Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Создание гипериммунного протективного антигена Bacillus anthracis для иммунопрофилактики сибирской язвы

На правах рукописи

ЩЕРБИНИН ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

СОЗДАНИЕ ГИПЕРИММУННОГО ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА BACILLUS ANTflRACISИДЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 СЕН 2015

Москва 2015

005562219

Работа выполнена в Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГ1»У «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Шмаров Максим Михайлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Саядяи Хачик Саркисовнч

профессор кафедры фармацевтической технологии Первого Московского государственного медицинского университета им. U.M. Сеченова

доктор ветеринарных наук Скляров Олег Дмитриевич

заведующий лабораторией качества и стандартизации бактерийных лекарственных средств ФГБУ «ВГНКИ»

Ведущая организация:

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина

Защита диссертации состоится октября 2015 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиолога и имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России) по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и на сайте Центра: www.gamaleya.org

Автореферат разослан «(О» сентября 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы и степень ее разработанности: Сибирская язва - опасное зооантропонозное инфекционное заболевание, поражающее людей и животных. Возбудителем является Bacillus an/hracis -грамположительный, спорообразугощий микроорганизм, способный длительное время сохраняться в почве и па различных предметах. Ежегодно в разных регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. Данные мониторинга за развитием эпидемической ситуации в России свидетельствуют о неуклонном росте неблагополучных но сибирской язве территорий (Локтионова М.Н., 2011). Развитию такой ситуации способствуют меняющиеся социально-экономические условия жизни населения, а также действие ряда факторов природного и антропогенного характера, требующие дальнейшего изучения. По уточненным данным кадастра, в 2003 году в России отмечено 28 986 стационарно неблагополучных по сибирской язве населенных пунктов, 13 855 скотомогильников, из них 4 961 - не отвечают требованиям ветеринарно-санитарных норм, что составляет 35,8 %. Кроме этого на территории субъектов РФ имеется еще 15 664 места захоронения павших животных и 925 - сжигательиых печей. В 14 субъектах Российской Федерации трупосжигателыше печи отсутствуют. Более того, ежегодно регистрируются спорадические вспышки болезни среди людей, в там числе со смертельными исходами- По статистическим данным за период с 2001 по 2012 годы в РФ заболело 120 человек, из которых четверо умерло (Рязанова А.Г., 2010). В других странах мира ситуация по сибирской язве также остается напряженной (Рязанова А.Г., 2014). Таким образом, санитарно-эпидемиологическую обстановку по сибирской язве в России оценивают как неблагоприятную (Адилов Д.А., 1972, Ведерников В., 1995).

Постановлением Правительства Российской Федерации от 1 декабря 2004 г. №715 «Об утверждения перечил социально-значимых и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих» сибирская язва отнесена к группе заболеваний, представляющих опасность для окружающих, наряду с чумой и холерой.

Высокая патогенноегь В. amliracis в сочетании с уникальной устойчивостью споровых форм к воздействию факторов внешней среды, ставят его в разряд крайне опасных биологических агентов относящихся ко второй группе патогенности и имеющих потенциальную угрозу применения в качестве оружия массового поражения (Spencer R.C., 2001, Redmond С,

з

1998). Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) относит В. anihracis к высшему классу (категория А) биотеррористических агентов (www.bt.cdc.gov). Потенциал В. anihracis в качестве биологического оружия был продемонстрирован несколькими громкими инцидентами, произошедшими в последних три десятилетия. В 1979 году аварийный случай распыления спор произошел на военном объекте в городе Свердловске, который привел к 96 случаям заражения сибирской язвы, в том числе 68 случаям со смертельным исходом (Meselson M., 1994, Abramova F.A., 1993). С 1985 по 1991 год в Ираке разрабатывалось биологическое оружие fia основе сибиреязвенных баю-ерий и могло быть использовано в любой момент в войне в Персидском заливе (Zilinsl:as R.A., 1997). В 1993 году Аум Синрикё распылили споры сибирской язвы на вершине здания в Токио (Takahashi H., 2004). Этот инцндент можно считать первым документально зарегистрированным случаем использования сибиреязвенных бактерии в качестве аэрозольного оружия биотеррористами. Впоследствии было обнаружено, что используемый террористами шгамм является вакцинным штаммом Sterne и был импортирован из США для использования в качестве вакцины для корон (Keim Р., 2001). Осуществленная в 2001 году рассылка зараженной спорами В. anihracis корреспонденции, вызвала палику среди населения США и привела к гибели пяти человек из одиннадцати от легочной формы заболевания (Jemigan J.А., 2001, Bush L.M., 2001, Brachman P.S., 2002).

Существуют различные пути передачи возбудителя сибирской язвы: через кишечник (поедание зараженной пищи), кожу (контакты с зараженными животными или их тушами), или через дыхательные пути (вдыхание спор). Следует заметить, что самой распространенной является кожная форма заболевания, которая протекает гораздо легче, чем другие формы болезни но, тем не менее, несмотря на проведение антабиотекотерапии сопровождается 5,5% летальностью, тогда как без лечения летальность достигает 20% (Ebensen Т., 2004). При проникновении возбудителя в организм человека через слизистые оболочки дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта может развиваться септическая форма, которая часто приводит к смертельному исходу. Установлено, что при кишечной и легочной формах болезни летальность составляет приблизительно 50% и 90%, соответственно (Meselson M., 1994). Все это свидетельствует о высокой вируле нтности сибиреязвенных бацилл, а также о необходимости контроля над данным заболеваш1ем.

Иммунизация современными ослабленными живыми вакцинами является научно-обоснованным и эффективным способом профилактики сибирской язвы. Однако выпускаемые жнвые вакцины необходимо водить двукратно, с последующей ежегодной ревакцинацией. Считается, что существующие вакцины обладают слабой иммуногенностью (Splino М., 2005) и длительность сохранения поегвагадинальнэго иммунитета не превышает 6-8 месяцст; (Мариннн Л.И., 2008). Отчасти это можно объяснить неспособностью стандартизировать скарификационный путь введения вакцины. Другим недостатком живых вакцин является их реактогенность (Burgasov P.N., 1976), а также наличие противопоказаний к их применению. Более того, некоторые авторы показали, что живые вакцины не создают напряженного иммунитета против некоторых полевых изолятов сибиреязвенных бацилл циркулирующих на территории Российской Федерации (Auerbach S., 1955, Little S.F., 1986, Ward М.К., 1965).

