Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка конструкций и синтез рекомбинантных химерных генно-инженерных белков ВИЧ-1 и ис-следование их свойств в твердофазном иммунном анализе

На правах рукописи

Гасанов Вагиф Али оглы

«Разработка конструкций и синтез рекомбинантных химерных генно-инженерных белков ВИЧ-1 н исследование их свойств в твердофазном

иммунном анализе» 14.00.36 - аллергология и иммунология

1 5 С п

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2009

003482555

Работа выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор И.Г.Сидорович кандидат химических наук А.Ф. Шевалье

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.В.Ковальчук доктор медицинских наук, профессор Л.И. Винницкий

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Защита диссертации состоится 2009 г. в 1300 часов на

заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2. Тел/Факс: (499) 617-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Автореферат разослан »г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

Л.С. Сеежшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема ВИЧ/СПИД на нашей планете с каждым годом становится все острее. Официальная статистика утверждает, что сейчас в мире от ВИЧ/СПИДа погибло более 25 млн. человек, 65 млн. инфицировано и количество инфицированных с каждым днем возрастает. Все ранние применяемые классические методы защиты от ВИЧ/СПИД не привели к каким-либо значимым результатам, лишь с внедрением в клиническую практику высокоактивной многокомпонентной специфической антиретровирусной терапии стало возможным на некоторое время продлить жить ВИЧ-инфицированным. Но несмотря ни на что, гибель ВИЧ-инфированных на сегодняшний день неизбежна. Связанно это с некоторыми особенностями ВИЧ:

• Не зафиксировано ни одного случая выздоровления от СПИДа. Итог заболевания - смерть.

• ВИЧ обладает крайне высокой вариабельностью (субтипы + рекомбинантные формы).

• Отсутствует адекватная модели ВИЧ-инфекции/СПИДа на животных

Т.о. классические пастеровские подходы для создания вакцины не применимы. Мы не можем вводить в организм человека, ослабленный или убитый вирус, т.к. есть возможность инфицировать человека, что затем приведет и к гибели. Нельзя вводить и разрушенный ВИЧ, а так же некоторые его части, полученные из нативного вируса, т.к. существует вероятность того, что в полученном препарате может присутствовать вирус неповрежденный, что в конечном итоге приведет к заражению и гибели человека. Единственным направлением, признанным на данный момент наиболее безопасным и перспективным, является вакцина созданная на основе генно-инжинерных белков, копирующих иммунореактивные участки белков ВИЧ.

В мире существует великое множество кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИДа, многие проходят клинические испытания. К сожалению, ни одна до сих пор не достигла главного результата - защиты от ВИЧ-инфекции.

На основе полученного мирового опыта можно предположить, что при подборе последовательности рекомбинантного белка необходимо опираться как на наиболее консервативные части белков ВИЧ-1, так и на наиболее иммуногенные, при этом различные эпитопы белков ВИЧ могут группироваться друг с другом, т.е. рекомбипантная молекула должна быть химерной. Также необходимо учитывать сложную пространственную структуру белков ВИЧ, т.е. эпитопы могут быть не линейными, а пространственными (конформационными).

Но, помимо создания рекомбинантных белков - основ кандидатных вакцин, также очень остро стоит вопрос масштабного производства тех из них, которые прошли доклинические испытания. Связанно это, прежде всего с тем, что те количества белка, которые получают в обычной биотехнологической лаборатории, не могут покрыть потребностей при проведении клинических испытаний. Процесс получения больших количеств рекомбинантных белков отличается от получения их в аналитических количествах и, помимо высокого качества получаемого препарата необходима и воспроизводимость наработки новых партий рекомбинантных белков. Не стоит забывать, что любая информация, полученная в момент испытаний, может повлечь за собой изменение состава или структуры рекомбинантного белка, что приведет к перенастройке всей производственной линии. Т.о. весь процесс получения рекомбинантных белков, копирующих иммунореактивные участки белков ВИЧ-1, от аналитических количеств до макроколичеств должен находится в одних руках - в руках коллектива авторов.

Все это говорит о том, что создание вакцины против ВИЧ/СПИДа на сегодняшний день является не прикладной, а фундаментальной задачей. Мировая общественность признает, что до появления вакцины, способной противостоять ВИЧ/СПИДу, должно пройти 15-20 лет. Поэтому любая информация, полученная во время проведения испытаний кандидатных вакцин, будет способствовать модернизации новых серий кандидатных вакцин. Подобная модернизация, в свою очередь приведет к скорейшей победе над страшным заболеванием и сохранению жизни и здоровья миллионам людей на планете.

Цель работы: наработать в количествах, достаточных для проведения второй фазы клинических испытаний рекомбинантный белок гес (24-41), прошедшего доклинические и первую фазу клинических испытаний как основа анти-ВИЧ/СПИД-вакцины «ВИЧРЕПОЛ», создание новой серии рекомбинантных белков - основ вакцин против ВИЧ/СПИД.

Задачи исследования.

1. Подобрать условия для наработки рекомбинантного белка гес (24-41) в ферментере.

2. Добиться воспроизводимости получения новых партий рекомбинантного белка гес (24-41) и наработать данный белок.

3. Произвести хроматографическую очистку полученных партий рекомбинантного белка гес (24-41).

4. Оценить структуру и иммунологические свойства полученного рекомбинантного белка гес (24-41).

5. Разработать рекомбинантную химерную белковую молекулу, состоящую из эпитопов 2Р5 и 4Е10 белка gp41 ВИЧ-1, и носителя - нетоксичного мутантного

TNF, способного тримеризоваться, для представления эпитопов ВИЧ-1 в форме, соответствующей таковой у нативного вируса.

6. Создать плазмиду, несущую ген, кодирующий белок тес (TNF-2F54E10).

7. Произвести ферментативную наработку и хроматографическую очистку рекомбинантного белка rec (TNF-2F5-4E10).

8. Оценить структуру и иммунологические свойства полученного рекомбинантного белка rec (TNF-2F5-4E10), доказать его способность к тримеризации.

Научная новизна работы.

Впервые проведена масштабная наработка рекомбинантного белка гес(24-41). Показана воспроизводимость наработки партий рекомбинантного белка гес(24-41). Создан штамм-продуцент ВЦ24-41) способный продуцировать белок rec (24-41) в условиях ферментации. Проведена работа по подбору оптимальных условий для экспрессии белка гес (24-41) в условиях ферментации. Подобраны условия очистки и рефолдинга макроколичеств рекомбинантного белка гес (24-41).

Впервые получен тример 2F5-4E10 на основе белка TNF. Создан ген, кодирующий белок rec (TNF-2F5-4E10). Получена плазмида, несущая данный ген. На основе плазмиды создан штамм-продуцент BL21(TNF-2F5-4E10). Наработан и очищен гес (TNF-2F5-4E10). Была доказана мономерная и тримерная структуры молекулы. Показана возможность тримеризоваться в различных растворах. Получены доказательства специфического взаимодействия rec (TNF-2F5-4E10) с сыворотками ВИЧ-позитивных людей.

Практическая значимость.

Полученный рекомбинантный белок гес (24-41) станет основой вакцины «ВИЧРЕПОЛ» в дальнейших клинических испытаниях.

Рекомбинантный химерный белок rec (TNF-2F5-4E10) является первым из новой серии кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД. Он пригоден для дальнейших исследований и представления к доклиническим испытаниям. На данной серии возможно изучение всех комбинаций гримерных белков ВИЧ-1.

Созданная база по масштабированию в лаборатории биотехнологии и СПИДа Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства станет местом для наработки новых кандидатных вакцин на основе рекомбииантнуых белков.

Апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисных работ.

Основные результаты исследования докладывались на Международной научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и вирусных парентеральных гепатитов (29 сентября-1 октября 2004г, Суздаль), XVI Международная конференция по СПИДу (13-18 августа 2006г., Торонто, Канада), IV Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (12-16 марта 2007г., Москва).

