Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка комплекса экспресс-методов исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток для клинических и массовых иммунологических исследований

,»> ;', •, V ; ! ; ' : /

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

БУТАКОВ Александр Анатольевич

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА ЭКСПРЕСС-МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК ДЛЯ КЛИНИЧЕСКИХ й МАССОВЫХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

14.00.36 —Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1991

Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава СССР.

Научный руководитель докт. мед. наук, >проф. Б. В. ПИНЕГИН Официальные оппоненты: докт. мед. наук,'Проф. И. С. ФРЕР1ДЛИН, докт. .мед. наук, проф. В. М. ЗЕ'МСКОВ

Ведущая организация — Центральный институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова.

Защита состоится « 1992 г. в часов

на заседании специализированного совета Д. 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава СССР ло адресу: 115478, г. Москва, 'Каширское шоссе, 24, ,корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава СССР.

Автореферат разослан « ■т^гС» 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук А. В. КОЛОБОВ

« ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: В последние годы для оценки воздействия на человеческий организм неблагоприятных Факторов шашней среды, различ них химических и Физических ■.акторов, производственных вредностей ши рокое распространение получили нассовые иммунологические ии:ледова-ния (Петров Р.В.и др. 1990,0радовская И.В.и др. 1990).Развитие "лини ческой иммунологии.истодов иммунодиагностики позволяет.на сегодняшний день.не только констатировать наличие у больного дефекта иммун ной системы,но и,с достаточной степенью точности выявить локализации дефекта, будь то нарушения в клеточном или же гуноральном звене имну-нитета. Известно, что резистентность организна к инфекции зависит во нногон от функционирования Фагоцитирующих клеток периферической крови и тканевых накроФагов (Земсков В Н. и др. 1989, М._ шский А. Н. и ДР., 1989)

Проявления реактивности Фагоцита крайне многообразны и включают в себя такие реакции как хемотаксис, адгезию клетки к эндотелию, микроб ным агентам, дыхательный взрыв, кислородзавистше и кислороднезависи-ные неханизмы бактерицидное™ секреторную дегрануляцию . Нарушения в любой из этих механизмов способны привести к тяжелым нарушениям нро-тивоинФекционной резистентности, что наглядно демонстрируется на при-нере больных с врожденными дефектами функционирования Фагоцитирующих клеток (ЬАВ-синдрон, ХГБ, дефецит ниелопероксидазы, синдром ленивых лейкоцитов) Также сообщается о нарушениях функционирования Фагоцита руюших клеток у ряда больных с вторичными иннунодефицитани (Маянский А. Н. и др. 1989,Нагоев Б. С. 1990. фрейдлин И. С. и др. ,1990).

Учитывая значительный полиморфизм проявлений реактивности фагоцитирующих клеток и возможность компенсаторной активации одних систем при дефектах функционирования других,на сегодняшний день ,на наш взгляд, целесообразно, ставить вопрос о необходимости комплексного исследования функциональной активности Фагоцитирующих клеток,позво ляшего не только оценить те или иные стороны проявления реактив ности фагоцитирующих клеток, но и установить наличие или отсутствие конпенсаторной активации и резервных возможностей клеток, поэтому является актуальным создание системы позволяющей проводить комплексное исследование функциональной активности фагоцитирующих кл^тм:

и оценивать не только отдельные параметры, но и взаимосвязь получае-ных показателей между собой.

Цель работы заключалась в разработке стандартизированного комплекса унифицированных экспресс-методов оценки Функциональной активности Фагоцитирующих клеток периферической крови и апробации разработанного комплекса в клинике при различных патологиях, а также при проведении массового иммунологического исследования в условиях экспедиции.

Задачи исследования:

1. Разработать стандартизированный конплекс унифицированных не-тодов оценки функционально» активности фагоцитирующих клеток периферической крови.

г. отработать нормативные показатели для различных тестов и выявить взаимосвязь' различных параметров Функциональной активности Фагоцитирующих клеток при обследовании здоровых доноров

3. Выявить наиболее характерные нарушения функциональной активности Фагоцитирующих клеток периферической крови при .обследовании больных с различными патологиями

4.Показать возможность применения и оцени ь информативность разработанного комплекса методов при массовом иммунологическом исследовании. •

Научная новизна исследования:Разработан стандартизированный комплекс унифицированных методов спе;трофотометрической оценки функционального состояния Фагоцитирующих клеток периферической крови чело-зека, включающий в себя определение адгезии клеток на пластик,спонтанного и индуцированного теста восстановления нитросинего тетразо-лнл,количества катионных белков, спонтанной и индуцированной актив-поста миелонероксидазц и кислой ФосФатазы в Фагоцитирующих клетках, оценку продукции и экскреции активных фори кислорода нетодон аутоэ-ритяоццтолиза. При обследовании донорской группы определены норма-шьние. показатели для каждого - из разработанных тестов, а также выявлены определенные корреляционные связи между отдельными проявлениями ,ч-лкпжнооти Фагоцита, ь т«м числе' между тестами входящими в разрабо-ijiii. ii (.мишикс и лмшшолзайигпм.'П хемилюминесцешшей Фагоцитируюши:: . !,,.чок ¡р.:иИН'ИЧеог.1/Н кгови.

По разработанному комплексу были обследованы больные с различными патологиями и выявлены изменения функциональной активности Фагоцитирующих клеток наиболее характерные для исследованных патологий.

На основании результатов обследования донорской группы н больнш с различными патологиями обоснована необходимость имсшо комплексно го исследования функциональной активности Фагопитнругаих клеток, охватывавшего различные проявления реактивности Фагоцита, в кпшшчсскои практике.

Разработанный конплекс нетодов аппробирован и доказана возможность его применения при массовом иммунологическом обследовании.

Практическая ценность:В ходе работы разработан стандартизированный и унифицированный комплекс методов исследования функциональной активности Фагоцитирующих клеток,применимый как для клинических,так и для массовых иммунологических исследований.

