR, гидролпзованная ИаеШ Далее провели генотиппрованне культур rusobacteuum necrophorum с целью их идентификации с помощью мулытш текепои одпошаювои ПЦР по ipe\i lenaM - -но ieiiu белка оболочки (гроВ), фермента ДНК-гпразы (DNA gyrase В ) и гемагпнотпнина (ompH) и одной межгеннон вставки (16S-23S лсйкотоксина) Для сравнения использовали ДНК, выделенные из баыерии штаммов Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и Escherichia coll Резудыаш бычн гюлолсшелыгыми, если ДНК кулыуры относилась к виду Hisobacteriuin necrophorum, и были огриц гтелытыми, если ДНК было выделено из сопутствующей микрофлоры

Для подтверждения специфичности тестируемых тепов бедка ободочки (троВ), фермента ДНК-птразы (DNA gyrase В protein), ген гемагтлюгннина (ompll) и спспсср 16S-23S лейкотоксииа мы ттаработали ати фрагменты на матрице ДНК соответствующих культур № 8(8TS630501) № 12( 12TSK630501 и № 27 (27TSM630501) и провели секвенирование

Анализ нуклеогнчных последовательностей синтезируемых фрагментов проводили методами выравнивания с другими опубликованными нос тедоватечьностями Усыновили, что рассматриваемая нуклеотидная нос тедотзателыюсть вставки 16S-23S лейкошкеина изоляа № 8(81 S630501) совпадала с нукчеогиднон после ювательтюстью культур Л"" 12 (12 ISK630501) и №27 (27TSM630501) и штаммов Гп subsp necrophoium Гп 48 (АГ410959) и ICM3716 (ЛГ410965) и Гп subsp lundulilorme Гп 513 (ЛГ410961) и JCM3717 (АЬ410967)

Определили, что нуклеотидная и аминокислотная последовательности гена гроВ ку тыуры №8(8TS630501) совпадают соотвественно с последовательностями кулыур № 12 (12TSK630501), № 27 (27TSM630501) и штаммов Гп subsp neciophorum А I СС 25286 (А1-527637) и на 30% с I п subsp tundulifoime тпг А ГСС 51357 в районе 3' - кошта

Нуклеотидная и аминокислотная нос юдоватсльности исследуемою фрат мента гена ompH (т ен гемат i дютитшна) к\льтуры № 8(8ТЬ630501) совпадает с пос 1словагечыюстыо культур № 12 (12FSK630501), № 27 (27 1 SM630501) и штамма и 1 n subsp necrophoium AT СС 28256

Нуклеотидная и аминокислотная последовательности исстедуемого фрагмента тена фермента ДНК-гиразы (DNA gyrase В prolem topoisomerase II) культуры № 8(87S630S01) совпадали соотвсственно с последователытостямтг штаммов f n subsp neciophoium NCTC10576 (AY372007), Inl (AY370663) и 1 n subsp iunduhlorme Гп45 (AY370665), а ыкже с иоследовагечыгосгями кулыур № 12 (121 SK630501) и № 27 (27 TSM630501) Из полученньк гапных с тедуег, ч'ю шффереицирующнм признаком межд\ 1 n subsp necrophoium и 1 n subsp fundulifoime является ген iемагглютинина имеющийся только у Гп subsp neciophorum

1 аклм образом на основании атмдтма результатов исследований, впервые в РФ сконструирован вариант му ндлтлексноп одношаговои полтгмеразной цепной реакции пригодной для reiroiннировапия выделенных кугы\р rusobacteuum necrophoium Эта реакция обладаем специфичностью, гак как согласуется с г не повой ПЦР и высокой чувствительностью в 10 пг/мкл

2 2 2 2 5 Идентификация и депонирование штаммов Fusobactcrium necrophorum subsp necrophorum

В процессе исследования культур Fusobactenum necrophorum, выделенных от больных животных в разных регионах Российской Федерации, согласно «Методический указаниям по лабораторной диагностике некробактериоза (Утвержд ГУВ Госагропрома СССР, 1987), было отмечено следующее С увеличением числа проведенных пассажей на питательных средах количество положительно реагирующих в гнездовой и мультиплексных ПЦР уменьшалось (от 3-го к 23-му пассажу) и далее стабилизировалось Так, из 40 культур из Приволжского региона в начале исследований 4 культуры, не-/Смотря на морфологическое сходство с Fusobactenum и патогенность для белых мышей, по результатам ПЦР были отрицательны В последующем с увеличением числа пассажей их стало больше Копичество положительно реагирующих стабилизировалось на 10 культурах Аналогичную картину наблюдали и с культурами, выделенными в Западно-Сибирском регионе, где из 7 положительных культур в начале исследований, осталось стабильно положительными 2

Мы полагаем, что при проведении диагностических исследований согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике некробактериоза (Утвержд ГУВ Госагропрома СССР, 1987) наряду с Fusobactenum necrophorum выделяются и не идентифицированные (uncultured) Fusobactenum, а также Fusobactenum pseudonecrophorum и другие анаэробы, морфологически схожие с F necrophorum, но обладающие несколько большей энергией роста Доля чистых культур при этом способе составляет около 30% (т е около одной трети от всех выделенных анаэробов) Об этом сообщали и зарубежные исследователи Tajima К , Arai S , Ogata К , Nagamme Т , Matsui Н , Namakura М , Aminov R I and Benno Y (2000)

По результатам генотипирования культур выбраны две^ как наиболее характерные представители Fusobactenum necrophorum subsp necrophorum штамма штамм № 8(8TS630501) и штамм № 12 (12TSK630501) Принадлежность, которых к подвиду necrophorum подтверждена установлением нуклеотидной последовательности генов транспозона, белка оболочки, топоизомеразыИ (ДНК-гираза), гемагглютинина и межгенной вставки (16S-23S лейкотоксина) Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов приведены в GenBank/NCIBI locus DQ417656 [gi 89891991] (ДНК-гираза, топоизомераза И), DQ417657 [gi 89891993] (спейсер), DQ335667[gi 84872488] (белок оболочки) и DQ341278[gi 85002770] (гемагглютинин) Эти два штамма были депонированы по заявке двух институтов ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и ВНИВИ (г Казань) в НИИ «Коллекции культур микроорганизмов» ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» Fusobactenum necrophorum subsp necrophorum штамм № 8(8TS630501) №1705/B-1075 от 8 сентября 2005 г и Fusobactenum necrophorum subsp necrophorum штамм № 12 (12TSK630501) №1895/ B-1076 от 8 сентября 2005 г Данные штаммы Fusobactenum necrophorum subsp necrophorum могут быть использованы при разработке диагностических систем и генетическом маркировании изолятов Fusobactenum necrophorum

2.2 2 2 6 Изучение геномного полиморфизма культур rusobacteilinn necrophorum с помощью RAPD-ПЦР

В настоящее время широкое распространение получила технология полимерашоп цепной реакции (ПЦР) Для выявления генетическою

по шчорфизмау разных групп ор1анпзмов она широко испотьзусгся с коро1кмчп с 10-15 ни праймерачи со «с туманной», произвольно выбранной последовательностью - RAPD-анализ (iadon amplified polymorphic DNA)(C А Булаг, О К Кобаев, 11 В Мироненко, Ф М Ибатулин Л А Лучкина, Л В Суслов 1902, ИЛ Шатпнян, Л Л Гинцбурт, 1995, IGK Williams Mk ПапаГеу, IA Rafalski, S V Fingey, 1993) Метол RAPD-чарксров позволяет получать боты нос число маркеров, рассеянных по всему геному, поэтому такие маркеры удобны для построения генетических карг (10 П Алтухов Е А Салчепкова, 2002, И А Шатиняп, АЛ Гинцбур!, 1991 CP Joshi, 111 Nguyen, 1993, J (, К Williams, M К Hanafey, J A Raialski, S V Tingey, 1993) )