Применяемые в США и Великобритании химические вакцины также имеют недостатки: для создания защитного иммунитета их требуется вводить шестикратно в течение 18 месяцев, что вызывает амортизацию ревакципируемого организма (ТигпЪнИ P.C., 2000). Используемые в этих странах субъединичные вакцины ввиду особенностей технологии получения их компонентов нз аттенуированных культур В. anthracis, неизбежно содержат минимальные примеси отечного и летального факторов (Turnbull P.C., 1991, Baillie L.W., 1999). Именно с данными продуктами связывают развитие аллергических реакщш, возникающих почти у 30 % вакцинированных в США людей (Swansori-Bie arman В., 2001, Bnichman P.S., 1962) и возникновение побочных эффектов наблюдается у 11% вакцинированных англичан {Enstone J.E., 2.(103). Kai: правило, побочные эффекты проявляются в аиде покраснения кожи, уплотнения места иммунизации, болезненных ощущений, а также повышения температуры тела. Более того, у 1% вакцинированных людей наблюдаются серьезные побочные реакции (Splino М, 2005), в том числе в виде некроза тканей (Svvanson-Biearman В.. 200Í).

С учётом вышесказанного :;здача совершенствования противосибиреязвенных вакцин является весьма актуальной, поэтому аедстся постоянный поиск новых средств для специфической профилактики сибирской язвы (Brey R.N., 2005). Основным» критериями оценки качества вакцин являются: увеличение продолжительности иммунитета, повышение уровня продукции специфических антител к протектиштому антигену,

индукция клеточного иммунного ответа, индукция как общего гуморального иммунного ответа, так и иммунного ответа на слизистых оболочках, а также снижение частоты возникновения побочных реакции по сравнению с существующими вакцинами.

Применяемые живые вакцины вводят в организм человека путем скарификации, в то время как субъединичпые вакцины вводятся подкожно (внутримышечно), что приводит к формированию преимущественно общего иммунного ответа. Поскольку входными воротами возбудителя сибирской язвы являются как кожные покровы, так и слизистые оболочки легочного и кишечного трактов, то будущие заюшны должны формировать стойкий как общий иммунитет, так и мест ный (на слизистых оболочках) иммунитет.

Одним из наиболее эффективных на сегодняшний день подходов для решения вышеуказанных проблем является использование генетических вакцин, базирующихся на аденовирусных векторах (Tutykhina I.L., 2011). При введении в организм таких вакцин происходит попадание генетического материала в клетки организма и экспрессия в них генов целевых белков патогена. В результате антигены распознаются иммунной системой хозяина, что приводит к индукции как л/моралыюго, так и клеточного иммунного ответа (Карпов А.П., 2007, Knoblich H.V., 2000). На сегодняшпий день одними из наиболее изученными и часто иснользз'емыми в генетической вакцинации являются рекомбннантные аденовирусные векторы. Вакцины на основе рекомбннантного аденовируса человека пятого серогипа имеют ряд преимуществ перед другими генетическими вакцинами. Во-первых, рекомбннантные аденовирусы являются репликаттшно-дефектными и не способны вызывать заболевания. Безопасность аденовирусных векторов с удаленными El и ЕЗ областями генома подтверждается целым рядом проведенных клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе (Van Kampen K.R., 2005, Li X., 2013). Во-вторых, использование рекомбинантных аденовирусов позволяет проводить иптраназальную нмм)тшзацию, и, как следствие, индуцировать образование иммунного ответа на слизистых оболочках. В-третьих, в настоящее время уже разработаны эффективные технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие быстро реализовать масштабное производство различных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента (Tang D.C., 2009). Вышеперечисленные свойства делают рекомбннантные аденовирусы хорошей технологической платформой

б

для создания широкого спектра вакцин против различных патогенов, в том числе и вакцин для биологической защиты (Boyer J.L., 2005).

В связи с вышесказанным, изучение возможности использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа для создания препаратов для вакцинации против такого особо опасного патогена, как В. anthracis, представляет самостоятельный научный интерес.

Цель диссертационной работы

Создание гипериммунного протективного антигена Bacillus anthracis для иммунопрофилактики сибирской язвы.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Смоделировать и сконструировать последовательность, кодирующую химерный белок, в состав которых входит протективный антиген В. anthracis, а также иммуностимулирующая молекула, способная усилить гуморальный иммунный ответ к протективному антигену.

2. Определить in vivo основные параметры иммуногенности полученных генетических конструкций.

3. Исследовать защитные свойства рекомбинантного аденовируса, несущего гипериммунный протективный антиген, на лабораторной модели летальной экспериментальной сибиреязвенной инфекций с безкапсульным штаммом В. anthracis.

4. Исследовать защитные свойства рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего гипериммунный протективный антиген, против капсулыюго, вирулентного штамма 71/12 В. anthracis.

Научная новизна

С помощью эффективной технологии получения рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, основанной на гомологичной рекомбинации в Е. coli, было сконструировано и получено четыре рекомбинантных аденовируса человека пятого серотипа, содержащих ген протективного антигена Bacillus anthracis: Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc, Ad-Fc-PA.

Продемонстрирована способность полученных рекомбинантных аденовирусов вызывать антиген-специфическую пролиферацию Т-клеток лимфатических узлов.

Показана индукция гуморального иммунного ответа к В. anthracis у лабораторных животных, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc.

Продемонстрировано защитное действие рекомбинантного аденовируса Ad-PA-Fc при интраназалыюй иммунизации мышей против В. anthracis штамма Sterne. Иммунизация Ad-PA-Fc способна полностью защищать мышей от заболевания сибирской язвой в течение трех месяцев после иммунизации.

Впервые показано, что генетическая иммунизация (генно-инженерная конструкция, которая после введения в клетку обеспечивает продуцирование белков патогенов) рекомбинантным аденовирусом (Ad-PA-Fc) индуцирует защитный иммунный ответ против капсулыюго штамма В. anthracis.