Объем и структура диссертация:

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Заключение и обсуждение», «Выводы». Указатель литературы содержит 83 источника (35 - отечественных, 48 - зарубежных). Работа иллюстрирована 24 рисунками и 15 таблицами и графиками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Клонирование, посев на чашки, культуральиое выращивание. Штамм продуцент Е.соН засеваем в 2 мл культуральной среды ЬВ с добавление антибиотика канамицина в концентрации 25 мкг/мл. Выращиваем на шейкере при 280 об/мин при температуре 37С в течении 8 часов до оптической плонтности 00585=20Е. Готовим чашки Петре для засева. В 100 мм чашку Петре заливаем 20мл агара (1,5%агар в среде ЬВ). После застывания агара втираем в него шпателем Дригальского раствор антибиотика канамицина объемом ЮОмкл для достижения конечной концентрации антибиотика в агаре 25мкг/мл. Далее на чашку наносим 25 мкл культуры с выращенным штаммом-продуцентом. Этот объем втираем в агар шпателем Дригальского. Оставляем на 16 часов при температуре 37С.

Индукция синтеза белка. Из выросших колоний выбираем несколько оптимальных по размеру (не крупных и не маленьких), по форме (идеально круглых), по окраске (равномерно окрашенных). Выбранные клоны засеваем в ЬВ объемом 2 мл с 25мкг/мл канамицином. Выращиваем на шейкере при 280 об/мин при температуре 37С в течении 8 часов до оптической плонтности 0Э585=20Е. Далее пересеваем в культуральные колбы со 100 мл ЬВ и 25мкг/мл канамицином. Начальная оптическая плотность культуры должна быть 00585=0,10Е. Выращиваем культуры на шейкере при 280 об/мин при температуре 37С до достижения оптической плотности значения 00585=0,80Е. Далее индуцируем раствором ГРТв. Конечная концентрация 1РТО в растворе должна быть 50мкМ. Через четыре часа культуральные колбы изымаются из шейкера. Культура клеток

центрифугируется на центрифуге Beckman на роторе JA-10 на 6000 об/мин в течении 10 минут. Осадок лизируем в 10 мл 6М мочевины.

Анализ белка электрофорезом в ПААГ. Наличие белка определяли электрофорезом в ПААГ. 10 мкл каждого лизата смешивали с 5 мкл буфера для приготовления проб и наносили в карман камеры прибора Bio-Rad Mini PROTEAN Tetra Cells. Концентрирующий гель 2% по акриламиду, разделяющий гель 13% по акриламиду. Форез протекает при 200V в течении 45 минут. Окрашиваем гель раствором Coomassie Blue G 250 в 10% этаноле.

Перенос на нитроцеллюлозную мембрану и иммуноблот.

Перенос на нитроцеллюлозу осуществляли в ячейке прибора Bio-Rad Mini PROTEAN Tetra Cells. Ток преноса 200мА, время переноса 1 час.

После переноса нитроцеллюлозу замачиваем на 16 часов в 1% BSA + 0,02% мертиолят. Нитроцеллюлозу трижды отмываем в буфере PBST (КН2Р04 - 0,2г; Na2HP04 - 0,7г; NaCl -8,7г; Н20 до 1 литра + 0,02% мертиолят + 0,1% Tween20).

Добавляем разведенную сыворотку ВИЧ-позитивного человека в PBST объемом 10-15 мл разводим в 100 раз и держим на шейкере 1 час. Нитроцеллюлозу трижды отмываем в PBST по пять минут.

Добавляем разведенный коньюгат с пероксидазой хрена в PBST объемом 10-15 мл и держим на шейкере 1 час.

Нитроцеллюлозу триады отмываем в PBST по пять минут.

Добавляем краску(19 мл субстратного буфера (лимонная кислота - 6,92g; C6H507Na3(sodium citrate) - 18,33g; NaB02*H202*3H20(sodium perborate) - 1.86g; H20 до 1 литра + 0,02% мертиолят) + 150mkl 10%Tween20 + 40mg 4-хлорнафтола, который предварительно растворили в 1ml этанола). Ждем 10-15 минут при температуре 37С. Окрашивание останавливаем, промывая нитроцеллюлозу дистиллированной водой. Масс-спсктрометрия. Применялась MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time Of Flight Mass Spectrometers (Времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией в присутствии вспомогательного вещества -матрицы)). Исследования проводились в отделе протеомных исследований Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН. Матрица- 2,5 дигидроксибензойная кислота.

Статистическая обработка результатов. Учитывая, что в медико-биологических исследованиях при малых выборках (менее 20) методы описательной статистики не могут адекватно отражать распределение, результаты наблюдений приведены в виде таблиц первичных данных. Для сравнения данных были использованы среднеарефметические значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Подбор условий для наработки рекомбинантного белка гес (24-41) в ферментере.

В лаборатории биотехнологии и СПИДа ранее был разработан белок гес (24-41). Он соединяет в себе иммунодоминантный участок корового белка gp41 и полноразмерный белок р24. Яес (24-41) стал основой вакцины «ВИЧРЕПОЛ». Данная вакцина успешно прошла доклинические испытания и вторую стадию клинических испытаний. Для прохождения второй стадии клинических испытаний стало необходимо большее количества рекомбинантного белка гес (24-41), что в свою очередь ведет к увеличенной наработке биомассы. Оптимальная наработка биомассы возможна лишь при применении ферметации. Данная методика позволяет выращивать биомассу в большем объеме и большей оптической плотности, чем в культуральных колбах. Началу работе на ферментере предшествует процесс подбора нового клона штамма-продуцента, т.к. в емкости ферментера он будет вести себя иначе, чем в культуральной колбе. Плазмидой рЕТ15Ь-24-41 трансформировали штамм ВЬ21(ОЕЗ) Е.соН. Трансформационная смесь засевалась на чашки с канамицином. Выросшие колонии рассевались в жидкие среды, подращивались и индуцировались ИПТГ. Отбирались колонии с максимальной экспрессией рекомбинантного белка гес (24-41). Далее эти колонии консервировались и использовались при наработке гес (24-41) в ферментере. Ферментацию проводили в 6 литровом ферментере с культуральной средой ЬВ. Основными параметрами которые необходимо бьио откорректировать являлись: кислотность культуральной среды (рН), температура (Т°С), растворенность кислорода в культуральной среде (сЮг), количество оборотов в минуту венчика шейкера.

Подбор рН При выборе рН изучался диапазон от 6,8 до 7,5. Исследованы следующие величины рН: 6,8; 7,0; 7,2; 7,4;7,6. Оптимальным значением рН признано то, при котором достигалась максимальная оптическая плотность культуры клеток. Титрование проводилось растворами 0.1 М №ОН и 0.Ш НС1. Оптимальным оказалось значение рН=7,2

наработки рекомбинантного белка гес (24-41) в зависимости от рН.

Подбор температуры. При выборе температуры было изучено три варианта: Т=28 °С, 34 °С и37°С. Оптимальной температурой признали ту, при которой достигалась максимальная оптическая плотность культуры клеток. Оптимальным значением оказалась температура Т=34С. На рисунке 2 видно, что при Т=28°С, культура выходит на плато при значениях 0В(585)=80Е, при Т=37°С культура набирает оптическую плотность до значений ОВ(585)=110Е, но затем из-за повышенного метаболизма клетки лизируют. При Т=34°С оптическая плотность изначально меньше, чем при Т=37С, однако лизиса не происходит и, в конечном итоге, мы получаем больше биомассы.

Рисунок 2. Изменение оптической плотпости 00(585) культуралыюй среды во время ферментативной наработки рекомбннантного белка гес (24-41) в зависимости от температуры Т°С.

Подбор условий по насыщенности раствора кислородом. Была исследована насыщенность раствора кислородом могла быть только в двух вариантах: 1 - (Юг = 69%, 2 -сЮ2= 10%.

Как видно на рисунке 3 при сЮ2 = 10% культура клеток медленно набирает оптическую плотность, а затем начинается медленный лизис. При Й02= 69% оптическая плотность растет достаточно быстро, выходит на «плато», лизиса нет. Т.о. оптимальным является насыщение культуры клеток кислородом и значение сЮг = 69%.

Рисунок 3. Изменение оптической плотности 00(585) культуральной среды во время ферментативной наработки рекомбннантного белка гес (24-41) в зависимости от насыщаемости раствора кислородом.