По материалам работы подготовлен проект методических рекомендаций: "Конплекс нетодов для выявления повышенной чувствительности к инфекционным агентаи", представленный в Минздрав СССР.

Разработанный конплекс методов применяется для обследования больных в лаборатории клинической иммунологии Института иммунологии Минздрава СССР, а также внедрен в практику во г-ой городской инфекционной больнице,24~ой городской клинической больнице г.Москвы,кафедре инфекционных болезней ННСИ ин. П. А. Семашко, Красноярской Краевой клинической больнице Н 1,Институте Медицинских проблем севера г. Крас' иоярск. лаборатории клинической инн/нологии Городской больницы N 1,г. Ангарска и ряде других научно-исследовательских и лечебно-профилактических учреждений страны.

Разрабо-ашшй комплекс методов применен для нассового иммунологи ческого обследования в гг. Нижний Тагил,Шахты и Липецк.

На основании разработанною комплекса методов проводится подбор оптимальной иннунокорригируюшей терапии в тестах in vitro у больны:; с нарушениями функциональной активности Фагоцитирующих клеток и ла боратории клинической иннунологии Института инмунологии Минздрава СССР.

Осногные положения выносимые на защиту: - Для определения функциональной активности Фагоцитирладл кп. ток

- б -

периФеричеа эй крови человека необходимо проведение комплексного исследования. . из у чаше со различные проявления реактивности Фагоцита.

- Разработанный стандартизированный коиплекс унифицированных методов является достаточно воспроизводимой и информативной системой, позволяющей тестировать различные паранетры функциональной активности Фагоцитирующих клеток.

- Предложенный комплекс нетодов позволяет значительно повысить информативность исследования функциональной активности Фагоцитирующих клеток по сравнению с используеныни в настоящее время методиками.

- Предложенный стандартизированный конплекс унифицированных нетодов может быть реконендован для клинических и массовых иннунологи-ческих исследований в лабораториях клинической иннунологии лечеб но-профилактических и научно-исследовательских учреждений страны.

Аппробация работы:Материалы диссрртадии доложены и обсуждены на конференции нолодых ученых Института иннунологии Минздрава СССР (19 1 г.), Всесоюзном рабочем совещании по клинической иммунологии (Москва, 1991г.),совместной клинико-лабораторной конференции Института иннунологии Нинздрава СССР (1991 г.),Научно-практической конференции но хенилюминесиенции (Москва,1991 г.).Научно-практической конференции инфекционистов Азербайджана (Баку. 1991 г.)

Публикации:По теме диссертации опубликовано научных работ,

Об„ен работа:Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунка и таблицы. В списке использованной литературы источник из отечественных

авторов.

Место выполнения работы:Диссертационная работа выполнена на базе Института иннунологии Минздрава СССР.

СОДЕРЖЛНИЕ РАБОТЫ

Матери лы и методы исследования: Характеристика обследованных групп больных:было проведено исследование функциональной активности Фагоцитирующих клеток у 267 болььых с различными патологиями.в том числе: ?.8 бодышк хронической герь^-тической инфекцией.20 больных с ■ >бостр жен хронического бронхита и 17 болышх хроническим бронхитом ь стадии ремиссии, 25 больных хроническин остеомиелитон. 15 болышх

атонической и 16 больных инфекционно-аллер^чческой бронхиальной аст ной. 38 больных острей Формой иерсиниоза,14 ВИЧ-инФицированных пани ентов, 23 больных с послеоперационными гнойно-сеьтическини осложнениями«^ больных поллиноэа1 I и 1С человек с лекарственной аллегги ей.Контрольную группу составили 42 практически здоровых донора.

НетоАЫ исследования: гепаринп^ированнуи венозну» крсвь в количестве 3-5 - 5.0 ил смеиивали с 1К раствором желатины на ¡.реле 19? и инкубировали 30 минут при 37 С.Забирали надосадок,добавляли до 10 пл среды 199 м центрифугировали 15 иин при 250 д.Клеточный осадок ресуспенировали в растворе Хенкса без Фенолового красного и трижды отмывали в этой растворе при 250 д по 10 минут. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 1-0 ил раствора Хенкса без фенолового красного»« просчитывали количество нейтрофилов и ионг 1уклеаров в капере Горяева,окрашивая клетки краской Романовского-Гимзы,верифицируя их по Форме клеточного ядра-Процент жизнеспособности клеток,при окрашивании 0.25 У, трипановын синим,составлял не ниже 97 '/»процент нейтрофилов в лейкоцитарной взвеси - не ниже 60 '/!■ Затеи полученную лейкоцитарную взвесь разводили раствором "еккса без Фенолового красного до концентрации нейтрофилов 2 млн/мл.

Для исследования индуцированной активности Фагоцитов готовили суспензию опсонизированногг оипозана следующим образом:Навеску зимо-зана тшательно перемешивали с пулевой донорской сывороткой AB(IV)J5h(-) в концентрации 20 вг зимозана на 1 нл сыворотки.Инкубировали 30 иин при 37 С,при непрерывном помешивании.Посль инкубации центрифугировали при 250 д 10 иин "и надосадок удаляли-Осевший зи-ноэан ресуспендировали в 10 мл PBS (рН 7.2-7-4) и затеи трижды отпивали PBS при 250 g по 10 мин. По лученный опсонизировакный и отттш зимозан разводил« PES до концентрации 20 мг/ нл, разлизали на аликвоты по 0.5-1.0 мл и хранили при -70 С. Размораживали однократно, непосредственно перед употреблением.

