Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунореактивность рекомбинантных белков ВИЧ

Актуальность проблемы.

Эпидемия синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), который является заключительной фазой инфекции ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), приняла характер пандемии. К настоящему времени от СПИДа умерло более 20 миллионов человек, а инфицировано более 60 миллионов. Россия занимает одно из лидирующих мест по темпам роста инфицирования. Вирус поражает молодое трудоспособное население. Инфекция ВИЧ предается половым путем, с кровью или ее препараты, от инфицированной матери к ребенку во время родов, при грудном вскармливании или во время беременности. В борьбе с ВИЧ-инфекцией достигнут определенный прогресс,

U 1 1 U U с» связанный с разработкой эффективной лабораторной диагностики, позволяющей в большинстве случаев определять инфекцию уже через месяц после заражения и, таким образом, предотвращать распространение вируса через банки крови и своевременно начинать антиретровирусную терапию. Исследованы молекулярная структура вируса, его жизненный цикл, используемые им клеточные рецепторы и корецепторы. Однако, не смотря на все принимаемые меры, эпидемия продолжает распространяться. В России это связано, прежде всего, с тем, что в настоящее время распространение вируса идет среди внутривенных наркоманов и их половых партнеров. Терапия не способна излечивать инфицированных людей, т.е. удалять вирус из организма, а стоимость годового курса лечения достигает 10 000 и больше долларов. Кроме того, показано образование штаммов вируса, устойчивых к лекарственным препаратам.

В связи с этим особое значение приобретает комплекс превентивных мер, частью которых является безопасная и эффективная вакцина.

Более 30 кандидатных вакцин проходят или прошли I или II фазу клинических испытаний. В ходе этой работы исследуется широкий спектр вакцинирующих препаратов (профилактических и терапевтических), различные схемы иммунизации и адъюванты. В последнее время возрос интерес к терапевтическим вакцинам в связи с внедрением в клиническую практику активной многокомпонентной специфической антиретровирусной терапии (HAART) [156]. Предполагается, что при перерыве в HAART следует назначать терапевтическую вакцину, чтобы иммунная система оставалась активной и сдерживала всплеск размножения вируса. Другой причиной активизации интереса к терапевтической вакцине является возможность с ее помощью смягчить остроту инфекционного процесса, снизить концентрацию вируса в организме и биологических жидкостях и тем самым снизить риск заражения людей, контактирующих с ВИЧ - инфицированными. Разработка вакцины особенно важна для нашей страны, где темпы ежегодного прироста числа новых случаев одни из самых высоких в мире. По данным Российского Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбы со СПИДом, в России в 2002 году зарегистрировано 200 000 ВИЧ - инфицированных.

Характерной особенностью ВИЧ является его высокая вариабельность. В связи с этим одним из исследуемых подходов является разработка так называемых «региональных» вакцин, в которых используются антигены, соответствующие субтипу ВИЧ, циркулирующему в данном географическом регионе. Прежде всего, это относится к вакцинам, основанным на белках оболочки ВИЧ, кодируемых геном env. Однако внутренние белки ВИЧ, в частности антигены, кодируемые геном gag, значительно более консервативны, следовательно, можно ожидать, что иммунный ответ против них может быть направлен против различных субтипов ВИЧ [35]. Поэтому в настоящее время особое внимание уделяется разработке вакцин на основе целых внутренних белков ВИЧ или их фрагментов.

Одними из перспективных являются вакцинные препараты на основе рекомбинантных белков. Они безопасны, имеют невысокую себестоимость, методика их получения и очистки хорошо отработана. В результате иммунизации рекомбинантными белками можно вызвать образование нейтрализующих антител и активацию СБ4+ клеток, играющих важную роль в контролировании ВИЧ [7,139,187,188,189,21].

В связи с этим целью работы было исследование иммунореактивности рекомбинантных белков, содержащих копии фрагментов и полноразмерных белков сердцевины и/или оболочки ВИЧ1 для их последующего применения в составе кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД.

В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать иммуногенные свойства рекомбинантных белков, повторяющие антигенные детерминанты ВИЧ1.

2. Провести сравнительный анализ сходства антигенных детерминант рекомбинантных белков с таковыми вирусного прототипа.

