Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка инсектных аллергоидов

МУХТЕРЕМОВА

Гульсум Асановна

На правах рукописи

рГБ ОД

15 ДПР 2002

РАЗРАБОТКА ИНСЕКТНЫХ АЛЛЕРГОИДОВ (НА МОДЕЛИ АЛЛЕРГОИДНЫХ ФОРМ АЛЛЕРГЕНОВ ИЗ ТАРАКАНОВ И ИЗ КОМАРОВ)

14.00.36 - Аллергология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва 2002

Работа выполнена в Институте иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при Минздраве Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Федосеева В.Н.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Польнер А.А.

Кандидат биологических наук Радунская С.Ф.

Ведущая организация -

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится ЩО^цлЛ^д 200^ г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в Институте иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при Минздраве Российской Федерации по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при Минздраве Российской Федерации.

Автореферат разослан ^ ил^/и^ 200^ г.

Ученый секретарь диссертационного

совета доктор медицинских наук еславина Л.С.

Р26 6.^10 П

______________________________Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Сенсибилизация к инсектным аллергенам может иметь место при разных аллергических заболеваниях: бронхиальной астме, аллергодер-матозах и др. Укусы насекомых могут играть роль триггера в формировании бронхиальной астмы, анафилактического шока, крапивницы и других аллерогопатологий.

Среди больных атонической бронхиальной астмой (АБА) — жителей Москвы гиперчувствительность (ГЧ) к аллергенам тараканов выявлена у 33% пациентов (Т.Г. Федоскова, 1996), в Санкт-Петербурге -до 41% пациентов с бронхиальной астмой (БА). Распространенность аллергии к комарам составляет 15-20% среди больных, страдающих атопическими заболеваниями. Проблема инсектной аллергии к так называемым нежалящим насекомым актуальна и для многих регионов мира (С. Perez-Santos, 1995; S.M.J. Sienra-Monge, 2001).

Отсутствие отечественных диагностических и лечебных аллергенов из нежалящих насекомых (тараканов, комаров, жуков, моли и др.) является препятствием к своевременной диагностике, профилактике и специфической терапии (СИТ) аллергических состояний, обусловленных сенсибилизацией к указанным инсектным аллергенам.

Вышеизложенное определяет актуальность разработки эффективных диагностических и лечебных аллергенов из тараканов и комаров.

Разработка технологий получения диагностических и лечебных форм должна осуществляться в направлении снижения токсических и аллергических свойств нативных препаратов и повышения их имму-ногенной активности.

Опыт предшествующих исследований по модификации пыльцевых аллергенов показывает, что наиболее оптимальным способом снижения аллергенных свойств и повышения иммуногенности нативных экстрактов является их химическая модификация с использованием формальдегида для получения аллергоидов (D.G. Marsh 1970). Формальдегид достаточно успешно применяется какдетоксицирую-щее средство при создании анатоксинов. Учитывая высокую степень токсичности аллергенных фракций тараканов и комаров в качестве модификатора аллергенов был выбран формальдегид.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в создании технологий получения диагностических и лечебных (аллергоидных) форм аллергенов из тараканов

(Blattella gennanica, Periplaneta americana, Blatta orientalis) и комаров (Aedesaegypti).

В соответствии с постановленной целью были определены следующие задачи:

1. исследовать характеристики инсектнош сырья из тараканов (Blattella gennanica, Blatta orientalis, Psriplaneta americana), из комаров (Aedes aegypti) и осуществить паспортизацию экспериментальных образцов сырья;

2. выделить и изучить характеристики аллергенных фракций в составе инсектных аллергенов;

3. разработать технологию получения диагностической формы аллергена из тараканов;

4. усовершенствовать существующую модель диагностической формы аллергена из комаров;

5. разработать технологии получения лечебных аллергоидных форм аллергенов из тараканов и из комаров;

6. получить аллергоидные формы аллергенов из тараканов и из комаров по разработанной технологии;

7. оценить токсические свойства инсектных аллергенов и аллергоидов;

8. оценить специфическую аллергенную и гипосенсибидизирующую активность аллергоидных форм;

9. оценить иммуногенные свойства аллергоидов.

Научная новизна

Впервые охарактеризованы по ряду иммунохимических характеристик аллергены тараканов вида: Blatta orientalis. Показано, что наиболее выраженная аллергенная активность этого вида тараканов ассоциируется с фракцией, имеющей М.м.=67 ГО, которая квалифицирована как главный аллерген Blatta orientalis. Фракции с М.м.=40,92-98 kD, квалифицированы как минорные (малые) аллергены.

Изучение характеристик аллергенных компонентов в составе суммарных аллергенных фракций тараканов (САФ-Т) и комаров (САФ-К) позволило выделить оптимальные композиции главных и малых аллергенов для создания высокоэффективных лечебных форм аллергенов - инсектных аллергоидов.

Показано снижение специфических IgE связывающих свойств у инсектных аллергоидов, в сравнении с их нативными аналогами, что свидетельствует и о сниженном «риске» реакций анафилактического типа

при введении аллергоидов в организм. Результаты патоморфологичес-ких исследований позволили установить безопасность введения животным суммарных гипосенсибилизирующих доз инсектных аллергоидов.

Выявлена высокая иммуногенная активность аллергоидов, что является оптимальным показателем эффективности СИТ.

Научно-практическая значимость

Научно-практическая значимость настоящего исследования заключается в разработке новых отечественных технологий лечебных форм аллергенов (аллергоидов) из тараканов и из комаров, для специфической терапии аллергических заболеваний, обусловленных сенсибилизацией к указанным аллергенам.

1. На разработанный аллерген из комаров вида Aedes aegypti получено «Регистрационное удостоверение № 98/283/7 МЗ РФ». Препарат разрешен к медицинскому применению, промышленному выпуску. Получен «Регистрационный № 2001102525 от 19.03.2001 в Российском Агентстве по патентам и товарным знакам на препарат: Аллерген из комаров вида Aedes aegypti для диагностики».

2. Разработаны технологии получения:

1) отечественного диагностического аллергена из тараканов;

2) лечебной формы - аллергоида из тараканов;

3) лечебной формы - аллергоида из комаров.

Внедрение в практику

На основе разработанной технологии получения диагностического аллергена из комаров (Реестр МЗ - регистрационное удостоверение № 98/283/7), который внедрен в практику НКО Института иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при МЗ РФ, Института педиатрии МЗ РФ (аллергологическое отделение), аллергологи-ческого отделения 1-й городской клинической б-цыим. Н.И. Пирогова

Препарат диагностического аллергена из тараканов внедрен также в практику клинико-лабораторных работ Института иммунологии, для специфического обследования в тестах in vitro больных респиратор-но-аллергическими заболеваниями с ГЧ к аллергенам тараканов.

По результатам доклинического испытания диагностической формы аллергена из тараканов, составлена научно-техническая документация (НТД) для предоставления в ГИСК им. JI.A. Тарасевича МЗ РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанные технологии инсектных аллергоидов на основе главных и малых аллергенов тараканов и комаров, обладают преиму-

ществом при создании лечебных форм - инсектных аллергоидов для гипосенсибилизирукмцей терапии.

2. Доклинические испытания на животных аллергоидов из тараканов и из комаров, свидетельствуют о безопасности этих препаратов.

3. Специфическая IgE-связывающая активность аллергоидов снижена соответственно в 1,3 (аллергоид из комаров) и 1,5 раза (аллерго-ид из тараканов), по сравнению с немодифицированными формами аллергенов.

4. Иммуногенность аллергоидов из тараканов и из комаров превосходит в 3,0-3,2 раза показатели их нативных аллергенов (р<0,05).

Публикации

Основные результаты исследований изложены в 9 научных публикациях и доложены на: 1-ом Национальном конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и им-мунофармакологии» (Москва, 1997); II-ом Национальном конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 1998).

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на^страницах машинописного текста, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, заключение и выводы. Библиографический указатель включает ^/источников, изних#/оте-чественных и/ЛЪарубежных. Работа содержит рисунков и#.таблиц.

