Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммуногенные и протективные свойства препаратов рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены консервативных антигенов вируса гриппа A

На правах рукописи

Есмагамбетов Ильяс Булатович

ИММУНОГЕННЫЕ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕНЫ КОНСЕРВАТИВНЫХ АНТИГЕНОВ ВИРУСА ГРИППА А

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О НОЯ 2014

Москва 2014

005555570

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Шмаров Максим Михайлович Официальные оппоненты:

Филатов Александр Васильевич - доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА России

Шилов Илья Александрович - доктор биологических наук, заведующий лабораторией анализа геномов ГНУ ВНИИСБ Россельхозакадемии

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздрава России

Защита диссертации состоится «12» декабря 2014 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и на сайте института www.gamaleya.org.

Автореферат разослан «10» ноября 2014 г. Ученый секретарь

доктор медицинских наук, профессор

диссертационного совета,

Русакова Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Грипп является социально значимым инфекционным заболеванием, представляющим серьезную угрозу здоровью населения земного шара вследствие широкого распространения, высокой контагиозное™, выраженной антигенной изменчивости возбудителей, а также недостаточной эффективности средств специфической и неспецифической профилактики. Каждый год эпидемии гриппа уносят около 500 ООО человеческих жизней. Особую опасность вирус представляет для людей, относящихся к группам риска (дети, пожилые люди, больные хроническими заболеваниями,

иммунокомпрометированые лица и др.) (Thompson W.W., 2004; Reber A.J., 2012). Грипп и другие ОРВИ занимают ведущие позиции в структуре инфекционных заболеваний в России. Ежегодно ОРВИ и гриппом в РФ заболевают 27-28 млн граждан, что составляет более 90% случаев всей инфекционной патологии (Заплатников А.Л., 2008; Бурцева Е.И, 2012). Большую опасность представляют пандемии, вызываемые вирусом гриппа А. В 20 веке было зарегистрировано три наиболее тяжелые пандемии, вместе унесшие по различным данным от 50 до 100 млн человеческих жизней, среди них самой крупной была пандемия «испанского гриппа» 1918 года (Taubenberger J.K., 2006). Затем первая пандемия 21 века, начавшаяся в 2009 году, в течение первых 12 месяцев, унесла более 200 000 человеческих жизней (Dawood F.S., 2012).

Серьезную угрозу не только для жизни людей, но и для экономики птицеводства представляют штаммы птичьего гриппа (Каверин Н.В. и Смирнов Ю.А., 2003). Так штаммы вируса гриппа H5N1 вызывают заболевание, сопровождающееся высокой летальностью (более 50%) для человека, они распространены среди сельскохозяйственных и диких птиц на территории более чем 60 стран по всему миру (Swayne D.E., 2011; Swayne D.E., 2012). Штаммы «птичьего» вируса гриппа H7N9 также способны вызывать инфекционный процесс с летальностью около 25% и являются причиной спорадических заболеваний гриппом у населения Китая. Вирусы птичьего гриппа не способны передаваться от человека человеку (источником возбудителя служит больная птица), но, если в результате специфических мутаций и/или реассортаций они смогут приобрести новые свойства, человечество окажется перед лицом серьезной опасности, поскольку могут появиться новые пандемические штаммы вируса гриппа А (Каверин Н.В. и Смирнов Ю.А., 2003).

Арсенал мер борьбы с гриппом весьма разнообразен и включает в себя как специфическую вакцинацию, так и меры неспецифической профилактики. Наиболее эффективной мерой оказалась массовая вакцинопрофилактика гриппа с помощью разнообразных вакцинных препаратов отечественного и зарубежного производства (живых аттенуированных, инактивированных, субъединичных, сплит-вакцин и др.) (Зверев В.В. Семенов Б.Ф., 2002; Ерофеева М.К., 2006; Гендон Ю. 3., 2007;

Зверев В.В., 2007; Ерофеева М.К. и Никоноров И.Ю., 2009). При этом основной проблемой для традиционных подходов к вакцинации против гриппа является ее переменная эффективность, связанная с постоянной антигенной изменчивостью вируса (Киселев О.И., 2010). Кроме того, существуют производственные ограничения для своевременной коррекции и выпуска вакцин, соответствующих циркулирующим штаммам вируса гриппа, в достаточном количестве (Ерофеева М.К., 2006; Ерофеева М.К. и Никоноров И.Ю., 2009).

На сегодняшний день основную долю вакцин против гриппа составляют живые аттенуированные, инактивированные и субъединичные вакцины. Однако такие вакцины индуцируют образование, в основном штамм-специфичных антител к гемагглютинину и нейраминидазе и, таким образом, не способны обеспечить защиту от широкого спектра различных штаммов вируса гриппа, существенно различающихся структурой своих поверхностных антигенов. Следовательно, существует необходимость постоянного мониторинга циркулирующих в человеческой популяции штаммов и периодического обновления специфических компонентов современных противогриппозных вакцин. Кроме того актуальным остается вопрос о безопасности применения живых аттенуированных вакцин и о предупреждении поствакцинальных осложнений (Кузнецов О. К., 2007; Киселев О.И., 2006).

В настоящее время актуальным является создание новых подходов к разработке «универсальных» вакцин против гриппа, способных обеспечивать защиту от широкого разнообразия его штаммов и в том числе штаммов птичьего гриппа. В качестве ключевых компонентов таких вакцин, должны выступать консервативные антигены вируса, индуцирующие образование кросс-реактивных антител и цитотоксических Т-лимфоцитов. Наиболее привлекательными из таких антигенов вируса гриппа являются белок М2 (ионный канал) и нуклеопротеин NP.

Белок М2 является одним из поверхностных антигенов вируса и обладает высокой степенью консервативности (Schotsaert М., 2009; Цыбалова Л. М. и Киселев О. И., 2012). Согласно литературным данным, антитела против эктодомена белка М2 способны ограничивать размножение вируса и образование вирусных бляшек (in vitro) в монослое клеток (Ito Т., 1991). Кроме того, белок М2 способен индуцировать защиту против различных подтипов вируса гриппа (Treanor J.J., 1990). Данные свойства делают перспективным его использование в качестве компонента универсальной вакцины.

Нуклеопротеин NP является одним из внутренних антигенов вируса и индуцирует выработку специфических цитотоксических Т-лимфоцитов. Согласно литературным данным, антигенные изменения в последовательности белка NP среди различных штаммов вируса гриппа А являются очень редкими (Scholtissek С., 1993; Shu L.L., 1993). Показано, что кандидатные вакцины на основе вирусных векторов, несущих ген NP

вируса гриппа А, способны обеспечивать защиту иммунизированных животных от штаммов вируса, относящихся к разным подтипам (Наапеп .1.В., 1999).