3. Провести сравнительный анализ иммунного ответа, вызываемого рекомбинантными белками, повторяющими антигенные детерминанты ВИЧ1, с иммунным ответом на вирус.

4. Исследовать иммуногенные свойства рекомбинантных белков при введении высоких и низких доз препарата.

5. Исследовать иммуногенные свойства конъюгата рекомбинантных белков с Полиоксидонием.

6. Провести анализ нейтрализующей активности сывороток животных, иммунизированных рекомбинантными белками, повторяющими антигенные детерминанты ВИЧ 1.

7. Исследовать лимфопролиферативный ответ, вызываемый рекомбинантными белками, повторяющие антигенные детерминанты ВИЧ1.

Научная новизна работы.

Впервые исследованы иммуногенные свойства нового экспрессируемого в Е.соН химерного рекомбинантного белка rec(24-41), повторяющего последовательность консервативного полноразмерного внутреннего белка ВИЧ1 -р24 и фрагмента трансмембранного белка ВИЧ1 - gp41.

Впервые показано, что иммунизация лабораторных животных рекомбинантным химерным белком приводит к образованию высоких титров антител на обе его составляющие - р24 и gp41- у разных видов животных (мышей и кроликов).

Впервые показано, что рекомбинантный химерный белок вызывает сильный лимфопролиферативный ответ клеток селезенки и лимфатических узлов мыши.

Впервые показано, что рекомбинантный химерный белок индуцирует у животных образование вирус - нейтрализующих антител.

Впервые исследованы иммуногенные свойства конъюгата белка rec(24-41) с иммуномодулятором Полиоксидонием. Показано, что конъюгация белка с Полиоксидонием позволяет достичь высокого иммунного ответа при введении низких доз антигена, и не приводит к изменению его антигенных детерминант.

Научно-практичесое значение работы.

На основании полученных данных создан кандидатный вакцинный препарат «ВИЧРЕПОЛ», представляющий собой конъюгат химерного рекомбинантного белка rec(24-41) с Полиоксидонием. В настоящее время препарат проходит доклиническое исследование в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Положения, выносимые на защиту.

1. Химерный рекомбинантный белок rec(24-41) является высокоактивным иммуногеном: он вызывает образование антител на оба своих участка - р24 и gp41 при иммунизации как высокими, так и низкими дозами препарата и антиген-специфическую пролиферацию клеток лимфатических узлов и селезенки у лабораторных животных.

2. Антигенные детерминанты рекомбинантного химерного белка rec(24-41), повторяющего внутренний белок р24 и часть трансмембранного белка gp41 ВИЧ1, схожи с антигенными детерминантами вирусного прототипа.

3. Химерный рекомбинантный белок rec(24-41) индуцирует у лабораторных животных иммунный ответ, специфичность которого схожа со специфичностью иммунного ответа на вирус.

4. Конъюгация рекомбинантного химерного белка с Полиоксидонием увеличивает иммуногенность rec(24-41) при иммунизации низкими дозами.

5. Иммунизация лабораторных животных рекомбинантным вирусным белком rec(24-41) вызывает образование антител, нейтрализующих лабораторный штамм ВИЧ1.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ВВЕДЕНИЕ

Вакцина является одним из средств, которые могли бы остановить эпидемию ВИЧ. Желательно, чтобы полученная вакцина соответствовала следующим критериям:

1. Вызывала образование антител, способных нейтрализовать все субтипы вируса.

2. Активировала вирус - специфические ЦТЛ.

3. Индуцировала сильный ответ на слизистых.

Разрабатываемые вакцины против ВИЧ/СПИД могут быть как терапевтическими, так и профилактическими, т.е. вызывать иммунный ответ, который полностью или частично контролировать ВИЧ-инфекцию [76]:

1. Стерильный Заражение не происходит, т.е. клетки не содержат иммунитет интегрированного провируса (вирус не обнаруживается (наиболее в крови, в лимфатических узлах или в месте предпочтительный). инфицирования при использовании самых (профилактические чувствительных методов ПЦР). Отсутствие вакцины) сероконверсии к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине. Не детектируются ЦТЛ к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине.

2. Временная Низкий уровень вируса, определяющийся только в инфекция. первое время после заражения (вирус не обнаруживается (профилактические в крови, в лимфатических узлах или в месте вакцины) инфицирования при использовании самых чувствительных методов ПЦР через 6 месяцев и все последующее время). Отсутствие или временная сероконверсия к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине. Временно или не детектируются ЦТЛ к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине.