Подбор оптимальных скоростей вращения венчика шейкера. Была измерена

максимальная оптическая плотность культуры клеток после окончания ферментации через 10 часов, при различных скоростях вращения венчика шейкера. Ферментация проводилась при скоростях вращения 300, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 и 1200 об/мин. Результаты представлены на гистограмме 1. Здесь видно, что до 900 об/мин оптическая плотность пропорционально растет, но при дальнейшем увеличении оборотов начинает падать. Особенно резкое падение заметно при 1200 об/мин. Возможно, что здесь речь идет о физическом повреждении клеток лопастями венчика шейкера.

В ю

300 500 600 700 800 900 1000 1100 1200

скорость вращения, об/мин

Гистограмма 1. Максимальные значения оптической плотности (Ш(585) кульзуральной среды после 10 часовой ферментации в зависимости от скорости вращения венчика шейкера.

Т.о. ферментация оптимально проходит при рН=7.2, Т=34°С, насыщенности культуры

кислородом (Юг=69%, скорости вращения венчика шейкера = 900об/мин и культура

клеток достигает, как правило, величины оптической плотности 00(585)=9,40Е.

Наработка рекомбинантного белка гес (24-41) и анализ воспроизводимости

получения новых партий.

Было проведено 16 ферментаций при оптимальных условиях. Индукцию проводили при достижении оптической плотности значения ОВ(585)=ЗОЕ. Ферментацию проводили строго 10 часов. По итогам мерили оптическую плотность культуральной среды и массу бактериальных клеток после центрифугирования. Полученные результаты отражены в

таблице 1.

Номер ферментации Оптическая плотность культуры клеток 00(585), ОЕ Среднеарифметическое значение оптической плотности Масса бактериальных клеток, грамм Среднеарифметическое значение массы бактериальных клеток после ферментации

ФЕРМЕНТАЦИЯ XI 1 9,1 26,03

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 2 9,4 27,13

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 3 9,2 26,41

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 4 9,2 26,37

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 5 9,5 27,35

ФЕРМЕНТАЦИЯ Л! 6 9,1 26,29

ФЕРМЕНТАЦИЯ Л! 7 9,2 26,35

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 8 9,2 9,3 26,47 26,69

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 9 9,4 26,95

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 10 9,4 27,09

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 11 9,1 26,25

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 12 9,3 26,69

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 13 9,4 26,89

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 14 9,4 17,06

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 15 9,3 26.85

ФЕРМЕНТАЦИЯ № 16 9,5 27,26

Таблица 1. Значения оптической плотности СШ{585) культуральной среды и массы бактериальных клеток после 10 часовой ферментации в зависимости от партии.

Наличие и количество рекомбинантного белка гес (24-41) определяли методом электрофореза в ПААГ. На рисунке 4 представлены гели после проведенного электрофореза всех ферментации. Наносились клетки, находящиеся в 10 мкл культуры.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рисунок 4. Электроферез клеточных лизатов проведенных ферментации. Треки 1-9 соответствуют ферментацням 1-9, трек 10 - стандарты молекулярных весов, греки 11-17 соответствуют ферментацням 10-16. Стрелкой отмечено положение рекомбинантного белка гес (24-41) в геле.

На рисунке видна однородность белкового спектра от ферментации к ферментации. Опираясь на данные таблицы 1, можно сделать вывод, что имеет место воспроизведение результата от партии к партии.

Хроматографическая очистку полученных партий рекомбинантного белка гес (24-41).

Полученная биомасса была растворена в 6М мочевине и обработана в ультразвуковом дезинтеграторе SONICS Vibra Cell. Было проведено 20 циклов УЗ обработки при амплитуде 75% и максимальной мощности прибора.

Раствор центрифугирован на центрифуге Beckman на роторе JA-20 на 20000 об/мин в течении 60 минут.

Первая стадия хроматографической очистки проводилась на колонке с аффинным сорбентом Chelating Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Швеция), содержащим иммобилизованные ионы Ni2+. Рекомбинантный белок гес (24-41) содержит на своем -конце полигистидиновую последовательность (6 молекул гистидина), образующую комлекс с №2+-сорбентом с константой диссоциации К=10"15, что позволяет проводить хроматографию в сильных хаотропных растворителях, растворяющих белковые конгломераты, подавляющих неспецифческие белок-белковые взамодействия, препятствующие очистке целевых продуктов экспрессии.

Хроматографию проводили на колонке ХК50*40 (GE Healthcare, Швеция), объемом 400 мл на хроматографе АКТА Prime plus (Amersham Biosciences, США). Скорость потока

10 мл/мин, ограничение по давлению 1,1 атм. На колонку, предварительно уравновешенную раствором: 8М мочевина, 50мМ Тпэ-НО (рН=8.0), наносили клеточный лизат. Промывали 800 мл раствора: 8М мочевина, 50мМ Тп8-НС1 (рН=8,0), 0,5М ШС1, для избавления от пе связавшихся с сорбентом белками. Целевые белки элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 50мМ Тпз-НС1 (рН=8.0), ЮмМ имидазол, финальный буфер: 50мМ Тпз-НС1 (рН=8.0), 400мМ имидазол. Объем градиента 4000мл. Элюат фракционировали по 10 мл. Наличие белка во фракции определяли электрофорезом вПААГ.

Рисунок 5. Хроматографнческии профиль элюцип рекомбинантного белка гес(24-41) с металл-афниной агарозы. Стартовый буфер: 50мМ Тле-НС! (рН=8.0), ЮмМ имидазол, финальный буфер: 50мМ Тте-НС1 (рН=8.0), 400мМ имидазол.

Фракции, содержащие целевой белок диализовали против 50мМ Tris-HCl (рН=8.0) и повторно наносили на колонку ХК50*40 с Chelating Sepharose Fast Flow предварительно уравновешенную 50мМ Tris-HCl (рН=8.0). Промывали 400 мл раствора: 50мМ Tris-HCI (рН=8.0), 0,5М NaCI. Целевые белки элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 50мМ Tris-HCl (рН=8.0), ЮмМ имидазол, финальный буфер: 50мМ Tris-HCl (рН=8.0), 200мМ имидазол. Объем градиента 2000мл. Элюат фракционируем по 5 мл. Целевой белок вышел в пределах концентраций имидазола от 1 ЮмМ до 125мМ. Наличие белка во фракции определяли электрофорезом в ПААГ.

Рисунок 6. Хроматографнческии профиль злюцни рекомбинантного белка гес(24-41) с металл-афшшон агарозы, повторное нанесение. Стартовый буфер: 50мМ Tris-HCl (pII=S.O), ЮмМ имидазол, финальный буфер: 50мМ Tris-HCl (рН=8.0), 200мМ имидазол.

Фракции, содержащие целевой белок диализовали против 20мМ Tris-HCl (рН=8.0) и приступали к следующему этапу хроматографической очистке на ионообменном сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Швеция). Хроматографию проводили на колонке ХК26*20 (GE Healthcare, Швеция), объемом 100 мл на хроматографе АКТА Prime

plus (Amersham Biosciences, США). Скорость потока 5 мл/мин, ограничение по давлению 1,1 атм. На колонку, предварительно уравновешенную 20мМ Tris-HCl (рН=8.0) наносили белковый раствор. Элюировали линейным градиетном. Стартовый буфер: 20мМ Tris-HCl (рН=8.0), ЮмМ NaCl, финальный буфер: 20мМ Tris-HCl (рН=8.0), ЗООмМ NaCl. Объем градиента 1500мл. Элюат фракционируем по 5 мл. Целевой белок вышел при концентрации NaCl равной 115мМ. Наличие белка во фракции определяем электрофорезом в ПААГ.

03

OD226

Рисунок 7. Хроматографическпй профиль элюцпи рекомбинантного белка гес(24-41) о Q-сефарозы. Стартовый буфер: 20мМ Tris-HCl (рН=8.0), ЮмМ NaCl, финальный буфер: 20,мМ Tris-HCl (рН=8.0), ЗООмМ NaCl.