Содержание работы

1. Материалы и методы исследования

Получение^необходимого для изготовления водно-солевого экстракта (ВСЭ) из тараканов осуществлялось из инсектного сырья, в составе которого были тараканы видов: Blattella germanica; Periplaneta americana; Blatta orientalis и сырья из комаров вида: Aedes aegypti.

Культивирование тараканов и комаров для получения аллергена проводили по стандартной методике, разработанной сотрудниками инсектария на базе Института профилактической токсикологии и дезинфекции МЗ РФ совместно с Ю.Б. Поляковой. При культивировании инсектных особей полностью исключали их контакт с инсектицидами не менее, чем в 10 поколениях.

Идентификация (паспортизация) биологического сырья осуществлялась по видоспецифическим морфофункциональным признакам, характерным для комаров вида: Aedes aegypti и для тараканов видов:

—Blattella germanica; Periplaneta americana; Blatta orientalis неспециалистами инсектария Института профилактической токсикологии и дезинфекции МЗ РФ (Паспорт№127, №432 Инсектария НИИ ПтиД МЗ РФ).

- Определение видовой принадлежности синантропных видов тараканов производили по определителю Б.М. Мамаева и соавт.(1976).

- Биологическое сырье из комаров (БСК) и из тараканов (БСТ) сохранялось при -70 С.

Выделение главных и минорных (малых) аллергенов из БСТ и БСК

• Получение водно-солевых экстрактов из биологического сырья включало 3 этапа: 1) обезжиривание (обработку эфиром); 2) экстрагирование белков из БСТ - по методу A. Coca (1922) в модификации Н. Lowenstein (1995), а из БСК - по В,Н. Федосеевой, Г.А. Мухтеремовой (1998); 3) диализ.

Изготовлено 5 серий из БСК и 6 серий из БСТ.

• Фракционирование ВСЭ и выделение главных и минорных (малых) аллергенов.

• Разделение ВСЭ из комаров (ВСЭ-К) и ВСЭ из тараканов (ВСЭ-Т) на фракции проводили методом восходящей гель-хроматографии (G. Determan 1982). Работа осуществлялась на колонках с декстриновым гелем Sefadex G-100 (Pharmacia Fine Chemicals АВ. Швеция). Абсорбцию фракций осуществляли автоматически при 254 нм на абсорбометре фирмы LKB Uvicord II.

• В целях определения белковой природы и молекулярной массы антигенов экспериментальных ВСЭ и выделенных главных аллергенов тараканов и комаров использовали электрофорез в полиакрила-мидном геле (SDS-PAGE) с окрашиванием по Кумасси в соответствии с методикой, предложенной U.K Laemmli. (1970) и модернизированной!. Kyhse-Andersen (1984). Определение молекулярной массы фракций осуществляли в электрофорезе с использованием стандартного набора белковых маркеров.

• Определение содержания белка в исследуемых материалах ВСЭ-К, ВСЭ-Т, СБФ-К, СБФ-Т, САФ-К, САФ-Т, АЛД-К, АЛД-Т - по методам О.Н. Lowry (1951) и М.М. Bradford (1976).

• Анализ аллергенной структуры ВСЭ проводили методом иммуноблоттинга, со специфическими IgE-антителами образцов банка специфических сывороток крови. Постановку иммуноблоттинга проводили по оригинальной методике, предложенной В.Г. Авдиенко (1992) в 2 этапа: 1). проводили разделение компонентов ВСЭ по ихэлектрофо-

ретической подвижности методом электрофореза в ПААГ с окрашиванием по Кумасси (Laemmli U.K., 1970); 2). осуществляли оценку специфической активности отдельных фракций аллергена способом имму-ноблоттинга. Работа проводилась совместно с лабораторией химии генов Института биоорганической химии АН России им. М.М. Шемякина и Ю А. Овчинникова (проф., В.К. Коробко и к.х.н., О.В. Некрасова) с образцами сывороток крови больных с гиперчувствительностью к аллергенам комаров или тараканов, входящими в состав банка сывороток.

• Формирование банка сывороток, обладающих специфической IgE -связывающей активностью с аллергенами из комаров и из тараканов. Подбор образцов для создания банка сывороток (БС) осуществлялся в процессе специфического аллергологического обследования больных атопическими заболеваниями с гиперчувствительностью к комарам или тараканам (к.м.н., Т.Г. Федоскова). Аллергологическое обследование включало определение специфических IgE-антител в сыворотках крови больных с инсектной аллиргией. Обследовано 254 пациента, из которых в сыворотках 22 выявлены высокие уровни (3-4 класс) специфических IgE-антител к комарам и у 25 - к тараканам.

• Оценка специфической IgE-связываюхцей активности аллергенов осуществлялась в ИФА по D Walsh 1994, а также хемилюминесцентным методом на стандартных тест-системах (MAST-CLA Immunosystems). В работе использованы коммерческие формы инсектных аллергенов фирмы BAYER, MILES, а также стандартный коммерческий аллерген из комаров (ВФС-42-3131-98) производства Института иммунологии МЗ РФ - «Медалл».

• Контроль токсичности и безвредности проводили по методикам, описанным в ГФ СССР, М., 1998, т. XI, ч.2, с.182-183.

Анализ гипосенсибилизирующих свойств аллергенов и аллергоидных форм

Исследование гипосенсибилизирующих свойств аллергоидов (АЛД) и ВСЭ осуществляли в опытах на 300 мышах, весом 18-20 г (линия ВаЙ>/с).

• Сенсибилизацию мышей осуществляли 2-кратно специфическим нативным аллергеном (ВСЭ) с интервалом в 7 дней, внутрибрюшин-ным введением ВСЭ в дозе 20 мкг по белку на 1 животное, в смеси с адъювантом - А1(ОН)з.

• Оценка гипосенсибидизируюцщ свойств аллергоидных форм и нативных аллергенов. На 21 день от начала сенсибилизации, осуществляли оценку уровней гомоцитотропных антител (ГЦА) в сыворотках сенсибилизированных мышей путем пассивной кожной анафилак-

сии (по A. Ovary, 1956) на коже крыс. При наличии выраженных показателей (реакции в d=2,5 см) проводили инъекции гипосенсибилизи-рующих доз аллергена, аллергоида и физиологического раствора по схемам, разработанным в лаборатории аллергенов ГНЦ Института иммунологии МЗ РФ (табл.1).

Табл.1. Схема проведения гипосенсибилизашш лабораторным животным

№ группы Количество животных Вид вводимого препарата

1 60 ВСЭ из комаров

2 60 Аллергоид комаров

3 60 ВСЭ из тараканов

4 60 Аллергоид тараканов

5 60 Физиологический раствор

• Анализ иммуногенных свойств аллергенов и аллергоидных форм. Исследование способности АЛД-К и АЛД-Т стимулировать синтез специфических IgG-антител проводили при однократном внутрибрю-шинном введении по 100 мкг по белку на одно животное АЛД-К (60 интактных мышей - 2 группа), ВСЭ-К (60 интактных мышей - 1 группа), АЛД-Т (60 интактных мышей - 4 группа), ВСЭ-Т (60 интактных мышей - 3 группа) и контрольная группа - физиологический раствор (60 интактных мышей - 5 группа).

Уровни содержания IgG - антител в сыворотках крови мышей измеряли дважды на 8 и 21 день от начала иммунизации методом ИФА с использованием моноклональных антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена («Полигност», Россия).

• Статистический анализ. Полученные результаты обрабатывались на IBM совместимом персональном компьютере с применением прикладных программ Excel 97. Достоверность различий результатов проводилась с использованием Т-критерия Стьюдента. Различия считали достоверным и при р< 0,05.

2. Результаты исследования

Разработка инсектных аллергенов

На первом этапе работы задача исследований сводилась к получению экологически чистого нативного инсектного сырья для приготовления аллергенов и их аллергоидных форм. Проведен

предварительный подбор наиболее актуальных для России видов насекомых (В.П. Дремова 1964, С.А. Рославцева 1990, Т.Г.Федос-кова 1996). Это тараканы видов: Blattella germanica; Periplaneta americana; Blatta orientalis. К числу актуальных для России видов (А.Д. Адо и соавт. 1985-1987), относятся и комары вида Aedes aegypti.