Конплекс нетодов тестирования функциональной, активности фагоцитирующих клеток периферической КРОВИ человека: Разработанный комплекс методов Еключает в себя определение адгезии на пластик,спонтанный и индуцированный НСТ-тест-определение спонтанной и индуцированнгм гг.-тивности внутриклеточно расположенных ферментов. миелопероксида.-.ы и

кислой фооф^тазы»количественное определение катионных белков в фагоцитирующих клетках,а также продукции и экскрецию фагоцитами активных форм кислорода в тесте аутоэритроцмтолиза .В качестве рефе-ренс-тестов использованы методы исследования лмминолзависимой хеми-лмнинесценции фагоцитов и бактерицмдность фагоцитирующих клеток периферической крови по отношении к Золотистому стафилококку (штамм 209).

-адгезивную способность иеитрофилов периферической ~ рови определяли следующим образст:в лунки плоскодонного планшета для иммунологических реакций вносили клеточную суспензию с концентрацией нейт-рофилов 2 клн/мл по 100 ккл/лунку.После 60 рчн инкубации при 37 С удаляли нег илипиие клетки|а адгезкрованные нейтрофилы Фиксировали зтанолок|с последующей окраской красителем Ронановского-Гимзы.Отныв неоключившийся краситель|растворял" внутриклеточно расположенный краситель 40 иМ НС1 в изопропано/.е и определяли оптическую плотность раьгвора при 650 нм на микропроцессор,. "ЕНба-П"( "ВеЬг1пдег") .Количество адгезированных клеток расчитывали по предварительно построенной калибровочной кривой.

-продукцию супероксид-аниона определяли в НСТ-тесте. Для этого к прилипшим на пластик и отмытым клеткам добавляли по 100 мкл раствора ИСТ ("Мегск").( 1кг/ил) на РБ5 (рН 7.2-7.4). В контрольные лунки добавляли по 50 мкл раствора Хенкса без фенолового красного«а в опыт\ кыг - по 50 пкл суспензии опсонизированного зипозана 20 нг/ мл* Планшет инкубировали 30 мин при 37 С.После игкубации клеточный мо-кослой с образовавшимися зернами диуормазана осторожного тщательна отмывали от гкмозана и раствора НСТ трижды.Планшет высушивали ^затеи» образовавшийся диформазан растворяли предварительно разогретый до 83 С диметилсульфоксидои (ДМС0).Оптическуа плотность измеряли при 540 нм на спектро- фотометре Т^е^ек МиШБсап Р1и2.бланкируя по ДМСО.Как зпонтанный (контроль)<так и индуцированный (опы*-) НСТ-тест ставится в триплетах.Вычисляется средняя оптическая плотность для контроля и опыта к индекс стимуляции равный отношению опыта к контролю .Уровень спонтанного НСТ-теста соответствует оптической плотности контроля)а индуцированного - ог.-гга.

-активность миелопероксидазы определяли следующим образомI к ад-

тезированным на пластик и отпытык клекам добавляли 100 пкл субстратной смеси,сс тоямей из 0.04 '/, ортофенилендианина ("Sigma") и 0-014 '/, перекиси водорода на фосфатно-цитратном "уфере (рН 5-0) - По истечении 10 мин.реакцию о^танав ив а ли 100 пкл 10 '/, серной кислоты.Интенсивность оптической плотности фиксировалась в многоканальном спектрофотометре "Multiscan Т : tertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 ни. в виде единиц оптической плотностиi умь женных на 1000.

-активность кислой фосфатазы определяли следующим образом: К адгезированным на пластик и отмытым клеткам« добавляли 50 нкл субстратной снес«) состоящей из 0-24 % паранитрофенилфосфатг. < "Boehring" ) и 0.34 'Á NaCl на натрий-цитратнам 1 M буфере ( рН 5.5).После 30 минутной инкубации при'57 С реакцию останавливали добавляя 100 икл 0.2 H NaOH.Интенсивность оптической плотности фиксировалась в многоканальной спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ( 'Flou lab.") при длине волны 405 ни- в виде единиц оптической плотности «умноженных на 1000.

-определение изиенения активности ниелопероксидазы и кислой ФосФатазы при стимуляции фагоцитирующих клеток in vitro проводили следующим образом! к адгезированным пластик и отмытый клеткамi добавляли по 30 икл суспензии опсонизированиого зимозана 20 иг/ил.После 30 иин. инкубации при 37 С клетки повторно отнывали трижды PBS (рН 7.2-7.4) от зкнозана и выделившегося при стимуляции фермента.Затем определяли активность ииелопероксидазы и кислой фосфатазЫ|как описано выые.

-определение количества нефериеитных катионных белков в Фагоцитирующих клетках проводили следующим образом: к адгезированным на пластик и отьатым клеткам добавляли 50 икл 0.1 % раствора зеленого прочного("Serva") на иетанолсвои трис-буфере (рН 8-2).После 30 минутной инкубации при 37 С клетки затем отнывали трижды от невкличив-иегося красителя«а внутриклеточно расположенный краситель растворяли ДМС0 пи 100 ккл на лунку. Интенсивность оптическойплотности фиксировалась в многоканальном сг.^ктрофотсметре"Ми11 iscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 620 ни. в виде единиц оптической плотности iумноженных на 1000.

