Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Биологические свойства аллергоидов из пыльцы деревьев



/у

г

о

0.-4

А М 7)

¿¡¡И

На правах рукописи

БОРЗДОВА Ирина Юрьевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АЛЛЕРГОИДОВ ИЗ ПЫЛЬЦЫ ДЕРЕВЬЕВ

14.00.36 - аллергология, иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ставрополь -1996

Работа выполнена в Ставропольском НТО "Аллерген" и Ставропольском научно-исследовательском противочумном институт

Научные руководители:

доктор медицинских: наук, профессор Б.Н.Райкис доктор медицинских наук, профессор В.И.Ефременко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мохин K.M.; кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Саяпина Л .В.

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский

противочумный институт.

Зашита состоится __ШШШ____1996г. в _______.часов

на заседании специализированного совета К 0743201 при Российс! научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (4I007I, г.Саратов, ул.Университ'етская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб

Автореферат разослан "96г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

3.Л.Девдариани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актхальность_щ)дблемд. Изучение аллергических заболеваний - одна кз актуальных проблем современной медицины. О социальном значении борьбы с аллергическими заболеваниями свидетельствуют данные о росте числа обращений за медицинской помощью, уровня госпитализации и смертности от этих болезней как за рубежом, так и в нашей стране (Адо А.Д., 1978, 1980; Адо В.А. с соавт., 199I; Астафьева Н.Г. с соавт., 1986; Богова A.B., 1990; Пылкий В.И., 1984; Пыцкий В.И. с соавт., 1991; Сидоренко E.H., 1986; Фрадкин В.А., 1978, 1990; Horak F. , 1990).

Известно, что среди аллергозов достаточно высокий'удельный вес занимают аллергические заболевания атопического характера, при которых одной из основных этиологических причин является пыльца растений (Астафьева Н.Г. с соавт., 1986; Бекле-ыкшев Н.Д. с соавт., 1985; Ермекова Р.К. с сбавт., 1986, 1988, 1989; Порядин Г.В., 1984; Фрадкин В.А., 1990; Jager $., 1990). Зоны наивысшей распространенности таких заболеваний тесным образом связаны с климато-географическими особенностями местности (Кобзарь В.Н. с соавт., 1990; Коваленко H.H. с соавт., 1991; Ыуминов А.И. с соавт., 1984; Садовничая Л.Т., 1979; Садовничая Л.Т. с соавт., 1991; Cerceaa-LarnvaE Н.» 1991).

Среди разнообразных этиологических факторов, вызывающих поллийозы, помимо пыльцы амброзии, луговых и злаковых ттэав, значительное место занимает пыльца деревьев - платан, карагач, сосна, ольха, береза, лещина, вяз и т.д. (Гургенидзе Г .В. с соавт., 1983; Ермекова Р.К. с соавт., 1983, 1986, 1988; Куценко P.P., 1990; Остроумова А.И. с соавт., 199I; Хакбердыев М.М. с соавт., 1975, 1982; Spiekman Р. , 1990; WctEÜin J.-E. , 1991).

Патогенетически обоснованным и аффективным методом лечения при поллиноэах является специфическая иммунотерапия, успепно применяемая с I9II года ( L.Noon ). Однако, существуший уже более 80 лет способ лечения аллергических заболеваний водно-солевыми экстрактами аллергенов, имеет ряд недостатков: больпак продолжительность курса иммунотерапии, нестойкая супрессия тазун-иого ответа, опасность возникновения обоих и мйстнзх аллергических реакций в процессе лечения (Новиков Д.К. с соавт., 1991; Порошина Ю.А. с соавт., 1985; Райкис Б.Н. с соавт., Î974-I994; Patterson R. , 1981; Marsh D. , 1981; QuesbrbaM 0. , 1982; Prost ad A. et aß., 1983).

Исходя из этих позиций, проводятся целенаправленные поиски новых форм лечебных аллергенов. С этой целью водно-солевые экстракты пыльцы растений химически модифицировали полизткленглико-лем ( Sehon H., 1978), мочевиной ( Hing P. . 1974), глютараль-дзгидом (Patterson R., 1973), галоформатами ( Overall H. , 1971). Наиболее изученными в экспериментальных и клинических условиях являются аллергонды - аллергены, подвергнутые воздействию формальдегида ( Marsh D. et aE.. , 1970).