Следует отметить, что в существующей Международной Номенклатуре Аллергенов (IUIS, 1999), аллергены тараканов вида: Blatta orientalis вообще не представлены. В связи с этим в процессе исследований особое внимание в изучении аллергенов тараканов было уделено именно структуре аллергенов этого вида насекомых.

Задача данного исследования на 1™ этапе сводилась к отбору качественных инсектных образцов для формирования сырья.

Полутени? и анализ еырм из комаров рила; Aedes aegypti- Установлено полное соответствие признаков инсектных особей видовым особенностям Aedes aegypti. Оформлен паспорт на каждый инсект-ный образец.Перед экстрагированием оценивалась однородность и гомогенность сырья.

• Получение и анализ сырь? вд тараканов видрр; Blattella germanica, Periplaneta americana и Blatta orientalis. Изучение морфофункциональ-ных особенностей тараканов (по Б.М. Мамаеву и соавт. (1976), позволило установить их видовую принадлежность к трем видам: Blattella germanica; Periplaneta americana; Blatta orientalis. Оформлены паспорта на каждый вид инсектного сырья.

Получение водно-солевых экстрактов из инсектного сырья

Цель следующего этапа работы заключалась в выборе оптимальных условий для полноценного выделения аллергенных фракций из гомо-гената указанных видов насекомых, в том числе подбор оптимального рН при выделении аллергенов.

• Получение ВСЭ из комаров (ВСЭ-Ю.

Получение экспериментальных серий водно-солевых экстрактов из комаров вида: Aedes aegypti проводилось по оригинальной технологии (В.Н. Федосеева, Г.А. Мухтеремова, 1995-96).

Из полученного сырья приготовлены 5 серий водно-солевых экстрактов (ВСЭ-К) из комаров Aedes aegypti.

• Получение ВСЭ из тараканов (ВСЭ-ТУ

В связи с тем, что в литературе не существует единого мнения относительно режимов экстрагирования белковых фракций аллергенов из тараканов, в данной работе предстояло выполнить этот

этап исследований. Были использованы: классический метод щелочного экстрагирования по Coca и метод экстрагирования в условиях нейтрального и кислого рН. Проведенная сравнительная оценка ВСЭ-Т, полученных на разных экстрагирующих жидкостях, количественному содержанию белка и по специфической активности, позволила выявить преимущество щелочной экстракции, с помощью которой удалось получить наивысший выход аллергенных белков (29 ООО PNU, 30 ООО PiNU). Степень их специфической IgE-связывающей активности оказалась наивысшей, равной М±т=3,8±0,3 кл. в ИФА, р < 0,05. При сравнении специфической активности ВСЭ-Т на щелочной жидкости Coca и коммерческого аллергена фирмы BAYER выявлена почти идентичная степень специфического их IgE-связывания с образцами специфических сывороток р < 0,01.

У 90% образцов ВСЭ, полученных методом щелочного экстрагирования из инсектного сырья, выявлена высокая специфическая IgE-связывающая активность.

Получение суммарной белковой фракции (СБФ) из ВСЭ-К и ВСЭ-Т

Осуществляли обработку ВСЭ из комаров вида: Aedes aegypti сульфатом аммония, до получения СБФ-К. Проводили также обработку ВСЭ тараканов видов: Blattella germanica; Periplaneta americana; Blatta orientalis до получения СБФ-Т по той же технологии.

• Изучение иммунохимических и аллергенных характеристик

СБФ-Кч СБФ-Т,

В связи с тем, что в данной работе стояла задача не только выделения, но и подробного ан&таза аллергенных свойств инсектных аллергенов, были выполнены следующие этапы исследования:

1) изучение фракционного состава инсектных СБФ методом восходящей гель-хроматографии по G. Determan (1982);

2) выявление аллергенных фракций.

1. Осуществляли препаративное разделение компонентов СБФ-Т на

фракции в соответствии с их размерами, формой и молекулярными массами. Эксперимент проводился с использованием метода восходящей жидкостной гель-хроматографии, калибровочный график строился с использованием набора белков-маркеров и декстрана с известными молекулярными массами: цитохром С (Mr 12,4 kD); бычья карбоангидраза (Mr29 kD); бычий альбумин (Mr 66 kD); голубой дек-стран (Mr2000 kD).(Pnc. 1).

Условия фракционирования:

Масса пробы 80 мг

Объем нанесения 8 мл

Концентрация пробы 10 мг/мл

Параметры колонки «Pharmacia» 26 мм х 650 мм

Сорбент Sephadex G-100

Элюент 0,5 М трис-HCl буфер

Скорость элюции 12 мл/час

Температура 20-22 "С

Рис. 1. Профиль элюции при проведении гель-фильтрации ВСЭ из смеси тараканов видов Blatta orientalis, Feriplaneta americana и Blatella germanica на геле Sephadex G-100 (I - выход вещества с Mr > 100 kD, II - выход фракции с Mr 92 -95 kD, III выход фракции с Mr 35-36 kD, IV выход фракции с Mr 21-27 kD, V выход вещества с Mr < 5 kD).

Показано, что в структуре СБФ-Т присутствуют фракции, специфическое IgE-связывающая активность которых, более 50% (согласно требованиям IUIS) выявлено у фракции с М.м.=72-78 kD.

78,0 i&fewräis

66,2 v « v

42,7

36,0

16,9 12,4

Рис. 2. Результат разделения СБФ тараканов Blattella germanica на фракции методом электрофореза в ПААГ с окрашиванием по Кумасси. Разделение СБФ на 6 пептидных фракций в пределах 12-78 kD.

На следующем этапе исследований проводилось разделение СБФ комаров и СБФ тараканов на отдельные фракции методом постановки электрофореза в ПААГе (рис. 2)

Разделение компонентов ВСЭ по их электрофоретической подвиж-иости осуществляли методом электрофореза в ПААГ с окрашиванием по Кумасси (U.K. Laemmli, 1970). Определение молекулярной массы фракций осуществляли в соответствии с калибровочной кривой, по-тученной на основе электрофоретического разделения белков-марке-юв (фосфорилаза - 94000, БСА - 67000, овальбумин - 43000, carbonic ranhydrase -30000, soybean trypsim inhibitor -20100 и lactalbumin-14400.

2. Выявление аллергенных фракций осуществлялось методом ИФА я иммуноблотгинга по интенсивности их специфического IgE-связы-ваиия с образцами БС.

Фракции в диапазоне 16,9-36 kD отличались высокой I gE-связы-зающей активностью. В процессе работы были выделены фракции в ;оставе СБФ Blattella germanica с указанными молекулярными массами. СБФ-Т Periplaneta americana включала фракции имеющие молекулярные массы в диапазоне 72-78 kD. Как показали наши результаты то специфическому IgE-связыванию и критериям Номенклатуре IUIS, эти фракции могут быть отнесены к главным аллергенам.

Особый интерес представлял электрофоретический анализ композитов СБФ, относящихся к аллергенному началу Blatta orientalis, ибо в Номенклатуре IUIS, аллергены этого вида тараканов не представлены.

Разделение компонентов СБФ-Т по их электрофоретической под-зижности методом электрофореза в ПААГ с окрашиванием по Кумасси тозволило разделить суммарные белки СБФ-Т Blatta orientalis на

отдельные фракции с учетом их молекулярных масс. В эксперименте выявлено 6 полипептидных фракций СБФ-Т (в пределах молекулярных масс от 20 до 80 kD). Аллерген с М.м.= 67kD показал специфическое IgE-связывание более, чем с 90% образцов БС, квалифицировали как главный аллерген Blatta orientalis.

• Выделение главных аллергенов из СБФ-К. Препаративное разделение СБФ из комаров рода Aedes на фракции в соответствии сих свойствами (природа, размер, форма, молекулярная масса и др.) проводили также методом восходящей жидкостной гель-хроматографии.