Расчет uoji/чешшх показателей ва 100 тысяч клеток: Очевидно,что адгезивная спг ;о6ность фагоцитирующих клеток может существенно колебаться у разных людей'Соответственно I и полученные величины оптической плотности в НСТ-тесте, тестировании активности миелоперокси-дазы и кислой ФосФатазы, а такие количества катионных белков будут зависить не только от функционального состояния клетки,но и от их количества, прйлипших к пластику-Чтобы стандартизировать получаемые в различных тестах показателя и сделать сравникыии результаты получаемые у разных лвдей, проводили пересчет полученных показателей на определенное количество клеток,в данной случае на 100 tij клеток,Для этого полученная при тестировании того иди. инг-о пгракетра функцно-нальой акть-ности клеток величина оптической плотности умноаается на 100 тысяч к делится на количество прилипших клеток определяемое при тесте адгезии фагоцитирующих клеток на пластик- продукцию и экскрецию фагоцитирукцини клетками активных кисло- • родных метаболитов определяли в тесте аутоэритроцитолиза•Для этого выделенную на 1 У. растворе желатины на растворе Хеккса без фенолового красного лейкоцитарную суспензия вносили в лунки круглодонного "36-луночного планшета для иммунологических реакций,по 100 мкл на лунку. В опытные' лунки добавляли по 50 мкл суспензии опсонизировак-' ного зинозана,а в контрольные по S0 ихл PBS <рН 7.2-7.4).Планшет центрифугировали 10 нин при 250 g,а затем инкубировали в течение 3-х часов при 37 Г.После инкубации осадок ресуспендировали,планшет повторно Ц-Жтрифугирсшали 10 мин при 250 g и на/.осадок в количестве 100 тел перекосили в плоскодонный 96-луночиыи планшет для иммунологических реакций-Интенсивность оптической плотности определяли в многоканальной спектрофотометре "Hultiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 40S ни. Результаты были представлены в виде условных единиц,вычисляемых как отношение оптической плотности опыта к оптической п.-отности контроля.

Исслеузвание лкнинолзавксимой хемилииинесценции фагоцитирующих клеток периферической крови челивека проводили н? приборе 1251 Lumi-riometer ( "U'B*" ) по методике Земскова В.И-, 1988 г- ,регистрируя пик спонтанной и инуцированной хемилмминесценции и вычисляли индекс стимуляции.

Также проводили исследование бактерицидности Фагоцитирующих клеток периферической крови человека по отношению к Золотистому стафилококка (штамп 209) меченному Н -тимидинои (Редькин А.П.,1989 г)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В процессе решения первой.задачи работа были разработаны модификации нетодик спектроФотометрического определения адгезии клеток на пластик,спонтанного и индуцированного НСТ-теста,определения активности миелопероксидазы и кислой ФосФатазы в фагоцитирующих клетках, а также изменения активности этих ферментов при стимуляции кле ток In vitro, спектроФотометрического определения количества катион них белков в Фагоцитирующих клетках,а также методики определения продукции и экскреции Фагоцитами активных Форм кислорода в тесте дуто эритро цитолиз а.

Разрабатывая спектрофотометрический способ определения адгезии Фагоцитирующих клеток на пластик,в лунки плоскодонного 96- луночного планшета для иммунологических реакций вносили нейтроФильную взвесь, выделенную на Фиколл-гипаке,с концентрацией 2 млн/мл.После 60 мин. инкубации удаляли неприлипшие клетки и просчитывали их количество. Косвенно, вычитая из обшего количества внесенных клеток коли-четво неприлипших клеток,определяли количество и процент адгезиро-вашшх на пластик нейтрофилов. Затем Фиксировали, окрашивали краской Романовского-Гинзы и определяли оптическую плотность.как описано выше. Было установлено,что примесь эритроцитов существенно не влияет на адгезию нейтрофилов на пластик. Кроме того при проведении параллельных исследований с чистой нейтроФильной суспензией и лейкоцитарной взвесью выделенной на желатине не было выявлено существенной разницы в количестве прилипших клеток, определяемых спсктроФотометги чески. Все это позволило, после построения калибровочной кривой (рис П.для спектроФотометрического определения количество прилипших к пластику клеток, работать в дальнейшем на лейкоцитарной взвеси выделенной на желатине.

Также были несколько модифицированы такие реакции, как определи ние спонтанного и индуцированного JICT-теста, активности миелоштскси дззы и кислой ФосФатазы, а также количества кл'пюнкнх бспкон в v.in.

количество клеток (»ю")

Рис.1 Калибровочная кривая для спектрофотоиетрического определения количества прилипших на пластик клеток.

цитирующих клетках. Суть модификаций заключалась в тон, что вышеперечисленные параметры определялись в выделенных на желатине, прилипших к пластику и отмытых фагоцитах, что позволяло полностью избавится от эритроцитов и подавляющего большинства лимфоцитов. Полученные результаты. выраженные в единицах оптичеа лй плотности.затем пересчитывали на 100 тысяч клеток, как описано выше. Это позволяло стандартизировать полученные результаты, а использование спектрофотометра для учета результатов реакции - значительно объективизировать получаеные данные.

В процессе работы была также модифицирована и значительно упрошена реакция лизиса активированными Фагоцитируюшини клетками аутоэ-ритроцитов, которую впервые описал в 1980 г. S. J. Weiss. Было показано, что при 3-х часовой инкубации активированных опсонизированвдн зи-нозанон фагоцитирующих клеток,выделенных на 1 z желатине происходит лизис аутоэритроцитов, присутствующих в клеточной суспезии.причен оп-

Условные

Рис. 2 Зависимость оптической плотности надосадка (длина волны 405 нн. от' соотношения нейтроФид:эритроцит при 3-х часовой инкубации в тесте эритроцитолиза.

индекс стимуляции индекс стинуляции

(опыт/контроль) (опыт/контроль)

Рис. За Врененная зависимость изменения Рис. 36 Зависимость изменения

активности НПО и КФ при стинуляции активности НПО и КФ от кг л ¡¡л

клеток In vitro (1-ниелопероксидаза; стинулятора(1-миелопер<.кешшз.;;

2-кислая ФосФатаза) 2-кислая ФосФатаза)

тималышм - в соотношении нейтроФил: эритроцит является интервал от 1:10 до 1:50,что практически всегда удается достичь при избранной нами способе получения лейкоцитарной суспензии (рис 2).

Изменение активности Ферментов, в частности кислой ФрсФатазы,при активации накроФагов было описано ранее (Сходова С. А.. 1990 г.). В' процессе работы нами была показана возможность изменения активности миелопероксидазы и кислой ФосФатазы в нейтроФилах, причен как в сторону увеличения количества Фернента,так и в сторону уменьшения.Снижение активности Ферментов в нейтроФилах происходит за счет экскреции его в экстрацеллюлярное пространство,в то время как в клетке, при активации последней, происходит синтез активных Форм Фернента. Были разработаны опптимальное время и дозы стимулятора, необходимые для тестирования изменения активности ниелопероксидазы и кислой фосфата-

Табл. 1

Показатели функциональной активности Фагоцитирующих клеток,полученные при обследовании донорской группы.