Для создания эффективной вакцины необходимо подобрать оптимальный способ доставки в организм специфических антигенов. Таким способом может быть использование генетической иммунизации, в результате которой происходит доставка генов целевых антигенов непосредственно в клетки организма. Экспрессия в организме генов, кодирующих антигены патогена, имитирует вирусную инфекцию и позволяет добиться высоких уровней как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Одними из наиболее популярных векторов для генетической иммунизации являются рекомбинантные аденовирусы человека, в том числе аденовирус человека пятого серотипа. Такие векторы способны проникать в различные типы клеток, в том числе профессиональные антиген-презентирующие, подходят для интраназального введения, способны активировать врожденный иммунный ответ и, как правило, не требуют применения адъювантов. Репликативно-дефектные рекомбинантные аденовирусы несут делецию Е1 области генома и могут размножаться только в специальной пакующей клеточной линии 293 НЕК. Кандидатные вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа показали свою эффективность против различных патогенов вирусного и бактериального происхождения, в том числе против вируса гриппа А (Седова Е.С., 2010; Шмаров М.М., 2010).

Цель работы: получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, экспрессирующих гены М2 и N1', изучение их иммуногенной и протективной активности в отношение различных штаммов вируса гриппа А.

В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Подобрать оптимальные аминокислотные последовательности антигенов М2 и наиболее гомологичные для различных штаммов вируса гриппа А.

2. Оптимизировать аминокислотную последовательность антигена ЫР для повышения его иммуногенности.

3. Получить рекомбинантные аденовирусы человека пятого серотипа, эффективно экспрессирующие гены антигенов М2 и ЫР.

4. Изучить экспрессию генов М2 и ЫР в составе полученных рекомбинантных аденовирусов.

5. Оценить иммуногенность полученных препаратов рекомбинантных аденовирусов.

з

6. Изучить протективные свойства полученных препаратов рекомбинантных аденовирусов против летальной дозы различных подтипов вируса гриппа А.

Научная новизна работы. С помощью эффективной технологии, основанной на гомологичной рекомбинации в E.coli, были впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека пятого серотипа (Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST), несущие гены консервативных антигенов М2 и NP вируса гриппа А под контролем индуцибельного промотора.

Для индукции иммунного ответа широкого спектра действия против различных штаммов вируса гриппа А, в качестве целевых антигенов были выбраны консервативный трансмембранный белок М2 и консервативный внутренний белок NP. При помощи методов биоинформатики были подобраны оптимальные аминокислотные последовательности антигенов М2 и NP, наиболее гомологичные для различных штаммов вируса гриппа А, выделенных от человека. Для повышения иммуногенности, аминокислотная последовательность антигена NP была оптимизирована удалением неканонического сигнала ядерной локализации, а также модифицирована мотивом быстрой деградации PEST.

Впервые разработан дизайн генетических конструкций, несущих гены антигенов М2 и NP под контролем системы экспресии tet-off и соединенные между собой нуклеотидной последовательностью саморасщепляющегося пептида 2А, позволяющего осуществлять экспрессию генов М2 и NP отдельно с общей экспрессионной кассеты.

Экспрессия генов М2 и NP в составе полученных рекомбинантных аденовирусов Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST была подтверждена на культуре клеток А549 методами иммуноблоттинга и иммуногистохимии. Была показана способность полученных препаратов рекомбинантных аденовирусов индуцировать формирование как гуморального, так и клеточного иммунного ответа к антигенам М2 и NP вируса гриппа А при однократной интраназальной иммунизации. Была продемонстрирована способность препаратов Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST защищать лабораторных животных от летальной дозы (10ЛД50) вируса гриппа А различных подтипов (H1N1, H5N2, H3N2, H2N3 и H9N2), при однократной интраназальной иммунизации.

Практическое значение работы. Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Полученные в результате работы рекомбинантные аденовирусы могут служить основой для создания универсальных кандидатных вакцин против вируса гриппа А.

Отдельные результаты работы были использованы при разработке Методических рекомендаций «Получение рекомбинантных аденовирусов пятого серотипа, экспрессиующих гены белков, обладающих

токсичностью для эукариотических клеток» М.-2014, утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, протокол №1 от 03.06.2014.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Современные вакцины не способны обеспечивать защиту против различных штаммов вируса гриппа А, существенно различающихся структурой своих поверхностных антигенов, что делает актуальным создание противогриппозной вакцины широкого спектра действия. В качестве ключевых компонентов таких вакцин могут выступать консервативные антигены М2 и NP вируса гриппа.

2. Для повышения спектра широты иммуногенности, были подобраны аминокислотные последовательности антигенов М2 и NP, наиболее гомологичные для штаммов вируса гриппа А, выделенных от человека. Последовательность антигена NP была оптимизирована для повышения уровня клеточного иммунного ответа.

3.Рекомбинантные аденовирусы человека пятого серотипа, экспрессирующие гены консервативных антигенов М2 и NP вируса гриппа А, способны индуцировать формирование иммунного ответа широкого спектра действия при однократной интраназальной иммунизации.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на 10-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых МГУПБ «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2012), Объединенном иммунологическом Форуме -2013 (Нижний Новгород, 2013). Апробация диссертационной работы состоялась на совместной научной конференции отдела иммунологии и отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «НИИЭМ им.Гамалеи» Минздрава России 3 июня 2014 г.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 в сборниках международных конференций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 178 странице машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (267 источников, из которых 30 отечественных и 237 иностранных). Работа содержит 5 таблиц и 29 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы микроорганизмов и клеточные линии. В работе использовали рекомбинантный аденовирус серотипа Ad5-null, вирусы гриппа, адаптированные для мышей A/Duck(Mallard)/Pensylvania/l 0218/84 (H5N2), A/BIackDuck/NewJersey/1580/78 (H2N3), A/Swine/Hong Kong/9A-1/98 (H9N2), A/USSR/90/77 (H1N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2), штаммы Escherichia coli DH5a и BJ5183. В работе использовали клеточные линии 293НЕК, MDCK, А549.

Плазмидные векторы. В работе использовали следующие плазмидные векторы: pShuttle-CMV, pAd-Eazy, pShuttle-tet-off, pAd-null и pAd-EGFP.