Эти препараты обладают сниженной аллергенностью и выраженной способностью индуцировать синтез защитных антител, ч?о позволяет уменьшить количество инъекций и сократить курс предсезонной иммунотерапии при условии безопасного применения более высоких доз препарата (Нартенко Т.М., 1990; Петрунов Б., 1980; Порошина Ю.А. с соавт., 1985, 1991; Фрадкин В.A.t ï990;Normwi Р. etat. , 1981; MaCLScfl H.etaL, 1982).

Научная разработка таких препаратов на основе приыэйения модифицированной одноэтапной технологии формалинизации га изготовления была начата в нашей стране в 1974 году (Райкис Б.Н. с

с соавт., 1974-1991). Ко времени начала настоящей работы, были завершены исследования, оформлена соответствующая нормативно-техничесная документация и внедрена технология изготовления в производство аллергоидов из пыльцы отдельных видов сорных трав (амброзия, полынь) и луговых трав (тимофеевка, ежа, овсянница). С целью расширения номенклатуры указанных препаратов необходимо было изучить возможность использования такого одноэтапного модифицированного метода формалинизации для изготовления аллергоидов из пальцы деревьев. В связи с этим предстояло решить вопрос о влиянии однозтапной формалинизации на физическое состояние, аллергенность, антигенность и иммунохимические свойства таких аллергенов.

Необходимо было выяснить, сохраняется ли з аллергоидах специфичность исходного аллергена и безвреден ли он при введении животным?

Конечные результаты таких исследований должны были обосновать возможность оформления соответствующих документов, тэегла-иентирующих промышленный выпуск указанных препаратов и, следовательно, расширить номенклатуру выпускаемых аллергоидов в напей стране.

Цель,.исследования - научно обосновать применение одноэтап-ной отечественной технологии формалинизации для изготовления аллергоидов из пыльцы деревьев.

Задачи^исследования - изготовить и изучить по:

- физико-химическим свойствам,

- антигенности,

- перекрестной антигенной реактивности,

- результатам клинического изучения (аллергенность и те-рапечтичвская эффективность)

ионо-аллергенн и ¡яжо-аллергоиды из пыльцы березы, ольхи и ле-

иины, и аллергоиды, изготовленные из смеси пыльцы (микст-аллер-гоиды) указанных наименований.

Нахчдая_новизца:

1. Полученные одноэтапной формалинизацией препараты из пыльцы березы, ольхи и лещины, а также из смеси пыльцы этих видов растений, обладают сходными физико-химическими, антигенными и аллергенными свойствами, характерными для аллергоидов, что является результатом однотипного влияния избранного способа на аллергены, экстрагированных из пыльцы указанных видов растений.

2. Сохранение в значительной степени антигенов в аллергои-дах из пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина), перекрестно-реагирующих между собой в исходных аллергенах, связано с их относительной устойчивостью к воздействию формалина.

3. Экспериментально установлено сохранение в аллергоидах из пыльцы деревьев их иммуногенных свойств - способности индуцировать синтез антител, комплементарных исходному аллергену.

4.','!Метод 51 оказался более информативным длл оценки остаточной аллергенности аллергоидов из пыльцы деревьев, чем обычный метод, основанный на сравнении размеров диаметров волдырей при тестировании аллергеном и аллергоидом, что связано с учетом индивидуальной неспецифической реактивности кожи (на гистамин! при использовании метода .

5. Терапевтическая активность аллергоидов из пыльцы дерзвь-ев обеспечивается их сниженной аллергенностыо и высокой иммуно-генностью.

П^а к т иче с к а я нно с т ь б о т ых

I. Впервые на основе отечественной технологии получены аллергоиды из пыльцы березы, ольхи и лещины и микст-ачлергоиды из смеси пыльцы березы, ольхи и леикны.

2. Для оцзнки аллергенности и специфичности аллергоидов прик-тест является более стандартным и менее травматичным, чем скарификационный, и позволяет проведение исследований одновременно большим количеством аллергенных препаратов.

3. Предложенный метод Sí ( sKiri index ) для опенки аллергенной активности формалинизированных аллергенов из пылыты де-рзвьев - определение реакции кожи на аллерген с учетом такой реакции на гистамин - позволяет повысить чувствительность и стандартность прик-теста.

4. Аллгргоидотерапия поллиноза, вызванного пыльцой деревьев, является более эффективным методом специфической иммунотерапии, чем аллергекотерапия.