При анализе ДПК-паттериов, для установления уровней родства очень важен выбор о нпопук теотидныч нрайчеров, которые давали бы наибо iee информативные картины теномното полиморфизма F necrophorum Из проанализированных 50 олигонуклеотидов были выбраны и синтезированы следующие десятинуклеотидиые праичеры №13, №16, №18, №20, №21, № 023, № 0023, № 27, № 28, № 36, № 38, № 44, № 48, № 50 После осуществления МЦР и сравнения полученных паттернов, выявили, что не всс сконструированные нами праймеры были пригодны для внутривидовой дифференциации изолятов Г necrophoium Малоинфорчативиычи оказались опшонуклеотды № 16, 18, 20, 21, 0023, 28, 36, 44, 48, 50 Результат геногипнроваппя с оставшимися пранмерачи приведены в таблице 3

Таб ища 3 Значения величии индексов подобия при попарном сравнении базовых культур с пзолятами 1- песгорЬогштт в Запдлной Сибири

1С>лы\'рм Ксчеров об п ВИЭВ Новосибирская область \.| 1.1111. К кран I ОМСК обл

I Кеч 215 3 М21 4 Кр | 5 Р | 6Р 7 Л II 8 1С

Праичер № 13

3 412 0 61 0 75 - 071 0 57 0 57 0,47 lit IKCli i

2 НИ JB-I 0,87 - 0 75 0X0 0,63 0 86 0 46 11L lieL. I<_ 1

(> Р 0 67 0,80 0 67 0 77 04 - 0 38 не ncciei

Прлйчср .V» 023

3 М2 0 то 0 55 - 0 62 0 1 3 0 40 0 20 HC lleCTcJ

2BI11B-1 0 14 - 0 36 0 46 0 27 0 44 0 44 Hi. иес ic г

6Р 0 15 0 44 0 60 | II 36 0 57 - 0 50 lit IKC 1CH

Пранмер „М1 27

3 М2 0 50 0 20 - 0 77 0 20 0,22 0 25 He ncuic I

2 В1П13Л 0 50 - 0 60 0 44 0 33 0 60 0 50 Hi. IicC Ti. 1

(» [' 0,29 0 40 0 44 0 25 08 - 0 67 He net. IU1

Праичер № 38

3 М2 0 86 0 42 0 77 0,40 0 92 0 92 -

2 ВТ! Л!-1 0<Л - 1 00 0 92 0 50 0 01 0 78 0 48

6 Р 0 so 0 86 0 42 0 71 0 59 - 0 71 0

Анализ величин индексов подобия при попарном сравнении изо тягов относящихся к патогенному виду Fusubactenum necrophoium, показа!,

что наиболее пригодным для ген оптирования был лраймер № ЗУ, Проведений генотипировапие с помощью «произвольных^ олитнуклеотндов.

прайм црующих геномную ДОК Н.песгорЬошт выявило высокую степень гомолог ни всех изолятоа со штаммам №28 (ВИЭВ), кроме изолята Раздольное Лг,.'5 и - из свинокомплекса, где индекс схожес ти был низким и составил 0,50. При попарном сравнении ДНК изолятов культуры №3

М2(ИЭВСнДВ) с Д1 !К культуры №6 также была выявлена низкая степень подобия 0,40 и 0,59 с культурой №5. Следовательно, в хозяйстве «Раздольное» НСО выявлена циркуляция двух вариантов патогенных Г. песгорЬогшп, которые морфологически схожи. Культура №й более патогенен для белых мышеи, чем культура №5.

Был получен спектр паттернов при проведении ИЛ 1'10-1 11 И1 с помощью нраймерд №38 и проведен их анализ ДНК культур Г. песторЬогит, выделенных от животных разных регионов Западно-Сибирского округа ¡рис. 8). Для распределения изучаемых изолятов Г. песгорИогшп по группам связанных с общностью их

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 М

Рис.8. - RAPD-ПЦР анализ ДНК F. necrophorum, выделенных от животных Западно-Сибирского округа с помощью иранмера №38: I -Str. Epidermity, 2 - Staf. Album, 3 - E. coli, 4 - №[Жр. культура 3 пассаж, 5-№8Чик, 6 - №7Ллт., 7 - №6Р., 8 - №5Р.. 9 - №4Кр. культура I пассаж, 10 - 3 М2 (ИЭВСпДВ), 11 - 2В (ВИЭВ-1), 12 - №1 Кем., М - маркер

риешАМ

происхождения был проведен кластерный анализ полученных паттернов. Генетические связи между культурами Fusobacterium necrophorum, выделенных из разных регионов Западно-Сибирского округа изображены на денлрограмме (рис»), построенной па основании RЛРD изменчивости, выявляемой с использованием праймера №38. Кластерный анализ разделил изучаемые культуры на два кластера, В один кластер, отмеченный малой стрелкой, с двумя субкластерами вошли четыре культуры Fusobacterium necrophorum: №3 М2(ИЭВСнДВ), №5Р, №6Р и №7Алт, Из них наиболее генетически схожими были №5Р и №7Алт. К ним примыкает культура №6Р. Отдельной ветвью стоит культура №3. В другом кластере, отмеченный большой стрелкой, объединены пять культур Fusobacterium

8

6

4

О ------------

365721489

Рис. 9. - Дендрограмма распределения культур Р песгор1тогит, выделенных от животных Западно-Сибирского региона по результатам кластерного анализа По вертикали показаны генетические дистанции, а по горизонтали даны номера изолятов 1-№1Кем, 2 - 2В (ВИЭВ), 3 - М2 (ИЭВСиДВ), 4 - №4Кр культура 1-й пассаж, 5 - №5Р , б - №6Р , 7 - №7 Алт, 8 - №8Чик, 9 -№4Кр культура 3-й пассаж культуры №4К

пеиорЬошт №1 Кем , 2В (ВИЭВ), №4Кр , №8 Чик, №9Кр культура 3 пассаж Наибольшее генетическое сходство проявнчи культуры №1Кем, №4Кр а затем культуры №8Чик и №9Кр 3 пассаж Неско тько отдельной не!выо сюит культура №213 (ВИ )В) Проверенные псстедования показали возможность выявляй, генетические связи между различными культурами Г песгорЬогит Установлена циркуляция в одном хозяйстве двух вариантов патотеннои Г песгорЬошпт №5Р и №6Р, которые тенетически разно удаленных как но отношению к культурам №1Кем и №4Кр) так и к культурам №3 М2 (I НУ ИЭВСиДВ) и №2В (ВИЭВ)

При тестировании культур из Привопжского региона испочьзовали ранее апробированный «произвольный» праймер № 38 5'-дсддсдддсс-3' Результаты сравнения полученных ДНК-паттернов (табч 4) позволили разделить про гсс тированные ттзоляты по уровню схожее I и к нук1Согиднои нос тедователыюсти культуры № 3430 на три Iруины Одна из них (11 из 36) с высоким уровнем схожести от 0,73 до 0,90, чрутая группа (6 нз 36) со средним уровнем почобия от 0,53 до 0,73 и третья группа (18 из 36) с очень низким уровнем схожести от 0 13 до 0,53 Из пи\ данных следует что, на территории округа циркулируют культуры Р песторЬогштт с различным уровнем юмоютии, тде низкий уровень схожести среди них занимает значительное место По результатам ЯДРО-ИЦР провели кластерный анализ для распределения изучаемых культур ГтьоЬастепит песгорЬогит по тру пнам связанных с общностью их происхождения I енетические связи между кулыурами Г песгорЬогит, вы деленных из разных регионов Приволжского округа, изображены на дендрограмме (рис 10) Она построена на основании КАРО изменчивости, тзыяв тяемой с использованием праймера №38