Антитела и рекомбинантные белки. В работе использовали следующие антитела и рекомбинантные белки: моноклональные мышиные IgG 14С2 и В248М, вторичные козьи поликлонапьные антитела к IgG мыши, коньюгированные с красителем DyLight® 488, поликлональные антитела лошади к IgG мыши, коньюгированные с пероксидазой, рекомбинантный белок NP вируса гриппа A/PuertoRico/8/34/Mount Sinai (H1N1) и эктодомен белка М2 (MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD).

Ферменты и другие реактивы. В работе использовали коммерческие препараты ферментов фирм Fermentas MBI, Promega, и NE BioLabs. Для приготовления буферных растворов использовали соли и другие реактивы фирм Serva, Sigma, Merck и Реахим. Для выращивания клеток E.coli использовали бакто-триптон, бакто-агар и дрожжевой экстракт фирмы Difco. Клеточные линии культивировали с использованием сред DMEM, МЕМ, спленоциты культивировали в среде RPMI-1640 с 5% сыворотки интактных мышей, мкМ меркаптоэтанолом, 6 ед. акт./мл IL-2. Для приготовления разведений вируса гриппа использовали среду Хенкса с гидролизатом лактальбумина и антибиотиком гентомицином. Для трансдукции культуры клеток вирусами гриппа использовали среду DMEM без добавления эмбриональной сыворотки КРС. Плазмидную ДНК очищали набором JETSTAR 2.0 Plasmid Midiprep Kit. Трансфекцию клеток линии 293 НЕК проводили с применением реагента Metafectene Pro. Для выделения РНК применяли набор реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «Рибо-сорб». Для постановки реакции обратной транскрипции использовали набор Reverse Tpanscription System. Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол». Синтез генетической конструкции M2NP и M2NP-PEST был выполнен в ЗАО «Евроген».

Лабораторные животные. Эксперименты проводились на мышах линии Balb\c, самках, весом 14-16 г.

Молекулярное клонирование. Все генно-инженерные

манипуляции проводили по стандартным методикам изложенным Maniatis et al. Трансформацию клеток Е. coli штамма DH5a плазмидной ДНК осуществляли методом Hanahan (Hanahan D., 1983). Для гомологичной рекомбинации использовали клетки E.coli штамма BJ5183.Трансформацию клеток Е. coli штамма BJ5183 осуществляли методом электропорации. Плазмидную ДНК выделяли из клеток E.coli штамма DH5a по методу Holmes (Holmes., 1981). Для лигирования фрагментов ДНК проводили согласно Legerski (Legerski R., 1985). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в автоматическом режиме на приборах МС-2 (ДНК-Технология, Россия) и РТС-200 (MJ Research, США). Параметры амплификации: 1. отжиг праймеров с матрицей - 50-55 °С - 30 сек.; 2. синтез комплементарных цепей — 72 °С - 30 сек. 3. периодическая денатурация - 95 °С - 30 сек. Всего проводили 25-35 циклов реакции.

Получение рекомбинантных аденовирусов. Рекомбинантные аденовирусы получали с помощью трансфекции клеток линии 293НЕК соответствующими плазмидными конструкциями в присутствии доксициклина 10мкг/мл. Рекомбинантные Ад5 накапливали в культуре клеток линии 293НЕК по методу Green (Green К.Y., 1980) в присутствии доксициклина 10мкг/мп. Очистку и концентрирование аденовирусов проводили при помощи ультрацентрифугирования в градиенте концентраций хлорида цезия. Экспрессию генов М2 и NP в составе полученных рекомбинантных аденовирусов изучали при помощи методов иммуногистохимии и иммуноблотгинга. Детекцию результатов иммуногистохимии проводили конфокальный микроскоп Nikon Confocal microscope С-1 и программное обеспечение EZ-C1 software ver. 3.90. Детекцию результатов иммуноблотинга проводили при помощи набора ECL Plus Western Blotting Detection System.

Изучение иммуногенности полученных рекомбинантных аденовирусов. Образцы сывороток крови иммунизированных мышей анализировали на наличие антител к антигенам М2 и NP методом непрямого ИФА. Определение Т-клеточного иммунного ответа к антигенам М2 и NP у иммунизированных мышей проводили методами ELISPOT (mouse IFN-y ELISPOT Kit, cat. 552569, BD Biosciences), согласно протоколу производителя.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTIC А. В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с к.б.н. Седовой Е.С., к.б.н. Лысенко A.A., м.н.с. Щербининым Д.Н. - сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, сотрудником

лаборатории активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА России, к.ф-м.н. Пичугиным A.B.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оптимизация аминокислотных последовательностей антигенов М2 и NP.

Подбор оптимальных последовательностей антигенов М2 и NP, для достижения максимального спектра широты спектра иммуногенности против различных штаммов вируса гриппа А.

Полноразмерные аминокислотные последовательности антигенов М2 и NP различных штаммов вируса гриппа А, выделенных от человека, были получены из международной базы данных Influenza Virus Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genornes/FLU/Database/nph-select.cgi?go=database). Для подбора оптимальных, использовали аминокислотные последовательности антигенов М2 и NP от штаммов вируса гриппа подтипов HI, Н2, НЗ по гемагглютинину и N1,N2 по нейраминидазе, а также штаммов подтипа H5N1, выделенных от человека, при помощи программы Geneious версии 4.8.5, полученные последовательности были выровнены алгоритмом выравнивания Muscle alignment и составлены их консенсусные последовательности (табл.1).

Название белка Консесусная аминокислотная последовательность (подчеркиванием обозначены наиболее вариабельные участки)

М2 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLVVAANIIGILHLILWILDRLFFK С1УКЛРКНОЬКЯОР5ТЕОУРЕ5МКЕЕУККЕООКАУРАРРОНЕУ31ЕЬ Е

NP МЛ8дс;ГККУУЕдМЕТООИГадЫА1Е1^\5УОЕМЮ(:ПОЯ1;У10МС'1ЕЬ Р1УКК¥ООКШМКЕЬУЬУОКЕЕ1ККТОКдАШСЕОАТАСЬТЩМ1\УН ЗЫЬШАТУОКТКАЬУКТОМОРЯМСЗШСЮЗТЬРаЯЗСААСААУКС У0ТМУМЕИКМ[КК0[МРКЫР\УК0ЕМ0ККГГ<.УАУПКМСМ1[.КС;КР0 ТААдКАММООУаЕЗЯЫРСЫАЕШРЬШЬАКЗАЫЬКСЗУАНКЗСЬРА СУУ0РАУА5СУРРЕК.ЕСУ5ЬУ01РРРК1Х(2Ы5(2УУ5ПЯРЫЕЫРАНК SQLVWMACHSAAFEPLRVSSFIRGTKVIPRGK-LSTRGVQIASNENMP TMPSSTLELRSRYWA1RTRSGGNTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLP FEKATVMAAFTGNTEGRTSPMRAEIIRMMESAKPEEVSFOGRGVFEL 8РЕКАтаР1УР8РРМ§ЫЕС5УРРСРЫАЕЕУР

Табл. 1. Оптимальные аминокислотные последовательности антигенов М2 и NP, подобранные в программе Geneious 4.8.5.