Материалы диссертации были-представлены и доложены на научных межлабораторных конференциях НПО "Аллерген" (1991, 1992) и Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (1995), на Международных симпозиумах по аллергологии и иммунологии в г.Алма-Ата (1992), Дагомысе (1992), на Всесоюзных конференциях по актуальным вопросам медицинской биотехнологии в г.Перми (1988) и г.Томске (1991).

Публикации. Основное содержание отражено в 5 опубликованных работах.

Положения^ .выносимые ащиту:

1. Метод опноэтапной Формалинизаиии аллергена позволяет изготавливать моно- и микст-аллергоиды из пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина) со сниженной аллергенностью и высокой иммуноген-ностью.

2. Оце::ка аллергоидов из пыльцы деревьев по их аллергенности методом Si ( sKin inolex ) дает объективную характеристику од-

ноцу из основных свойств этих препаратов.

3. Аллергоиды из пыльцы деревьев (береза, ольха, лешина) являются эффективными препаратами для специфической иммунотерапии поллиноза.

Структураработы. Диссертация состоит из введения, I главы обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописи, иллюстрирована 32 рисунками и б таблицами. Библиографический указатель содержит 194литературных источника, в том числе 99 работ отечественных и 95 зарубежных авторов.

СОДШАНИЕ РАБОТЫ

I. Материалы_и_методы. Объектом исследования служили аллергоиды из пыльцы березы, ольхи и лещины (моно-аллергоиды), а также аллергоиды из смеси пьшьпы березы, ольхи и лещины (микст-аллергоиды).

В основу технологии изготовления указанных аллергоидов положен принцип, изложенный в технологической документации на производство аллергоида из пыльцы амброзии (Лабораторный регламент получения аллергена амброзийного йормалинизированного - ал-лергоада, !На-81). Особенностью нашего метода явилась трехкратная поэтапная экстракция соответствующих навесок пыльцы, что значительно увеличивало выход аллергенного материала. Всего изготовлено 47 серий аллергоидов: 19 - экспериментальных серий из пыльцы березы, 12 - из пыльцы ольхи, 5 - из пыльцы лещины, II -из смеси равных количеств пыльцы березы, ольхи и лещины.

В процессе изготовления аллергоидов физико-химические показатели (рН,Л^- группы, азот белка) определяли согласно При-

каза МЗ СССР № 31 от 13.01.83г. "Об унификации методов контроля медицинских и иммунобиологических препаратов".

Фракционный состав исходных и формалинизированных аллергенов изучали гель-фильтрацией на сефадексе tí - 75, на установке 4ирмы LKB (Швеция), а также с помощью метода изоэлектпофокуси-рования в агагюзном геле, содержащем амфолины с рН от 3,5 до 9,5 (Фримель X., 19791.

Антигенные свойства препаратов исследовали в реакции преципитации по Оухтерлони в агаровом геле,реакции непрямой агглютинации (РИГА) (Кэбот Е., Мейер M., 19681 и иммуноэлектрофореза в агарозном геле (Флимель X., 1979). Антисыворотки к аллергоидам и исходным аллергенам получали от кроликов, иммунизированных относительно высокими дозами по схеме, предложенной Е.Ю.Хавкиным и Э.В.Марковым (1981) и по схеме, предусматривавшей введение относительно небольших доз аллергена (Райкис Б.Н., 1988).

Сравнительную характеристику специфичности и аллергенной активности аллергоидов (моно- и микст-) и гомологичных аллергенов (моно- и микст-1 проводили методом прик-теста на ?! пациенте, сенсибилизированных к пыльце деревьев (береза, ольха, леши-на) согласно Методических рекомендаций - "Проведение диагностики аллергии тестом укола - прик тестом" (Фрадкин В.А. с соавт., I9S5). Результаты прик-теста выражали через полусумму ратмепов диаметра волдыря (Да + да)/2 и методом Si . При этом каждый индекс рассчитывается как отношение произведения максимального и перпендикулярного к нему диаметров волдыря, полученного в ответ на введение аллергена, к такому же произведению диаметров волдыря в ответ на введение гистамина (Да + да)/Дг х дг), гяе Да и да - максимальный и перпендикулярный к нему диаметры волдыря,по-

лученные при кожном тестировании аллергеном и аллергоидом; Дг и дг - максимальный и перпендикулярный к нему диаметры волдыря, полученные при тестировании 0,Olí гистамина. Результаты изучения аллергенной активности аллергенов и аллергоидов (моно- и микст-) из пыльцы деревьев проводили по четырехбальной системе (Адо А.Д., 1978).

Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами вариационной статистики с определением средник, стандартных отклонений, коэффициента корреляции (г ). Достоверность различия показателей определяли по таблице t - критерия Стьюдента (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962).

2. Физико-химические и антигенные свойства аллергоидов из пыльцы березы, ольхи и лещины

В настоящем разделе представлены результаты изучения трех видов аллергоидов из пыльцы деревьев: березы, ольхк, лещины. Всего изготовлено 36 серий аллергоидов: IS - экспериментальных серий из пыльцы березы, 12 - из пыльцы ольхи, 5 - из пыльны лещины. При сравнительном анализе физико-химических сбойств экстрактов из пыльцы указанных деревьев в процессе их фсрмали-низации были выявлены сходные закономерности в изменении этих свойств. Так, после формалинизации отмечается примерно одинаковое снижение pH с 7,48 - 7,51 до 7,37 - 7,31 и количества свободных аминогрупп - с 28 - 39 wv% до 0 uv%.

Указанные изменения в аллергенах сопровождались увеличением молекулярной массы. Так, по данным гель-фильтрации элюцион-ные профили аллергоидов из пыльцы березы, ольхи и лещины имели один пик, сдвинутый влево в сторону относительно более высокомолекулярных фракций белка в сравнении с исходными аллергена-

ми. В то время как последние элюировали двумя пиками. Увеличение молекулярной кассы сопровождалось изменением соотношения фракций белков с различными изоэлектрическими точками. Метод "зоэлекгрофокусирования в геле агарозы выявил, что большинство компонентов аллергоидов из пыльцы деревьев фокусировались в более узкой зоне рН от 3,5 до 6,0 в сравнении с компонентами соответствующее аллергенов - от 4,5 до 9,5. Таким образом, уменьшение фракций с изоэлектрическими точками, регистрируемыми при относительно высоком рН, явилось еще одним подтверждением активного взаимодействия формальдегида с основными группами белка (в том числе и с А группами) и свидетельствовало о том, что такое увеличение массы молекулы сопровождается глубокими Физико-химическими изменениями белков в аллергенах.

Однако, такие глубокие изменения в аллергенах, обусловленные взаимодзйствием формальдегида и температурного Яяктога с положительно заряженными группами белка экстрактов пыльцы деревьев, не отразились отрицательно на антигенных свойствах -способности аллергоидов индуцировать синтез антител гомологичных исходному аллергену. Это было выявлено в реакции преципитации по Оухтерлони, когда антиаллергоидные и антиаллергенные сыворотки формировали сливающиеся линии преципитации с исходным аллергеном, что свидетельствовало об идентичности антигенов, вступающих в реакция с антителами, содержащихся как в одной, таге и в другой сыворотках.

Кроме того, аллергоиды из пыльцы деревьев обладали достаточно высокой антигенной способностью индуцировать не только прецчпитирушие, но и гемагглютинирумлие антитела. Так, при иммунизации кроликов по схеме Е.Ю.Маркова - Э.В.Хавкина (достаточно высокие дозы) шко-аллергоидами из пыльцы березы, ольхи и

лещины содержание гемагглютинируших антител было несколько выше (соответственно на 60&, 3856, 26%), чем при иммунизации одноименными аллергенами. Титр соответственно достигал для березы ù6gl:128 и д!!§ 1:80, ольхи -иЦ 1:67,3 и 1:52,8, лещины-Л Ej 1:127 и AÎlj 1:91,8. Эти данные свидетельствуют о сохранении в полученных аллергоидах специфических антигенных детерминант исходных аллергенов.

Для сравнительного анализа электрофоретической подвижности аллергенов и аллергоидов использовался метод тмуноэлектрофореза с' применением антисыворотки кроликов, иммунизированных аллергои-дом. Было установлено, что при обработке формальдегидом экстрактов из пыльцы березы, ольхи и лещины блокируются антигены с относительно медленной электрофоретической подвижностью. При этом, линии преципитации располагались, в основном, со стороны анода, так как, по-видимому, при иммунизации аллергоидом формируются антитела, комплементарные к антигенам, сосредоточенным в зонах с относительно более высокой электрофоретической подвижностью (как в аллергенах, так и в аллергоидах).