Таблица 4 Значения ветчин индексов подобия при попарном сравнении кулыур I neciophorum, выделенных в Приво тжеком регионе

Примечание «Ь> - по юани, тьныи резу тыа[

N П.шмспоплп IipoOllj lwn.ivpil Выпилите in IIIUHHOII.I Уровень 1 омо ioi mi N пробы Il.lIIMlIIOnJII Н\ u>»\ pi 1 Hi.i'.iii leiiue ip ШСШНОНЛ Уровень 1 0\1(l 1011111

XICKhOUlk,!!! GO 1KI! (HI HKTI) 1 ill apci III

2 | 3430 | 1- | 1 00 3 С пМ + 0 73

11ИИСХКС 4 \Л t 0 S3

1 ! S9 4 | - | 0 S3 5 111 r 0 13

ни ЛЗ 10 С-(> ) 0,13

213 | HIt)!3-l • | 0 40 1 1 ДЦ , 0 13

( ар и okl к i;i об uci i 12 В К l 0 13

8 | К | t | Oftl 13 \||14| i 0 88

Ь нпкарнк тан 14 1ч lit bi.uisuui 0 88

Ч | 1 l.Tii | г | 0,13 И Л,1-14 0 13

Марии ') 1 16 \ 1-12 + 0 13

20 МНЮ о х", 17 То 1 1 0 80

27 М11Ю-2 0,13 18 Ус11 0 13

28 МПЗ 0 13 35 1>-2 t 0 13

2<) Рк < о п 36 Vk 1 II 13

30 МК о и 38 ВУП 0 13

С 1М ф'-Ь ш об йен 40 111 а к 0 13

0 С К к 0 40 Ульяновская об ¡аиь

7 1907 - 0 88 23 УВР | + 0,67

21 ( 1 -г 0,73 24 Кг | + 0 T 3

22 Искра he иыяи 1ui 0 73 25 С киям t 0 36

У iMvpnni 34 УММ + 0 78

I"1 Р\1 о п

33 Р-4 0 п

14 М(ък lit HI IMBIJWI 0 78

Ктастерпыи анализ разделил изучаемые кулыуры на три кластера (рис 10) один из них срсднии включал два субкластера Наиболее разнородный среднип к lacrcp (одна короткая стрелка), объединяющий кулыуры, выделенные в Ульяновской об не in (№24,25,39), республиках Мари Эл (№27,28,29,30), У тм\ ртег ой (№-32, 33) и Р 1 агаре тане ( №5, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18 36, 38) Слсд\ег огчетпгь в этой группе два субкластсра В один входят №35 и 40 (Р Татарстан) а в друiой - №3 и 25 (соогвссгвенно республика Татарстан и Ульяновская область) От тельной ветвыо слоит культура №4 (Р 1агарсган) Во второи кластер (две короткие стрелки) вошли культуры №7, 21, 22 (Самарской обл), №13,14, и 17 (Р Татарстан), №>23 (Ульяновская обл ) и №1 (11ИИСХ Краннето Севера) В греши кластер отмеченный длинной стрелкой входят две куп,туры имеющие от тленные т енсл ичеекпе связи с культурами двух ару тих кластеров Это ку тьгура №6 (Самарская обл ) и №2 (Московская обл )

гЧ 1

jjL i JL fi? х,

6 40 39 37 33 31 29 27 24 18 15 II 9 5 25 23 22 7 20 1 2 35 38 36 32 30 28 26 19 16 12 10 8 4 3 17 13 21 14

Рис. 10. - Дендрограмма распределения культур F. neerophprum выделенных и Приволжском регионе по результатам кластерного анализа RAPD-ПЦР с праймером №38. Но горизонтали даны номера нзолятов, по вертикали - генетические дистанции.

Исследования полиморфизма ДИ1С культур F. necrophorum выявили неоднородность их популяции. Далее нами были испытаны в RAPD-IIU.P еще несколько произвольных праймеров: с №55 по № 65. Эти праймеры были выбраны на основании анализа ну клеотидиых последовательностей генов, кодирующих белок оболочки, а № 38/1 - белок лейкото ксина. 11аиболее информативными оказались праймеры № 38'1 и №60 в паре с №ó 1.

При анализе RAPD - спектров, полученных с помощью праймера №38/1 51 -gcggcgga-.u 3' были выявлены характерные для большинства исследуемых и юля гон фрагменты. Методом кластерного анализа были определены генетические расстояния между изолятами. На дендро: рамме (рис, I 1) выделяются два основных кластера: в первый входят и золя ты № 9, 8, i 2, 2. 19и 16; во второй -№ 41, 2В н 40. И отдельные кластеры вхолят № 20, 22. 34.

При проведении RAPD-аналнза одновременно с пранмерами № 60 и № 61 (рис.12) соответственно 5'-gcttatggtgc-3' и 5'-gcatatggggc-3' выбранными но нукпеотндиым последовательностям белка оболочки, были определены расстояния связывания кластеров среди исследуемых культур. На дендрограмме выделяются два основных кластера: в первый входят и зол ять № 19; 2, 41, 17 и 1; во второй - № 8, 27. 12 и 13. В отдельные кластеры входят № 34 и 37.

Каждый из основных кластеров (рпс.11) представляет собой смешанную группу. Так степень сходства (праймер №38/1) между основными кластерами находится на уровне 0,42-0,54, что ориентирует на значительный полиморфизм между изолятами данной выборки но патогенности, У двух основных кластеров (рис. 12) полученных с

11 -

ю : --

9 --

8 --

7 --

6 -J-

5 -—-

4 --

3 --

2 . --

1 --

О -------------

20 34 41 2В 40 22 9 8 12 2 19 16

Рис 11. - Дспдрограмма 12 изолятов rusobactcrium nectophorum, построенная по резу чматач RAPD-апачиза с прапмероч № 38/1 По торизонталп номера культур, по вертикали тенетические дистанции

и

ю -

9 --

8 -1-

? --

6 --

5 --

4 . ............

3 --

2 --1

1 -1-

О ------------

34 37 8 27 13 12 19 2 41 17 1

Рис 12 - Дспдрограмма 11 культур fusobactermm necrophorum по резу лыатач RAPD-анали за с прапмерачи № 60-61 По i ори зон тали - номера п зотятоп по вертикали - теистические дистанции

помощью праимеров №60-61 уровень сходства составляет 0,45-0,63% Так как тги прайчеры бы пи выбраны на основании пуютеотндных последовательностей, кодирующих белки оболочки, а у ана фобов разных видов они выпошякм в основном одни и те ас функции, то и сходство межд\ изолятачи основных кластеров несколько выше Эксперименты на белых мышах с этими культурами выявили различное воздействие на животных сукон некроз подкожных тканей ити паралич конечностей, или похудание при параличе задних конечностей 1о

ecib исследуемая ipynna изотятов данного вида микроорганизмов оказалась разнородной, несмотря на морфологическое сходство

Проведенное маркирование с помощью RAPD-ПЦР и использование произвольных нраимеров сконструированных на основе нуктеогидпои пос юдовательносш деикоюксина - №38/1 и протеина - №60-№61 rusobacterium neciophorum более полно отражают степень схожести культур из разных территории в сравнении с результатами морфологических и биологических исследовании Высокие показатели полиморфизма внутривидовых генетических дистанций свидетельствуют о значительной т енегической неоднородности популяций исследованного вида Fusobacterium necrophorum Отобранные маркеры можно использовать по маркированию ДИК и паспортизации культур Г necrophorum, а также Moiyr помочь в опреде тении закономерностей появления и циркуляции тин3001 ическнх штаммов в стадах, выявлять изменчивость микроорганизмов пот воздействием различных факторов