Параметр Доноры (Н=42) Параметр Доноры (N=42)

Адгезия (X) 52. 08*3. 61 НПО ИС 1. 11+0. 05

НСТ-спонт ед. пт. плЮ 89. 77+9. 3 Акт КФ спонт ед. опт. плЮ 151.5+21.9

НСТ-индуц ед. опт. плЮ 141. 1 + 12. 26 Акт КФ индуц ед. опт. плЮ 131.0+20. 1

НСТ (ИС) 1. 78*0.06 КФ ИС 0. 97+0.05

Бактерицидн. (X) 71.6+5.2 ЛЗХЛ инд. нв. 41. 32+8. 07

/13ХЛ спонт. нв. 12. 68*3. 37 ИС /гзхл. 21.52+3. 55

Акч-шю спок'1 ед. опт. ил 10 598+101 КБ ед. опт. ил 10 85. 3+7. 5

АКТ Ш10 инду! ед. опт. плЮ 730+99. 1 ЭЦЛ 4. 16+0. 56

- 15 -

зы при активами клетки in vitro (рис. За и 36).

В процессе выполнения второго раздела исследований были обследованы 42 здоровых донора в возрасте от 18 до 50 лет и определены нор мативные параметры для каждого из предложенных тестов (табл 1).

Такин образом, как видно из представленной таблицы,только принер но половина из нейтрофилов периферической крови обладает,у здогопых людей способностью к адгезии на пластик. Весьма вариабельными оказалась Ферментативная активность Фагоцитирующих клеток,в то время как количество катионных белков и способность клеток к восстановлению НСТ характеризовалась большей стабильностью. Оценивая результаты, полученные при исследовании изменения активности Ферментов в фагоцитирующих клетках периферической крови необходимо отнетить, что у большинства доноров сохраняется примерное равновесие между экскрецией активных Форм Фернента во внеклеточное пространство и ресинтезом его клеткой.

t Так как люнинолзависиная хемилюминесценция (ЛЗХ/I) Фагоцитирующих клеток является интегральным показателем их функциональной активности (Зенсков В. Н. и соавт., 1988 г.) было важно, установить наличие корреля ции между изученными параметрами и ЛЗХ/1.

Для этого был проведен корреляционный анализ показателей полученных при обследовании донорской грушши лзхл Фагоцитирующих клеток периферической крови, а также этих показателей между собой. Весьма интересным, нанаш взгляд, оказалось наличие средней степени корреляционной корреляционной зависимости между тестон ауторитроцитолиза и индексом стимуляции люминолзависимой хенилюнинесценции,что, возножно,позволяет использовать этот тест как аналог хенилюнинеценшш, тем более,что ЭЦ/1-тест является значительно более простнн и менеее дорогостоящим нетодон исследования и обладает значительно более высокой пропускной способностью. Адгезия клеток также коррелировала со спонтанной хенилюминесцешшей, что подтверждает данные литературы о тон, что спои танная люнинолзависиная хемилюнинесценция зависит от активации клет ки при адгезии ее на пластик (Земсков В.н. и соавт.,1988). Выраженная корреляция также отмечена нежду индуцированным НСТ-тестом и актив ностью миелопероксидазы,а также активностью кислой ФосФатазы и ниелопероксидазы, то есть Ферментативной активностью клетки. в то *<:

I--

х/л с1юнт.

" 0.46 ^

г

НПО ис

КФ ПС

1СГ ис

716-

I. 39-

адгсзия ||-

-С.4&-

о-

-аз7-

—0.65-

Х/л индуц.

—0.83-

-1

т ис

—\ 03б_г—

-рил

НПО ИШУП

3

0.54 г

-|[ КФ иидэтГ^

1сг индуд

-0.46-

3

-0.59-

Ьсзтаон.

белки!

азб

-0.9-

-1-0.64

Чи~

Е

НПО CD0HT 1-1

46-

а5б

l 87—

рКФ спонт~~|

_С. о

ШГ CDOHT^j^

Рис 4. Коррелядиошше взаимосвязи между различными тестани исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток.

вреня не выявлено корреляции нежду изменениями активности ииелопе-роксидазы и кислой фосфатазы при стимуляции клеток in vitro,что свидетельствует об автононности Функционирования этих Фернентных систен,и возможно, большей активации кислой фосфатазы при относительно меньшем изменении активности ниелопероксидазн при стимуляции клетки или наоборот. Также интересным представляется наличие корреляции нежду ЭЦ/1-тестон и изненениеи активности миелопероксидазы, что так подтверждает значительную роль этого Фернента в продукции активных кислородных радикалов i лизисе аутоэритропитов при стиуляции клетки in vitro (рис 4).

В третьем разделе работы было обследовано 267 больных с различными патологиями, с целью определить информативность разработанного комплекса методов в клинике и выявить нарушения функциональной активности фагоцитирующих клеток наиболее характерные для этих патологий. Нам не удалось выявить значительных нарушений по сравнению с контролем,как в средних показателях, так и при частотном

анализе, при обследовании больных поллинозами й лекарственной аллергией.атонической бронхиальной астмой,хроническин бронхитом в состоянии ремиссии.