В реакции иммунодифузии по Оухтерлони для анализа перекрестной реактивности аллергенов из пыльцы деревьев были получены данные о наличии общих, а также уникальных антигенов в указанных аллергенах, что подтвердило мнение H. Ipseneioil. (1986) и K.Wiûbiekè et dl. (1987). При помогай этой же реакции с антисыворотками к аллергоидам из пыльцы деревьев и одноименными аллерго-идами показано, что в аллергоидах сохранялись антигенные детерминанты исходных аллергенов, перекрестно реагирующих между собой, ¿¡то явилось, в известной мере, обоснованием возможности изготовления аллергоидов из смеси пыльцы березы, ольхи и лещины.

Таким образом, представленные выше исследования характеризуют способность моно-аллергоидов индуцировать синтез как гомологичных, так и перекрестно реагирующих антител.

Такая способность реализуется вне зависимости от того, что часть антигенных детерминант в аллергоиде теряется, что было установлено нами в реакциях преципитации с сыворотками, полученными от животных, иммунизированных немодифицированным (исходным) аллергеном. При этом выявлено, что в аллергоиде из пыльцы березы в значительно большей степени были редуцированы антитела, чем в аллергоидах из пыльцы ольхи и лещины, где они почти полностью сохранялись.

Реакцией иммуноэлектрофореза было показано, что оставшиеся нередуцированными антигены в аллергоидах обладают относительно более высокой электрофоретической подвижностью, чем аллергены, что явилось, по-видимому, результатом преобладания отрицательно заряженных гидроксильных групп над основными положительно заряженными свободными Л/ Н£- группами, блокированными формальдегидом.

Таким образом, результаты лабораторного и экспериментального изучения показали, что использование одних и тех же технологических приемов формалинизации позволяет получить аллергоиды из пыльцы березы, ольхи и лещины. Эти препараты сохраняют на высоком уровне антителостимулирующуга активность, общность антигенных свойств между собой при сниженной способности взаимодействовать со специфическими антиаллергенными антителами. Принципиальных различий в изменении выше названных процессов, зависящих от вида растений, из пыльцы которых готовили аллергоиды, выявить не удалось.

3. Физико-химические и антигенные свойства микст-аллергоидов из пыльцы березы, ольхи и лещины

Учитывая известные й клинической практике факты о часто встречаемой полисенсибилизации больных к пыльце разнообразных растений, прежде всего родственных в антигенном отношении, каковыми являются береза, ольха, лещина (Вик X. с соавт., 1984; Ер-кекова Р.Г. с соавт., 1989; HicKman В. , 1990), а также поло-нитзльные результаты изготовления моно-аллергоидов из пыльцы деревьев методом одноэтапной формалинизации, следующим этапом исследования была оценка возможности применения модифицированной технологии формалинизации аллергенов для изготовления аллергоидов из смеси пыльцы трех видое (береза, ольха, лещина) деревьев.

Аллергоиды из смеси пыльцы (микст-аллергоиды1 готовили по технологии, разработанной для моно-аллергоидов деревьев, с учетом модификации метода экстрагирования, перед экстракцией предварительно смешивая данные виды пыльцы в равных количествах.

Анализ результатов динамики показателей физико-химических свойств, определяемых в процессе получения микст-аллергоидов, практически не отличается от тех, которые наблюдались при изготовлении моно-аллергоидов из пыльцы деревьев. Так, в процессе формалинизации препарата наблюдается достоверное (Р/0,05) снижение рН в среднем с 7,49 до 7,37 (на 1,6*) и свободных tJ Hg-групп, в среднем с 218 нс% до 0 иг%. Это свидетельствовало об активном взаимодействии с формалином азотсодержащих продуктов аллергена (свободных аминогрупп - /» Н«р). Такоз взаимодействие вызывало увеличение молекулярной массы аллергоида, что выражалось в смещении элюционной кривой микст-аллергоида в сторону относительно более крупных белковых молекул в сравнении с алюцион-

ным профилем исходного микст-аллергена.

Данные изоэлектрофокусирования в геле агарозы подтверждают увеличение молекулярной массы препарата. Микст-аллергоид характеризовался меньзгсл количеством заряженных компонентов по сравнении с микст-аллергеном, при этом большинство компонентов аллергоида фокусировалось в более узкой зоне рН (от 3,5 во 5,5), а в аллергене - рН от 3,5 до 7,0.