Оптимизация аминокислотной последовательности антигена ^ для повышения уровня цитотоксического иммунного ответа. Для

индукции высокого уровня цитотоксического иммунного ответа к антигену его последовательность была модифицирована удалением неканонического сигнала ядерной локализации. Данная процедура проводилась путем замены мотива Т6КЯ8 на мотив А6АА8 согласно К.

8

Ohba et al. (Kenji О., 2007). Аминокислотная последовательность антигена NP, модифицированная удалением сигнала ядерной локализации представлена в таблице 2. Для повышения уровня деградации белка NP в цитоплазме по убиквитин-зависимому пути в его аминокислотную последовательность была включена аминокислотная последовательность мотива PEST (SRSEVTISPAETPESPPATPKTRS) белка силигериолизина О бактерии Listeria seeligeri

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP 012984716.1) (табл. 2). По данным, полученным при помощи компьютерной программы epestfind (http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/epestfind). данная

аминокислотная последовательность является сильным сигналом к полиубиквитинированию и быстрой деградации полипептида. Для оценки влияния мотива PEST на иммуногенность белка NP, было разработано два варианта аминокислотной последовательности белка NP, с мотивом PEST и без него (табл. 2).

Аминокислотная последовательность антигена NP до оптимизации MASQGTKRSYEQMETDGERQ"'... Е 493eydn

Аминокислотная последовательность антигена NP с удаленным сигналом ядерной локализации MASQGAAASYEQI\1ETDGERQ/U . Е 493eydn

Аминокислотная последовательность антигена NP, модифицированная мотивом PEST MASQGAAASYEQMETDGERQ'". Е ^EYDNSRSEVTISPAETPESPPA TP KT RS

Таблица 2. Аминокислотные последовательности белка NP до и после оптимизации. Жирным шрифтом выделен неканонический сигнал ядерной локализации, подчеркнуты аминокислотные замены, курсивом выделена аминокислотная последовательность мотива PEST.

Получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа. эффективно экепрессирующнх гены антигенов М2 и NP вируса гриппа А.

Оптимизация экспрессии гена М2 в составе рекомбинантного аденовируса. Для нивелирования токсического действия белка М2 на эукариотические клетки 293НЕК при получении рекомбинантных аденовирусных частиц, было решено поместить ген М2 под контроль индуцибельного промотора. Для этих целей была использована система Tet-off, позволяющая блокировать экспрессию подконтрольных генов путем добавления доксициклина (рис. 1).

Рис. 1. Схем а работы системы экспрессии tet-off. TRE-тетрациклин-зависимый элемент, mCMV-минимальный промотор цитомегаловируса человека, CMV-промотор цитомегаловируса человека, tTA- ген тетрациклин-зависимого трансактиватора.

Разработка генетических конструкций, несущих гены антигенов М2 и NP под контролем индуцибельного промотора. На

следующем этапе, было разработано два варианта генетических конструкций, экспрессирющих гены антигенов М2 и NP. Первый вариант генетической конструкции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую оптимизированную аминокислотную последовательность антигена М2, и нуклеотидную последовательность, кодирующую оптимизированную аминокислотную последовательность белка NP с удаленным сигналом ядерной локализации. Второй вариант генетической конструкции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую оптимизированную аминокислотную последовательность антигена М2, и нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированную мотивом PEST, оптимизированную аминокислотную последовательность антигена NP (NP-PEST), с удаленным сигналом ядерной локализации. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки М2 и NP, были соединены между собой через нуклеотидную последовательность, кодирующую само-расщепляющийся пептид 2А

(QLLNFDLLKLAGD VESNPGP) вируса Picornavirus aftae штамма А10-61, взятую из базы данных UNIPROT (UniProtKB/Swiss-Prot Р03306). Последовательность пептида 2А позволяет осуществлять синтез полипептидной цепи каждого белка отдельно с одной мРНК (Szymczak A.L., 2005). Кодоны генетических конструкций были адаптированы для экспрессии в клетках млекопитающих согласно базе данных http.V/www.kaziisa.or.ip/codon/. Нуклеотидные последовательности генов М2, NP и мотива PEST представлены в таблице 3.

Название генетического элемента Нуклеотидная последовательность в направлении 5'- 3' (подчеркиванием обозначены старт и стоп кодоны, жирным курсивом выделены сайты эндонуклеазы рестрикции ВдШ.)

М2 АТСАОССТССТСАСССАОСТССАААСАСССАТСАОАААССАОТСССССТС ТАССТССААТСАСТССАСССАГССССТССТССТСССТСССААСАГСАТТСС ААТССТССАССТСАТССТОТСОАТТСТССАСАОАСТОТТСТТТААОТССАТС ТАСАООАОАТТСААОСАТООССТСААААСАООАСССАОСАСССААОСССТ