Фракционирование СБФ с использованием реактивов, декстраново-го геля Sefadex G-100 и набора белковых маркеров производства фирмы «Pharmacia». Тип геля был подобран с учётом максимальной молекулярной массы вещества, способного войти в зерно геля (150.000) и предположительного интервала молекулярных масс фракционированных молекул (5.000- 150.000). В процессе фракционирования было выделено 5 пиков (фракция№1-более 150kD, фракция№2- 60-68 kD, фракция №3 - 44-58 kD, фракция № 4 - 20-38 kD, фракция №5 -менее 10kD), из которых было сформировано 5 фракции для их последующего изучения. После оценки IgE-связывающей активности этих фракций с образцами БС, была сформирована на основе активных аллергенов суммарная аллергенная фракция (САФ-К) - основа для создания аллергоидных форм комаров, (рис.3)

В минорная М"4* м-м=

И балластная 160kD 68И> 58kD 38kD 10-12ИЭ

Фракции

Рис.3. Интенсивность специфического IgE-связывания с отдельными фракциям» СБФ комаров впда Aedes aegypti с сыворотками кровн лиц, страдающих ГЧ к комарам, (%).

Ü главная

№1- Nfi- №3- №4- №б-

Подбор оптимальных соотношений аллергенов разных видов тараканов для получения композиции суммарной аллергенной Фракции (САФ)

№ Ь №»2 - N93 - Ns4 -М.м.= 65 М.м.= 60 М.м.= 36 М.м.*21-kD kD kD 27 kD

Ф p а к ц и и

Рис. 4. Интенсивность специфического IgE-связывании с отдельными фракциями СБФ тараканов вида Blattella germanica с сыворотками крови лиц страдающих ГЧ к тараканам, (%).

№1- №2- №3- № 4 -М .м .= 90 М .м .= 72- М.м.= М.м.= kD 78 kD 55kD 37kD

Фракции

Рис.5. Интенсивность специфического IgE-связывания с отдельными фракциями СБФ тараканов вида Periplaneta americana с сыворотками крови лиц, страдающих ГЧ к тараканам, (%).

0,8

f 0,6

| °'4

d 0,2 0

№1 - №2 - №3-

M.m.=92-98KD M.M.=67KD M.M.=40KD

Фракции

Рис.6. Интенсивность специфического IgE-связывания отдельными фракциями СБФ тараканов вида Blatta oriental] с сыворотками крови лиц, страдающих ГЧ к тараканам. (%).

Изучены различные соотношения главных и минорных (малы? аллергенов тараканов разных видов в составе суммарных белковы фракций (СБФ-Т). Подбор аллергенных фракций при формировали САФ-Т осуществлялся с учетом специфической IgE-связывающе активности главных и малых аллергенов каждого вида насекомые Сравнивали как интенсивность, так и количественные показатели Igí связывания с образцами в составе БС. (рис.4,5,6,). Главные аллерген] всех трех видов тараканов (Blattella germanica, Periplaneta americana Blatta orientalis) оказались чрезвычайно активными и были введены САФ-Т в соотношении 1:1:1. Малые аллергены оказались мене активными и показатели процента связывания с образцами колебался с 25 до 40%. В связи с этим подбор малых аллергенов осуществлялс индивидуально, для каждого вида аллергоида, с учетом их IgE связывающих характеристик. САФ, послужившая источником создали аллергоидных форм, состояла из главных аллергенов трех указанны видов тараканов и была дополнена наиболее активными малым аллергенами. По такому же принципу формировали САФ комаров.

САФ служила основой для дальнейшей модификации и получения аллергоидов, но в немодифицированной форме служил диагностическими препаратами.

Разработка инсектных аллергоидов.

Известно, что аллергоидами называют химически модифицирован' ные аллергены, предназначенные для терапии ряда аллергических за

болеваний. Что касается инсектных форм, то практически вопрос создания их вообще и на формальдегидной основе, в частности, не изучен. Вместе с тем известно, что, например, токсины, в частности Blatta orientalis на 90% имеют белковую природу (L.M. Roth, D.W. AIsop, 1978), в связи с этим детоксикация формальдегидом является наиболее оптимальным способом снижения токсичности препаратов и повышения степени их безопасности. При изготовлении инсектных аллерго-идов (на модели тараканов и комаров) в качестве основного модификатора был выбран - формальдегид. В литературе метод получения инсектных аллергоидов из названного инсектного сырья не представлен.

Инсектные аллергоиды разработанные на основе САФ.

• Разработка метода получения аллергоида из комаров (АЛД-К).

Первая стадия получения аллергоида сводилась к инкубации аллергенного белка формалином. Вторая стадия - полимеризации указанного белка. Третья стадия имела целью стабилизацию аллергоида раствором NaBH4. Наконец, на четвертой стадии осуществлялся диализ. Последующие три этапа включали контроль препарата: определение остаточного формалина; лиофильное высушивание; определение белка. Сравнительная оценка специфической IgE-связывающей активности аллергоида и нативного препарата САФ осуществлялась на восьмой стадии изготовления АЛД-К методом ИФА. (табл.2) По указанной схеме обработано 5 серий САФ-К.

Табл.2. Результаты специфического IgE-связывания АЛД-К и САФ-К с образцами БС.

аллерген/аллергоид Специфическая IgE-связывающая активность с образцами БС (ELISA) (класс реакции, М ± т)

АЛД-К серия №

серия М1 1,2 ±0,2 класс

серия №2 1,5 ±0,2 класс

серия №3 1,1 ±0,1 класс

серия №4 1,4 ±0,2 класс

серия №5 1,5 ±0,1 класс

САФ-К серия №

серия № 1 3,9 ±0,1 класс

• Разработка метода получения аллергоида из тараканов (АЛД-Т).

В задачу исследования входила разработка метода получения АЛД-Т на основе САФ-Т, содержащей главные и минорные аллергены тараканов видов: Blattella germanica; Periplaneta americana; Blatta orientalis.

За основу также был выбран ступенчатый подход для получения аллергоида, именно этот подход дает возможность максимально сохранить нативные свойства аллергенного белка, при одновременной блокаде ^Е-связывающих эпитопов.

По указанной схеме обработано 6 серий САФ-Т.

В конце 7 этапа образцы полученных серий изучены по степени 1ёЕ-связывающей активности с сыворотками в составе БС. Показано, что в образцах всех шести серий АЛД-Т способность к 1§Е связыванию снизилась, в сравнении с таковой у суммарной фракции нативных аллергенов р<0,05. (табл.3)

Табл.3. Результаты специфического IgE-связывания АЛД-Т и САФ-Т с образцами БС.

аллерген/аллергоид Специфическая IgE-связывающая активность с образцами БС (ELISA) (класс реакции, М ±т)

АЛД-Т серия №

серия №1 1,3 ±0,2 класс

серия №2 1,4 ±0,1 класс

серия №3 1,2 ±0,1 класс

серия №4 1,5 ±0,2 класс

серия №5 1,4 ±0,2 класс

серия №6 1,1 ±0,2 класс

САФ-Т серия №

серия № 1 3,9 ±0,2 класс

В итоге полученные аллергоиды представляли собой сухие препараты в виде воздушного порошка светло-коричневого цвета.

Изучение гипосенсибилизирующих и иммуногенных свойств ин-сектных аллергенов и их аллергоидных форм.

• Сравнительный анализ гипосенсибилизирующих свойств ин-сектвых аллергенов и их.аллергоиднмхФорж

Изучение гипосенсибилизирующей (терапевтической) ценности полученного препарата проводили в эксперименте на мышах (Ва1Ь/с, самки, вес 18-20 г).

Трем группам (по 20 животных в каждой) мышей проводили сенсибилизацию (на 1 и 7 день от начала эксперимента) с использованием ВСЭ-К, внутрибрюшинно по 0,5 мл, включающего 400 мкг гидроокиси алюминия и ВСЭ-К комаров, из расчёта 20 мкг белка на 1 мышь, контролем служила группа, которым вводили физ. раствор, внутрибрюшинно по 0,5 мл, включающего 400 мкг гидроокиси алюминия.

Трем другим группам (по 20 в каждой) животных проводили сенсибилизацию ВСЭ-Т, внутрибрюшинно по 0,5 мл, включающего 400

мкг гидроокиси алюминия и ВСЭ-Т, из расчёта 20 мкг белка на 1 мышь, — контролем служила группа, которым вводили физиологический раствор внутрибрюшинно по 0,5 мл, включающего 400 мкг гидроокиси алюминия.