Результаты изучения способности микст-аллергоидов индуцировать синтез антител гомологичных как аллергоиду, так и исходному аллергену, проводилось в иммунодифузии по Оухтерлони. Анализ данных реакции преципитации микст-аллергоида и микст-аллергена с ан-ткаллергенной и антиаллергоидной микст-сыворотками показал, что в микст-аллергене и в микст-аллергоиде содержатся идентичные антигены, вступающие в перекрестную реакцию с антителами, содержащимися как в антиаллергенной, так и в антиаллергоидной сыворотках. Это указывает на то, что полученный микст-аллергоид ип пыльцы деревьев индуцирует синтез антител, комплементарных к спектру антител, индуцированным микст-аллергеном.

Этим же методом показана способность микст-аллергоидов индуцировать синтез антител, комплементарных к отдельным аллергенам, входящим в состав такого микст-аллергоида. Так, антисыворотка к микст-аллергоиду образует менее интенсивные и в -меньшем количестве преципитации линии, чем антисыворотка к микст-аллергену. В то же время, в аллергенах из пыльцы березы, ольхи и лещины выявляются свои, уникальные антигены, характерные только для этих видов пыльцы. Видимо, в процессе формалинизации микст-аллергена часть антигенных детерминант экранируются и остаются, главным образом, антигены, общие для всех аллергенов, входящих б

состав микст-препарата.

Кроме того, результаты изучения иммуностимулирующей активности микст-аллергоидов показали, что они сохраняют способность индуцировать и синтез специфических гемагглютинируюпшх антител. При иммунизации более высокими дозами аллергоидов, изготовленных из смеси пыльцы, формирование антител тормозилось по сравнению с тем, что наблюдалось ири введении микст-аллергенов. Уровень содержания.антител был на 40$ ниже в группе животных, иммунизированных аллергоидом, чем аллергеном, что возможно, обусловлено конкурентными взаимоотношениями аллергоидов изучаемых нами видов растений, входящих в состав микст-аллергоидов. Анализ же результатов иммунизации микст-аллергоидами по относительно щадящей схеме показал, чтс при этом наиболее полно реализуется стимулирующий эффект микст-аллергоида, что выражалось в 2 раза более активным Армированием антител, чем при введении микст-аллергена (результаты изучения иммуностимулирующей активности микст-аллергоидов представлены на рис.1 и 2) (Р > 0,05).

Полученные данные свидетельствуют, что в практике использования аллергоидов с терапевтической целью не следует стремиться к максимальному увеличению дозы такого препарата, учитывая его сниженную аллергенность, так как это может привести к торможению процесса Армирования блокирующих 1д(э - антител.

Анализируя способность микст-аллергоидов взаимодействовать с антителами в реакции иммунодифузии по Оухтерлони, было выявлено, что способность микст-аллергоида взаимодействовать с такими преципитирующими антителами была также снижена, как и у аллергоидов из пыльцы отдельных видов деревьев. Электрофо-ретический анализ позволил уточнить характер этих антител.

Рис.1. Результаты изучения иммуностимулирующей активности микст-аллергена ( СИ) ) и микст-аллергоида ( КЗ ^ в условиях применения иммунизации по схеме Б.Ю.Маркова - Э.В.Хавкина.

Микст-аллергоид формировал линию преципитации с антисывороткой к микст-аллергену в анодной части препарата, а микст-аллерген -как в анодной, так и в катодной (хотя и в меньшей степени) частях. Очевидно, это явилось результатом блокады антигенных детерминант в микст— аллергоиде, связанных с положительно заряженными свободными аминогруппами (аналогично тому, как это происходит в моноаллергенах) . Однако, данные полученные с сывороткой к микст-аллер-гоиду, отличались от результатов исследования электрофоретической

Рис.2. Результаты изучения иммуностимулирующей активности микст-аллергена (I I ) и михст-аллергои-да ( ) в условиях применения щадящей схемы иммунизации.

подвижности моно-аллергенов с соответствующими им сыворотками к моно-аллергоидам. Линии преципитации, образованные микст-аллер-гоидом, располагались ближе к аноду, чем линии, образованные ыикс'1'-аллергеноы.