Впервые продемонстрировано, что иммунизация генетической конструкцией, кодирующей, кроме антигена, иммуностимулирующую молекулу, значительно увеличивает защиту лабораторных животных от бактериальной инфекции.

Впервые показана возможность увеличения иммуногенности антигенов при генетической иммунизации против бактериальных инфекций. Таким образом, подобные антигены, экспрессируемые из состава вирусных векторов, могут рассматриваться как компоненты будущих противобактериальных вакцины.

Теоретическая и практическая значимость.

Работа представляет теоретический интерес в плане создания антигенов с увеличенными иммуногенными свойствами, за счет слияния антигенов с иммуностимулирующими молекулами. Более того, сконструированные генетические конструкции представляют также практическую значимость. Полученные в результате работы рекомбинантные аденовирусы могут выступать как компоненты будущих противосибиреязвенных вакцин.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, вошли в патент Российской Федерации № 2444570 «Способ получения рекомбинантной вакцины», в МР 1.2.2522-09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека», а также в МР «Получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, экспрессирующих гены белков, обладающих токсичностью для эукариотических клеток».

Методология и методы исследования.

В диссертации использованы современные бактериологические методы (приготовление компетентных клеток Е. coli штаммов DH5a и BJ5183 и их трансформация, гомологичная рекомбинация в клетках Е. coli), генно-

инжинериые методы (выделение аналитических и препаративных количеств плазмидной ДИК, методы рестрикционного картирования, отбор рекомбинантных клонов и другие методы молекулярного клонирования), вирусологические методы (пол^спис, накопление и очистка рекомбинантных аденовирусных векторов, выделение вирусной ДНК, титрование рекомбинантных аденовирусов), методы работы с животными и биоинформатичeCKiie методы.

Степень достоверности я апробация результатов.

Для решения поставленных задач в работе использовались современные инструментальные методы. Обсуждение результатов проведено с учетом современных данных медицинской и биологической науки. Научные положения и выводы, изложенные з диссертации обоснованы и подтверждены фактическим материалом.

Результаты диссертационной работы были доложены на девятой межнациональной аденовиру сной конференции «Development of recombinant adenoviruses expressing M. tuberculosis antigens, and transfection of dendritic cells. 9th International Adenovirus Meeting 26-30 April 2009, Dobogoko, Hungary» ii XIV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В И. Иоффе «Экспрессия типериммуногеяного антигена М tuberculosis Ag85E» в рекомбипантном аденовирусном векторе». Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии, медицинской микробиологии и генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Гаманеи» МЗ РФ 09.04.2015 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 22 научные работы, из них 8 статей в журналах рекомендованных ВАК, а также 1 патент, 2 методических указаний, 11 тезисов в научных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (187 источника, из которых 27 отечественных, 154 иностранных и 6 интернет ссылок). Работа содержит 12 таблиц и 13 рисунков.

Основные положения, выпосимые на защиту.

Разработана технология получения гипернммупных антигенов, состоящих из иммуностимулирующей молекулы, слитой с протективным антигеном В. anthracis, которые в свою очередь экспедируются из состава

репликагивно-дефектных аденовирусов человека пятого серотипа. Продемонстрирована экспрессия рекомбинантных белков из состава полученных рекомбинантных аденовирусов in vitro.

Иммунизация рекомбттнтньши аденовирусами Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc приводит к индукции гуморального иммунного ответа к В. cmthracis у лабораторных животных.

При интраназальной иммунизации лабораторных животных против В. anthracis штамма Sterne, показано защитное действие рекомбинантного аденовируса - Ad-PA-Fc. Иммунизация Ad-PA-Fc способна полностью защищать мышей от заболевания сибирской язвой в течение трех месяцев после иммунизации.

Генетическая иммунизация рексмбинантпым аденовирусом Ad-PA-Fc индуцирует защитный иммунный ответ против капсулыюго штамма В. anthracis в дозе равной 5 LD50.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена в период с 2006 по 2015 годы в лаборатории Молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Мииздравсоцразвития РФ. Эксперименты по оценке протективных свойств рекомбинантных аденовирусов проводились в лаборатории Экспертиментальной микробиологии ГНУ ВНИИВВиММ Россельхозакадемни.

В работе были использованы:

- безкапсульный штамм Sterne и капсульиый штамм 71/12 Bacillus anthracis, рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа Ad5-null, любезно предоставленный к.б.н. Тутыхиной И.Л. (лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Гамалеи» Мииздравсоцразвития РФ);

- лабораторные штаммы E.coli DH5a и BJ5183, клеточные линии 293-НЕК (клетки эмбриональной почки человека, трансформированные El-областью Ад5) и линия А549 (карциномы легких человека).

- плазмидные вектора pBhiescript IT SK (+) (Fermentas MBI, Литва), плазмидная система pGEM-T-Easy (Promega, США), плазмидный вектор pAL-TA (ЗАО Евроген, Россия), плазмидные вектора pShutlle-CMV и pAd-Easy (Siratagene, США).

зо

- коммерческие препараты специфических эндодезоксирибонуклеаз рестрикции и других ферментов фирм Сннтол (Россия), Силекс (Россия), Fermentas MBI (Литва), Promega (США) и NE BioLabs (США).

Для анализа экспрессии генов сРА, sPA, PA-Fc использовали очищенный белок протективного антигена фирмы Calbiochim (кат. номер 176908-100UG). Плазмндную ДНК очищали набором JETSTAR 2.0 Plasmid Midiprep Kit (Genomed, США). Трансфекцию клеток линии 293-НЕК проводили с применением реагента Metafectene™ Pro (Biotex, Германия). Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол». Синтез химерного гена - PA-Fc, из которого впоследствии получали гены сРА и sPA, был выполнен в ЗАО «Евроген». Секвенирование генов проводилось в лаборатории Анализа геномов ФГБУ «НИИЭМ им. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ. Эксперименты проводились на мышах линии BALB\c, самках, весом 7-9 грамм, а также на безпородных морских свинках, самках, весом 200 грамм.

Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методам, изложенным в руководстве Maniatis et al., 1982. Все манипуляции связанные с работой с аденовирусами, проводили согласно Graham&Prevec, 1991.