3. Контролируемая Снижается уровень вируса и остается низким (< 1000 инфекция. копий РНК/мл). Сероконверсия к белкам ВИЧ, которые (терапевтические не представлены в вакцине. ЦТЛ к белкам, не вакцины)

4. Отсутствие инфицирования представленных в вакцинном препарате. Уровень вируса в крови и секретах недостаточно высокий для инфицирования. других. терапевтические вакцины)

При разработке вакцины против ВИЧ/СПИД исследователи столкнулись с серьезными трудностями:

- Отсутствие случаев самопроизвольного выздоравливания инфицированных;

- Не установлено, какие механизмы определяют иммунную защиту против вируса;

- Вирус встраивается в геном хозяина;

- Желание достигнуть стерильного иммунитета;

- Генетическая вариабельность вируса;

- Нет адекватной животной модели;

- Передача вируса посредством клеток;

Однако в настоящее время накоплены факты, позволяющие надеяться на создание эффективной вакцины:

1. Иммунная система некоторое время (достаточно долго) способна контролировать ВИЧ-инфекцию после заражения.

2. Показан ВИЧ - специфический иммунный ответ у людей, имеющих частые половые контакты с ВИЧ инфицированными, но остающимися незараженными.

3. У приматов удается индуцировать вакцинами иммунный ответ против родственного ВИЧ вируса иммунодефицита обезьян.

4. ВИЧ2 обеспечивает частичную защиту против ВИЧ1 инфекции [89].

5. ВИЧ1 малоинфекционный.

6. В последнее время разработаны новые подходы к созданию вакцинных препаратов (например, вакцины на основе рекомбинантных векторов, ДНК-вакцины, стратегия прайм-буст).

Геном ВИЧ отличается сложностью, на ряду с генами кодирующими структурные белки, в него входят гены регуляторных элементов. Ниже перечислены структурные элементы ВИЧ их функции, а также гены и их продукты [91].

Генные структурные элементы ВИЧ

LTR Длинный концевой повтор. Последовательность ДНК, фланкирующая геном интегрированного провируса. Содержит важные регуляторные области для начала транскрипции и полиаденилирования. TAR Участок связывания для белка tat и клеточных белков. Состоит приблизительно из первых 45 нуклеотидов вирусной мРНК у ВИЧ1 (или первых 100 нуклеотидов ВИЧ2 и ВИО). РНК tar образует шпильку с боковой петлей, для связывания и функционирования белка tat.

RRE Элемент РНК, кодирующийся в области env. Состоит приблизительно из 200 нуклеотидов (7327-7530 от начала транскрипции ВИЧ1, соединяет края gp120 и gp41). Необходим для действия гена rev. Содержит высоко аффинный сайт для белка rev. rre образует комплекс вторичных структур, необходимых для специфического связывания белка. CRS Ингибирует экспрессию структурных белков в отсутствие rev. INS Находится среди структурных генов ВИЧ1. Ингибирует посттранскрипционную экспрессию. Мутации в этой области приводят к инактивации INS и повышенной экспрессии генов.

Гены и их продукты

GAG Область гена, кодирующая капсидные белки (антигены групповой специфичности). Предшественником является миристилирированный белок р55, который процессируется (нарезается) вирусной протеазой на белки: р17 (Матриксный), р24 (Капсидный), р7 (НуклеоКапсидный) и р6. gag соединяется с цитоплазматической Н мембраной, где происходит сборка вирусного вириона.

Ы Ы

Он

Предшественник gag 55 kDa белок называется ассемблин, что отражает его роль в сборке вириона (assembly).