Таким образом, результаты изучения ыикст-аялергоидов из пыльцы березы, ольхи и лещины показали принцшшалъЕуювозыожность использования отечественной технологии формалинизации для получения таких препаратов, обладающих низкой аллергенностью, более высокой иммуностимулирующей активностью и сохранностью антиген-

ных свойств каждого вида пыльцы, входящей в его состав, в сравнении с ^модифицированными водно-солевыми экстрактами.

4. Клинические испытания аллергоидов и микст-аллергоцвов из пыльцы деревьев

Представленные в предыдущих разделах автореферата данные послужили основанием для утверждения программы клинических испытаний лечебных свойств аллергоидов и микст-аллергоидсв из пыльны березы, ольхи и лещины на добровольцах (решение ученого совета ГИСК им.Л.А.Тарасевича от 28.08.90). Результаты этих исследований, проведенных на базе различных клиник нашей страны, показали следующее. Так, при изучении аллергенных свойств, разработанных нами микст-аллергоидов из пыльцы березы, ольхи и лещины, было установлено снижение интенсивности кожных проб в 2-2,5 раза в сравнении с аналогичными аллергенами, а порог чувствительности слизистой носа на микст-аллергоид был ниже в 10-100 раз (Горяч-кина Л.А. с соавт., 1990, 1991; Никанорова М.В., 1991). Это позволило начать специфическую иммунотерапию с более высокой концентрации (в среднем начальная доза 0,2Р/^И) и тем самым лостичь высоких суммарных доз в процессе лечения (максимальная конечная доза составила в среднем 3 ООО РЛ/и, , а курсовая - 40 ООО РМа ). Курс иммунотерапии аллергоидом из пыльцы березы и микст-аллерго-идом из пыльцы деревьев составил 20 инъекций, причем положительный лечебный эффект находился в пределах от 73% до 94% (Горячки-на Л.А. с соавт., 1990, 1991; Фрадкин В.А. с соавт., 1990, 1991; Балао'олкин И.И. с соавт., 1991).

Проведенными исследованиями было установлено, что в процессе лечения пациентов разработанными нами микст-аллергоидами из пыльиы березы, ольхи и лещины, сначала отмечалось повышение, а затем снижеьие исходного уровня общего !а Е (Балаболкин И.И.

с соавт., 1991; Горячкина Л.И. с соавт., 1991; Никанорова М.В., 1991). Уровень же аллергенспецифических Ig E-антител под влиянием специфической иммунотерапии аллергоидами имел тенденцию к снижению (Фрадкин В.А. с соавт., 1990) или не изменялся (Горячкина Л.А. с соавт., 1991; Никанорова М.В., 1991). Показано также, что специфическая иммунотерапия аллергоидами из пыльцы деревьев способствует более интенсивной выработке блокирующих антител (Фрадкин В.А. с соавт., 1990; Горячкина Л.А. с соавт., 1990, 1991; Бала-болкин И.И. с соавт., 1991) и отмечена прямая корреляция между увеличением блокирующей активности сыворотки и эффективностью специфической иммунотерапии. Остальные группы иммуноглобулинов ( Ig A, Ig М) менялись незначительно, а уровень ЦИК оставался неизменным (Фрадкин В.А. с соавт., 1990).

Более подробно аллергенность пыльцевых аллергоидов из деревьев была изучена по кожным тестам на базе Ставропольского аллерголог ического кабинета. При этом выявлено, что если формалини-эация существенно не влияла на активность аллергоидов и микст-аллергоццов индуцировать синтез антител, то способность взаимодействия аллергоидов с аллергическими антителами заметно снижалась. Так, при кожном тестировании прик-тестом у больных, сенсибилизированных к пыльце деревьев и оценки ее по средним размерам двух диаметров волдыря (без учета реакции на гистамин), аллергенность как в moho-, так и в микст-аллергоидах (рис.3) уменьшалась примерно в 2 раза.

Пли оценке результатов тестирования по методу Si ( sUin ítidest 1 путем учета одновременно с активностью реакции кожи на аллерген (аллергоид) реакции кожи на гистамин, была обнаружена более высокая степень снижения аллергенной активности мою-и микст-аллергоидов (рис.4) (в 4-6 раз), что свидетельствует и о более

Рис.3. Результаты прик-теста на аллерген ( I I ), аллер-гоид (ККЗ ), микст-аллерген ( ), микст-ал- . лергоид ( ^ и кратность снижения аллергенности Ан/Аг ( ГГТТП 1.