Анализ экспрессии антигенов сРА, sPA, PA-Fc из состава рекомбинантных аденовирусных векторов проводили с помощью метода вестерн-блотта. Уровень индукции антител к протективному антигену у лабораторных животных оценивали с помощью ИФА-анализа. Оценку пролиферации иммунокомпетентных клеток проводили с помощью включения радиактивно меченного НЗ-тимндина. Статистическую обработку результатов по выживаемости экспериментальных животных оценивали с применением критерия Манна-Уитни.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также д.б.н. Носковым А.Н. - зав. лаб. клостридиозов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ и д.б.н. Селянинов Ю.О. - лаборатория Экспериментальной микробиологии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Выражаю им глубокую благодарность за помощь и поддержку.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Дизайн генетических конструкций сРА, sPA, PA-Fc

Белковые и нуклеотидные последовательности четвёртого домена антигена РА были получены из UniProtKB/Swiss-Prot: PI3423 и GenBank: М22589.1. Анализ кодонов РА В. anthracis показал, что в геноме бацилл

преобладают АТ-нуклеотиды. Для оптимальной экспрессии гена РА в клетках млекопитающих необходимо модифицировать кодоны под Mus musculiis. Наиболее часто встречающиеся кодоны В. antlwacis и Mus muscuhis были определены согласно базе данных используемых кодонов http://www.kazusa.or.jp/codon/. Для обеспечения высокого уровня продукции белка, кодоны были оптимизированы под экспрессию в клетках Mus musculus. Белковые и нуклеотидные последовательности Fc-фрагмента IgG2a были взяты из UniProtKB/Swiss-Prot: PO 1863 и GenBank: V00798.1. Между РА антигеном и Fc-фрагментом антитела был встроен 12-ти членный глицин-сериновый спейсер.

Была разработана нуклеотидная последовательность гена PA-Fc с таким учетом, чтобы с помощью последовательного удаления нуклеотидных последовательностей можно было получить гены сРА и sPA. Нуклеотидная последовательность гена PA-Fc представлена ниже.

Сконструированный химерный ген, кодирующий протективный антиген слитый с Fc-фрагментом антитела, был синтезирован компанией ЗАО «Евроген» и доставлен нам в составе плазмиды pAL-TA-PA-Fc.

Получение челночных плазмид pSh-cPA, pSh -sPA, pSh -PA-Fc.

Нуклеотидная последовательность PA-Fc из состава плазмиды pAL-TA-PA-Fc была субклонирована по сайтам для рестриктаз Notl и HindIII в челночный вектор pShuttle-CMV для получения челночной плазмиды pSh-PA-Fc (Рисунок 3). Затем из накопленной и очищенной плазмиды pSh-PA-Fc, путем рестрикционного гидролиза и последующего лигирования, были получены челночные плазмиды pSh-sPA и pSh-cPA. pSh-sPA получали путём гидролиза плазмиды pSh-PA-Fc рестриктазой Xhol с последующим лигированием липких концов. С-концевой сайт рестрикции для рестриктазы Xhol располагался в последовательности TAACTCGAGTAAAAGCTT. таким образом, после удаления Fc-фрагмента получается новый стоп кодон. pSh-сРА был получен из плазмиды pSh-sPA путём удаления лидерного пептида tpa рестриктазами Notl и Ndel. Сохранение рамки считывания подтверждали секвенированием генов после соответствующего клонирования.

Получение рскомбинантных аденовирусов Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc.

Дальнейшее получение рекомбинантных аденовирусов Ad-PA-Fc, Ad-сРА и Ad-sPA выполняли с помощью метода гомологичной рекомбинации в Е. coli.

Для получения рекомбинантных аденовирусов методом гомологичной рекомбинации в Е. coli была использована система Ad-EASY Adenoviral Vector System («Stratagene», США). Метод основан на гомологичной рекомбинации между геномом рекомбииантного аденовируса и челночным плазмидным вектором, который содержит последовательности, гомологичные концам генома вируса, и экспрессирующую кассету с целевым геном. Полученная в результате рекомбинации плазмидная конструкция содержит сайт инициации репликации - ori, ген устойчивости к антибиотику канамицину и экспрессирующую кассету с целевым геном в составе генома аденовируса. Преимуществом метода является возможность использования клеток Е. coli в качестве основного инструмента для проведения клонирования, рекомбинации и наращивания в препаративных количествах аденовирусной ДНК. Возможность проведения гомологичной рекомбинации в клетках Е. coli позволяет работать с индивидуальными клонами, содержащими плазмидные конструкции только рекомбинантных аденовирусов, что исключает вероятность контаминации аденовирусом дикого типа.

Для получения плазмидной конструкции, несущей полноразмерный геном рекомбииантного аденовируса человека пятого серотипа и экспрессирующую кассету с целевым геном, использовали клетки Е. coli штамма BJ5183, которые трансформировали методом электропорации смесью геномной ДНК рекомбииантного аденовируса и линеаризованной ДНК соответствующего челночного плазмидного вектора. Затем плазмидная конструкция, содержащая геном рекомбииантного аденовируса с экспрессирующей кассетой, была трансформирована в компетентные клетки Е. coli штамма DH5a, неспособные к рекомбинации.

В результате гомологичной рекомбинации в клетках Е. coli был получен набор плазмидных конструкций pAd5-cPA, pAd5-sPA и pAd5-PA-Fc, несущих геномную ДНК аденовируса человека пятого серотипа со вставкой в сайте делеции Е1 области экспрессирующей кассеты, содержащей соответствующие гены антигена Bacillus anthracis. Полученные нлазмиды рекомбинантных аденовирусов pAd-PA-Fc, pAd-cPA и pAd-sPA были проанализированы методом ПЦР, для которого были использованы пары праймеров, комплементарные соответствующим целевым генам. В результате проведённого ПЦР анализа последовательностей ДНК полученных рекомбинантных аденовирусов было показано, что геномы

аденовирусов содержат соответствующие целевые гены. Примесей репликативно-компетентных вирусных частиц обнаружено не было.