GCCTGAGTCCATGCGGGAAGAGTACAGAAAGGAGCAGCAGAACGCCGTCG ACGCTGATGACGGCCACTTCGTGAGCATCGAGCTGGAA

2А AGCTCCTGAACTTTGACCTGCTCAAGCTGGCGGGGGACGTGGAGAGCAATC CTGGCCCT

NP ATGGCCTCCCAAGGAGCTGCCGCAAGCTACGAGCAGATGGAAACCGATGG CGAGAGACAGAACGCCACAGAGATCAGAGCTAGCGTGGGGAGGATGATTG GCGGCATCGGAAGATTCTACATCCAGATGTGCACCGAGCTGAAGCTGAGC GACTACGAGGGCAGACTCATTCAGAACTCCCTGACAATCGAAAGGATGGT CCTGAGCGCCTTCGACGAAAGAAGAAACAAGTATCTCGAAGAGCACCCCA GCGCCGGGAAAGACCCTAAGAAGACCGGCGGCCCCATCTACAGGAGAGTG GATGGCAAGTGGATGAGAGAGCTGGTGCTCTACGACAAGGAGGAGATTAG GCGGATCTGGAGACAAGCCAACAACGGAGAGGACGCTACCGCCGGCCTGA CCCACATCATGATTTGGCATTCCAATCTCAACGATGCCACATACCAGAGAA CCCGGGCTCTGGTCAGAACCGGCATGGACCCCAGGATGTGCAGCCTGATGC AGGGCTCCACCCTTCCTAGAAGAAGCGGAGCCGCAGGCGCTGCCGTGAAG GGAGTCGGCACAATGGTGATGGAACTGATCAGAATGATTAAACGCGGGAT CAACGACAGAAATTTCTGGAGGGGCGAGAACGGAAGAAAGACCAGGGTCG CCTACGAGAGAATGTGCAACATCCTGAAAGGCAAGTTTCAGACAGCTGCCC AACGGGCAATGATGGATCAGGTGAGAGAAAGCAGAAACCCAGGCAACGCC GAGATTGAAGACCTCATCTTCCTGGCTAGATCCGCCCTCATCCTGAGAGGC AGCGTGGCCCACAAGAGCTGCCTGCCTGCTTGTGTCTATGGACCCGCCGTG GCATCCGGCTACGACTTCGAGAAGGAAGGGTACAGCCTGGTCGGCATCGA TCCCTTCAAGCTGCTCCAGAACAGCCAAGTGTATTCTCTGATTAGGCCTAAT GAGAACCCCGCCCACAAGAGCCAGCTGGTGTGGATGGCCTGCCACAGCGC TGCCTTTGAGGACCTGAGAGTTTCCAGCTTCATCAGGGGCACCAAAGTGAT CCCCAGAGGCAAGCTCAGCACCAGAGGAGTGCAGATTGCCAGCAACGAGA ATATGGATACAATGGACTCCAGCACCCTGGAACTTAGGAGCAGATACTGG GCCATCCGGACCAGAAGCGGCGGCAACACAAATCAGCAGAGAGCTTCCGC CGGGCAAATCAGCGTCCAGCCCACCTTCAGCGTGCAGAGAAACCTGCCCTT CGAGAAGGCCACCGTCATGGCTGCCTTTACAGGCAACACCGAAGGAAGGA CCAGCGACATGAGAGCCGAGATTATCAGGATGATGGAAAGCGCCAAGCCT GAGGAGGTGAGCTTCCAGGGCAGAGGAGTCTTCGAGCTGTCCGACGAGAA GGCAACCAATCCCATCGTGCCTAGCTTCGATATGTCCAACGAAGGCAGCTA CTTTTTCGGAGACAACGCCGAGGAGTACGACAAT

PEST /IGirtTAGAAGCGAGGTGACCATCTCCCCCGCCGAAACACCTGAGAGCCCC CCTGCCACACCCAAAACCAG/f TCTAGAT AG

Табл. 3. Нуклеотианые последовательности генов белков М2 и NP, пептида 2А и мотива PEST.

Таким образом, был разработан дизайн двух генетических конструкций: генетической конструкции, несущей нуклеотидные последовательности М2 и ТЧР, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид 2А, (М2ЫР) и генетической конструкции несущей нуклеотидные последовательности М2 и ЫР-РЕБТ, соединенные нуклеотидной последовательностью кодирующей пептид 2А, (М2ЫР-РЕ8Т) (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение разработанных генетических конструкций М2№ и М2^-РЕ8Т. ТЯЕ - тетрациклин-зависимый элемент, гпСМ\' -минимальный промотор цитомегаловируса человека, М2- ген белка М2, 2А-нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид 2А вируса ящура, ЫР - ген

белка NP, PEST - нуклеотидная последовательность мотива PEST, CMV - промотор цитомегаловируса человека, tTA- ген тетрациклин-зависимого транс-активатора.

Синтез разработанной генетической конструкции M2NP-PEST, был осуществлен в ЗАО «Евроген». Для возможности получения варианта последовательности белка NP без мотива PEST, в дизайн нуклеотидной последовательности мотива PEST, были включены сайты для эндонуклеазы рестрикции Bglll (табл.3). Генетическая конструкция M2NP-PEST была клонирована фирмой-производителем в плазмиду pAL-TA. Таким образом, была получена плазмида pAL-TA-M2NP-PEST. Плазмида pAL-TA-M2NP была получена путем гидролиза плазмиды pAL-TA-M2NP-PEST с помощью специфической эндонуклеазы рестрикции Bglll, в результате чего происходило удаление нуклеотидной последовательности мотива PEST.

Получение рекомбинантных аденовирусов Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST. Челночная плазмида pShuttle-Tet-off-tTA, несущая регуляторные элементы системы tet-off, была любезно предоставлена к.б.н. Лысенко A.A. Челночные плазмиды pShuttle-tet-M2NP и pShuttle-tet-M2NP-PEST, несущие разработанные генетические конструкции, были получены из плазмид pAL-TA-M2NP и pAL-TA-M2NP-PEST соответственно. Плазмиды pAd-tet-M2NP и pAd-tet-M2NP-PEST, несущие полноразмерный геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа и разработанные генетические конструкции, получали при помощи метода гомологичной рекомбинации в клетках E.coli штамма BJ5183. Рекомбинантные аденовирусы человека пятого серотипа, несущие в своем геноме разработанные генетические конструкции, были получены при помощи трансфекции клеток линии 293НЕК плазмидами pAd-tet-M2NP и pAd-tet-M2NP-PEST. После трансфекции клетки инкубировали в присутствие доксициклинна в концентрации 10 мкг/мл. Присутствие целевых генов и элементов системы экспрессии tet-off, а также отсутствие примеси репликативно-компетентных частиц в полученных препаратах было подтверждено методом ПЦР. Таким образом, были получены рекомбинантные аденовирусы Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST.

Изучение экспрессии генов М2 и NP в составе полученных рекомбинантных аденовирусов (Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST).

Изучение экспрессии генов М2 и NP в составе полученных рекомбинантных аденовирусов методом иммуноблоттинга. Клетки линии А549 трансдуцировали полученными рекомбинантными аденовирусами Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST. Лизаты образцов, трансдуцированных клеток подвергали вертикальному электрофорезу в ПААГ и затем иммуноблоттингу с использованием антител мыши к белкам М2 (14С2) и NP (В248М), а также вторичных антител к IgG мыши, меченных пероксидазой. Результаты иммуноблоттинга представлены на рисунке 3.

А. 1 2 3 4 Б- 1 2 3 4

к1)я м:кррЕ5Т Шя мгхрркет

Ш (72 кО») М2\Р 130 (72 кПя) м2\р

Ш / <69 Юа) Тш> / (69к1)а)

¿2. Ж

55

35 40.