Фракции, содержащие целевой белок диализовали против воды. Диализат высушивали в лиофильной сушке ЬАВСОМСО Ргеегопе 2,5. Суммарное количество полученного рекомбинантного белка гес (24-41) равно 3,4 г. Лиофильно высушенный белок хранится в плотно закрытых флаконах при комнатной температуре.

1 2

^ Рисунок 8. Электроферез очищенного

рекомбпнантного белка гес (24-41). Трек 1 _ стандарты молекулярных весов, трек 2 гес

(24-41).

130 kDa 95 kDa 72 kDa

гес (24-41)

Оценка структуры и иммунологических свойств полученного рекомбинантного белка гес (24-41).

Аминокислотная последовательность гибридного полипептида, определенная на основании нуклеотидной последовательности приведена на рисунке 9. (Рассчитанная масса рекомбинантного белка гес (24-41) равна 34919 Эа).

аЗЗННННННЗЗСЬУРЯОЗНМЬЕОР0ЫУР1У0№0С0МУН0А18РЯТЬЫАШУКУУЕЕКЛРЗРЕУ1РМР8АЬЗЕС

ATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWM

T^ÍNPPLPVGEIYÍÍRWПШLNИVRMYSPTSILDIRQGPKEPERDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQN

АКРОСКТ1ЬКАЬСРААТЬЕЕММТАС0ОУССРСНКАКУЕАЕАМ50ЬЕПЬатоОООКАМАВОЕ0а1ЕЫУЕЕУЕ

KX)QQLLGIWGCSGKLICTTAEPW

Рисунок 9. Аминокислотная последовательность белка гес(24-41) в однобуквенном коде.

Структуру подтверждали масс-спектром МА1Х>1 - ТОБ как моноиоиа, так и результатами триптического гидролиза. Матрица- 2,5 дигидроксибензойная кислота.

Рисунок 10. Масс-спектр моноиона рекомбинантного белка гес(24-41).

№ Номера Масса метила Сикцснс

аминокислот

1 1-16 1768.85 ОЗЗИНННННЗЗОЬУРИ

2 17-45 3287.61 ОЗНМ1.ЕОР(ЗМУР[У<ЗМ1С>ОСгМУНдАВР1(

3 46-52 831.47 П.ЫА\УУК

4 53-57 603.34 УУЕЕК

5 58-97 4233.05 АРЗРЕУ1РМРЗА13Е0АТР<301.МТМиЧТУ0СНС>ААМ<5Ми<.

6 98-109 1462.65 ЕТПЧЕЕААЕ\УОЯ

7 110-124 1566.83 УНРУНАОР1АРО0М((

8 125-127 401.21 ЕРа

9 128-158 3317.64 О301АОТгеТ1.дЕ(ЗЮ\Ум™]ЧРР1РУОЕ1УК

10 159-159 175.12 я

II 160-167 956.59 \VIILGLNK

12 168-170 387.27 1УК.

13 171-181 1295.67 муэртзихия

14 182-185 429.25 QGPK

15 186-189 548.28 EPER

16 190-194 667.31 DYVDR

17 195-197 457.25 FYK

18 198-200 389.25 TLR

19 201-209 989.49 AEQASQEVK

20 210-226 1975.91 NWMTETLLVQNANPDCK

21 227-230 474.33 TILK

22 231-254 2325.09 ALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHK

23 255-256 246.16 AR

24 257-275 2048.97 VLAEAMSQLLDLGTDDDDK

25 276-284 1004.52 AMAISDLQR

26 285-290 743.44 1LNVER

27 291-293 423.26 YLK

28 294-306 1403.69 DQQLLGIWGCSGK

29 307-315 1032.50 LICTTAEPW

Рисунок 11. Масс-спектр трнптического лизата рекомбинантного белка гес(24-41). Иммунологические свойства белка гес (24-41) проверяли в иммуноблоте.

Перенос на нитроцеллюлозу осуществляли в ячейке прибора Bio-Rad Mini PROTEAN Tetra Cells. Ток преноса 200мА, время переноса 1 час.

После переноса нитроцеллюлозу замачиваем на 16 часов в 1% BSA + 0,02% мертиолят. Нитроцеллюлозу отмываем в буфере PBST и добавляем разведенную в 100 раз сыворотку ВИЧ-позитивного человека в PBST и инкубируем 1 час.

Нитроцеллюлозу отмываем в PBST и добавляем разведенный коньюгат с пероксидазой хрена в PBST, инкубируем 1 час. Окрашивали 4-хлорнафтолом на цитрат-перборатном буфере. Окрашивание останавливаем, промывая нитроцеллюлозу дистиллированной водой. Результаты представлены на рисунке 12.

1

гес (24-41)

130 kDa Рисунок 12. Иммуноблот

95 kDa очищенного рекомбинантного

72 kDa

белка гес (24-41). Трек 1 - гес (24-

55 kDa

36 kDa 28 kDa

41), трек 2 - стандарты молекулярных весов.

Ч: ' * 17 Ша

Т.о. мы видим специфическое окрашивание рекомбинантного белка гес (24-41).

Разработка рекомбинантной химерной белковой молекулы, состоящей из эпитопов 2Р5 и 4Е10 корового белка gp41 ВИЧ-1, и носителя - мутантного, нетоксичного белка ФНО, способного тримеризоваться, для представления эпитопов ВИЧ-1 в форме, соответствующей таковой у нативного вируса.

Разработке структуры рекомбинантной химерной молекулы предшествовало изучение особенностей корового белка gp41 ВИЧ-1.

Интересен он тем, что существуют моноклональные антитела к его фрагментам 2F5 и 4Е10, которые показывают высокую нейтрализующая активность по отношению к первичным изолятам вируса. Данный белок до момента слияния оболочек ВИЧ и клетки остается закрытым gpl20, и лишь на короткое время обнажает свои эпитопы, т.о. создание генно-инженерного продукта с этими эпитопами, возможно, приведет к образованию протективных антител. И, наконец, последняя особенность этого белка - он является триммером, а стало быть, антитела могут образовываться не к линейным эпитопам, а к конфирмационным. Т.о. при соединении эпитопов 2F5 и 4Е10 с молекулой способной тримеризоваться, мы получим и тримерную структуру участков gp41. В качестве молекулы «тримеризатора» мы выбрали мутантную молекулу фактора некроза опухолей-альфа человека (ФНО-а). Это белок с молекулярной массой около 17 кД, продуцируемый активированными макрофагами и является одним из центральных белковых иммуномедиаторов и противовоспалительный цитокин. Биологически активной формой ФИО является гомотример. Как центральный медиатор воспаления ФИО обладает высокой общей токсичностью. Удалось полутать мутантную форма ФН(Ж32Н с заменой Arg в положении 32 на His. В опытах на животных показано, общая токсичность ФНСЖ32Н составляет 0,0005% от токсичности дикого типа. Т.о. структура нашей молекулы должна быть как на рисунке 13.

Схема молекулы выглядит следующим образом:

Рисунок 13. Схема рекомбннантного химерного белка rec(TNF -2F54E10). TNF (tumor necrosis Tactor) - молекула <I>HOR32H. 2F5-4E10 - участок несущий одноименные эпптопы и короткие линкеры. 6Шs-последовательность из 6 гнстндинов, способствующая эффективной очистке на металл-афинных сефарозах.

Создание плазмиды, несущей ген, кодирующий белок rec (TNF-2F54E10)

Ген мутантного ФНО был клонирован в плазмиду рЕТ28а (Novagen, США), в результате была получена плазмида pETTNF. На основе плазмиды pETTNF сконструирована плазмида pETFETNF, содержащая перед нуклеотидной последовательностью ФНО последовательность ДНК, кодирующую последовательность 2F5- 4Е10 иммуногенных эпитопов белков ВИЧ.

Схема плазмиды представлена на рисунке 14. Структуру ДНК фрагмента подтверждали секвенированием по методу Сэнгера.

Т7 terminator

гес (TNF-2F54E10)

Pst I (1056)

Nde I (2109)

Рисунок 14. Схема плазмиды

pETFETNF,

рекомбинантнын химерный белок гес (TNF-2F54E10).