Первичную последовательность экспрессирующих кассет в составе аденовирусов определяли методом секвенирования. Идентичность последовательностей в составе полученных рекомбинантных аденовирусов целевым генам показали сравнением их нуклеотидных последовательностей.

Таким образом, было сконструимрованно и получено три рекомбинантных аденовируса - Аё-РА-Рс, Аё-вРА и Аё-сРА (Рисунок 1).

лслеши Е! области аленоанрусого генома

tpa PA SP Fc В' W-| | fl . Ad-PA-Fc

tpa PA

PA

|_f. Ad-cPA

Рисунок 1. Схема геномов рекомбинантных аденовирусов, несущих протективный антиген В. anthracis. А. Схематично представлен геном рекомбинантного аденовируса человека 5 сератипа. На месте делеции Е1 области аденовирусного генома, вставлена экспрессионная кассета. В. Схематично представлены нуклеотидные последовательности антигенов, находящихся под контролем CMV-промотера. CMV - промотор цитомегаловируса человека, рА - сигнал полиаденилирования, tpa -сигнальный пептид Tissue-type plasminogen activator, PA - протективный антиген, SP - глицин-сериновый спейсер, Fc - Fc-фрагмент антитела IgG2a

Изучение экспрессии генов сРА, sPA, PA-Fc из состава рекомбинантных аденовирусов, методом вестерн-блотта

Для оценки экспрессии и секреции РА в составе рекомбинантных аденовирусов, клетки А549 были трансдуцированны 3 вариантами аденовирусных конструкций. В качестве положительного контроля мы использовали четвертый домен протективного антигена, продуцированный в Е. coli. После 48 часов инкубации надосадочная жидкость от инфицированных клеток и клеточный осадок были проанализированы на

наличие четвертого домена протективного антигена методом иммуноблотинга. Надосадочная жидкость от клеток трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами Ad-sPA и Ad-PA-Fc, а также лизированные клетки трансдуцированные рекомбинантным аденовирусом Ad-cPA содержали четвертый домен протективного антигена. Четвертый домен протективного антигена, синтезированный и очищенный в Е. coli, также дал положительный результат.

Определение антиген специфического лимфопролиферативного ответа к протективному антигену у мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-PA-Fc, Ad-sPA и Ad-cPA

Иммунногенность полученных конструкций оценивали с помощью антиген-специфического лимфопролиферативного ответа. Для этого мышей линии Balb/c были интранозально иммунизировали соответствующими рекомбинантными аденовирусами. Через две недели были взяты клетки подколенных и паховых лимфатических узлов, посеяны на 96 л.п. и добавлен протективный антиген. На второй день после высева добавляли Н'-тимидин и на следующий день оценивали включение радиоактивной метки в ядра делящихся клеток на жидкостном сцинтилляционном счетчике (Рисунок 2).

Тысяч имп./мин.

30 "

25 ' Г

20 ' I I

15 '

10 •

К- Ас1-сРА Аё-эРА Аё-РА-Ис Рисунок 2. Определение антиген специфического лимфопролиферативного ответа к протективному антигену.

В результате лимфопролиферативного анализа было продемонстрировано, что лимфоциты иммунизированных мышей после добавления антигена активно включали меченый тимидин, что говорит об их пролиферации в ответ на стимуляцию антигеном. В контрольной группе,

содержащей клетки лимфатических узлов полученные от не иммунизированных мышей, такой эффект не был обнаружен.

Оценка индукции антител класса к РА в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, методом ИФА

Иммунный ответ на четвертый домен протективного антигена, экспрессируемый в составе рекомбинантных аденовирусов, оценивали на мышах линии Ва1Ь/с. Мыши были двукратно иммунизированы с интервалом в две недели. Спустя 10 дней после второй иммунизации у мышей брали кровь, отбирали от неё сыворотку и анализировали методом ИФА на наличие специфических антител к РА (Рисунок 3). Сыворотка крови мышей, трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом Аё-сРА, содержала специфические антитела к РА в наибольшей концентрации, сходной с таковой у мышей, иммунизированных непосредственно РА с неполным адъювантом Фрейнда. Сыворотки крови мышей, инфицированных рекомбинантными аденовирусами Аё^РА и Аё-РА-Рс, содержали специфические антитела к РА в меньшей концентрации, но приблизительно на одинаковом уровне.

Рисунок 3. Результаты выявления антител к РА в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, методом ИФА. Аё-РА-Рс - рекомбинантный аденовирус содержащий РА слитый с Рс-фрагментом иммуноглобулина 1§С2а, Аё-сРА - рекомбинантный аденовирус содержащий не секретируемую форму РА, Аё-зРА - рекомбинантный аденовирус содержащий секретируемую форму РА, Положительный

3,0

1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 Разведение сыворотки

контроль - белок РА смешанный с неполным адъювантом Фрейнда, Отрицательный контроль - фосфатный солевой буфер (PBS)

Оценка методом ИФА подклассов антител IgG специфических к РА в сыворотках крови мышей

Сыворотки, полученные в предыдущем эксперименте, были проанализированы на наличие подклассов специфических иммуноглобулинов (IgG) к РА-антигену (Рисунок 4). Результаты показали, что все рекомбинантные аденовирусы индуцируют выработку на высоких уровнях IgG2a и IgGl. В сыворотках крови мышей, иммунизированных Ad-сРА и Ad-Fc-PA, так же присутствуют антитела подкласса IgG2b. Антитела подкласса IgG3 не обнаружены в сыворотках крови животных ни одной из групп, включая группу положительного контроля. Интересно, что иммунизация РА с неполным адъювантом Фрейнда не индуцировала синтез IgG2a, но вызывала синтез иммуноглобулинов подклассов IgG2b и IgGl.

1:400 1:800 1:1600 13200 1:6400 1:12800 Разведение сыворотки

фосфатный

> солевой буфер (К-)

РА + псполпьш адъювант фрейнда (К+)

1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 Разведение сыворотки

■ Ad-cPA

1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 Разведение сыворотки

1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 Разведение сыворотки

Рисунок 4. Результаты выявления методом ИФА подклассов специфических IgG к РА в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-cPA, Ad-sPA, и Ad-Fc-PA. На рисунке показано обнаруженное количество специфических к РА иммуноглобулинов подклассов IgG2a, IgGl, IgG3, IgG2b.