У больных инФекционно-аллергической бронхиальной астной отнечено значительное увеличение частоты встречающихся нарушений по сравнению с контрольной группой в тестах адгезии на пластик, индуцированнон НСТ-тесте, количестве катионных белков,причем последний показатель был достоверно снижен по средним показателям по сравнению с контролен. У больных с обостренней хронического бронхита значительно чаше, чей в контроле наблюдали снижения спонтанного и индуцированного НСТ-теста,а также теста аутоэритроцитолизл причен показатели этого теста, в средней по группе были достоверно снижены по сравнению с контролен. В то же время, у больных с обостренней хронического бронхита активность ниелопероксидазы и кислой ФосФатазы при стимуляции клетки in vitro повышалась достоверно сильнее, чем в контрольной группе. Учитывая снижение индуцированной хемилюминесценции в этой группе можно рассценивать эти изненения не как следствие усиления образования активных Форм Фермента Фагоцитируюшини клеткани при их стимуляций,а,скорее,как следствие нарушения процессов нарушения сек-ретороной дегрануляции и экскреции Фернентов и активных Форм кислорода во внеклеточное пространство.

Однако, наиболее выраженные нарушения функциональной активности Фагоцитирующих клеток наблюдали у больных хронической герпетической инфекцией,ВИЧ-инФицированных лиц. больных с послеоперационными гной-но-септическини осложнениями, хроническин остеониелитом,а также острой Форной иерсиниоза (рис 5).При этой интересным является сопоставление выявленных нарушений у больных со сходныни патологическими процессани. Так,если у больных хроническин герпесон на фоне значительного снижения показателей адгезии, НСТ-теста. ЭЦ/1-теста и количества катионных белков наблюдали повышения Ферненгативной активности клеток, то у ВИЧ-инфицированных пациентов, при наличие сходных нарушений в продукции активных.кислородных нетаболитов и адгезии,не отмечено повышения активности ниелопероксидазы и кислой ФосФатазы. а напротив,инелась тенденция к снижению этих показателей. Это,в какой-то нере может объяснять более частое развитие вторичных инфекций при

контрол ь

yp. бронхит fcbaf**) УрЛ^и«*

kvuc

7м»

KTu Д/iJMl (ISI.<)

UCTuhhT

ЭЧК fh,l() MW UC

1кгт.ллч') wf HCTHCft.*"»^

■мпо-л /М0> «-«"

НСТиЛ

Пегие ^

MfiOen 'мпОинЪ нпоис

НП01Ч

В иV- инфекций Хронич.герпее

Htru*3. • //ггае 'мпОы.

НПб им) г ¿¡Jjj

Ocrnjb. uejbcuM"os

нетынт KVUC KeJf^HCT^r неГиЛ Л^лС^^—^Хксг^"2

HtruC

HCTUC g.

МПОсп М>

/7о еиеоп ера у ионные урйничлемй

ипуаельиснмае ослсЖмянЫ. остеомиелит

МЬг

К* 5чд «по

"ПО UC

Н(Т»оиГ , мст«»э ^

ЫПОск. МПОимЭ P*?'"«»

fipr

HCt

¿/нлекуиснио -

ос'лго.

ЛйГ

НСГ-Л

нгт iii f&vä МПО ей ^ ГЛПО um&

МПО«« HnOuiÄ-

Рис 5. функциональная активность Фагоцитирующих iслеток периферической крони при различных патологиях.

АДГ-адгезия на пластик; НСТ-спонт - спонтанный НСТ-тест;11СТ-инд -индуцированный IICT-тест; HCT ИС - индекс стимуляции в HCT-тесте; НПО сн -спонтанная активность миелоиероксидазы;ИПО инд - индуцированная активность ииелопероксидазы,' НПО ИС - индекс стимуляции при индукции миелопероксидазн; ЭЦ/1 - тест эритроцитолиза; Кф спонт - спонтанная активность кислой ФосФатазы;кф инд - индуцированная активность кислой ФосФатазы; Кф ИС - индекс стинуляции .при индукции активное™ кислой ФосФатазы;КБ - количество катиошшх белков в клетке.

ВИЧ-'шФекоии.хотя,учитывая выявленные при хроническим герпесе нарушения Функциональной активности Фагоцитирующих клеток, неснотря на повышение активност.1 Фегнентов, имеющих, по видимону компенсаторный характер, можно объяснить частое присоединение у больных герпесом бактериальных инфекций.

У больных с послеоперационными гнойно-сентическини осложнениями отмечено значительное снижение адгезии клеток на пластик,повышение спонтанного ИСТ-теста и снижение способности клетки к усилению продукции активных кислородных метаболитов при ее с гимуляшш, что ирг ;о-дит к снижению индекса стимуляции в НСТ-тесте. В этой группе больных также отнечено достоверное снижение количества катиошшх белков и ЗИЛ- теста, в то время как активность кислой ФосФатазы значительно возрастала. Гри хронизации гнойно-септического процесса,что ны наблюдали при обследовании больных хроническим остеомиелитон нарушения функциональной активности Фагоцитирующих клеток еше более усугубляются. Несмотря на то. что не было выявлено нарушений адгезии,следует ответить снижение до норны спонтанного НСТ-теста и значительное снижение индуцированного НСТ-теста. Активность ниелопероксидазы у этих больных значительно ниже чем в контроле, а повышения активности кислой ФосФатазы, характерное для больных с послеоперационными гнойно-септическими осложнениями в этой группе больных не отмечалось. Кроне того значительно было снижено количество катиошшх белков и показатели теста аутоэритроцитолиза.

Также довольно грубые нарушения Функциональной активности Фагоцитирующих клеток вывлены при обследовании больных острой Формой иерсиниоза. Значил: пьно снижалась адгезия клеток на пластик, спонтанный и индуцированный НСТ-тест. количество катиошшх белков. Выл несколько понижен ЭШЬтест. В то же вреня отнечено достоверное повышение спонтанной и индуцированной активности ниелопероксидазы и кислой ФосФатазы, что,наиболее вероятно, играет конп чсаторный характер.