На высоте сенсибилизации, с 21 дня от начала эксперимента (с 1 -ой сенсибилизирующей инъекции аллергеном ВСЭ-К) проводилась ги-посенсибилизация разными препаратами. При сенсибилизации ВСЭ-К, гипосенсибилизация мышей осуществлялась препаратами соответс-венно САФ-К (1 гр.), АЛД-К (II гр.), физ. раствор (контроль). При сенсибилизации мышей ВСЭ-Т, гипосенсибилизация проводиласть препаратами САФ-Т (I гр.), АЛД-Т (II гр.), физ. раствор (контроль).

Оценка гипосенсибилизирующей активности осуществлялась по показателям динамики специфических (1яО-блок)-антител в ИФА.

Максимальный уровень специфических (1яО-блок)-антител был зарегистрирован в группе животных, получавших препарат АЛД-Т и АЛД-К.

Выявлено увеличение показателей специфических (^С-блок)-ан-тител при гипосенсибилизации аллергоидами в 1,5 раза в сравнении с активностью нативной формы аллергена из тараканов САФ-Т и в 1,3 раза в сравнении с активностью нативной формы аллергена из комаров САФ-К. (рис.7,8).

—я— интактныв

Рис.7. Показатели динамики уровней специфических (^б-блок)-ан-тител в сыворотках крови мышей, сенсибилизированных нативным аллергеном при гипосенсибиллизации САФ-К, АЛД-К и физ. раствором (контрольная группа).

-«— САФ-Т -Х-АЛД-Т

-м-с.Исиб«п«»Ро..ини. Дни, от начала ГС

■ кнтктны»

Рис.8. Показатели динамики уровней специфических (^б-бдок)-ан-тител в сыворотках крови мышей, сенсибилизированных нативным аллергеном при гипосенсибиллизации САФ-Т, АЛД-Т н физ. раствором (контрольная группа).

Представленные результаты свидетельствуют о более высокой (по сравнению с ВСЭ) способностью АЛД-Т и АЛД-К стимулировать специфический -ответ в процессе гипосенсибилизации.

Сравнительная оценка 1§Е-связывающей активности аллергена из тараканов и его аллергоидной формы позволила установить снижение аллергенной активности у аллергоидной формы в 1,5 раза (р< 0,05) и сравнительная оценка аллергенной активности из САФ-К и его аллергоидной формы позволила установить снижение аллергенной активности у аллергоидной формы препарата в 1,3 раза.

Изучение иммуногенных свойств АЛД-Т и АЛД-К

Оценка иммуногенных свойств АЛД-Т и АЛД-К оценивали по способности стимулировать -ответ при однократном введении имму-ногенной дозы препарата (100 мкг на 1 мышь). Изучение иммуноген-ности осуществлялась в опытах на 4 группах мышей (ВАЬВ/с). Двум группам мышей вводили соответственно I группе САФ-Т и АЛД-Т -II группе животных. Двум другим группам вводили соответственно САФ-К (III группа) и АЛД-К (IV группа).

После окончания эксперимента животных забивали с целью получения необходимого количества сыворотки крови. Изучение уровней специфических ^-антител в сыворотках крови мышей проводилось до начала иммунизации и на 22 день от начала иммунизации в ИФА, с использованием моноклональныханти-1§0-антител. Результаты представлены на рисунке 9.

ДО н иммунизации

22 суток

Дни после иммунизации

□ САФ-К ЕЗАЛД-К ЫФР

Рис.9, Показатели уровней специфических ^-антител в сыворотках крови мышей ори иммунизации АЛД-К и нативными аллергенами комаров (САФ-К), физ. раствор (контрольная группа).

о

до начала иммунизации

2 2 сутки

Дни поело иммунизации

ОВСЭ-Т 0АЛД-Т ИФР

Рис.10. Показатели уровней специфических ^в-антител в сыворотках крови мышей при иммунизации АЛД-Т и нативными аллергенами тараканов (САФ-Т), физ. раствор (контрольная группа).

Введение мышам внутрибргошинно препарата АЛД-Т и АЛД-К вызывало стойкий эффект стимуляции выработки специфических 1§0-антител, в 3,2-3,0 раза превышающий эффект при введении препарата САФ, что свидетельствует о его более выраженной, по сравнению с САФ 1вО-стимулирующей активности.

Доклиническое изучение безопасности применения аллергена САФ-Т, аллергоида АЛД-Т и аллергена САФ-К, аллергоида АЛД-К.

В условиях доклинических испытаний оценивали безопасность разработанного АЛД-Т, САФ-Т и САФ-К, АЛД-К.

Изучение безопасности осуществляли в соответствии с РД-42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения», с Санитарными правилами (СП 3.3.2.561-96), «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов» 1998 г. и требованиями Фармакологического государственного комитета к изучению общетоксического действия новых лекарственных препаратов.

Исследование проводили с использованием лиофилизированной формы САФ-Т и АЛД-Т, САФ-К и АЛД-К на мышах (CBAxC57BL/ 6) F, 120 особей.

программа доклинического изучения безопасности применения аллергоида из тараканов и аллергоида из комаров включала в себя оценку острой токсичности.

Аллергоид из тараканов (АЛД-Т) и аллергоид из комаров (АЛД-К) предназначен для проведения специфической иммунотерапии, аллерген из тараканов (САФ-Т) и усовершенствованный аллерген из комаров (САФ-К) предназначен для специфической диагностики. Курс специфической иммунотерапии аллергоидом состоит из 20-25 инъекций и показан больным с аллергией к тараканам и с аллергией к укусам комаров. Общая курсовая терапевтическая доза препарата 3,6 мг. Максимальная разовая терапевтическая доза препарата 10000 PNU (содержит 0,625 мг белка).

Выбор экспериментальных животных, доз и схем изучения аллергоида в остром эксперименте определялся требованиями комитета по МИБП и ФГК, природой препарата, терапевтическими дозами и длительностью курса клинического применения.

Конкретно схемы гипосенсибилизации, а также дозы препаратов обоснованы.

• Определение безопасности САФ-Т. АЛД-Т и САФ-К. АЛД-К -по ГФ СССР вып.2, с. 182, при этом ориентировались на суммарные дозы препаратов вводимых в течение всего курса инъекций.

Изучение безопасности аллергоидов проведено на 120 мышах самцах (CBAxC57BL/6)F, массой 20-25 г. при однократном внутрибрю-шинном введении в дЬзах 600, 800,1000 и 1500 мг/кг. На каждую дозу использовали 6 мышей. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор. Наблюдения за животными проводили в течение 7 дней. Следили за поведением, внешним видом, изменением массы тела животных. На 8 сутки мышей забивали. Определяли массовый коэффициент внутренних органов, проводили патоморфологи-ческие исследования. Взятие материала для патоморфологического ис-

следования проводили в соответствии с требованиями РД 42-28-8-89. Вычисляли коэффициенты масс (процент от массы тела) сердца, печени, почек, надпочечников, тимуса, селезенки, семенников, легких. Осуществляли статистический анализ коэффициентов масс внутренних органов, достоверность полученных результатов оценивали с помощью t критерия Стъюдента. Осмотр и обследование животных групп, получавших аллерген из тараканов, аллергоид тараканов и аллерген из комаров, аллергоид комаров в дозах: 600, 800,1000,1500 мкг/'кг показал следующее. Внешний вид мышей, состояние шерсти, кожных покровов и скелета в подопытных группах с аллергоидами не отличались от контроля. В точках введения инсектных аллергоидов (кожа, подкожная клетчатка, мышцы) подопытным животным, признаки деструкции и воспаления тканей отсутствовали.

Результаты показали, что токсичностью аллергоиды не обладают,

ВЫВОДЫ

1. Разработанная технология получения аллергенов из тараканов (Blattella germanica; Periplaneta americana; Blatta orientalis) и комаров на основе главных и минорных (малых) аллергенных фракций, позволяет получить диагностические формы инсектных аллергенов для специфической диагностики аллергических заболеваний, обусловленных сенсибилизацией к указанным видам насекомых.

2. Главными аллергенами Blatta orientalis являются белки с M.M.=67kD, минорными аллергенами - белки с М.м.= 40 и 92-98 kD.