Ad-PA-Fc - рекомбинантный аденовирус содержащий РА слитый с Fc-фрагментом иммуноглобулина IgG2a, Ad-cPA - рекомбинантный аденовирус содержащий не секретируемую форму PA, Ad-sPA - рекомбинантный аденовирус содержащий секретируемую форму РА, Положительный контроль - белок РА смешанный с неполным адъювантом Фрейнда, Отрицательный контроль - фосфатный солевой буфер (PBS).

Изучение протективных свойств рекомбинантных аденовирусов Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc против В. anthracis методом контрольного заражения лабораторных животных

Для оценки протективной активности гуморального иммунного ответа, индуцируемого сконструированными рекомбинантными аденовирусами, иммунизированные мыши были заражены летальной дозой В. anthracis штамм Sterne (4 LDJ0). 80% животных контрольной группы, вакцинированных рекомбинантным аденовирусом без генетической вставки (Ad-null) пали в течение недели после заражения (Таблица 1). Все генетические конструкции содержащие РА обеспечили защиту животных от заражения культурой В. anthracis на уровне 80 - 90 %. При этом, в группе мышей иммунизированных рекомбинантным аденовирусом Ad-PA-Fc защита составила 90%, в то время как в группах мышей иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-cPA и Ad-sPA защита составила только 80%.

Таблица 1. Уровень защиты мышей линии Ва1Ь/с, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, от сибирской язвы

Группа Иммунизирующий Количество Выжило Пало % защиты

животных препарат голов в фуппе

1 РА + IFA 10 3 7 30

2 Ad-PA-Fc 10 9 1 90

3 Ad-cPA 10 8 2 80

4 Ad-sPA 10 8 2 80

5 Ad-null 10 2 8 20

РА — протективный антиген, IFA - неполный адъювант Фрейнда

Изучение длительности защитных свойств у лабораторных животных, иитраназально иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-cPA. Ad-sPA, Ad-PA-Fc

Предварительную оценку продолжительности сохранения напряжённого противосибиреязвенного иммунитета проводили в эксперименте по следующей схеме. С интервалом в две недели были иммунизированы мыши линии Balb/c рекомбинантными аденовирусами в дозе 4,6 * 1 (Г БОЕ/мышь, после чего через 88 дней их заразили культурой В. anthracis штамм Sterne (4 LD50) (Рисунок 5). Как видно из результатов эксперимента (Таблица 7) 90 - 100 % мышей, привитых рекомбинантными аденовирусами, выжили после введения В. anthracis штамм Sterne. Группа мышей, которым вводили рекомбинантный аденовирус Ad-PA-Fc, выявила более высокую степень защиты по сравнению с группами мышей иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-sPA и Ad-cPA. Более того, мыши иммунизированные Ad-sPA и Ad-cPA теряли в весе и проявляли болезненное состояние, в отличие от мышей иммунизированных Ad-PA-Fc.

Первая Вторая

иммунизация иммунизации*

Заражение-

1

Учет выживших

__I

14 дней

88 дней

10 дней

Рисунок 51. Схема эксперимента по изучению длительности защитных свойств против бацил у лабораторных животных, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами. Иммунизацию псевдоаденовирусами проводили иитраназально, в дозе 4,6 * 109 БОЕ/мышь, в объеме 100 мкл. В качестве положительного контроля был использован полноценный белок РА с неполным адъювантом Фрейнда.

Таблица 2. Уровень защиты мышей линии Ва1Ь/с, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, от сибирской язвы

Группа животных Иммунизирующий препарат Количество голов в группе Выжило Пало % защиты

1 РА + 1FA 9 9 0 100

2 Ad-PA-Fc 9 9 0 100

3 Ad-cPA 9 8 1 89

4 Ad-sPA 9 8 1 89

5 Ad-null 9 1 8 11.1

6 PBS 9 1 8 11.1

РА - протекгивнын антиген, IFA - неполный адъювант Фрейнда

Оценка индукции антител класса IgG к РА в сыворотках кропи »юрских свинок, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, методом ИФА

Поскольку полученные генетические векторы показали индукцию протективного иммунного ответа на мышиной модели, было решено, во-первых, перейти на модель морских свинок, а, во-вторых, в качестве тест-заражаюшей культуры использовать вирулентный штамм В. anthracis М71/12 (вторая вакцина Цепковского). Вначале была оценена способность полученных аденовирусных векторов индуцировать выработку специфических антител в организме морских спинок.

Уровень специфических антител к протостивному антигену В. anthracis в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc, оценивали методом ИФА, используя протективный антиген (0,1 мкг/лунку), «Caihiocliem». Морские свинки были двукратно иммунизированы аденовирусами с интервалом в две недели, и через 10 дней после второй иммунизации у них была взята сыворотка крови для обнаружения специфических антител к РА. Морские свинки которым вводили фосфатпый буфер PBS, использовались в качестве отрицательного контроля.

В сывсрэтках крови морских свинок иммунизированных рекомбииантным аденовирусом несущим цитоплазматнческую форму протективного антигена (Ad-cPA), не было детектировано специфических антител, в тоже время в сыворотках крови морских свинок иммунизированных секретируемой формой протективного антигена (Ad-sPA и Ad-PA-Fc) были обнаружены высокие титры (1:6400) апти-РА антител.

20

2,5

0

2,0

§

1

о 1,5

5 с к та

5 1,0

а э* X

О 0,5 0,0

1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 Разведение сыворотки

Рисунок 6. Результаты ИФА на протективный антиген с сыворотками крови морских свинок, иммунизированными рекомбинантными аденовирусами.

Оценка защитных свойств гипериммунного протективного антигена от летальной сибиреязвенной инфекции на модели морских свинок

Далее был поставлен эксперимент, по защите животных от антракса по следующей схеме: группы по 5 морских свинок иммунизировали интраназально дважды различными генетическими конструкциями с интервалом в две недели и через 3 недели после второй иммунизации заражали подкожно в область живота капсульным вирулентным штаммом В. стШгаск 71/12 (вторая вакцина Ценковского), в дозе 2ЬОюо. Результаты эксперимента представлены в таблице.