2 2 2 2 7 Исследование белкового полиморфизма культур rusobacteiiuin necrophoium круиного рогатого скота

В нашей стране и за рубежом поиск специфических препаратов в виде вакцин и гипериммунных сывороток не принес ожидаемых результатов АС Донченко, А А Самоловов (1998) высказали мнение, что создание при некробактериозе высокоэффективных вакцин традиционными методами маловероятно В неудачах, которые долгое время сопутствовали работам по созданию специфических средств профилактики некробактериоза имело немаловажное значение игнорирование авторами неоднородности циркулирующих в природе эпизоотических штаммов Fusobacterium necrophorum

Из полученных данных морфологических и биологических исследований свойств изолятов Fusobacterium necrophorum заключили, что изучаемые культуры представляют достаточно однородную группу микроорганизмов Являются неподвижными грамотрицательными бактериями, располагаются в поле зрения в виде палочек или нитей разной длины со слабой или сильной зернистостью Согласно данных литературы длинные нити, палочки образуют не только F necrophorum, но и культуры F godiaformans, F mortiferum, F necrogenes, F periodonticum, выделяемые от животных

Fusobacterium necrophorum морфологически также схож с родом Bacteroides, культуры которых можно выделить из пищеварительного тракта (слепая кишка, рубец) Для подтверждения однородности в антигенном отношении изучаемых изолятов Fusobacterium necrophorum провели биологические пробы на белых мышах

Несмотря на схожесть изучаемых культур по морфологическим и культуральным свойствам, при проведении биологической пробы на белых мышах клиническое проявление заболевания и картины посмертного вскрытия были разнообразными Это ориентировало нас на полиморфизм белков у этих культур

При изучении полиморфизма белков культур F necrophorum базовыми культурами, с которыми мы сравнивали остальные, были №8, №12 и №27, которые нами идентифицированы и №34 не идентифицирован Из анализа паттернов следует, что наибольшее сходство отмечали у №8, №12 и №27, а расхождение с №16, №22, №24, №34 и №40 Особенно отличалась от других культура №34, которая не идентифицировалась при проведении ПЦР с разными парами праймеров и при проведении RAPD-ПЦР анализа также

занимала особое положение. Это свойство культуры №34 было постоянным, как и №8, №12 и №27. На рисунке 13 (фрагмент исследований) видно как бы две группы культур отличающихся по распределению молекулярных весов мономеров. Номера 5, 8, 12, имеют схожее распределение

М 12 3 4 5 (, 7 Н

Рис. 13.- 10% Оэ-Нц-ПААГ электрофорез бактериальных л и зато и культур Г. оесгорЬогит: 1-№5, 2 -№8, 3 №12. 4 - №21, 5 -№28. 6 -№34, 7 -№38. 8 - №йР, М - маркер молекулярного веса с верху вннз(кОа): 66—45 —36— 29—24 —20,1 —(фрагмент исследований)

12 ю s е

Рис. 14. - Кластерный анализ мономеров культур l'usobacterium necrophomm с npaihiepoM №38, По горизонтали приведены номера исследуемых культур, а но вертикали - уровни подобия.

_г" ~ i

п Хп

_____________lzl_l.

24 2Я дн 37 21 19 17 13 2 34 40 26 24 22 16 27 8 9 12 3 is i

белковых фрагментов, отличное от №№21,28, 34, 38, 6Р Методом кластерного анализа результатов электрофореза белковых мономеров культур РизоЬайепиш песгорЬогит были определены генетические расстояния между изолятами На рисунке 14 выделяются два основных кластера, В первый кластер входят номера культур 1, 3, 8, 9, 12, 15, 16, 22, 24, 26, 27 и субкластер с №2 и №13 Отдельной ветвью располагается культура №34 Во второй кластер вопли №№17, 21, 28, 37, 38 и отдельной ветвью №29

И в завершение был проведен кластерный анализ* ДНК девяти культур ГичоЬастепит песгорИотит (рис 15 и 16), дающих наиболее схожие результаты при исследовании в КАРО-ПЦР с праймером №38/1 и ею результаты сравнили с результатами кластерного анализа мономеров этих лее девяти культур ГичоЬастепитп песгорЬогит

1 -1_

13 ---

3 ---

2 -

8 9 12

15 --

27

012345678

Рис 15 Кластерный анализ ДНК девяти культур Fusobacteiium nccrophorum, дающих наиболее схожие результаты при исследовании в RAPD-ПЦР с праймером №38/1 По торизонтали приведены уровни подобия, а по вертикали -номера исс зедусмых культур

Кластерный анализ ДНК девяти культур Fusobacterium necrophorum (№№1, 2, 3 8, 9, 12, 13, 15, 27), дающих наиболее схожие результаты при исследовании в RAPD-ПЦР с праймером №38'1 разделил их на две гру ппы (рис 15) В одну вошли культуры №№8, 9, 12 15, 27 Уровень подобия между собой наибольший Во Biopyio труппу вошли №№1 3 и 13 Отдельной ветвыо вчодш №2

Кластерный анализ мономеров девяти культур Fusobacteiium necrophoium (№№1, 2, 3, 8, 9. 12, 13, 15 27) разделил их на два кластера (рис 16) В один вошли три субктаетера первый - культуры №1 и №15 в другой - №3, 12, 9 и в

ipeiiiii - №8 и №27 Уровень подобия иаибодьшнп между №8 и №27, затем у №3, 12 9 и дачес у №1 и №15 Во шорой кластер вошли №2 и №1 3

1 ---1

15 -1

з ■ -

12 ■ _

9 -

8 27

2--1_

13 -1

О 1 2 3 4 t 6

Рис 16 - Кисгернып анализ мономеров девяти культур Г usobacterium necrophorum, дающих наиболее схожие результаты при исследовании в разных шпах ПНР По горпзоптати приведены номера исечечуемых к\чьт\р а по вершка ж ровни подобия

Распре лечение по группам при проведении ктастерното анализа ДНК мономеров девяти ку плур Fusobaetcnum necrophorum совпадают за исключением №1, №3 Иссчедуемые ку шгуры при геногппировапии по генам тпоизомеразы II гранспозону, бе гку обочочкп гемат rjnorинину и спенсеру 16S-23S лейкоюкенна были идентифицированы как I usobacterium necrophorum subsp necrophorum Песте юваппя полиморфизма мономеров в течение 2-х легнето периода давачи схожие peiyibiaibi 1ю opucnrnpyei на ю, чю была проведена цтсссоциация с г рх к | х рыыч оипомеров, коюрые MOiyr быть прпюцны тля исследования в качестве маркеров структурных генов

Можно зак почить что исследуемая группа культ\р данною вида микроорганизмов ока за гась разнородной, несмотря на морфо югичеекое сходство Выявленные высокие ноказдте ш потиморфизма вну гриви товых дистанции eiiii тете н.ствуЮ1 о значите 1Ыюи бе тковои псодноро птосги популяции псе ie товаппото пи та I usobacterium necrophorum