A POL Область гена, кодирующая ферменты протеазу, обратную Я транскриптазу и интегразу. Продукт экспрессируется как h 1 предшественник gag-pol полипротеин, который затем процессируется вирусными протеазами. ENV Продукт гена - гликопротеин gp160, который процессируется на два нековалентно связанных белка: наружный gp120 и трансмембранный gp41. Зрелые gp120- gp41 образуют тримеры на поверхности вируса. На gp120 находится сайт связывания с CD4 и хемокиновыми рецепторами (корецепторами ВИЧ1). TAT Трансактиватор экспрессии генов ВИЧ. Известно две его формы: !а! 1 Н exon (минорная форма, состоит из 72 аминокислот) и Та! 2 exon мажорная форма, состоит из 86 аминокислот). Его действие

Q активации начала и элонгации транскриппции от LTR промотора. X

REV Регуляторный фактор вирусной экспрессии. Фосфопротеин с основано на связывании с TAR элементом РНК, что приводит к молекулярной массой 19 kD, находится в ядреклетки, связываясь с Н

RRE, обеспечивает переход репликации вируса из ранней стадии

Ы экспрессии регуляторных генов в стадию крупномасштабной экспрессии структурных генов ВИЧ.

И К Л Е Б Е нн

-О Н

О В

А Б О Д

VIF Фактор вирусной инфекционности. Основный протеин, 23 kD. Способствует инфекционности вируса, но не продукции вирусных частиц. В отсутствие vif образуются неполноценные вирусные частицы, но путь передачи вируса через клетку не нарушается. vif -цитоплазматический белок, существующий как в растворимой, так и в связанной с мембраной форме.

VPR Вирусный белок R, состоит из 96 аминокислот (14 kD), располагается в ядре клетки. Взаимодействует с белком gag р6. Основная функция -трансактивация клеточных генов, импорт преинтегрированных комплексов и активация дифференцировки клетки.

VPU Вирусный белок U, состоит из 81 аминокислоты (16 kD), встроен в мембрану. Разрушает CD4 в эндоплазматическом ретикулеме и усиливает высвобождение вирионов из плазматической мембраны ВИЧ - инфицированных клеток. Vpu способствует созреванию белка env.

NEF Многофункциональный миристилированный белок 27 kD. В основном располагается в цитоплазме и связан с цитоплазматической мембраной. Это один из первых вирусных белков, который продуцируется в инфицированной ВИЧ клетке. Высоко иммуногенен. Необходим для распространения вируса и развития болезни. nef снижает уровень CD4 и МНС1 молекул на поверхности клетки. Взаимодействие nef с компонентами пути сигнальной клеточной трансдукции, приводит к увеличению инфекционность вируса.

VPX Белок ВИЧ2, 12 kD. Является гомологом vpr ВИЧ1.

Белки ВИЧ

БЕЛОК РАЗМЕР ФУНКЦИЯ РАСПОЛОЖЕНИЕ

GAG МА р17 связывание с мембраной; взаимодействие с env; транспорт сердцевины вируса в ядро вирион

КА р24 внутренний капсид вирион

НК р7 нуклекапсид; связывание РНК вирион р6 связывание vpr вирион

Протеаза р15 нарезание и созревание gag/pol вирион

Обратная р66 обратная транскрипция вирион транскриптаза вирусной РНК

РНКаза Н активность РНКаза Н вирион

Интеграза р51 интеграция ДНК провируса в геном клетки вирион

ENV gp120 gp41 наружные вирусные белки, связываются с CD4 и корецепторами плазматическая мембрана, оболочка вириона

ТАТ р16/р14 трансактиватор вирусной транскрипции ядро

REV р19 транспорт РНК, стабилизирующий фактор (фосфопротеин) ядро, перемещается между ядром и цитоплазмой

VIF р23 способствует созреванию и инфекционности вириона цитоплазма (цитозоль, мембраны), вирион

VPR p10-15 способствует локализации в ядре преинтегрального комплекса, ингибирует клеточное деление, задерживает инфекционные клетки в фазе G2^ вирион, ядро

VPU р16 способствует высвобождению вирусных частиц, разрушает CD4 в ЭПР встроен в клеточную оболочку

NEF р27-р25 Понижает экспрессию СD4 и МНС1 молекул плазматическая мембрана, цитоплазма

VPX р12-16 Белок ВИЧ2, гомолог vpr ВИЧ1 вирион

Рисунок 1.1. Строение вириона ВИЧ1.

Vpr

Vpu

5562 5853 6070 6302

Tat1

Tat2

5834 6048

8368 8458

Gag

793

2295

Vif

Rev1

Rev2

5044 5622 5973 6048

8368 8663

5' LTR

Pol

636 2088

Env

Nef

3' LTR

5099 6230

8805 8807

9431

Рисунок 1.2. Строение генома ВИЧ1

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что рекомбинантный химерный белок ВИЧ1 rec(24-41) индуцирует сильный иммунный ответ на оба свои участка (р24 и gp41) при иммунизации как высокими, так и низкими дозами.