кодирующей

lac operator

Полученной плазмидой рЕТРЕТОТ трансформировали штамм ВЬ21(ОЕЗ) Е.соН. Трансформационная смесь засевалась на чашки с канамицином. Выросшие колонии рассевались в жидкие среды, подращивались и индуцировались ИПТГ. Отбирались колонии с максимальной экспрессией рекомбинантного белка гес (ТОТ-2Р54Е10).

Далее эти колонии консервировались и использовались при наработке гес (ТНР-2Р54Е10) в ферментере.

Ферментативная наработка и хроматографнческая очистка рекомбинантного белка

гес (ТОТ-2Р54Е10).

Ферментацию проводили в б литровом ферментере с культуральной средой ЬВ. Используя ранее полученные параметры, задаем условия ферментации: рН=7.2, Т=34°С, насыщенности культуры кислородом (102=69%, скорости вращения венчика шейкера = 900об/мин. Кривая изменения оптической плотности указана на рисунке 15.

9

я

Оптическая

.Р £ <& <$ .«S л,0 .-P .f .oft .J? .3?.

" " " Время, мин

Рисунок 15. Изменение оптической плотности OD(585) культуральной среды во время ферментативной наработки рекомбинантного белка rec (TNF-2F54E10). Кривая А - изменение оптической плотности культуральной среды. Кривая В - изменение концентрации титрующего раствора 0,1М NaOH. Кривая С - изменение концентрации титрующего раствора О,IM HCl.

Максимальная оптическая плотность культуры составила 0D(595)=8,50E, Масса бактериальных клеток после центрифугирования 22 г. Полученная биомасса была растворена в 6М мочевине и обработана в ультразвуковом дезинтеграторе SONICS Vibra Cell. Было проведено 20 циклов УЗ обработки при амплитуде 75% и максимальной мощности прибора.

Раствор центрифугирован на центрифуге Beckman на роторе JA-20 на 20000 об/мин в течении 60 минут. Первая стадия хроматографической очистки проводилась на колонке с аффинным сорбеитом Chelating Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Швеция), содержащим иммобилизованные ионы Ni2+. Рекомбинантный белок rec (TNF-2F54E10) содержит на своем N-конце полигистидиновую последовательность (6 молекул гистидина), образующую комлекс с №2+-сорбентом с константой диссоциации К=10"15, что позволяет проводить хроматографию в сильных хаотропных растворителях, растворяющих белковые конгламераты, подавляющих неспецифческие белок-белковые взамодействия, препятствующие очистке целевых продуктов экспрессии.

Хроматографию проводили на колонке ХК50*40 (GE Healthcare, Швеция), объемом 50 мл на хроматографе АКТА Prime plus (Amersham Biosciences, США). Скорость потока 5 мл/мин, ограничение по давлению 1,1 атм. На колонку, предварительно уравновешенную раствором: 8М мочевина, 50мМ Tris-HCl (рН=8.0), наносили клеточный лизат. Промывали 100 мл раствора: 8М мочевина, 50мМ Tris-HCl (рН=8.0), 0,5М NaCl, для избавления от не связавшихся с сорбентом белками. Целевые белки элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 50мМ Tris-HCl (рН=8.0), ЮмМ имидазол, финальный буфер: 50мМ Tris-HCl (рН=8.0), 400мМ имидазол. Объем градиента 500мл. Элюат фракционировали по 10 мл. Наличие белка во фракции определяли электрофорезом

вПААГ.

1000 QD230 400 Рисунок 16. Хроматографнческий

750 300 профиль элюцнн рекомбинантного белка

500 200 rec(TNF-2F54E10) с металл-афинной агарозы.

250 Ишдааол, им 100 Стартовый буфер: 50мМ

Tris-HCl (рН=8.0), ЮмМ

0 , имидазол, финальный

300 V. ml SOO буфер: 50мМ Tris-HCl (рН=8.0), 400мМ имидазол.

Фракции, содержащие целевой белок диализовали против 20мМ Tris-HCl (рН=8.0) и приступали к следующему этапу хроматографической очистке на ионообменном сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Швеция). Хроматографию проводили на колонке ХК26*20 (ОЕ Healthcare, Швеция), объемом 20 мл на хроматографе АКТА Prime plus (Amersham Biosciences, США). Скорость потока 5 мл/мин, ограничение по давлению 1,1 атм. На колонку, предварительно уравновешенную 20мМ Tris-HCl (рН=8.0) наносили белковый раствор. Элюировали линейным градиетном. Стартовый буфер: 20мМ Tris-HCl (рН=8.0), ЮмМ NaCl, финальный буфер: 20мМ Tris-HCl (рН=8.0), 400мМ NaCl. Объем градиента 200мл. Элюат фракционировали по 2 мл. Целевой белок вышел при концентрации NaCl равной 195мМ. Наличие белка во фракции определяем электрофорезом в ПААГ.

1 2 з

750

500

250

OD2SO

NaCl, гаМ

M95mM

JV_

400

300

200

100

lift

130 kDa 95 kDa 72 kDa

36 kDa 28 kDa

■iPS

150

300 V. ml

Рисунок 17. а) Хроматографический профиль элюции рекомбинантного белка гес(ТОТ-2Р54Е10) с С2-сефарозы. Стартовый буфер: 20мМ Тпв-НС! (рН=8.0), ЮмМ N»0, финальный буфер: 20мМ Тпв-НС] (рН=8.0), 400мМ №аС1. Ь) Электроферез очищенного рекомбинантного белка гес (ТОТ-2Р54Е10). Трек 1 - нанесение иа(2-сефарозу, трек 2 - стандарты молекулярных весов, грек 3 - элюция с (¿сефарозы, очищенный гес СгаР-2Р54Е10).

Фракции, содержащие целевой белок диализовали против воды. Диализат высушивали в лиофильной сушке ЕАВСОЖЮ Ргее2опе 2,5.

Оценка химических и иммунологических свойств полученного химерного рекомбинантного белка гес (Т!\Т-2К54Е10), доказательство его способности трнмеризоваться.

Аминокислотная последовательность гес (Т№-2Р54Е10), определенная на основании нуклеотидной последовательности приведена на рисунке 18. (Рассчитанная масса рекомбинантного белка гес (ТМЕ-2Р54Е10) равна 26787 Эа).

MGSSHHHHHHSSGLVPROStiMNEOF.l.l-F-LÜKWASI.WNKGWNVVFDITNW^ittASSSRTPSDKJVAHVVANPOAEGOLOWLNRRANAI. LANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFICGQGCPSTHVLLTHTiSRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQL EK.GDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

Рисунок 18. Аминокислотная последовательность белка rec(TNF-2F54E10) в однобуквенном коде.

Рисунок 19. Масс-спектр моиоиона рекомбинантного белка rec(TNF-2F54E10).

3000 m/z

м Номера аминокислот Масса летида Сиквенс

1 1-17 2188,6 MGSSHHHHHHSSGLVPR

2 18-31 1877,0 GSHMNEQELLELDK

3 32-38 1012,1 WASLWNK

4 39-50 1721,8 GWNWFDITNWGK.

5 51-55 578,6 ASSSR

6 56-60 618,6 TPSDK

7 61-80 2569,5 PVAHVVANPQAEGQLQWLNR

8 81 174,2 R

9 82-93 1438,6 ANALLANGVELR

10 94-114 2786,0 DNQLWPSEGLYLIYSQVLFK

U 115-131 2095,4 GQGCPSTHVLLTHTISR

12 132-139 1035,1 IAVSYQTK

13 140-147 983,2 VNLLSA1K

14 148-152 661,7 ' SPCQR

15 153-161 1075,0 ETPEOAEAK

16 162-177 2063,2 PWYEPIYLGGVFQLEK

17 178-180 528,6 GDR

18 181-187 910,0 LSAEINR

19 188-206 2442,7 PDYLDFAESGqvYFGIIAL

Рисунок 20. Масс-спектр триптического лизата рекомбинантного белка rec(TNF-2F54E10).

Т.о. структура рекомбинантного химерного белка rec(TNF-2F54E10) подтверждена.