2 2 2 2 7 Из\чеиие lenoMiioio полиморфизма млыур Мусор1лмп е помощью КЛРО-ПЦР

При анализе ДНК-паттернов, для установления уровней родства, очень важен выбор «произвольных» праймеров, которые давали бы наиболее информативные картины (паттерны) геномного полиморфизма микоплазм Из проанализированных 43 олигонуклеотидов были выбраны и синтезированы 10 После проведения RAPD-ГЩР с референтными культурами микоплазм и сравнения полученных паттернов выявили, что не все сконструированные нами праймеры были пригодны для дифференциации видов возбудителя (табл 5) Малоинформативными олигонуклеотидами для дифференциации родов микоплазм оказались №11,12, 23, 32 34, 36, 43 Наиболее интересным олигонуклеотидами, на наш взгляд, являются №15 5 '-gtttcgccca и №39 5 1 -gagegeggte Так если паттерны, полученные с помощью праймера №15 сравниваются с

М Ьоу^епПайшп и с М ЬоунпазЬРсйз Если же за репер взять шт М агцциш, то выявляется высокий уровень гомологии между остальными культурами микоплазм при использовании праймеров № 11, 32, 34, 39, 40 и 43, за исключением М ЬоущепИайит и М ЬоуипаБИМю Схожую дифференциацию выявляет праймер №39 То есть «произвольные» праймеры № 15 и 39 дифференцируют М ЬоущепЦайит от остальных штаммов микоплазм, показывая низкую с ними гомологию, за исключением штамма М ЬоуипазНйскз В данном случае, несмотря на то, что гомология достаточно высокая (индексы соответственно 0,89 и 1,0), эти штаммы не идентичны

Таблица 5 Резу 1ыаш анализа генешческих профилей штаммов микоплазм с помощью ЯДРО-ПЦР при попарном сравнении

сравнение с М bovigenitahum

рг\штамм М arginini М bovimast М bovirhinis М alcalenses М mycoides Е coll Staph aureus

12 02 - 0,2 0,22 0,22 - -

15 - 0,89 - - - - -

23 0,22 - 0,29 0,44 0,44 - -

32 0,2 0,33 0,2 0,2 0,2 - -

34 - - - - - - -

36 0,4 0,44 0,44 0,67 0,4 - -

39 0,29 0,53 0,29 0,29 0,29 0,38 0,38

40 0,25 0,4 0,25 0,25 0,25 0,3 0,3

43 0,5 0,47 0,5 0,5 0,47 0,4 -

11 0 29 0,25 0,29 0,29 0,29 0,25 -

сравнение с М bovimastitidis

рг\штамч М bovigcn М arginini М bovirhinis М alcalenscs М mycoides Е coli Staph aureus

12 - 0,4 0,4 0,44 0,44 - 0,15

15 0,89 - - - - - -

23 - 0,29 0,4 0,29 0,29 - -

32 0 83 0,33 0,33 0,33 0,33 - -

34 - - - - - - -

36 0,44 - - - - 0,44 0,29

39 0,67 0,27 0,27 0,27 0,27 0 35 0,4

40 0,4 0,2 0,2 0,2 0,2 0,53 0,53

43 0,47 08 0,8 0,8 0,7з 0,52 0,18

11 0,5 0,57 0,57 0,57 0,57 - -

сравнение с М arginini

рг\штамм М bo>igcn М bovimast М bovirhin М alcalenses М mycoides Е coli Staph aureus

12 0,2 04 0,86 0,86 0,86 0,18 -

15 - - 1 1 1 - -

23 0 22 0 29 0,75 0,8 0 8 0 25 0,29

32 0,2 0,33 1 1 1 - -

34 - - 1 1 1 0,18 0,18

36 0,4 - 0,67 0,83 1 0,2 0,25

39 0,29 0,27 1 1 1 - -

40 0,25 0,2 1 1 1 0,3 03

43 0,38 0,8 1 1 0,93 0,55 0,2

11 0,29 0,57 1 1 1 0,29 0,22

Посте проведения ЯАРО-РСЯ с референтными культурами мпкоплазм протзе 1и ко шчес1 венну ю оценку сходства между ними при по парном сравнении полученных паттернов с расчетом индекса подобия Из полученных данных следует, что референтные культуры можно разделить на две (таб 1 6) основные труппы в первую - относятся М Ьоу^епПаЬшп и М ЬохмтачШкЬч, а во вторую-М ЬомгЬпич М а1са!ечсепч, М тусон1еь, М агцпит М 1^1тачинйтч

Таб ища 6 Гепешческий по шморфизм референтных штаммов микопдазм в КАРО-РСК при попарном сравнении

сравнение с М Ьо\'^ег>иа1шт

Рг/пп лмч М агцтптпт М 1ад\ llnast М ЪомгЫп М а]са1счсепя М ту со1с!сь

39 0 29 0 51 0 29 0,29 0,29

сравнение с М ЬоуттазШк!^

Рг/ип лмм \1 а1иттп1 М Ьомткп М ЬомгЬтп М а1са!ечсепч М тусок1сч

34 0 27 0 ы 0 27 0,27 0 27

сравнение с М а! £51111111

Рг/ш гамм М Ьо\ ттпаь! М Ьо\'^епт1 М ЬомгЬт М а1са1ечсеп8 М тусотёеч

39 027 0 29 1 0 1,0 1,0

При генотипировании культур, выделенных из одного и того же хозяйства, но в разные годы, использовали выше названные праймеры На основании КАРБ-спектров методом кластерного анализа установили генетические расстояния между родами микоплазм На деидрограмме (рис 17) четко

6

5 -

4 --

3 --

2 --

1 --

О -------

М ЬоунпавПМ^ М тусонкэ М ЬстгИииэ

М Ьоу^спИаЬиш М акаквсспя М лгдтип

Рис 17 - Дендротрамма 1 енетнчеекото сходства штаммов мнконлазм в ЯАРО-аналнзе с праимером Л« 39 Но вертикали - генетические дистанции, по горизонта тн - номера культур

выделяются два кластера один включает М Ьоу^епИакит и М ЬоуттазШкйз, а другой - М Ьоу1г1т1пт5 и М а^инш Во втором кластере молено выделить два подкластера, первый из которых включает в себя М а1са1езсет, второй - М тусон^ев Микоплазмы первого кластера поражают в основном репродуктивные органы животных, а второго - органы дыхания

1сне1ические свя!н штаммов и изолятв микоплазм отражены на дендрограмме (рис 18) на которой выделяются три кластера Один из них, вк почаюшии референтный иламм М Ьоу^спПайит и четыре изолята более однороден и степень сходства составляет 0,72 - 0,81 Друтоп кластер содержит М Ьо\ и два пзоляга п степень сходства равна 0,54 - 0,63 'Греши кластер

состоит из М дгутпип и других двух изолятов глс степень сходства по отношению к дру гпм изолягам оказалась значительно меньше - 0,27- 0 36

11 :

ю; -

9 : --

8 I --

7 : ——

6 I --

5 ——

4 : --

3 : --

2 : - --

1 ; ——

о------------

Ма^тшш 09-03 15-03 М Ьоу^епПайит 13-03 06-01

01-03 М ЪоунпаБМкЬ 11-01 16-03 12-01

Рис 18 - Дентрограмча генетического схо тства референтных штаммов и изолятов микоплазч в ЯДРО-анализе с праймером №39 По вертикали -теиешческие дистанция, но тори зон тали - номера культур

В результате экспериментальных исследований выбраны олигонуклеотидные праймеры №15 и №39, сконструированные на основе анализа ДНК генов т1трЗ, ттщр (оперон М§Ра) М ЬоУтцепиаИшп Полученые данные по дифференциации видов микоплазм с помощью ЯАРО-ПЦР показали возможность их использования в изучении геномного полиморфизма родов микоплазм

Таким образом, построенные по результатам ЯДРО-анализа дендрограммы по двум видам микроорганизмов согласуются с результатами биологических исследований и, по нашему мнению, более полно отражают степень схожести родов внутри вида Исследования геномного полиморфизма возбудителей бактериальных инфекций могут помочь в определении закономерностей появления и циркуляции эпизоотических штаушов в стадах, а также выявлять молекулярную изменчивость микроорганизмов под воздействием различных факторов