Таблица 3. Защитные свойства рекомбинантных аденовирусов от сибирской язвы, на модели морских свинок

№ Группа Количество Выжило Пало % защиты

п/п животных голов в группе

1 Ad-PA-Fc 5 3 2 60

2 РА адсорбированный на силикатных частицах 5 2 3 40

3 Ad-sPA 5 2 3 40

4 Ad-cPA 5 0 5 0

5 PBS 5 1 4 20

РА - протективный антиген, IFA - неполный адъювант Фрейнда

Этот эксперимент показал, что: 1. Группа морских свинок иммунизированных генетическим вектором несущим гипериммунный антиген (Аё-РА-Рс) была защищена от антракса лучше остальных групп, 60% животных в этой группе выжило. 2. В группе морских свинок иммунизиированных рекомбинантным аденовирусом несущим цитоплазматическую форму протективного антигена (Аё-сРА) все животные умерли. Эти данные согласуются с результатами ИФА на наличие антител к РА. 3. Группы морских свинок, получившие протективный антиген адсорбированный на силикатных частицах, гак же как и аденовирусный вектор несущий секретируемый 4-й домен РА (Аё-вРА) были одинаково защищены, но в меньшей степени чем с РА-Рс.

Оценка напряженности иммунного ответа при иммунизации гипериммунным протективным антигеном

Поскольку аденовирусный вектор экспрессирующий генетическую конструкцию кодирующую гипериммунный антиген показывает очевидное увеличение защитных свойств, в сравнение с другими векторами, мы повторили этот эксперимент оставив только эту генетическую конструкцию. Кроме того, ежедневно регистрировали сметь животных с целью оценить среднее время жизни животных. Эксперимент выполняли по такой же схеме, как в предыдущем опыте. Морских свинок заражали подкожно в область живота в дозе 5ГВ50 В. аШИгасй штаммом 71/12, что соответствует примерно 13 ООО спор. Результаты эксперимента показаны на рисунке 7.

0123456789 10

Рисунок 7. Оценка напряженности иммунного ответа при иммунизации гипериммунным протективным антигеном.

Из результатов представленных на рисунке можно заключить, что иммунизация ЛсЗ-РЛ-Гс продлевала время жнзнн экспериментальным животным и защитный эффект составил 20%.

Таким образом, в серии этих экспериментов нами было показано, что добавление к РА Рс-фрагмента значительно усиливает защитные свойства от летального заражения В. аМкгася. Рекомбпнантный аденовирусный вектор, несущий такой антиген, способен полностью защищать от бескапсульного штамма сибиреязвенных бацилл, а также от капсульного штамма в дозе до 51Л}50 на 20%.

ВЫВОДЫ

1. Впервые была получена генетическая конструкция, состоящая из гена протсктивного антигена В. anthracis и Fc-фрагмента иммуноглобулина IgG2a, в составе рекомбинантного аденовируса человека пя тою серо типа

2. Иммунизация животных рекомбинантным аденовирусом несущим ген гипериммунного протективного антнгена приводит к полной защите мышей от бескапсульного штамма В. anthracis, а также индуцирует защитный иммунный ответ против капсульного штамма В. anthracis на модели морских свинок.

3. Защитные свойства гипериммунного протективного антигена выражаются за счет индукции иммуноглобулинов IgGl, IgG2a и IgG2b, титр которых составляет не мепее 1:6400.

4. Продемонстрирована антнген-специфическая пролиферация клеток легочных лимфатических узлов мышей, иммунизированных полученной генетической конструкцией, содержащей гнпериммунный протективнын антиген.

5. Иммунизация животных рекомбинантным аденовирусным вектором, несущим ген гипериммунного протективного антигена, способна полностью защищать их от заболевания сибирской язвой на срок не менее трех месяцев после иммунизации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Shcherbinin D.N., Tutykhina I.L., Shmarov М.М., Logunov D.Y., Naroditskv B.S., Kondxatieva Т.К., Apt A.S. Development of recombinant adenoviruses expressing M. tuberculosis antigens, and transfection of dendritic cells. // 2009. 9th International Adenovirus Meeting. Dobogoko. Hungary.

2. Шмаров M.Vi., Седова E.C., Лысенко А.А., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Янова А.С'.. Верховская В.Н., Рогожин В.Н., Тутыхина И.Л., Логунов Д.Ю., Народицкин Б.С., Гинибург А.Л. Разработка кандидатных иммунобиологических препаратов для профилактики и иммунотерапии опасных вирусных заболеваний (птичий грипп, бешенство) на основе рекомбинантных и капснд-модифинированных рекомбинантных аденовекто}юв. /7 2009. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направления развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы". С. 126127.

3. Shmarov W.M., Scdova E.S„ Verkhovskaya L.V., Rudneva I.A., Bogachcva E.A., Baryikova Yu.A., Schcrbinin D.N., Lysenko A.A., Tutykhina I.L., Logunov O.Y., Smirnov Yu.A., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Induction of a Protective Hcterosubtypic Immune Response Against the Influenza Virus by Using Recombinant Adenoviral Vectors Expressing Hemagglutinin of the Influenza H5 Virus. // 2010. Acta Naturae V. 2. As 1. P. 115-121.

4. Щербинин Д.Н., Шмаров M.M., Народицкий B.C., Г'убакова Э.И., Коидратьепа Т.К. Исследование вакцинных противотуберкулезных препаратов на основе рекомбинантных аденовирусов в экспериментальной модели на мышах. // 2010. Туберкулёз и болезни лёгких. Т. »7. № 10. С. 50-53.

5. Тухватулни АЛ1- Логунов Д.Ю., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Народипкк й Б.С., Гудков А.В., Гинцбург АЛ. То11-подобные рецепторы и их адапгпрные молекулы. // 2010. Биохимия. Т. 75. В. 9. С. 1224 - 1243.