Необходимо отнети ь, что нарушения,выявляемые в адгезии клеток на пластик, а также показателей кислородзависиного нетаболизма клеток (НСТ-тест,активность ниелопероксидазы, ЭЦЛ-тест) в подавляющей большинстве случаев подтверждались выявлениен нарушениями при исследова

го -

нии люнинолзависиной хенилюнинесценции.хотя выраженность нарушении не всегда была одинаковой, и. например, снижение НСТ-теста в 2 рзэа. при увеличении активности миелопероксидазы в 1. 5 - 2 раза ногло сопровождаться только незначительно сниженными показателями люнинолза-висимой хенилюнинесценции. Таким образом предлагаемый конплекс не.одов иозволяет не только тестировать в единой систене те или иные стороны

• ' I

проявления реактивности фагоцита, но и вывляя дефектное звено р '.то | функционировании, оценивать способность клеток к компенсированию нарушенных функций за счет активации иных бактеришишх систен.

Наконец, на последнем этапе работы была проведена аппробация разработанного конплекса методов при нассовом иинунологичскон обследовании. Для этого бригадой из двух человек за 4 дня было проведено обследование 110 человек, занятых на хиническон производстве в г.Нижний Тагил. Таким образом, пропускная способность конплекса методов составила около 25 человек в день. При проведении обследования, на основании анамнеза и анализа амбулаторных карт все работающие были разделены на две группы:группа практически здоровых лиц и группа лиц, подверженных частым остры 1 респираторный инфекциям. Были проанализированы отдельные параметры Флшционалыюй активности Фагоцитирующих клеток у всего контингента габотаюших в услови к вредного хни-ческого произвол~тва, практически здоровых лиц из данного контингента и у лиц,подверженных частый респираторным инфекдиян и просчитана не только достоверно! гь вьпвленных различии в параметрах имнунного статуса между группами и контролем но проведен частотный анализ,выявляемых нарушений по отдельным показателям. Как видно из рис б, имеется тенденция к снижению активности ниелопероксидазы и количеству кати-онных белков, а также ЭШ1-теста у всех лиц занятых на хиническон производстве, при^ен значительно повышется процент лиц с выявляеныни нарушениями в отдельных параметрах. В то же у этого контингента имеется тенденция к повышению активности кислой ФосФатазы,хотя ни в одном из вышеперечисленных тестов различия с контрольной группой не были статистически достоверны, при анализе данных полученных при обследовании группы подверженных частын респираторным инфекпиян были выявлены достоверные различия с контролен и группой практически здоровых лиц, работающих на том же производстве, в индуцированном НСТ-тесте. ко-

Нонтроли «в мг НСТспмт

\мстие

НПйспант

МЯО »»д, НПО не

РаЪотаюшие но ъ-ле Хкм пласт /пл моровые/

НОТопснт НСТчнл

НСТис

МПОспонп* НПОинА

МПОие

Рода/псющие но в-де .Химпласт г%}йЛма„.

НОТсс* ны<) НОТинд

НСТис

Н (10опоим

СПОИГ

ЭЦП^-^НПОим ГПОил

Работами/иена зле Хинплост /часто Ролешшие /

КбЛЕ. нет*™»,

ИСТ инь ИСТ ие

НПО споит МПУ мид,

МПОие

Щ

спемт

Рис в. Результаты исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток периферической крови, полученные при нассовон инчунологическом обследовании в г.Нижний Тагил, (обозначения те же,что на рис.5

личестве катионных белков, тесте эритроцитолиза. Отмечено достоверное снижение уровня ниелопероксидазы в этой группе по сравнению с контролем и тенденция к далонейшему ее синению по сравнению с практически здоровыми лицани, в то вреня как активность кислой ФосФатазы не отличалась сущестгенно от в группе практически здоровых людей,занятых на этон производстве,хотя и сохранялась тенденция к ее повышению по сравнению с контрольной группой. Суннируя все выше изложенное,можно говорить о значительной роли нарушений функциональной активности Фагоцитирующих клеток в частой развитии инфекционных процессов у лиц занятых на вредной хиническон производстве. Кроме того, сравнивая изменения, характерные для показателей функциональной активности Фаго-

цитирующих клеток, с показателями полученпыни при обследовании больных с различными патологиями, нельзя не отнетить схожесть этих изменении с нарушениями-имеющимися при хроническон остеомиелите, что позволяет предположить преобладание в обследованной контингенте лиц с хронической бактериальной инфекцией.

ВЫВОДЫ.

, I.Создан стандартизированный конплекс унифицированных нето-дов исследования Фуг :циональной активности фагоцитирующих клеток периферической крови, в процессе создания которого разработаны и значительно модифицирования нетоды спектрофотонетрического определения адгезии Фагоцитирующих клеток на пластик, спонтанного и индуцированного НСТ-теста. активности ниелопероксидазы и кислой ФосФатазы.а также изменения активности этих ферментов при стиуляции клеток 1п vit.ro и количества катионных белков и продукции и экскреции активных Форм кислорода по лизису аутоэритроцитов.

П.По разработанному, комплексу обследовано 42 здоровых донора в возрасте от 10 до г>0 лет и разработаны нормативные показатели для каждого из предложенных тестов,а также определены корреляционные взаимосвязи между о гделышни параметрами функциональной активности Фагоцитирующих клеток определяемыми по данному комплексу и люнинол-зависиной хемилюминесценцениией Фагоцитов периферической крови.

Обоснована необходимость коплексногс исследования функциональной активности Фагоцитирующих клеток периферической крови с тем,что бы не только выявить уровень дефекта их Функционирования.но и оценить возможность компенсирования нарушенной функции.за счет активации других бактерицидных систем.

'1. Обследование в клинике 267 больных с различными патологиями по казапо высокую информативность разработанного комплекса у больных с нарушениями противоинфекиионного имнунигета. В то же время при ряде патологий, таких как атоническая бронхиальная астна,полиноз, ле: карственная алдергия, хронический бронхит в стадии ремиссии,не выявлено существенных нарушений функциональной активное™ Фагоцитирующих клеток периферической крови.