Ц М2 (12 кОя) 35_ >р(«кОа)

Г\г

ж

(59 кОа)

Рисунок 3. Результаты изучения экспрессии генов М2 (А) и № (Б) в составе рекомбннантных аденовирусов Ad5-tet-IVI2NP и А(15-1еЫУ12ОТ-РЕ8Т методом иммуноблоттинга. 1, Отрицательный контроль — клетки, трансдуцированнные А(15-гш11; 2. Клетки, трансдуцированные Ad5-M2NP-PEST; 3. Клетки, трансдуцированные А(15-М2ЫР; 4. Положительный контроль, - вирус гриппа А/и88ЯУ90/77 (НШ1).

Полученные данные показывают, что продуктами экспрессии генов М2 и № в случае Ad5-tet-M2NP являются белок М2 (12кДа), белок NP (56кДа) и химерный белок М2№ (69кДа), при синтезе которого не произошло расщепления в последовательности пептида 2А, а продуктами экспрессии в случае Ай54е1:-М2№-РЕ8Т являются белок М2 (12кДа), белок ЫР с мотивом РЕ8Т(59кДа) и химерный белок М2№-РЕ8Т (72кДа), при синтезе которого не произошло расщепления в последовательности пептида 2А.

Изучение экспрессии генов М2 и № в составе полученных рекомбннантных аденовирусов методом иммуногистохимии. Для

оценки экспрессии генов М2 и ЫР в составе Ас15-1е1-М2№ и Ас15-1е1-М2ЫР-РЕ8Т применяли метод иммуногистохимии с использованием моноклональных антител мыши к белкам М2 (14С2) и № (В248М) и вторичных антител, меченных флуоресцентным красителем Оу^М 488. Для этого клетки линии А549 трансдуцировали А<15-1е1:-М2ЫР и Ас15-1е1:-М2№-РЕ8Т, через 48 часов фиксировали ацетоном и инкубировали с антителами. Оценку результатов иммуногистохимии проводили методом конфокальной микроскопии (рис. 4). При помощи вторичных антител, меченных флуоресцентным красителем, происходило окрашивание белков М2 и ЫР в зеленый цвет, при помощи красителя БАР1 происходило окрашивание ядер клеток в синий цвет. Таким образом была подтверждена экспрессия генов М2 и МР в составе рекомбннантных аденовирусов Ас15-и Ас15-1е1-М2№-РЕ8Т. Было показано, что белок М2 локализуется как в цитоплазме, так и на цитоплазматической мембране. Ядерная локализация белка № наблюдалась только в положительном контроле, что свидетельствует об успешном удаление неканонического сигнала ядерной локализации.

А.

1 1 34 4

1 2 3 4 »

Рис. 4. Результаты иммуногистохимического анализа экспресии гена М2 (А) и гена (Б) в клетках А549, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST. 1. Отрицательный контроль -клетки трансдуцированные Ad5-null; 2. Клетки, трансдуцированные Ad5-tet-M2NP; 3. Клетки, трансдуцированные Ad5-tet-M2NP-PEST; 4. Положительный контроль - клетки инфицированные вирусом гриппа A/USSR/90/77 (HIN1).

Изучение иммуногенности полученных препаратов Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-lV12NP-PEST.

Оценка гуморального иммунного ответа. Для изучения иммуногенности рекомбинантных аденовирусов Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST, мыши были однократно интраназально иммунизированы полученными рекомбинантными аденовирусами в дозах 107 и 108 БОЕ на животное. Через месяц после иммунизации, образцы сыворотки крови животных были проанализированы на наличие специфических антител к антигенам М2 и NP вируса гриппа А методом непрямого ИФА. Результаты представлены на рисунке 5.

А.

Б.

О

/ / / / / / <f Рвшдехие сывороток

-Ad5-tet-M2NPPEST 10'8

—Ad5*tet-MJNP М'7 -*-Ad5-lel-M2NPPESI 10*7 -«-Ad-nuH

Раэвеаенке cwbcpotok **

-♦-AdS let M2NP 10*8

Рис. 5. Результаты детекции антител к белку М2 (А) и к белку NP (Б) в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST.

В результате иммуноферментного анализа было показано, что титр антител к антигену М2 в сыворотках крови мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP-PEST в дозе 10s БОЕ на мышь, составил в среднем 25600. Средний титр антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP-PEST в дозе 107 БОЕ на мышь, а также в сыворотках крови мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP в дозах 108 и 107 БОЕ на мышь, составил 12800. Средний титр антител к антигену NP в сыворотках крови мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP-PEST в дозе 10s БОЕ на мышь, составил в среднем 25600. Средний титр антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP-PEST в дозе 107 БОЕ на мышь, а также в сыворотках крови мышей иммунизированных Ad5-tet-M2NP в дозах 10s и Ю7БОЕ на мышь составил 12800.

Оценка клеточного иммунного ответа. Для изучения иммуногенности полученных рекомбинантных аденовирусов применяли метод ELISPOT, позволяющий выявлять специфичные к антигенам М2 и NP Т-лимфоциты по их способности секретировать IFN-y в ответ на реактивацию дендритными клетками. Для оценки клеточного иммунного ответа, мыши были однократно интраназально иммунизированы рекомбинантными аденовирусами Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST в дозах 107 и 108 БОЕ на мышь. Через месяц после иммунизации животных умерщвляли, выделяли спленоциты, которые затем реактивировали in vitro. Для реактивации использовали 2 варианта дендритных клеток. В первом варианте, дендритные клетки предварительно активировали LPS и инкубировали в присутствии рекомбинантного белка NP вируса гриппа A/PuertoRico/8/34/Mount Sinai (HIN1) или в присутствие синтетического эктодомена белка М2 (MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD) соответственно. При втором варианте постановки эксперимента

дендритные клетки трансдуцировали Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST. Результаты эксперимента представлены на рисунках 6 и 7.

= **

без активации интактные дендритные дендритными дендритные клетки +• LPS клетками клетки

дендритные дендритные клетки + LPS клетки * LPS+NP +М2

Реактивация дендритными клетками слленоциты мышей, получивших PBS спленоциты мышей, получивших Ad5-null з спленоциты мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP 10*7

■ спленоциты мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP-PEST 10*7

■ спленоциты мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP 10*8

■ спленоциты мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP-PEST10*8

Рис. 6. Определения количества спленоцитов, отвечающих секрецией интерферона гамма в ответ на специфицескую реактивацию дендритными клетками, активированными LPS и «нагруженными» антигенами М2 и NP.