3 выводы

1 Использование в эпизоотологии молекулярного маркирования генетического материала и оценке его на новой теоретической основе составляет предмет специальной отрасли знания - молекулярная эпизоотология Основными объектами и точками приложения молекулярной эпизоотологии являются индикация, дифференциация и полиморфизм микроорганизмов Теоретической базой мРНК и ДНК-маркирования является концепция комплементарности, где основной механизм выявления полиморфное™ является гибридизация Применение ДНК-маркеров решает проблему насыщения генома маркерами и позволяет маркировать практически любые участки ДНК, в том числе не кодирующие

2 Разработанные способы EST-PHK мономорфного специфического маркирования последовательностей мРНК вируса классической чумы свиней и вирусной диареи крупного рогатого скота с помощью ОТ-ПЦР позволяют помимо выявления соответствующих вирусов устанавливать циркуляция; вируса вирусной диареи крупного рогатого скота среди свиней и исключать персистенций вируса классической чумы свиней среди крупного рогатого скота

3 Разработанный способ STSs-ДНК мономорфного маркирования нуклеотидных последовательностей Fusobacterium necrophorum на основе мобильного элемента (транспозона) с помощью гнездовой ПЦР обладает специфичностью и высокой чувствительностью, которая позволяет проводить маркирование в биологических образцах патогенные Fusobacterium necrophorum

4 Диагностическая тест-система гнездовой ПЦР для выявления патогенных Fusobacterium necrophorum методом совмещения двух реакций с наружными и внутренними праймерами в одной пробирке позволяет сократить время выделения геномной ДНК с 22ч до 5ч и снизить стоимость выделения геномной ДНК в 3 раза сократить время проведения реакции на 2,5 часа и экономить реактивов на 50 реакций ПЦР

5 Сконструирована система полиморфного маркирования, основанная на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs) с помощью ПДРФ-ПЦР анализа, позволяющая проводить генотипирование изолятов Fusobacterium necrophorum, при использовании специфических наружных №11-№12, внутренних №011-№022 праймеров и эндонуклеазы Mspl, не прибегая к секвенированию ампликонов

6 Разработанный способ мономорфного STSs-ДНК маркирования с помощью мультипраймерной ПЦР может быть примени генетической характеристики и дифференциации на подвиды культур Fusobacterium necrophorum с помощью одновременно двух или трех пар праймеров к разным генам одной нуклеотидной последовательности ДНК возбудителя болезни Оптимальный вариант мультиплексной одношаговой ПЦР для генетической характеристики геномной ДНК - это использование трех пар праймеров для выявления белка оболочки, топоизомеразы И, гемагглютинина, или двух пар - белка оболочки и гемагпиотинина, где основным дифференцирующим признаком является ген гемагглютинина, присущий только подвиду Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum

7 Разработанный способ SNPs-маркирование Fusobacterium necrophorum с помощью RAPD-ПЦР и произвольных праймеров, сконструированных на основе нуклеотидных последовательностей лейкотоксииа - №38/1 и протеина - №60-№61

Fusobacterium necrophorum позволяет выявлять степень схожести культур из разных регионов Данные маркеры можно использовать при паспортизации культур F necrophorum, а также в определении закономерностей появления и циркуляции эпизоотических штаммов в стадах, выявлять изменчивость микроорганизмов под воздействием различных факторов

8 Построенные дендрограммы по данным RAPD-ПЦР анализа более полно отражают степень схожести по сайтам праймирования культур из разных территорий в сравнении с результатами морфологических и биологических исследований Выявленные высокие уровни полиморфизма внутривидовых генетических дистанций свидетельствуют о генетической неоднородности популяций Fusobacterium necrophorum в Сибирском и Приволжском регионах Степень схожести при использовании праймера №38/1 между основными кластерами находится на уровне 0,42-0,54, а с праймерами №60-61 0,45-0,63%, что ориентирует на значительный полиморфизм между культурами

9 На основании полученных данных генотипирования изолятов выбраны два наиболее характерных представителя Fusobacterium necrophorum subsp necrophorum штамма штамм № 8(8TS630501) и штамм № 12 (12TSK630501), принадлежность которых к подвиду necrophorum подтверждена установлением нуклеотидной последовательности генов белка оболочки, топоизомеразыП (ДНК-гираза), гемагглютинина и меж^-генной вставки (16S-23S лейкотоксина) Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов приведены в GenBank/NCIBI locus DQ417656 [gl 89891991] (ДНК-гираза, топоизомераза II), DQ417657 [gl 89891993] (спейсер), DQ335667[gi 84872488] (белок оболочки) и DQ341278[gi 85002770] (гемагглютинин) Данные штаммы могут быть использованы при разработке диагностических систем и защитных препаратов, а штаммы 12TSK630501 и 8TS630501 Fusobacterium necrophorum subsp necrophorum предлагаем считать референтными

10 Разработанные две модифицированные методики по выделению геномной ДНК Fusobacterium necrophorum (первая - основная депротеинизация ДНК Fusobacterium достигается обработкой протеиназой К (10мкг/мл) при +55°С в течение 18-20 часов, вторая - основная депротеинизация ДНК осуществляется обработкой 10% СТВ при +80°С в течение 1,5 часов Использование модифицированных методик позволяет получать чистые препараты суммарной ДНК от примеси белков, где соотношение D260/D280 равно 1,74-1,75

11 Результаты исследования белкового полиморфизма культур Fusobacterium necrophorum (несмотря на морфологическое сходство) говорят о высоких показателях внутривидовых дистанций и о значительной белковой неоднородности популяций исследованного вида Проведенный кластерный анализ более полно отражает степень схожести культур из разных территорий в сравнении с результатами морфологических и биологических исследований Исследования белкового полиморфизма Fusobacterium necrophorum помогут в определении закономерностей появления и циркуляции эпизоотических штаммов в стадах, а так же выявлять изменчивость микроорганизмов под воздействием различных факторов

12 Разработанная система полиморфного SNPs-маркирования культур Mycoplasm на основе RAPD-ПЦР с праймерами №15 и №39 сконструированных на основе ДНК генов mhp3, mgp (оперон MgPa) М bovigemtahum может

использоваться в популяционной генетике микоплазм Получаемые с их помощью данные позволяют разграничивать выделенные культуры микоплазм по видам

13 При проведении диагностических исследований общепринятыми методами^ позволяющими устанавливать наряду с Fusobacterium necrophorum наличие, как не идентифицированные Fusobacterium, так и Fusobacterium pseudonecrophorum и другие анаэробы, морфологически схожие с F necrophorum subspecies necrophorum, но обладающие несколько большей энергией роста Доля чистых культур при этом способе составляет около 30% (одной трети от всех выделенных анаэробов)

14 Использование в эпизоотологии молекулярного маркирования генетического материала позволяет на примерах мРНК и ДНК содержащих микроорганизмов применять различные ДНК - маркерные системы для обнаружения, разграничения по видам и подвидам, установления полиморфизма патогенных микроорганизмов При генетическом маркировании мРНК и ДНК микроорганизмов распространение получили методы, основанные на полимеразной цепной реакции В экспериментах показана возможность использовать различные типы маркеров, для индикации, дифференциации и изучения генетических признаков микроорганизмов содержащих мРНК (вирусов классической чумы свиней и вирусной диареи крупного рогатого скота) и flHK(Fusobacterium necrophorum и Mycoplasm)

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Научные разработки и положения диссертационной работы нашли отражение в нормативных документах, освоенных ветеринарной практикой