Иммунологические свойства белка rec (TNF-2F54E10) проверяли в нммуноблоте. Перенос на нитроцеллюлозу осуществляли в ячейке прибора Bio-Rad Mini PROTEAN

Tetra Cells. Ток преноса 200мА, время переноса 1 час. Далее одну мембрану обрабатывали сывороткой ВИЧ-позитивного человека, вторую - ВИЧ-негативного. После инкубации добавляли конъюгат с пероксидазой хрена в PBST, так же инкубировали 1 час. Окрашивали 4-хлорнафтолом на цитрат-перборатном буфере. Окрашивание останавливаем, промывая нитроцеллюлозу дистиллированной водой. Результаты представлены на рисунке 21.

ВИЧ-позитивная ВИЧ-негативная

сыворотка сыворотка

3 4 1 2 3 4

95 kDa 72 kDa

55 kDa 36 kDa

Рисунок 21. Иммуноблот очищенного рекомбинантного белка гес (Т№-2Р54Е10). Трек 1 - гес (24-41), трек 2 - натнвнын ФНО-а, трек 3 - гес (Т№К-2Г54Е10), трек 4 - стандарты молекулярных весов.

Т.о. показано, что рекомбинантный химерный белок гес(Т№-2Р54Е10) специфически взаимодействует с ВИЧ-позитивными сыворотками и не взаимодействует с ВИЧ-негативными сыворотками на иммуноблоте.

Доказательство тримеризации рекомбинантного химерного белка гес (ТN Г-2 Р54К10) путем анализа гетеротримеров.

В связи с тем, что ФНО-а как и наш гес (ТМТ'-2Р54Е10) является природным тримером, способным самопроизвольно тримеризоваться, то при смешивании их друг с другом мы должны получить гетеротримеры. Т.е. триммеры состоящие из молекул как ФНО-а , так и гес (ТОТ-2Е54Е10). При нанесении на металл-афинную сефарозу данных гетеротримеров с ионами металлов способны взаимодействовать лишь молекулы гес (ТКР-2Р54Е10), т.к. они имеют 6 гистидинов на №конце, молекулы же ФНО-а такой способностью не обладают. Зная, что молекулярный вес ФНО-а равен 17 Ша, а гес (ТОТ-2Р54Е10) - 27 кОа, то элюируя гетеротримеры с металл-афинной сефарозы мы можем увидеть на электрофорезе в ПААГ две полосы вместо одной, при условии, что гетеротример образуется, а значит и наш гес (Т№-2Р54Е10) является триммером. Подобный эксперимент был проведен и результаты его показаны на рисунке 22. Как видно на рисунке проскоком (элюция в 3 мМ имидозола) является чистый гомотример ФНО-а, неспособный задержаться на колонке. При низких концентрациях имидозола

2 3 4

130 кОа 95 кЭа 72 кОа 55 кЭа

гес (Т№-2Р54Е1С)).

ФНО-а------.„„,. »"л

Рисунок 22. Элекгроферез элюцни гетсротримеров с металл-афинной сефарозы. Трек I - элюцпи с металл-афинной сефарозы 70 мМ имидозолои, трек 2 - элюция с металл-афинной сефарозы 200 мМ нмидозолом, трек З-элюция ЗмМ имидозолом, трек 4- стандарты молекулярных весов.

(70мМ) сходит фракция гетеротримеров, т.к. константа связывания у молекулы гетеротримера меньше, чем у гомотримера гес (ТЫБ-2Р54Е10), который сходит при более высоких концентрациях имидозола (200мМ).

Т.о. доказана способность гес (Т№-2Р54Е10) образовывать тримеры.

ВЫВОДЫ

1. Были подобраны оптимальные условия для ферментативной наработки рекомбинантного белка гес (24-41).

2. Проведены работы по хроматографической очисте макроколичеств гес (24-41). Рекомбинантный белок гес (24-41) был наработан в количестве, необходимом для проведения второй стадии клинических испытаний вакцины против ВИЧ/СПИД «ВИЧРЕПОЛ».

3. Показана воспроизводимость наработки новых партий рекомбинантного белка гес (24-41).

4. Для новых партий гес(24-41) доказана структура, подтверждено распознавание ВИЧ-позитивными сыворотками в твердофазном иммунном анализе.

5. Разработан белок новой серии кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе тримеризующей мутантной молекулы ФНОК.32Н.

6. Впервые получена плазмида, кодирующая рекомбинантный химерный белок гес (Т№-2Р54Е10), получен штамм-продуцент.

7. Впервые рекомбинантный белок rec (TNF-2F54E10) ферментативно наработан и

хроматографически очищен. Доказана структура данного белка масс-спектрометрией.

Впервые показана способность тримеризоваться путем анализа гетеротримеров.

8. Для rec (TNF-2F54E10) изучены свойства твердофазным иммунным анализом

(иммуноблотом) и показано распознавание rec (TNF-2F54E10) ВИЧ-позитивными

сыворотками.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Сидорович И.Г., Шевалье А.Ф., Коробова C.B., Гудима Т.О., Николаева И. А, Гасанов В.А., Киселев A.B., Игнатьева Г.А., Скляров Л.Ю., Истамов Х.И., Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова Т.В., Чеканова Т.А., Воробьева М.С., Хаитов P.M. Повышение иммуногенности вакцин против ВИЧ/СПИДа/ Физиология и патология иммунной системы, 2005, №9 с.17-23.

2. Николаева И. А, Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Шевалье А.Ф., Игнатьева Г.А., Коробова C.B., Гасанов В.А., Киселев A.B., Истамов Х.И., Ефремов Е.Е., Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова Т.В., Чеканова Т.А., Воробьева М.С., Петрова Т.В., Трофимов Д.Ю.,Ю Алексеев Л.П. Хаитов P.M. Разработка тест-систем для диагностики и мониторинга результатов иммунизации и лечения больных СПИДом/ Физиология и патология иммунной системы, 2005, №12 с.3-11

3. Сидорович И.Г., Гудима Г.О., Николаева И.А., Игнатьева Г.А., Шевалье А.Ф., Коробова C.B., Карамов Э.В., Киселев A.B., Гасанов В.А., Хаитов P.M., Анти-ВИЧ/СПИД-вакцины и микробициды: создание и клинические испытания. Материалы Международной научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и вирусных парентеральных гепатитов (29 сентября-1 октября 2004 г., Суздаль). М., МЗ РФ, стр. 180-181.

4. Kiselev A.V., Gasanov V.A., Toporova V.A., Shevalier A.F., Gudima G.O., Nikolaeva I.A., Korobova S.V., Sidorovich I.G. HIV/AIDS clade A DNA vaccine creation. Basic Science in Allergology and Clinical Immunology, a Prerequisite for Improving Patient Care. Proc. of XXV EAACI congress (Abstract book). EAACI publ., 2006, al600.

5. Nikolaeva I.A., Korobova S.V., Chevalier A.F., Gudima G.O., Kiselev A.V., Gasanov V.A., Sidorovich I.G., Khaitov R.M. Clinical trials of the first Russian HIV vaccine Vichrepol are

in progress. Proc. Of XVI International AIDS Conference (August 13-18, 2006, Toronto, Canada), B35, p. 190/

6. Сидорович И.Г., Николаева И.А., Коробова C.B., Шевалье А.Ф., Гудима Г.О., Горностаева Ю.А., Трубченинова Л.П., Клименко Т.П., Пинегин Б.В., Черноусов А.Д., Гасанов В.А., Киселев A.B., Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова Т.В., Хаитов P.M. Биотехнологические подходы в борьбе с ВИЧ/СПИД. IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 12-16 марта 2007 г.

7. Сидорович И.Г., Гудима Г.О., Коробова C.B., Николаева И.А., Шевалье А.Ф., Гасанов В.А., Горностаева Ю.А., Клименко Т.В., Игнатева Г.А., Хаитов P.M. Результаты первых в России клинических испытаний первой отечественной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины «ВИЧРЕПОЛ». Рабочее совещание по вакцинопрофилактике ВИЧ (20-21 февраля 2009 г. Новосибирск). Сборник докладов и материалов. Новосибирск, издательство «Церис», 2009, с. 64-70.