5 Ч

2 5 60 Ё §

5S «

ы rk :'lfe

без активации интактные дендритные дендритные дендритные

дендритными дендритные клетки +Ad5-null клетки, -ьА05- клетки +Ad5-tet-

клетками клетки tet-M2NP M2NP-PEST реактивация дендритными клетканми

спленоциты мышей, получивших PBS спленоциты мышей , получивших Ad5-null

■ спленоциты мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP 10*7

■ спленоциты мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP-PEST 10*7

■ спленоциты мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP 10*8

■ спленоциты мышей, иммунизированных Ad5-tet-M2NP-PEST10*8

Рис. 7. Определения количества спленоцитов, отвечающих секрецией интерферона гамма в ответ на специфическую реактивацию дендритными клетками, трансдуцированными Ас15-1е1:-М2^ и Ас15-^е1-1М2^-РЕ8Т.

Методом ЕЫБРОТ, была продемострирована индукция значимого уровня клеточного иммунного ответа к антигенам М2 и № в организме мышей, иммунизированных препаратами Ас15-1е1-М2ЫР и А<15-1е1:-М2ЫР-РЕ8Т. Наиболее высокое количество специфичных к антигенам М2 и № Т-лимфоцитов наблюдалось при иммунизации мышей препаратом Ас15-1е1-М2№. Также, было продемонстрировано, что иммунизация препаратами Ас15-1е1-М2ЫР и Ас15-1е1-М2ЫР-РЕ5Т в дозе 108 БОЕ/мышь, индуцирует более значимый уровень иммунного ответа по сравнению с иммунизацией в дозе 107 БОЕ/мышь.

Таким образом, препараты Ас15-1е1-М2ЫР и Ас15-1е1-М2№-РЕ8Т способны индуцировать выработку как гуморального, так и клеточного иммунного ответа к антигенам М2 и № вируса гриппа, при однократной интраназальной иммунизации.

Исследование протективных свойств препаратов Ас15-1е^М2^ и А115-1е1-М2^-РЕ8Т.

Главной задачей данной работы являлось изучение способности препаратов рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены консервативных антигенов вируса гриппа А, индуцировать формирование иммунного ответа широкого спектра действия. Для этого мыши линии Ва1Ь/с весом 14-16 грамм были были однократно интраназально иммунизированны рекомбинантными аденовирусами А<15-1е(:-М2ЫР и Ас15-1е1-М2ЫР-РЕ8Т в дозе 108 БОЕ/мышь. В качестве контрольных, выступали мыши получавшие Ас15-пи11. Через 30 дней после иммунизации, мыши были интраназально заражены вирусами гриппа А различных подтипов в дозе 10ЛД50. В качестве модели летальной гриппозной инфекции были выбраны штаммы вируса гриппа А подтипов НШ1, Н2Ю, Н3№, Н5№ и Н9Ы2, адаптированные для мышей (Эггитоу У.А., 2000). Результаты экспериментов по изучению протективной активности Ас15-1е1-М2ЫР и Ас15^-М2№-РЕ8Т представлены на рисунках 8-12. Сводные данные экспериментов по изучению протективных свойств полученных препаратов представлены в табл. 4.

Выживаемость

•м.

дни

-Ad5.tet-M2NP.PE5T 10-8

10 1? 11

Динамика изменения веса

дни ■Ай5-1е1 М2ЫР

-К-

10 14

Рис. 8. Данные по выживаемости и динамике изменения веса иммунизированных мышей, после заражения вирусом гриппа А НШ1.

Выживаемость

-5 и§ш§а—ан

а N с

дни

-AdS.tet-M2NP.PEST 10'8 -А<15-1еМИ2МР 10*2 -К-

Динамика изменений веса

0 ■ ■>>>

-Дни"

-Ad5.tet-M2NP.PEST 10*8

Ail5.tet.M2NP 10-8 -К-

Рис. 9. Данные по выживаемости и динамике изменения веса иммунизированных мышей, после заражения вирусом гриппа А Н2Ш.

Рис. 10. Данные по выживаемости и динамике изменения веса иммунизированных мышей, после заражения вирусом гриппа А НЗШ.

Выживаемост»

дни

-Ас15-ГМ-М2^ 10*8 -Ас«5-1еХ-М2^-РЕ5Т 1У*8 -к-

Динамика изменения веса

,■ им *т

дни

-До5-1е1-М2МР 10*8 ~Ас5-Гег-М2^Р-РЕЫ 10*8

Рис. 11. Данные по выживаемости и динамике изменения веса иммунизированных мышей, после заражение вирусом гриппа Н5Ш.

Рис. 12. Данные по выживаемости и динамике изменения веса иммунизированных мышей, после заражения вирусом гриппа А Н9Ш.

Заражение различными подтипами вируса гриппа А в дозе 10ЛД50

Н1Ы1 Н2ЫЗ НЗЫ2 Н5Ы2 Н9Ы2

Иммунизация в дозе Ю8БОЕ/мышь Ас154е1-М2ЫР 90 100 90 100 100

Ас15-1е1-М2№-РЕ8Т 80 100 80 100 100

К- (Ас15-пиН) 40 0 10 20 30

Табл. 4. Сводные данные выживаемости мышей (%), иммунизированных Ас15-1е(:-М2^ и .\d5-tet-.M2NP-PEST. при последующем заражение мышей различными подтипами вируса гриппа.

Данные экспериментов по изучению протективной активности рекомбинантных аденовирусов Ас154е1-М2^ и Ас154е1-М2^-РЕ8Т свидетельствуют о том, что полученные препараты способны индуцировать формирование иммунного ответа широкого спектра действия в отношение различных подтипов вируса гриппа А, при однократной интраназальной иммунизации в дозе 108 БОЕ/мышь.

выводы

1. Подобраны оптимальные аминокислотные последовательности антигенов М2 и ]\1Р, наиболее гомологичные между различными штаммами вируса гриппа А (подтипов Н1-НЗ, Н5 и N1, N2), выделенными от человека.

2. Проведена модификация аминокислотной последовательности антигена КР, для повышения индукции цитотоксического иммунного ответа.

3. Впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека пятого серотипа (Ас15-1е1-М2КР, Ас154е1-М2ЫР-РЕ5Т), несущие гены антигенов М2 и ЫР вируса гриппа А под контролем индуцибельного промотора.

4. Изучена экспрессия генов М2 и ИР в составе полученных рекомбинантных аденовирусов.