- инструкции «Тест-система для выявления Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum методом полимеразной цепной реакции с помощью гнездовых праймеров» и ТУ 9388-001-05095732-2006 (Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ Свидетельство о государственной регистрации № ПВР-1-2 6/01846 от 20 февраля 2007 г Учетная серия 35-1-2 6-1495)

временная инструкция по применению тест-системы для выявления патогенных Fusobacterium necrophorum методом совмещенной гнездовой полимеразной цепной реакции (two in one nested PCR, утвержденная директором ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН, 2006,

- временная инструкция по применению тест-системы для генотипирования культур Fusobacterium necrophorum методом применение RAPD-ПЦР анализа для молекулярно-генетического картирования культур Fusobacterium necrophorum, утвержденная директором ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН, 2006

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВ\ННЫХ ПО 1LML ДИССЕРТАЦИИ

1 Выявление вируса классической чумы свпиеп с помощью полимеразной цепной реакции' (оавт Л 1 Пузырев, С Ф Орешкова, \С Донченко, В М Чскишев, Л \ Ильичев // Молекулярная генешка, мпкробиоло!ия и виру со ни ия М - 1999 -Ш - С 27-30

2 О lnronvK3COIи шые прапчеры в дпапюсшческих leci-cncicMax для дифференциации вирусов классической чумы свннеи и вирусной диареи крупного

рогатого скота' Соавт С А Юрик //Сибирский вестник сельскохозяйственной науки Новосибирск -2000 -№1-2 - С 99-104

3 Дифференциальная диагностика классической чумы свиней и болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота методом полимеразиой цепной реакции/ Соавт С А Юрию'/ Доклады РА СХН М -2000 -№1 -С 37-39

4 Полимсразная цепная реакция с гнездовыми праймерами в диагностике 1 usobacterium neerophoruin / Соавт II В Некрасова А А Самоловов, II 11 Блинова /'Сибирский вестник сельскохозяйственной пау кп Новосибирск - 2002 -№3-4 -С 100-105

5 I еногнпирование патогенного биотипа АВ hububacterium neerophoruin subsp neerophoruin / Соавт MA Филипенко II В Некрасова, С А Храпов А А Самоловов '/Сибирский весшик сельскохозяйственной пауки Новосибирск-2003,-№1 - С 86-90

6 ПЦР-гснетическое типирование^ I usubactciium ncciophorum с помощью анализа ПДРФ синтезированного амплнк'она / Соавт МА Фигтипснко, II В Некрасова ЕЛ Храпов Л А Самоловов //Сибирский весшик сельскохозяйственной науки Новосибирск - 2003 -№3(149) -С 124-127

7 Транспозоны в передаче патогенных свойств rusobactenum necrophorum subsp necrophorum биотипа АВ/Соавт АС Донченко, В М Блинов, ДВ Сараев АЛ Самоловов, С В Лопатин //Сибирский весшик сельскохозяйственной науки

11овосибнрск - 2003 - №4 - С 84-87

8 Полиморфизм ДНК изолятов возбудителя некробактериоза крупного рогатого скота в Западной Сибири /Соавт С А Юрик, Ю А Горбунов, А А Самоловов, С В Лопатин, Е В Дударева // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки Новосибирск - 2005 - №2 - С 98-102

9 Выявление гена гемагглютинина Fusobacterium necrophorum с помощью полимеразиой цепной реакции /Соавт Д А Хузин, С А Юрик, X Н Макаев, Е В Дударева // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки Новосибирск -

2005 -№3 -С 83-87

10 Разграничение Fusobacterium necrophorum на подвиды с помощью дуплексной одношаговой полимеразиой цепной реакции /Соавт Е А Храпов, С А Юрик, М А Филипенко, Е В Дударева //Сибирский вестник сельскохозяйственной науки Новосибирск - 2005 - № 3 - С 87-92

11 Исследование геномного полиморфизма гнолягов Fusobacterium necrophorum в Приволжском округе/Соавт Д А Хузин, XII Макаев С А Юрик Г В Дударева // Сибирскии вестник сельскохозяйственной науки Новосибирск -2005 - №4 - С 131-135

12 Дифференциация I usobactenum necrophorum на подвиды с помощью дуптскспон оцношаговои полимеразнои цепной реакции 'Соавт Е. А Храпов, С А Юрик, МА Филипенко//Доклады Россе гьхозакадемнн М - 2006 - №1 -С 51-53

13 Сравнительная индикация Fiisobacternim neerophouim бактериологическим методом и с помощью гнездовой ПЦР /Соавт Самоловов А А Караваев Ю Д , Лопатин С В , Семенова И Н // Сибирский весшик сельскохозяйственной науки Новосибирск - 2006,-№ 2 - С 92-96

14 Использование однопраймерион полимеразиой цепной реакции для изучения межвидового геномпото полиморфизма у микоилазм/Соавт С А Юрик, М II Шадрина // Сибирский весшик сельскохозяйственной науки Новосибирск -

2006 - №3 -С 86-9!

15 Использование RAPD-PCR анализа в исследовании молску шрно теистическою полиморфизма культур Г usobactenum necrophoium и Mycoplasm /Солвг С А Юрик, ДА Ху зин//Сибирскии вестник сельскохозяйственноп науки Новосибирск -2007 - № 1 -С 76-82

16 Генстческии полиморфизм ДНК кулыур Fusobacteiium nccrophorum по данным КАРО-анллнза /Соавг ГА Юрик, ДА Ху зпн //Доклады Россельхозакадемпи М -2007 - №2 - С 52-56

17 Иссшдовапие полиморфизма олигомеров культур rusobacterium ncciopliorum'C А Юрик, Д А Хузип, А В Мокеева it О С Воронова, Е В Ду ирев^Сибирскнн вестник сельскохозяйственной науки -2007 - №3 - С 76-82

18 Патеш №2120994 от 27 октября 1998 Способ выявления вируса к иссическоп чумы свиней / Солв! AT Пу зырев, А С Допчепко, С Ф Орешкова, ВМ Чекишев, А А Ильичев// - заявшель и патентообладатель ГНУ ИЭВСиДВ СОРАСХН н 1 НИ ВЬ «Вектор» - заявка №97103934 от 1203 1997 - Ьюп №30

19 Патент №2158306 от 27 октября 2000 г Способ выявления вируса вирусной диареи (болезни стизнсшх обо ючек) крупною рогаюю скота с помогиыо специфических олигону к ieoiилных праимеров в полимеразной цепной реакции / Соавт А С Донченко, С Ф Орешкова, В М Чекишев, С А Юрик А А Ильичев // заявше ib и naienтообладателн ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХ11 и ГНЦ ВБ «Векюр» - заявка №99101603 oi 19 января 1999 -Бюч №30

20 Патент №2203951 от 10 мая 2003 i Способ выявления I usobactenum neciophoium в генездовоп ПЦР / Соавт А А Самоловов, С А Юрик, 1111 Блинова Н В Некрасова // заявшель и па1енкюблада1елн ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСXI1 и I НИ, ВЬ «Вектор» по заявке №200! 133577 от 10 12 2001 - Ьюл №13

21 Патент №2294374 or 27 февраля 2007 г Способ определения в пробе naioiemioro подвида rusobacterium neciophorum subspecies necrophorum с помощью полимера зной ценной реакции /Соавт С А Юрик, ЕВ Дударева // заявитель и паченгооб тачатель I НУ ИЭВСиДВ СО PACXII по заявке №2004125139/13 от 03 08 2004 - Ьюл №6

22 Получение матричной РНК вируса вируснои диареи крупною poiaioio скота для ее после ту loniei о клонирования /Соавт , В А Кру i тяк //III Всесоюзная конференция по эпизоотологии - Новосибирск, 24-26 сент 1991 - Новосибирск -1991 -С 251-252