2. Антитела, индуцированные у животных рекомбинантным антигеном rec(24-41), специфически взаимодействуют с прототипными белками культурального вируса.

3. Рекомбинантный химерный белок ВИЧ1 rec(24-41) индуцирует у иммунизированных животных сильный лимфопролиферативный ответ и образование антител нейтрализующих ВИЧ1 in vitro.

4. Конъюгация белка с Полиоксидонием позволяет увеличить иммуногенность и снизить дозу вакцинирующего препарата.

Заключение

Основная трудность, которая возникает при разработке вакцины против ВИЧ/СПИД - то, что, несмотря на детально изученный патогенез инфекции ВИЧ, неизвестны иммунные корреляты защиты против вируса. До сих пор не найдены достоверные случаи излечивания инфицированных ВИЧ. Однако показано, что в некоторых случая иммунная система способна контролировать инфекцию ВИЧ, посредством клеточного (ВИЧ-специфические ЦТЛ) и гуморального (нейтрализующие антитела) иммунного ответа [19,76]. Кроме того, обнаружены генетические факторы устойчивости к ВИЧ-инфекции, такие как мутации в генах, кодирующих ко-рецепторы, кроме того люди с определенными аллелями главного комплекса гистосовместимости I и II типа более устойчивы к заражению ВИЧ [24]. Показаны также неспецифические факторы защиты против ВИЧ, например CD8 антивирусный фактор (CAF) [4, 185]. Все это позволяет надеяться на возможность разработки терапевтической и профилактической вакцины против вируса. Создание терапевтической вакцины позволило бы понизить уровень вирусной нагрузки, контролировать инфекцию при отмене или перерыве химиотерапии, привело бы к удешевлению стоимости курса терапии, сократило бы число случаев передачи инфекции половым путем, от матери к ребенку.

Вакцина против ВИЧ/СПИД должна индуцировать обе ветви иммунного ответа - гуморальной и клеточной. Вакцина на основе живого аттенуированного вируса была бы идеальной. Однако разработка этого направления сдерживается соображениями безопасности. Поэтому в настоящее время наиболее перспективной считается («прайм-буст») стратегия вакцинации. В этом случае при первой вакцинации («прайм») вводится рекомбинатная плазмида, содержащая некоторые гены вируса, а при второй («буст») - рекомбинантные белки ВИЧ. Это позволяет одновременно индуцировать, как гуморальный, так и клеточный ответ.

В ходе нашей работы были изучены и отобраны рекомбинантные белки вируса, копирующие внутреннего и трансмембранного белка ВИЧ1: rec (24-41), rec p24, rec trx gp41. Проведенные исследования показали, что белок rec(24-41) обладает наилучшими свойствами: он оказался лучшим иммуногеном, в его состав одновременно входят как полноразмерный внутренний белок ВИЧ1 р24, в котором находятся эпитопы для СБ4+ лимфоцитов, так и нейтрализующий эпитоп (участок gp41). Химерный полипептид rec(24-41) индуцировал образование высоких титров антител на оба своих фрагмента, при введении как высоких, так и низких доз. При исследовании специфической активности белка было показано, что его антигенные детерминанты похожи на антигенные детерминанты вирусного прототипа. Это было показано в следующих опытах: во-первых белок специфически распознается антителами людей, инфицированных ВИЧ1, во-вторых с ним специфически взаимодействуют антитела барана, иммунизированного белками ВИЧ1. Кроме того, рекомбинантный белок вызывает образование антител, специфичность которых, близка специфичности антител, образующихся у инфицированных ВИЧ людей, это подтверждается, тем, что сыворотки иммунных животных нейтрализуют культуральный штамм ВИЧ1 in vitro и распознают белки культурального вируса в иммуноблоте. Иммунизация белком вызывает сильный лимфопролиферативный ответ in vivo у лабораторных животных.

Таким образом, рекомбинантный белок rec(24-41) является перспективным иммуногеном сам по себе, а также может быть использован при второй иммунизации по схеме «прайм-буст».