Подписано в печать 22.10.09 Формат60x84/16. Бумага офсетная.

_ Заказ № 838 Тираж 100 экз._

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Классификация ВИЧ РАЗНОВИДНОСТИ ВИЧ СТОЕНИЕ ВИЧ ГЕНОМ ВИЧ

ПРОНИКНОВЕНИЕ В КЛЕТКУ И ЦИКЛ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ CD4 — главный рецептор ВИЧ. Рецепторы хемокинов — корецепторы ВИЧ. СОБЫТИЯ ПОСЛЕ ПРОНИКНОВЕНИЯ ВИРУСА В КЛЕТКУ. ВИЧ И ИММУННАЯ СИСТЕМАДендритные клетки как основные антигенпредставляющие клетки.

Взаимодействие дендритных клеток с В- и Т-лимфоцитами.

Лимфоидная ткань как место репликации вируса.HLA и иммунный ответ на ВИЧ.

Клеточный ответ на ВИЧ.

Т-хелперы 1 и 2 типа.

Гуморальный иммунный ответ на ВИЧ.Gpl20.Gp41.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ52525353535454565858585959606061616262626363646465МАТЕРИАЛЫ Реактивы Ферменты ОлигонуклеотидыБактериальные штаммы Ecsherichia coli Питательные среды Буферные растворы Приборы и оборудование МЕТОДЫКлонирование, посев на чашки, культуральное выращивание.

Индукция синтеза белка.

Анализ белка электрофорезом в ПААГ.

Перенос на нитроцеллюлозную мембрану и иммуноблот.

Осаждение ДНК этаноломВыделение плазмидной и фагмидной ДНК из небольшого объема ночной культурыЭлектрофорез ДНК.

Расщепление ДНК рестриктазами.

Лигирование фрагментов ДНК по "липким концам"Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Определение нуклеотидной последовательности.

Хроматография на колонке с Chelating Sepharose.

Повторная хроматография на колонке с Chelating Sepharose. (только для гес 24-41). Диализ.

Ионобменная хроматогрфия на Q Sepharose.

656667676868697070727579808183МАСС-спектрометрия. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕПОДБОР УСЛОВИЙ ДЛЯ НАРАБОТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (24-41)В ФЕРМЕНТЕРЕ.

Подбор рН.

Подбор температуры.

Подбор условий по насыщенности раствора кислородом. Подбор оптимальных скоростей вращения венчика шейкера. НАРАБОТКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (24-41) И АНАЛИЗ ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ПАРТИЙ. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА ПОЛУЧЕННЫХ ПАРТИЙ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (24-41).

ОЦЕНКА СТРУКТУРЫ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЛУЧЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (24-41).

Проверка иммунологических свойства белка гес (24-41) в иммуноблоте. РАЗРАБОТКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ХИМЕРНОЙ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ, СОСТОЯЩЕЙ ИЗ ЭПИТОПОВ 2F5 И 4Е10 КОРОВОГО БЕЛКА GP41 ВИЧ-1, И НОСИТЕЛЯ - МУТАНТНОГО, НЕТОКСИЧНОГО БЕЛКА ФНО, СПОСОБНОГО ТРИМЕРИЗОВАТЬСЯ, ДЛЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ЭПИТОПОВ ВИЧ-1 В ФОРМЕ, СООТВЕТСТВУЮЩЕЙ ТАКОВОЙ У НАТИВНОГО ВИРУСА. СОЗДАНИЕ ПЛАЗМИДЫ, НЕСУЩЕЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ БЕЛОК REC(TNF-2F54E10).

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ НАРАБОТКА И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (TNF-2F54E10).

86 ОЦЕНКА ХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЛУЧЕННОГО ХИМЕРНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (TNF-2F54E10), ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ЕГО СПОСОБНОСТИ ТРИМЕРИЗОВАТЬСЯ.

89 Проверка иммунологических свойства белка rec (TNF-2F54E10) в иммуноблоте.

90 Доказательство тримеризации рекомбинантного химерного белка rec (TNF-2F54E10) путем анализа гетеротримеров.

93 ЗАКЛЮЧЕНИЕ95 ВЫВОДЫ96 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

98 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫВВЕДЕНИЕАКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫПроблема ВИЧ/СПИД на нашей планете с каждым годом становится все острее. Официальная статистика утверждает, что сейчас в мире от ВИЧ/СПИДа погибло более 25 млн. человек, 65 млн. инфицировано и количество инфицированных с каждым днем возрастает. Все ранние применяемые классические методы защиты от ВИЧ/СПИД не привели к каким-либо значимым результатам, лишь с внедрением в клиническую практику высокоактивной многокомпонентной специфической антиретровирусной терапии стало возможным на некоторое время продлить жить ВИЧ-инфицированным. Но несмотря ни на что, гибель ВИЧ-инфированных на сегодняшний день неизбежна. Связанно это с некоторыми особенностями ВИЧ:• Не зафиксировано ни одного случая выздоровления от СПИДа. Итог заболевания - смерть.• ВИЧ обладает крайне высокой вариабельностью (субтипы + рекомбинантные формы).• Отсутствует адекватная модели ВИЧ-инфекции/СПИДа на животныхТ.о. классические пастеровские подходы для создания вакцины не применимы. Мы не можем вводить в организм человека, ослабленный или убитый вирус, т.к. есть возможность инфицировать человека, что затем приведет и к гибели. Нельзя вводить и разрушенный ВИЧ, а так же некоторые его части, полученные из нативного вируса, т.к. существует вероятность того, что в полученном препарате может присутствовать вирус неповрежденный, что в конечном итоге приведет к заражению и гибели человека. Единственным направлением, признанным на данный момент наиболее безопасным иперспективным, является вакцина созданная на основе генно-инжинерных белков, копирующих иммунореактивные участки белков ВИЧ.

В мире существует великое множество кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИДа, многие проходят клинические испытания. К сожалению, ни одна до сих пор не достигла главного результата - защиты от ВИЧ-инфекции.

На основе полученного мирового опыта можно предположить, что при подборе последовательности рекомбинантного белка необходимо опираться как на наиболее консервативные части белков ВИЧ-1, так и на наиболее иммуногенные, при этом различные эпитопы белков ВИЧ могут группироваться друг с другом, т.е. рекомбинантная молекула должна быть химерной. Также необходимо учитывать сложную пространственную структуру белков ВИЧ, т.е. эпитопы могут быть не линейными, а пространственными (конформационными).

Но, помимо создания рекомбинантных белков — основ кандидатных вакцин, также очень остро стоит вопрос масштабного производства тех из них, которые прошли доклинические испытания. Связанно это, прежде всего с тем, что те количества белка, которые получают в обычной биотехнологнической лаборатории, не могут покрыть потребностей при проведении клинических испытаний. Процесс получения больших количеств рекомбинантных белков отличается от получения их в аналитических количествах и, помимо высокого качества получаемого препарата необходима и воспроизводимость наработки новых партий рекомбинантных белков. Не стоит забывать, что любая информация, полученная в момент испытаний, может повлечь за собой изменение состава или структуры рекомбинантного белка, что приведет к перенастройке всей производственной линии. Т.о. весь процесс получения рекомбинантных белков, копирующих иммунореактивные участки белков ВИЧ-1, от аналитических количеств до макроколичеств должен находится в одних руках - в руках коллектива авторов.

Все это говорит о том, что создание вакцины против ВИЧ/СПИДа на сегодняшний день является не прикладной, а фундаментальной задачей. Мировая общественность признает, что до появления вакцины, способной противостоять ВИЧ/СПИДу, должно пройти 15-20 лет. Поэтому любая информация, полученная во время проведения испытаний кандидатных вакцин, будет способствовать модернизации новых серий кандидатных вакцин. Подобная модернизация, в свою очередь приведет к скорейшей победе над страшным заболеванием и сохранению жизни и здоровья миллионам людей на планете.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: наработать в количествах, достаточных для проведения второй фазы клинических испытаний рекомбинантный белок rec (24-41), прошедшего доклинические и первую фазу клинических испытаний как основа анти-ВИЧ/СПИД-вакцины «ВИЧРЕПОЛ», создание новой серии рекомбинантных белков - основ вакцин против ВИЧ/СПИД.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ1. Подобрать условия для наработки рекомбинантного белка rec (24-41) в ферментере.