23 Выде теине РНК вируса классической чумы свинеи// Научное обеспечение ветеринарных проб тем в животноводстве (Со науч ip I НУ ИЭВСиДВ СО РАСХП) - Новосибирск - 2000 - С 329-133

24 Дпамкхшка боте ¡пи слизистых оболочек крупного ротатого скота и к 1л.ст1чсскот1 чумы евинеи с помошыо но тттмера зной ценной реакции /Соавт А С Донченко ВМ Чекишев, СФ Орешкова, С А Юрик /'Развитие агропромышленной^ комптекса в зонах рискованного земледелия материалы VI научпо-практическоп конференции г Новокузнецк -1999 -С 29-30

2s Вы телепне и очистка м-I'HK вируса вируснои диареи крупною роиттою скота Соавт В \ Кру i 1як //Инфекционные болезни животных ")пи зоотолот ия итат нос тика, профи тактика и меры борьбы Со науч гр - СО РЛСХН - ГНУ И )ВСнДВ - Новосибирск - 1991 - С 103-106

26 Клонирование фра1мсша теномнон РНК вируса вирусной тиарсн крупного рогатого ском, кодирующего ген gp48 /Соавт С А Юрик СФ Орешкова В И Афонюшкин //Проблемы стаби шзацнн и развития сельскою хозяиствч Казахстана Сибири и Монтотин - 3-я Между народная науч - ттракт

конф (Алматы 18-19 июля - 2000)/С0 РАСХН - Новосибирск - 2000 -С 195196

27 Выцеленис хромосомной ДНК 1 usobactenum nccrophorum /Соавт А А Самоловов, С В Лопатин //Научное обеспечение ветеринарных проблем в Лч'ивошоводстве (Сб научных фудов ) Новосибирск -2000 -С 163-166

28 Применение полнмеразной цепной реакции для обнаружения вируса болезни слизистых оболочек парнокопытных животных /Соавт ВМ Чекишев, СФ Орешкова, С А Юрик //Научное обеспечение ветеринарных проблем в /кивогноводстве (Сб науч ip ) Новосибирск - 2000 - С 130-134

29 Возможность прижизненной диагностики классической чумы свиней и болезнзт слизистых оболочек крупного рогатого скота /Соавт С И Прудников, С. А Юрик, А А Духовский // Научное обеспечение ве1ерпнарных проблем в живошоволстве (Сб на\ч ip ) Новосибирск -2000 -С 183-186

30 Получение геномной библиотеки в плазмидном векторе хромосомной ДНК Г nccrophorum /Соавт А А Самоловов, С А Юрик, Н В Некрасова, СФ Орешкова //Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии Материалы 3-й Междунаролной науч-практ конф (Алматы, 18-19 июля 2000 г )/РАСХП Сиб отд-нне Новосибирск -2000 - С 195-196

31 Сравнительный анализ специфичности и чувствительности полнмеразной пенной реакции с методами индикации вируса классической чумы свиней на культуре клеток /Соавг ВМ Чекишев, СИ Прудников, ТМ 1 лотова, НЕ 11анова //11аучнос обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве (Сб науч Ф ) Новосибирск - 2000 - С 134-139

32 Использование кДПК, специфичных вирусу классической чумы свиней, для дифференциации Pestiviruses /Соавт С Ф Орешкова //Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве (Сб науч тр ) Новосибирск - 2000 -С 143-150

33 Выбор специфических олигонуклеотидных праймеров// Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве (Сб науч тр ) Новосибирск -2000 -С 167-173

34 Использование по тимеразной цепной реакции для обнаружения RNA вируса классической чумы свинеи /Соавт AT Пузырев А С Донченко. С'Ф Орешкова ВМ Чекишев, А А Ильичев //Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве (Сб науч ip ) Новосибирск - 2000 - С 174-178

35 О возможности эволюционной изменчивости представителей пестивирусов классической чумы свиней и вирусной диареи/Соавт Ю И Вульф, К С Макарова //Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве (Сб науч тр ) Новосибирск - 2000 - С 179-183

36 Клонирование хромосомной ДНК Fusobactenum neciophorum / Соавт II В Некрасова //Ьолсзни сельскохозяйственных животных вирусной и других это Ю1 ии и меры борьбы с ними (Материалы научпо-практическон конф-Иркутск - 2001 - Новосибирск -2001 -С 111-112

37 Разработка биотинилнрованного ДНК-зонда на основе кДНК гена gp48 вируса виру спои диареи крупного рогатого скота, клонированного в плазмндньпт вектор /Соавт В Н Афоптошкин //Болезни сельскохозяйственных животных вирусной и другой этнологии и меры борьбы с нимт^/Материалы научно-практической конференции (Иркутск, 6-7 сентября 2001) - Иркутск - 2001 -С 36-37

38 Выяв iemie и идентификация rusobacterium necrophorum с помощью полимеразной цепной реакции и гнездовых прайчеров /CoaBi H В Некрасова АЛ Самозовов //Ьнотого-экологичсские проблемы заразных болезней диких /кпвошых и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей (Магерна 1ы международной научно-практической конф Покров 16-18 апр 2002 i ) Покров -2002 -С 251-252

39 Дифференциальная диагностика вирулентного биотипа АВ 1 usobactenum necrophoium subsp neciophorum с помощью ПЦР и ПДРФ ампликопов /Соавт П В Некрасова. А А Самоловов //Материалы первою международною конгресса (Алматы 10-11 октября 2002) Алматы -2002 - Г4 - С 171-173

40 Дифференциальная диагностика rusobacterium necrophorum у мелкого и крупною poiaioio CKOia с помощью нолнмеразнон цепной реакции /Соавт H В Некрасова, А А Самоловов //Науч обеспеч АПК Сибири, Монгочии, Казахстана, Беларуси и Башкортостана Матер 5-ой Междунар науч - практ конф (Абакан, 10-12 июля 2002) РАСХП Сиб отделение Новосибирск - 2002 - С 468-471

41 Дифференциация сходных по фенотипу Fusubacterium necrophorum subsp neciophorum с помощью анализа ПДРФ синтезированного ампликона /Соавт MA Филипенко, П В Некрасова, ЕА Храпов, А А Самоловов //Ветеринарные и медицинские аспекты зооантротгонозов //Труды Международ Научно-практическ конференции посвяти 45-леппо института 24-26 сещ , 2003 т 4acib 1, Покров -2003 - С 304-308

42 Исследование полиморфизма ДНК изолятов rusobacterium neciophorum/Соав1 С А Юрик, Ю А Горбунов //«Maiepiiajibi международной научно-практической конференции «Современное состояние и актуальные проблемы развития ветеринарной науки и практики», посвященной 100-летию института» 15-16 сентября 2005 г . гАлматы, КазНИВИ, Т1 Инфекционные болезни С -249-252

43 Дифференциация husobacterium necrophorum методом ПЦР-анализа /Соавт h В Дударева //Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых Тр 2-й Междунар конф мол Ученых (20-21 апреля 2006 т , нос Краснообск) / РАСХН Сиб ош-ние - Новосибирск 2006 - 656 с - С 398-402

44 Идентификация rusobacterium песгорЬогит//Актуальиые проблемы ветеринариою обеспечения живошоводства Сибири Сб науч ip /РАСХН Сиб От-тпте ГНУ ИЭС'иДВ - Новосибирск -2006 - С 322-327

Подписано в печать 15 05 2007 г Формат 60x84 '/|6 Печ л 2,0 Тираж ЮОэкз Заказ № 154

ООО ИПФ «Агрос» 630501, Новосибирская область, пос Краснообск