3. Разработанная технология получения инсектных аллергоидов (на модели аллергоидных форм аллергенов из тараканов), позволяет получить лечебные формы, обладающие преимуществом гипосенси-билизирующей активности, в сравнении с нативными аллергенами.

4. На основе данных патоморфологических исследований, показана безопасность введения суммарных «гипосенсибилизирующих» доз J LT) животным.

5. Специфические IgE- связывающая активность аллергоидов снижена соответственно в 1,3 (аллергоид из комаров) и 1,5 раза (аллерго-ида из тараканов), по сравнению с немодифицированными формами инсектных аллергенов.

6. Иммуногенность аллергоидов превосходит в 3,0-3,2 раза показатели нативных инсектных аллергенов (р<0,05).

7. Инсектные аллергоиды (аллергоид из комаров и аллергоид из тараканов) могут быть рекомендованы для клинических испытаний на ограниченном контингенте больных с гиперчувствительностью к указанным видам инсектных аллергенов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Мухтеремова ГЛ. Тараканы - один из важных источников аллергенов человека.// Тезисы докладов 1 -го Симпозиума МААКИ. «Актуальные проблемы практической аллергологии и клинической иммунологии». Москва, 1995, с.52.

2. Мухтеремова Г.А., Федоскова Т.Г., Федосеева В.Н., Прокопенко В.Д. Структура и функции аллергенов тараканов.// Сборник трудов 1-го Конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии». Москва, 1997, с.616.

3. Федоскова Т.Г., Иванов В.Д., Мухтеремова Г.А. Внутрижшшщ-ные инсектные аллергены. // Врач, 1998, №6, с.12-13.

4. Федоскова Т.Г., Иванов В.Д., Мухтеремова ГЛ. Аллергические реакции к внутрижилищным инсектным аллергенам у больных рес-пираторно-аллергическими заболеваниями. // Сборник трудов 2-го Конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии». Москва, 1998, с.700.

5. Иванов В.Д., Федоскова Т.Г., Мухтеремова Г.А.Перекрестные аллергические реакции к внутрижилищным инсектным аллергенам у больных атопической бронхиальной астмой. // Сборник трудовУ-го Национального Конгресса «Человек и лекарство». Москва, апрель, 1998, с. 225.

6. Федоскова Т.Г., Иванов В .Д., Мухтеремова ГЛ.Гиперчувствительность к внутрижилищным инсектным аллергенам у больных бронхиальной астмой. // Сборник трудов 1-го Международного Конгресса «Интерастма 98» Москва, октябрь, 1998, с.123.

7. Fedoskova Т., Ivanov V., Muhteremova G. The specific IgE- response to bee and wasp allergens in patients with allergic diseases. // XVIIIth Congress of the EAACI, Brüssel, 03.07.1999, p. 408.

8. Иванов В.Д., Федоскова Т.Г., Орлова И.А., Мухтеремова ГЛ. Разработка аллергоидов на основе комплекса модифицированных аллергенов тараканов. // Сборник трудов 3-го Конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии». Сочи, 2000, с. 42.

9. Мухтеремова Г.А., Федосеева В.Н, Лункина Е.В. Инсектные ал-лергоиды. // Сборник трудов 4-го Конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии». Москва, 2001, том 2, с.559.

Список принятых сокращений-----------

АБА - атопическая бронхиальная астма.

algE - аллергенспецифические IgE.

АЛД - аллергоид.

АЛД-К - аллергоид комаров.

АЛД-Т - аллергоид тараканов.

БА - бронхиальная астма.

БС - банк сывороток.

БСТ - биологическое сырье тараканов.

БСК- биологическое сырье комаров

ВСЭ - водно-солевой экстракт.

ВСЭ-К - водно-солевой экстракт из комаров.

ВСЭ-Т - водно-солевой экстракт из тараканов.

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа.

ГНТ - гиперчувствительность немедленного типа.

ГЧ - гипер чувствительность.

ДП - домашняя пыль.

1UIS - Международная Номенклатура аллергенов.

ИФА - иммуноферментный анализ.

ОП - оптическая плотность.

PACT (RAST) — радиоаллергосорбентный тест.

СБФ - суммарная белковая фракция.

СБФ-К - суммарная белковая фракция из комаров.

СБФ-Т - суммарная белковая фракция из тараканов.

САФ - суммарная аллергенная фракция.

САФ-Т - суммарная аллергенная фракция из тараканов.

САФ-К - суммарная аллергенная фракция из комаров.

CLA-MAST- Immune System, Inc., USA — хем. лабораторный анализ.

ПААГ - полиакриламидный гель,

ФБР - фосфатно-буферный раствор Эванс-Кока-Мильфорда.

ФР - физиологический раствор.

ЩЖК- щелочная жидкость Кока (A. Coca).

Проблема инсектной аллергии представляет собой одну из актуальных проблемы современной аллергологии.

Сенсибилизация к инсектным аллергенам может иметь место при разных аллергических заболеваниях: бронхиальной астме, аллергодерматозах, укусы насекомых могут играть роль триггера в формировании бронхиальной астмы, анафилактического шока, крапивницы и других аллерогопатологий. Тяжесть, острота проявления этих состояний (вплоть до летального исхода) ставит исследователей перед необходимостью разработки безопасных лечебных аллергенов, которые могут быть использованы для диагностики и аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) инсектной аллергии. Вместе с тем отсутствие необходимых диагностических и лечебных форм аллергенов в аллергологической практике не позволяет врачам проводить специфическую диагностику и терапию инсектной аллергии. Зарубежные фирмы (BAYER, Sevapharma и др.) выпускают спектр аллергенов из нежалящих насекомых (рисЛ), но эти препараты не имеют лицензий на применение в России.

Известно, что яд и слюна насекомых обладают как аллергенным, так и токсическим действием на организм человека. В связи с этим наличие токсических веществ в составе лечебных смесей аллергенов может осложнять проведение больному аллерген-специфической терапии с гиперчувствительностью к аллергенам насекомых. Одним из возможных вариантов детоксикации экстрактов из насекомых является обработка их формальдегидом.

Начиная с работ D.G. Marsh 1970 [127], формальдегид достаточно успешно применяется для создания так называемых аллергоидных форм пыльцевых аллергенов. Были проведены целенаправленные поиски новых аллергоидных форм. Предпринимались различные попытки модифицировать пыльцевые экстракты, в том числе формальдегидом, глютаральдегидом, мочевиной, полиэтиленгликолем и т.д. Наиболее оптимальным способом снижения аллергенных свойств и повышения иммуногенности нативных экстрактов явилась их химическая модификация с использованием формальдегида. Анализ работ по проблеме получения и контроля аллергоидных форм аллергенов позволяет подвести итог основным достижениям в этом направлении, который показывает преимущество этого способа модификации аллергенных экстрактов, выражающееся следующими качествами препарата: 1. значительно сниженной аллергенной активностью, а следовательно, снижением риска при АСИТ аллергических реакций; 2. повышением иммуногенности; 3. отсутствием токсичности.

Высокая частота контактов с этими насекомыми - комарами и тараканами, тяжесть анафилактических реакций на инсектные аллергены, ставит перед современной аллергологией проблему лечения, и своевременной диагностики и профилактики этих состояний на основе использования высокоэффективных лечебных и диагностических аллергенов. В то же время в отечественной аллергологии вопросы создания технологий изготовления высокоэффективных лечебных аллергоидов из нежалящих насекомых только поставлены и ждут своего решения.

Цель работы

Разработка технологий получения диагностических и лечебных (аллергоидных) форм аллергенов из тараканов (Blattella germanica, Periplaneta americana, Blatta orientalis) и комаров (Aedes aegypti).

Задачи исследования

1. Изучить характеристики инсектного сырья из тараканов (Blattella germanica, Blatta orientalis, Periplaneta americana), из комаров (Aedes aegypti) и осуществить паспортизацию экспериментальных образцов сырья.

2. Выделить и изучить характеристики аллергенных фракций в составе инсектных аллергенов.

3. Разработать технологию получения диагностической формы аллергена из тараканов.

4. Разработать технологию получения диагностической формы аллергена из комаров.

5. Разработать технологии получения лечебных аллергоидных форм аллергенов из тараканов и из комаров.