2. Добиться воспроизводимости получения новых партий рекомбинантного белка rec (24-41) и наработать данный белок.

3. Произвести хроматографическую очистку полученных партий рекомбинантного белка rec (24-41).

4. Оценить структуру и иммунологические свойства полученного рекомбинантного белка rec (24-41).

5. Разработать рекомбинантную химерную белковую молекулу, состоящую из эпитопов 2F5 и 4Е10 белка gp41 ВИЧ-1, и носителя - нетоксичного мутантногоTNF, способного тримеризоваться, для представления эпитопов ВИЧ-1 в форме, соответствующей таковой у нативного вируса.

6. Создать плазмиду, несущую ген, кодирующий белок rec (TNF-2F54E10).

7. Произвести ферментативную наработку и хроматографическую очистку рекомбинантного белка rec (TNF-2F5-4E10).

8. Оценить структуру и иммунологические свойства полученного рекомбинантного белка rec (TNF-2F5-4E10), доказать его способность к тримеризации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫВпервые проведена масштабная наработка рекомбинантного белка гес(24-41). Показана воспроизводимость наработки партий рекомбинантного белка гес(24-41). Создан штамм-продуцент ВЦ24-41) способный продуцировать белок rec (24-41) в условиях ферментации. Проведена работа по подбору оптимальных условий для экспрессии белка rec (24-41) в условиях ферментации. Подобраны условия очистки и рефолдинга макроколичеств рекомбинантного белка rec (24-41).

Впервые получен тример 2F5-4E10 на основе белка TNF. Создан ген, кодирующий белок rec (TNF-2F5-4E10). Получена плазмида, несущая данный ген. На основе плазмиды создан штамм-продуцент BL21(TNF-2F5-4E10). Наработан и очищен rec (TNF-2F5-4E10). Была доказана мономерная и тримерная структуры молекулы. Показана возможность тримеризоваться в различных растворах. Получены доказательства специфического взаимодействия rec (TNF-2F5-4E10) с сыворотками ВИЧ-позитивных людей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬСозданна база по масштабированию рекомбинантных химерных белков, проработана методика их ферментативной наработки, показа воспроизводимость процесса наработки.

Полученный рекомбинантный белок гес (24-41) как основа вакцины «ВИЧРЕПОЛ» продолжит дальнейшие клинические испытания.

Рекомбинантный химерный белок гес (TNF-2F5-4E10) является первым из новой серии кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД. Он пригоден для дальнейших исследований и представления к доклиническим испытаниям. На данной серии возможно изучение всех комбинаций тримерных белков ВИЧ-1.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ1. Создан штамм-продуцент BL21 (DE3)£. coli, несущий в себе плазмиду рЕТ15Ь гес24-41, способный продуцировать рекомбинантный белок гес (24-41) в условиях ферментации.

2. Были подобраны оптимальные условия для ферментативной наработки рекомбинантного белка гес (24-41).

3. Проведены работы по хроматографической очисте макроколичеств гес (24-41). Рекомбинантный белок гес (24-41) был наработан в количестве, необходимом для проведения второй стадии клинических испытаний вакцины против ВИЧ/СПИД «ВИЧРЕПОЛ».

4. Показана воспроизводимость наработки новых партий рекомбинантного белка гес (24-41).

5. Для полученного рекомбинантного белка гес(24-41) доказана структура, подтверждено распознавание ВИЧ-позитивными сыворотками в твердофазном иммунном анализе.

6. Разработан белок новой серии кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе тримеризующей мутантной молекулы ФН(Ж32Н.

7. Получена плазмида, кодирующая рекомбинантный химерный белок rec (TNF-2F54EI0), получен штамм-продуцент.

8. Рекомбинантный белок rec(TNF-2F54E10) ферментативно наработан и хроматографически очищен.

9. Доказана структура рекомбинантного белка rec(TNF-2F54E10) масс-спектрометрией. Показана способность тримеризоваться путем анализа гетеротримеров.

10. Для rec (TNF-2F54E10) изучены свойства твердофазным иммунным анализом (иммуноблотом) и показано распознавание rec (TNF-2F54E10) ВИЧ-позитивными сыворотками.

выводы

1. Были подобраны оптимальные условия для ферментативной наработки рекомбинантного белка rec (24-41).

2. Проведены работы по хроматографической очисте макроколичеств rec (24-41). Рекомбинантный белок rec (24-41) был наработан в количестве, необходимом для проведения второй стадии клинических испытаний вакцины против ВИЧ/СПИД «ВИЧРЕПОЛ».

3. Показана воспроизводимость наработки новых партий рекомбинантного белка rec (24-41).

4. Для новых партий гес(24-41) доказана структура, подтверждено распознавание ВИЧ-позитивными сыворотками в твердофазном иммунном анализе.

5. Разработан белок новой серии кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе тримеризующей мутантной молекулы <i>HOR32H.

6. Впервые получена плазмида, кодирующая рекомбинантный химерный белок rec (TNF-2F54E10), получен штамм-продуцент.

7. Впервые рекомбинантный белок rec (TNF-2F54E10) ферментативно наработан и хроматографически очищен. Доказана структура данного белка масс-спектрометрией. Впервые показана способность тримеризоваться путем анализа гетеротримеров.

8. Для rec (TNF-2F54E10) изучены свойства твердофазным иммунным анализом (иммуноблотом) и показано распознавание rec (TNF-2F54E10) ВИЧ-позитивными сыворотками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Не смотря на то, что детально изучен ВИЧ, а также процессы патогенеза и многие вопросы молекулярной биологии вируса остается неясным каким образом возможно защитить организм человека от ВИЧ.

Мы наблюдаем многие феномены связанные с данным вирусом. ВИЧ крайне неустойчив, даже незначительный нагрев, неговоря уже о кипячении и обработки специальными растворами, приводит к его гибели или инактивации. ВИЧ крайне малозаразен. Ведь у ВИЧ-инфицированных матерей рождаются ВИЧ-негативные дети, многие годы живут дискордантные пары и ВИЧ-негативный партнер не заражается. Кажется, что лишь незначительный толчок с нашей стороны и проблема решится. Но проходят годы, дажы десятилетия. От ВИЧ погибло людей столько же, сколько и во Второй мировой войне. И если ничего в ближайшие годы не изменится, то 60 миллионов ВИЧ-инфицированных должны будут погибнуть.

Огромные ресурсы брошены на борьбу с этим вирусом, но до сих пор весь мир ничего не может ему противопоставить.

Огромный спектр создаваемых вакцин, пока таюке не привел к значимым результатам. Мировая научная общественность прогнозирует появление вакцины через 15-20 лет. Страшно преставить сколько миллионов людей к тому времени погибнет от ВИЧ-инфекции.

Поэтому сейчас любая кандидатная вакцина, а ососбенно кандидатная вакцина построенная по новому принципу так важна. Любое новое направление в создании вакцинных препаратов против ВИЧ-СПИДа спосбно стать тем толчком, которы сдвинет проблему с мертвой точки, приблизить день победы над ВИЧ, спасти жизни многих людей.

В результате проведенной работы создан белок-тример, способный стать кандидатной вакциной новой серии. Впервые получена возможность копироваться не полько линейные эпитопы, но сложные пространственные, появилась возможность на базе полученного белка создавать тримеры прежде всего поверхностных белков ВИЧ, т.е. абсолютно точно копировать те белки с которыми прежде всего и встечается иммунная система человека.

Созданна база по масштабированию рекомбинантных химерных белков, проработана методика их ферментативной наработки, показа воспроизводимость процесса наработки. Все это позволит в кратчайшие сроки нарабатывать необходимые количества любого рекомбинантного химерного белка — основ кандидатных вакцин, при переходе от доклинических испытаний к клиническим.

На созданной базе и был наработан ранее разработанный лабораторий биотехнологии и СПИДа ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России рекомбинантный белок гес (24-41) - основа вакцины «ВИЧРЕПОЛ», для прохождения дальнейших клинических испытаний.