При обследовании по разработанному комплексу методов больных с

различныни патологиями позволило выявить определенные закономерное™ н нарушениях функциональной активности фагоцитирующих kjioiok у больных хронический вирусной инфекцией,гнойно-воспалительными заболеваниями,острой бактериальной инфекцией и острыми гнойно-септическини-процессани. Бнесте с тем выявлены сушест венные различия между показателями полученными у больных хроническим герпесом и ВИЧ-инфицированных лиц,хроническим остеомиелитом и остры ми послеоперационными гнойно-септическими осложнениями,а также ост рым иерсиниозом, что, очевидно играет существен 1ую роль в патоге незе и клиническом течении этих заболеваний.

б. Продемонстрирована возножноссть применения разработанного коми лекса методов при нассовон иммунологических исследованиях при оболе довайии лип занятых на вредной химическом производстве в г. Нижний Тагил. Полученные результаты позволили выявить олпгеделенные нарушения функциональной активности Фагоцитирующих клеток у лиц подвержен ных частый респираторный заболеваниям по сравнению с донорской грун по'! и практически здоровыми лицами работающими на этом же производстве. что дает основание оценивать разработанный комплекс мето дов,как весьма информативную систему для массовых иммунологических исследований.

СИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАШШ ПО ТЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Динамика хемилюминесиентного ответа при использовании различных стинуляторов//Иммунология - 1991 И J. стр/3~-/А'(Бакулин H.H., Саидов Н. 3., Бутак^в А. А.)

2. Хемилюминесценция у больных острыми бактериальными и вирусными инфекциями. //Тезисы докладов научно-практической конференции "Актуальные вопросы кишечных инфекций". Ташкент 1990 г. ,стр 114-115 (Кузнецов В. Ф.. Никулин в. н. . Бутаков А. А.)

3. Комплексное исследование Фагоцитарного звена иммунитета при первичных иннунодеФ"Цитных состояниях. //Хурнал микробиологии, эпидемиологии и иннунобиологии - 1991, N 5, стр 44 - 47. (Саидов Н. 3. .Гонес Л. А.. Ярцев Н. Н.. Мальцева Н. И., Еремина 0. Ф. , Шкарупета Н. А., Бутакон А. А., Пинегин Б. В.)

4. Применение теста восстановления нитросинего тетразолия для иммунологического скрипилнга/УТезисы докладов на VI Всероссийской съезде микробиологов,эпидемиологов и паразитологов, Н. Новгород,1991, Москва 1991 г. т г стр 217-218 (Бурая Т.Л.,Бутаков A.A., Никулин В.Н.)

5. Люминолзависимая хенилюминесценпия нейтрофилов периферической крови человека в до-и послеоперационном периоде у больных с желнока-ненной болезныо//Тезисы докладов на 1-ой научно-практической конференции "Многопрофильная больница-сегодня и завтра",Носква,1991 г, стр. 15-17 (Антонов И. А., Бутаков А. А., Бурая Т. Л.)

6.Использование методов оценки кислородзависиного метаболизма нейтрофилов периферической крови для дифференциальной диагностики острой бактериальной и вирусной инФекции//Советская недицина.199/ Н/2 стр.ЗГ-З? СЮшук Н. Д., Кузнецов В. Ф., Никулин В. Н., Кареткина Г. Н.. Бурая

Т. Л. , Бутаков А. А. , Коюденко Л. Г. )

7. Изненение активности ниелопероксидазы и кислой ФосФатазы в нейтрофилах периферической крови человека при стимуляции клеток in vitro.'//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 1991.

Н \0,ctp&-£S. (Бурая Т. Л., Бутаков А.А.,Дроженников В.А.,Никулин В. Н., Пинегин Б. В., Кшук Н. Д.)

S. СпектроФотонетгнческое определение адгезивной способности поли-морФноядериых лейкоцитов периферической крови. //Иммунология.1991,N 5 стр У/ж (Бутаков А. А., Оганезов В. К., Пинегин Б. В., Черноусов А. Д.) .

9.Изменение количества катионных белков в фагоцитирующих клетках при различных патологиях.//Тезисы докладов на 1-ой научно-практической конференции "Многопрофильная больница-сегодня и завтра" - Носква,1991. стр. 158-160 (Никулин В. II., Бурая Т. Л., Бутаков А. А.)

10. Комплекс стандартных и унифицированных тестов оценки функциональней активности Фагоцитирующих клеток//Тезисы докладов 1-го респ. ...яканского съезда иммунологов Узбекистана - Самарканд, 1991, стр

ПО -/// (Пинегин Б. В., Бутаков А. А., Бурая Т. /1.)

11. Фагоцитукое звено иммунитета у больных'с хронической герпетической инфекцией//Тезисы докладов на 1-ой научно-практической конференции "Многопрофильная больница-сегодня и завтра" - Носква,1991 стр. 5-7 (Алкеева А. Б., Борисова А. К., Бутаков А. А., Бурая Т. Л.)

12. функциональная активность нейтрофилов периФериче ской крови у

больных с бактериальной и вирусной инфекцией. //Тезисы докладов научно-практической конференции инфекционистов Азербайджана.Баку,1991, стр. (Юшук Н. Д., Кузнецов В. ф., Никулин В. II., Бурая Т. Л., Булга-

ков А. А. )

13. Фагоцитарное звено инмунитета у больных оперированных по поводу хронического калькулезиого холецистита. //Хирургия, 1992 ,N 1 стр. (Антипов И. А., Бурая Т. Л., Бутаков А. А., Говоров М. К., Кулаков А. В. )

14.The estimate of informationity of methods at complex research of Phagocytar part of immunity. //"Mononuclear phagocyte system in normal and pathological states" - Materials of all Union symposium with participation of foreign scientisis, HovosibirsK, 1990, p. 122-123 ISaidov M. Z., Pinegin В. V. .Eremina 0. F., Gomes L. A. .ButaKov A. A., Maltseva N. H., Scarupeta H. A., Yartsev H. N. .Oganesov V. M. )

/У/у/Л'/« Jсо