6. Получить аллергоидные формы аллергенов из тараканов и из комаров по разработанной технологии.

7. Оценить на доклиническом уровне безопасность введения гипосенсибилизирующих доз аллергоидов из тараканов и из комаров;

8. Оценить специфическую аллергенную и гипосенсибилизирующую активность аллергоидных форм из тараканов и из комаров.

9. Оценить иммуногенные свойства аллергоидов.

Научная новизна.

Впервые охарактеризованы по ряду иммунохимических характеристик аллергены тараканов вида: Blatta orientalis. Показано, что наиболее выраженная аллергенная активность этого вида тараканов ассоциируется с фракцией, имеющей М.м =67 Ш, которая квалифицирована как главный аллерген Blatta orientalis. Фракции с М.м =40 и 92-98 kD, квалифицированы как малые аллергены.

Изучение характеристик аллергенных компонентов в составе суммарных аллергенных фракций тараканов (САФ-Т) и комаров (САФ-К) позволило выделить оптимальные композиции главных и малых аллергенов для создания высокоэффективных лечебных форм аллергенов - инсектных аллергоидов.

Показано снижение специфических IgE-связывающих свойств у инсектных аллергоидов, в сравнении с их нативными аналогами, что свидетельствует и о сниженном «риске» реакций анафилактического типа при введении аллергоидов в организм. Результаты патоморфологическиХ исследований позволили установить безопасность введения животным суммарных гипосенсибилизирующих доз инсектных аллергоидов.

Выявлена высокая иммуногенная активность аллергоидов, что является оптимальным показателем эффективности СИТ.

Научно-практическая значимость.

Научно-практическая значимость настоящего исследования заключается в разработке новых отечественных технологий лечебных форм аллергенов (аллергоидов) из тараканов и из комаров, для специфической терапии аллергических заболеваний, обусловленных сенсибилизацией к указанным аллергенам.

1. На разработанный аллерген из комаров вида Aedes aegypti получено "Регистрационное удостоверение № 98/283/7 МЗ РФ". Аллерген из комаров вида Aedes aegypti для диагностики разрешен к медицинскому применению и промышленному выпуску. Получен «Регистрационный № 200112525 от 19.03.2001 в Российском Агентстве по патентам и товарным знакам на препарат: Аллерген из комаров вида Aedes aegypti для диагностики». g

2. Разработаны технологии получения:

1). отечественного диагностического аллергена из тараканов;

2) лечебной формы - аллергоида из тараканов;

3) лечебной формы - аллергоида из комаров.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные технологии инсектных аллергоидов на основе главных и минорных (малых) аллергенов тараканов и комаров обладают преимуществом при создании лечебных форм -инсектных аллергоидов для гипосенсибилизирующей терапии.

2. Доклинические испытания на животных аллергоидов из тараканов и из комаров, свидетельствуют о безопасности этих препаратов.

3. Специфическая IgE-связывающая активность аллергоидов снижена соответственно в 1,3 (аллергоид из комаров) и 1,5 раза (аллергоид из тараканов), по сравнению с ^модифицированными формами аллергенов.

4. Иммуногенность аллергоидов из тараканов и из комаров превосходит в 3,0-3,2 раза показатели их нативных аллергенов (р<0,05).

Внедрение в практику.

На основе разработанной технологии получен диагностический аллерген из комаров (Реестр Минздрава РФ - регистрационное удостоверение № 98/283/7), который внедрен в практику НКО Института иммунологии Федерального управления «Медбиоэкстрем» при МЗ РФ, Института педиатрии МЗ РФ (аллергологическое отделение), аллергологического отделения 1-й городской клинической б-цы им. Н.И. Пирогова и клинического отделения РМАПО (г. Пенза).

Препарат диагностического аллергена из тараканов внедрен в практику клинико-лабораторных работ Института иммунологии для специфического обследования в тестах in vitro больных респираторно-аллергическими заболеваниями с ГЧ к аллергенам тараканов.

По результатам доклинического испытания диагностической формы аллергена из тараканов составлена научно-техническая документация (НТД) для предоставления в ГИСК им. JI.A. Тарасевича МЗ РФ.

Публикации

Основные результаты исследований изложены в 9 научных публикациях, а также доложены и обсуждены на:

1-ой Национальной конференции РААКН «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 1997) - Постерный доклад «Структура и функции аллергенов тараканов»;

П-ой Национальной конференции РААКИ «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 1998) - Доклад «Аллергические реакции к внутрижилищным инсектным аллергенам у больных респираторно-аллергическими заболеваниями».

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, включает в себя 20 таблиц, 15 рисунков и состоит из разделов: «Введение», «Обзора литературы», «Материалы и методы», «Собственные исследования», «Заключение» и «Выводы». Указатель литературы включает 191 источника, из них 81 отечественных и 111 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1 Разработанная технология получения аллергенов из тараканов (Blattella germanica; Periplaneta americana; Blatta orientalis) и комаров на основе главных и минорных (малых) аллергенных фракций, позволяет получить диагностические формы инсектных аллергенов, для специфической диагностики аллергических заболеваний, обусловленных сенсибилизацией к указанным видам насекомых,

2. Главными аллергенами Blatta orientalis являются белки с М.м =67kD, минорными аллергенами - белки с М.м = 40 и 92-98 Ш.

3. Разработанная технология получения инсектных аллергоидов (на модели аллергоидных форм аллергенов из тараканов), позволяет получить лечебные формы, обладающие преимуществом гипосенсибилизирующей активности, в сравнении с нативными аллергенами.

4. На основе данных патоморфологических исследований, показана безопасность введения суммарных «гипосенсибилизирующих» доз животным.

5. Специфические IgE- связывающая активность аллергоидов снижена соответственно в 1,3 (аллергоид из комаров) и 1,5 раза (аллергоида из тараканов), по сравнению с ^модифицированными формами инсектных аллергенов.

6. Иммуногенность аллергоидов превосходит в 3,0-3,2 раза показатели нативных инсектных аллергенов (р<0,05).

7. Инсектные аллергоиды (аллергоид из комаров и аллергоид из тараканов) могут быть рекомендованы для клинических испытаний на ограниченном контингенте больных с гиперчувствительностью к указанным видам инсектных аллергенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что лечение и профилактика аллергии к «нежалящим насекомым» и, в частности, аллергических состояний, формирующихся при укусах комаров и контактах с тараканами, представляет серьезную проблему в аллергологии в связи с широкой распространенностью этих насекомых на Земле - с одной стороны, и отсутствием отечественных эффективных лечебных форм аллергенов - с другой [66,67,68,156].

Острота развития аллергической реакции, тяжесть проявления этих состояний (вплоть до анафилактического шока) требует разработки соответствующих инсектных аллергенов для качественной диагностики и лечения аллергии к комарам и тараканам. Вместе с тем, хорошо известно, что в России существует лишь единственный вид аллергена - из комаров Aedes aegypti, в то время как ведущие фирмы мира BAYER, Sevapharma и др. успешно разрабатывают технологии получения диагностических форм аллергенов из нежалящих насекомых. В частности, фирма BAYER представляет аллерген мотыля, тараканов, комаров, мушки, кузнечиков, бабочек, червецов, моли, тли, муравьев и др. Фирма не ограничиваясь только диагностическими формами, разрабатывает различные виды лечебных аллергенов на основе введения в аллергологическую практику депонированных форм, аллергоидных вариантов лечебных аллергенов, для своевременной профилактики аллергических состояний в сезоны появления насекомых. В России не существует, ни одной отечественной технологии, по изготовлению лечебных форм аллергенов из нежалящих насекомых. И при отсутствии отечественных технологий, ни одна форма аллергенов из нежалящих насекомых производства зарубежных фирм не разрешена к применению в России.

В этом случае отечественная практическая аллергология остается без средств своевременной профилактики аллергии к нежалящим насекомым. В связи с этим возникает особая актуальность препаратов - инсектных аллергенов, как для диагностики, так и, для профилактики инсектной аллергии.

Выраженные токсические свойства слюны комаров, метаболитов тараканов, требуют методов их модификации, позволяющих с одной стороны снизить риск токсических реакций, с другой, избежать провокаций реакций анафилактического типа при многократных введениях гипосенсибилизирующих доз лечебных форм аллергенов.