6. Шмаров М М., Седова Е.С., Верховская Л.В., Руднева И.А., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Лысенко А.А., Тутыхина ИЛ., Логунов Д.Ю., Смирнов Ю.А., Народицкин Б.С., Гинцбург А.Л.. Индукция протектийн.->го гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа при иммунизации рекомбингнтными аденовирусными векторами, экспрессирующими гемагглютинин вируса гриппа И5. И 2010. Тезисы всероссийской научно-практической конфереици "Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагности ки и лечения инфекционных болезней". С. 130.

7. Королева Е.А., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Зигангироза H.A., Народицкий Б.С. Конструирование рекомбинантного аденовируса, несущею ген OmcB Chlamydia trachomatis, для разработки вакцинного препарата против урогенитального хламидиоза. // 2010. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. №. 10. С. 38-40.

8. Шмаров М.М., Седова Е.С., Лысенко A.A., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Богачева Е.А., Верховская В.Н., Рогожин В.Н., Неугодоза Г.Л., Тутыхина И.Л., ИЛ., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбурт А.Л. Разработка кандидатных иммуио-биологических препаратов для профилактики и иммунотерапии опасных вирусных заболевании (птичий грипп, бешенство) на оснор.е рекомбинантиых и капсид-модифнцированны>. рекомбинантных адеЕювекторов. // 2010. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направления развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы". С. 3031.

9. Тутыхииа ИЛ., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С. Преимущества и перспективы использования генетических вакцнп для защиты от опасных и социально значимых инфекций. //2011. Вестник российской академии наук. S. 10. С. 39-47.

10. Шмаров М.М., Седова Е.С., Верховская Л.В., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А., Щербиннн Д.Н., Лысенко A.A., Тутыхина И.Л., Неугодэг.а Г.Л., Лсгунов Д.Ю., Смирнов Ю.А., Народицкий Б.С., Гинцбурт А.Л. Исследование возможности индукции рекомбинантными аденовирусными векторами гетеросубтипнческого иммунного ответа против вируса гриппа А. // 2011. Биопрепараты. № 1. С. 31-35.

и. Tntykhiiia I.L., Logunov D.Y., Shchcrbinin D.N., Shmarov M.M., Tukhvatiilin A.I., Naroditsky BJS., Gintsburg A.I^ Development of adenoviral vector-based mucosal vaccinc against inlliien/.a. // 2011. .1 Mol Med. V. 159, № 4. P. 331-41.

12. Щербинин Д.Н., Тутыхина HJL, Логунов Д.Ю., Шмзров M.M., , Апт. A.C., Кондратьева Т.К., Народицкий Б.С. Экспрессия гипериммуногенного антигена I\l.tuberculosis Ag85B в рекомбинантиом аденовирусном векторе. // 2011. Медицинская иммунология. Т. 13. JVs 4-5. С. 347.

13. Седова Е.С., Шмаров М.М., Щербинин Д.Н., Лысенко A.A., Тутыхина ИЛ., Логунов Д.Ю., Смирнов Ю.А., Народицкий B.C.. Гинцбурт АЛ. Иммунизация рекомбииантным аденовирусом, несущим ген эктодамена М2 белка, обеспечивает перекрестный иммунны]« ответ против

различных штаммов вируса гриппа птиц. // 2011. Медицинская иммунология. Т. 13. № 4-5. С. 407-408.

14. Шмаров М.М„ Седова Е.С., Щербинин Д.Н., Туты липа ИЛ., Логунов Д.Ю_, Народицкнн Б.С., Гинцбург АЛ. Разработка мукозальных генетических вакцин для защиты от вирусных патогенов. // 2011. Медицинская иммунология. Т. 13., № 4-5. С. 414-415.

15. Тухватулии А.И., Щербинин Д.Н., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Народищ» й Б.С. Роль паттерн-распознающих рецепторов в противоиифнкциопиом иммунитете. // 2011. Вестник российской академии наук. В. 10. С. 47-54

16. Седова Е.С., Щербинин Д.Н., Мигу поп А.И., Смирнов Ю.А., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Цыбалова Л.М., Народицкий Б.С., Киселев О.И., Гинцбург АЛ. Гриппозные рекомбинантные вакцины. // 2012. Acta naturae. Т. 4. Ja 15. С. 17-27.

17. Есмагамбетов И.Б., Николаевич Д.Н., Народицкий Б.С. Конструирование рекомбинагтных аденовирусов несущих гены консервированных белков вируса гриппа. // 2012. Материалы X международной научной конференции студентов и молодых ученых: «Живые системы и биологическая безопасность населения». С. 149.

18. Есмагамбегов И.Б., Гарас М.Н_ Щербинин Д.Н., Седова Е.С. Иммунпзтия рекомбинантным аденовирусом, несущим гены белков М2 н NP, обеспечивает перекрестны!! 2/4/2/4/ иммунный ответ против различных штаммов вируса гриппа типа А. // 2013. Российский иммунологический 5курнал. Т. 7. № 2-3. С. 324-325.

19. Щербинин Д.Н., Гарас М.Н., Есмагамбетов И.Б., Евграфов Е.В., Кондратьева Т.К., Апт А.С. Исследование протективных свойств химерпого антигена М. tuberculosis AG85B, экспрессируемого аденовирусным вектором. // 2013. Российский иммунологический журнал. Т. 7. № 2-3. С. 327-328.

20. Slichcrbinin D.N., Esmagambetov I.B., Noskov A.N., Stlyaninov Y.O., Tutykhirm [.L., Shmarov M.M-, Logunov D.Y., Naroditskiy B.S., Gintsburg A.L. Protective Immune Response against Bacillus anthracis Induced by Intranasal Introduction of a Recombinant Adenovirus Expressing the Protective Antigen Fused to the Fc-fragment of IgG2a. // Acta Naturae. 2014. V. 6. № 1. P. 76-84.

21. Esmagambetov I.B., Sedova E.S., Shcherbinin D.N., Lysen'ko A.A., Garas M.N„ Shnriarov M.M., Logunov D.Yu. Construction of Recombinant Adenoviral Vector Expressing Genes of the Conservative Proteins M2 "Ion Channel" and Nuclcoprotcin of Influenza A Virus. // Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2014. V. 29. № 2. P. 69-76.

Подписано в печать 13.08.2015 г.

Заказ № 284 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т. д.''8, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 80 шт.