5. Однократная интраназальная иммунизация мышей препаратами Ас15-1е1-М2ЫР и Ad5-tet-M2NP-PEST индуцирует формирование как гуморального, так и клеточного иммунного ответа к антигенам М2 и № вируса гриппа А.

6. Препараты Ad5-tet-M2NP и Ad5-tet-M2NP-PEST способны индуцировать формирование протективного иммунного ответа широкого спектра действия при однократной интраназальной иммунизации.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Грибова И.Ю. Получение Е1-комплементирующей клеточной линии для производства рекомбинантных аденовирусов, свободных от репликативно-компитентных частиц, при помощи лентивирусной трансфекции / И.Ю. Грибова, А.И. Тухватулин, М.Н. Гарас, И.Б. Есмагамбетов, И.В. Должикова, Д.А. Бурмистрова, Т.В. Каштиго, И.Л. Тутыхина. // Естественные и технические науки.- 2013.- №3 (65).- С. 52-64.

2. Тутыхина И.Л. Изучение безопасности кандидатной вакцины против гриппа А на основе рекомбинантного аденовируса человека на грызунах / И.Л. Тутыхина, Е.С. Седлова, A.A. Панкратов, Т.Н. Андреева, А.О. Безбородова, И.Б. Есмагамбетов, И.Ю. Грибова, М.Н. Гарас, М.М. Шмаров, Д.Ю. Логунов, Р.И. Якубовская // Токсикологический вестник,- 2013.- № 6 (123).- С. 21-27.

3. Щербинин Д. Н. Индукция иммунного ответа к Bacillus anthracis при ннтраназальном введении рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего протективный антиген, слитый с Fc-фрагментом антитела IgG2a / Д. Н. Щербинин, И. Б. Есмагамбетов, А. Н. Носков, Ю. О. Селянинов, И. Л. Тутыхина, М. М. Шмаров, Д. Ю. Логунов, Б. С. Народицкий, А. Л. Гинцбург. // Acta Naturae.- 2014.- Т. 6, № 1(20).- С. 82-90.

4. Есмагамбетов И.Б. Конструирование рекомбинантного аденовируса человека, экспрессирующего гены консервативных антигенов вируса гриппа А ионного канала М2 и нуклеопротеина / И.Б. Есмагамбетов, Е.С. Седова, Д.Н. Щербинин, A.A. Лысенко, М.Н. Гарас, М.М. Шмаров, Д.Ю. Логунов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 2014,- №2.- С. 22-28.

5. Гарас М. Н. Мишень-специфичная доставка генов с помощью рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц,способных эффективно связываться с наноантителами / М. Н. Гарас, С. В. Тиллиб, О. В. Зубкова, В. Н. Рогожин, Т. И. Иванова, Л. А. Васильев, Д. Ю. Логунов, М. М. Шмаров, И. Л. Тутыхина, И. Б. Есмагамбетов, И. Ю. Грибова, А. С. Банделнж, Б. С. Народицкий, А. Л. Гинцбург // Acta Naturae.-2014.- Т. 6, № 2(21).- С. 40-51.

6. Шмаров М.М., Седова Е.С., Лысенко A.A., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Янова A.C., Верховская Л.В., Рогожин В.Н.,Тутыхина И.Л., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л., Есмагамбетов И.Б.,

Валихов А.Ф. Разработка кандидатных иммуно-биологических препаратов для профилактики и иммунотератии опасных вирусных заболеваний (птичий грипп, бешенство) на основе рекомбинантных и капсид-модифицированных рекомбинантных аденовекторов. // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» - Москва 2009,- С. 126-127.

7. Есмагамбетов И.Б., Булгаков А.Д., Валихов А.Ф. Конструирование биобезопасных аденовирусов используемых в ветеринарии.// Материалы 8-ой международной научной конференции студентов и молодых ученых «ЖИВЫЕ СИСТЕМЫ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ НАСЕЛЕНИЯ» - М: МГУПБ,- 2010,- С. 238-239.

8. Есмагамбетов И.Б., Щербинин Д.Н., Народицкий Б.С. Конструирование рекомбинантных аденовирусов, несущих гены консервативных белков вируса гриппа А // Материалы 10-ой международной научной конференции студентов и молодых ученых «ЖИВЫЕ СИСТЕМЫ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ НАСЕЛЕНИЯ» - М: МГУПП,- 2012,- С. 149

9. Есмагамбетов И.Б., Гарас М.Н., Щербинин Д.Н„ Седова Е.С. Иммунизация рекомбинантным аденовирусом, несущим гены белков М2 и NP, обеспечивает перекрестный иммунный ответ против различных штаммов вируса гриппа А. // Объединенный иммунологический форум НиНо 2013. Российский иммунологический журнал.- 2013- Т. 7 (16).- №23,- С. 324-325.

10. Щербинин Д.Н., Гарас М.Н., Есмагамбетов И.Б., Евграфов Е.В., Кондратьева Т.К., Апт A.C. Исследование протективных свойств химерного антигена М. Tuberculosis Ag85B, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом. // Объединенный иммунологический форум НиНо 2013. Российский иммунологический журнал.- 2013.- Т. 7 (16).-№2-3.- С. 327-328.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю, доктору биологических наук Шмарову Максиму Михайловичу и доктору биологических наук, профессору Народицкому Борису Савельевичу за предоставление возможности выполнения данной диссертационной работы, всестороннюю помощь и внимание. Искренне благодарю кандидата биологических наук Седову Елену Сергеевну, Щербинина Дмитрия Николаевича, кандидата биологических наук Лысенко Андрея Александровича и других сотрудников лаборатории молекулярной биотехнолгогии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России за помощь и ценные советы в работе. Выражаю искреннюю благодарность кандидату физико-математических наук Пичугину Алексею Васильевичу и доктору медицинских наук, профессору Аттаулаханову Равшану Иноятовичу за помощь в выполнении отдельных этапов работы. Кроме того, выражаю искреннюю благодарность доктору ветеринарных наук, профессору Кальницкой Оксане Ивановне за помощь и ценные советы в работе.

Выражаю свою признательность ученому секретарю диссертационного совета доктору медицинских наук, профессору Русаковой Екатерине Владимировне, рецензенту доктору биологических наук, профессору Пронину Александру Васильевичу и рецензенту доктору биологических наук Лунину Владимиру Глебовичу за помощь в подготовке материала диссертации к защите.

Подписано в печать:

06.10.2014

Заказ № 10271 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorcferat.ru