В литературе описаны способы изготовления пыльцевых аллергоидов на основе обработки их формальдегидом (D.G. Marsh, Б.Н. Райкис, Н.И. Воронкин, Н.А. Иллютович и т.д.) [39,40,58,59,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136]. С помощью этого метода было достигнуто укрупнение молекулы аллергенов, повышение его иммуногенных свойств и снижении риска реакций анафилактического типа. В литературе по изготовлению аллергенов из нежалящих насекомых мы не нашли подобных публикаций, позволяющих получить аллергоиды из нежалящих насекомых на формалиновой основе. С нашей точки зрения существующие методы изготовления аллергоидов с применением глютаральдегида, сукцинилирования и др., наименее подходят для обработки инсектного сырья, обладающие свойствами токсичности. В связи с этим, в этом случае, в нашей работе позволяет получать аллергоиды с заранее заданными свойствами, которые можно рассматривать как оптимальными для достижения эффективности СИТ [26].

В настоящей работе впервые создана технология получения лечебных форм аллергенов из тараканов и из комаров, на основе обработки формальдегидом фракции аллергенов, сформированные на основе главных и малых аллергенов инсектного сырья.

В настоящей работе создана технология получения диагностического аллергена из тараканов, усовершенствована методика изготовления ранее созданного нами диагностического аллергена из комаров.

Известно, что диагностические формы аллергенов должны быть максимально «обогащенными» аллергенными фракциями для полноценного выявления аллергии, но лишенными балластных примесей, способных вызвать нежелательные осложнения у высоко чувствительного больного при введении ему диагностической дозы.

В связи с этим, разработка технологий получения аллергенов осуществлялась в направлении максимального сохранения нативности препаратов и очистки их от балласта. В работе проведено фракционирование ВСЭ из трех наиболее актуальных для России видов тараканов: Blattella germanica; Periplaneta americana; Blatta orientalis. Выделены и охарактеризованы главные аллергены указанных насекомых. При изучении иммунохимических свойств главных аллергенов Blattella germanica и Periplaneta americana были выявлены их характеристики, полностью совпадающие с показателями главных аллергенов этих насекомых, представленными в Международной Номенклатуре Аллергенов (IUIS) [118]. В тоже время структура аллергенов Blatta orientalis не представлена в указанной Номенклатуре, в связи с чем мы провели самостоятельное изучение аллергенных фракций указанного насекомого и впервые в работе были выявлены характеристики главных и малых фракций этого вида. Удалось показать, что главный аллерген Blatta orientalis, способный выявлять специфические IgE-антитела в 50% и более образцов БС (до 80% образцов), соответствовало фракции ВСЭ с М.м.= 67kD, малые аллергены - тождественны фракциям с М.м.=92-98 kD и М.м =40 kD, способные выявлять специфические IgE-антитела в 25% и 30% образцов БС соответственно.

Изучение структуры аллергенов Blattella germanica, Periplaneta americana позволило выявить, что наивысший IgE-связывающей активностью отмечалась с фракциями: Blattella germanica - М.м =36 kD; Periplaneta americana - М.м =72-78 kD. В то же время фракции Blattella germanica М.м.=65; 60; 21-27 kD и фракции Periplaneta americana М.м.=90; 55; 37 kD в диапазоне также обладали некоторой IgE-связывющей активностью, которые квалифицировались как малые.

На основе полученных главных и малых аллергенных фракций Blattella germanica, Periplaneta americana, Blatta orientalis была сформирована диагностическая форма аллергена (фракции с М.м.= 9298; 90; 72-78; 67; 65; 60; 55; 40; 37; 36; 21-27 kD).

Сформированные суммарные фракции из главных и малых аллергенов позволило получить диагностический аллерген отличающийся высокой степенью нативности, но не обладающего балластными примесями. Такой аллерген вполне удовлетворял требованиям диагностической препарата и оказался активным в in vivo диагностике больным, с подозрением на аллергию к тараканам.

Аналогично диагностической форме аллергена из тараканов получен диагностический аллерген из комаров содержащий фракции с М.м.=68; 38 kD, показавшие 90% и 65% связывания соответственно.

Полученные аллергены послужили в дальнейшем для приготовления инсектных аллергоидов. По существующим критериям эффективности лечебных форм последние должны характеризоваться: 1) сохранением нативности по сниженным в сравнении диагностической формой аллергенной активностью. Эти требования обусловлены многократными инъекциями препарата в период лечения СИТ;

2) отсутствие токсичности. В связи с этим была использована обработка аллергенов формальдегидом по типу токсин-анатоксин. Обработка формальдегидом белковых препаратов способствует на первой стадии взаимодействия образованию метилольных производных, которые достаточно быстро образуют внутримолекулярные метиловые мостики, если в макромолекуле имеются сближенные особенностями нативной структуры белка реакционноспособные группы.

На второй стадии из-за напряжений, вызванных образованием внутримолекулярных мостиков, в макромолекуле происходит некоторое нарушение нативной структуры глобулы, что дает возможность СН20 прореагировать с дополнительным количеством реакционноспособных групп прежде экранированных структурой макромолекулы. На второй стадии реакции белка с СНгО уменьшается количество полярных групп на его поверхности (А.Т. Кравченко и др., В.Г. Кулак и др., И.В. Москвичева) [43,44,51].

В результате проведенной работы были получены инсектные аллергоиды для профилактики и лечения аллергии к нежалящим насекомым: аллергоид из комаров; аллергоид из тараканов.

В задачу исследования входило исследование характеристик препаратов: гипосенсибилизирующая активность, имуногенные характеристики и оценка безопасности введения аллергоидов в организм. В эксперименте на животных было показано, что на высоте сенсибилизации к аллергенам, аллергоиды сохраняли специфическую активность и способность вызывать состояние гипосенсибилизации у животных. Изучение динамики специфических IgG-антител в период гипосенсибилизации и после проведенного курса, свидетельствовало о стимуляции в организме опытных животных специфических (IgG-блок)-антител. Согласно данным А.Д. Адо, В.М. Бержец и др., И.С. Гущин, С.Ф. Радунская и др., [1,8,9,10,11,25,26,60] эти показатели свидетельствуют о формировании блокирующих антител в организме.

Проведенные патоморфологические исследования органов и тканей опытных животных после введения суммарных гипосенсибилизирующих доз аллергоидов было выявлено отсутствие изменения в органах и тканях, свидетельствующих об отсутствии токсических реакций в ответ на введение препаратов.

О снижении IgE-связывающей активности в сравнении с нативными формами аллергенов, свидетельствуют данные полученные в ИФА, при изучении сывороток крови животных сенсибилизированных нативными аллергенами. Снижение IgE-связывающей активности выявлено также в ИФА при обследовании образцов БС больных, имеющих высокие уровни специфических IgE-антител к аллергенам тараканов и комаров, В случае например: специфическая IgE-связывающая активность снизилась водно-солевых экстрактов тараканов с 3,5 класс реакции до 1,3 класс реакции у аллергоидных форм тараканов, также снизилась специфическая IgE-связывающая активность водно-солевых экстрактов комаров с 3,2 класс реакции до 1,3 класс реакции у аллергоидных форм комаров,

Снижение IgE-связывающей активности при модификации аллергена, указывает на возможную блокаду В-эпитопов, отвечающих за стимуляцию синтеза IgE-антител (А. А. Польнер) [57].

Полученные лечебные препараты - аллергоиды по нашим данным в 3,2-3,0 раза по иммуногенности превосходили эти характеристики нативных инсектных аллергенов, что свидетельствуют о возможности использовать аллергоиды в качестве самостоятельного иммунизирующего препарата при СИТ.

Ill

При изучении работ Лаборатории аллергенов Института иммунологии РФ по созданию пыльцевых аллерготропинов, можно предполагать, что полученные нами инсектные аллергоиды могут служить для создания аллерготропинов - с использованием в качестве модификатора - полиоксидония, для создания высокоиммунных препаратов из нежалящих насекомых. Безопасность применения и выраженная специфическая активность аллергоидов позволяет рекомендовать для клинических испытаний.