высокой чувствительности данного метода. Проведенный нами корреляционный анализ показал достоверную (р/0,05) взаимосвязь данных прик-теста, выраженных в 5! и путем сравнения только средних размеров диаметра волдырей ( с = 0,8 - 0,93) без учета реакции на гистамин.

Таким образом, клинические испытания наших микст-аллергои-дов и отдельных аллергоидов из пыльцы .деревьев (береза, ольха, лещина) на базе Ставропольского аллергологического кабинета и

Рис.4. Результаты кожного тестирования, выраженные S!

аллергеном ( I I ), аллергоидом ( IWN ), микст-аллергеном (EZJ ), миксг-аллергоидом ( ) и кратность Sí снижения аллергенности Ан/Аг ( ШВ ).

на ограниченном контингенте на базе различных клиник страны свидетельствуют о высокой клинической и иммунологической эффективности данного препарата при проведении специфической иммунотерапии. Это дазт возможность введения аллергоидоз в относительно высоких дозах в силу низкой их аллергенности.

ВЫВОДЫ

I. Методом одноэтапной формалинизации получены отечественные моно- к микс^-аллергоиды из пыльцы деревьев (береза,

ольха, лещина) со сниженной аллергенностьго, высокими иммуноген-ными свойствами и терапевтической активностью.

2. Формалинизация вызывает общие для моно- и микст-аллер-гоидов из пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина) изменения рН, свободных // Hg- групп, молекулярной массы, заряда изоэлектри-ческой точки, иммуноэлектрофоретической подвижности, антиген-ности и аллергенности.

3. В аллергоидах из пыльцы березы, ольхи и лещины сохраняются общие антигены, перекрестно реагирующие между собой, что свидетельствует об их устойчивости к действию денатурирующего влияния формальдегида.

4. Аллергоиды из пыльцы березы, ольхи и лещины и микст-ал-лергоиды из пыльцы этих видов деревьев обладают способностью активно стимулировать синтез гомологичных и перекрестно реагирующих антител.

5. Аллергоиды из пыльцы деревьев обладают значительно сниженной способностью взаимодействовать с кожносенсибилизирующими антителами, чем аллергены. Наиболее объективным методом оценки такой способности является sfcn index (Si ). позволяющий учесть индивидуальную неспецифи^ескую реакцию кожи пациентов на стандартное количество гнстамина.

6. При лечении больных моно- и микст-аллергоидами из пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина) достигается более высокий терапевтический эффект, чем при аллепгенотерапии, за счет сниженной аллергенности и более высокой имадуногенности аллергоидов.

татов_исследований. Утверждена инструкция по изготовлен™ и контролю микст-аллергоида из пыльны берззы, ольхи и лещины, а также Программа проведения Государственных

клинических испытаний (решение Комитета по МИБП, протокол № б от 28.07.94г.) после проведенных испытаний на ограниченном контингенте в клинике аллергологии ЦОЛИУВ (решение Ученого совета ГИСК им.Л.А.Тарасевича, протокол f> 18 от 28.08.1990г.). Оформлены и представлены в ГИСК им.Л.А.Тарасовича экспериментально-производственный регламент и временная фармакопейная статья, которые будут утверждены после принятия решения Комитетом по МИБП о возможности их применения в практике здравоохранения по итогам Государственных испытаний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

I. Экспериментальное обоснование технологии изготовления отечественных пыльцевых аллергоидов (Райкис Б.Н., Воронкин Н.И., Махлиновская Ф.Л.) // Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов. - Пермь, 1988. - C.I57-I5S.

2. Новый лечебный препарат для иммунотерапии поллинсза микст-аллергоидом из пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина) (Райкис Б.Н., Иллвтович H.A., Деншикова Т.Ю.) // Реабилитация

иммунной систему. - Цхалтубо, 1990, - С.337.

3. Биологическиз свойства микст-аллергоидов из пыльцы деревьев // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии. - Томск, 199I. - С.67-68.

4. Депигментированные пыльцевые аллергены (Райкис Б.Н., Иллртович H.A., Филиппова З.К.) П Международный симпозиум по аллергологии и иммунологии: Тез.докл.-Алма-Ата,1992.- С.33.

5. Микст-аллергоидц из пычьцы деревьев (Райкио Б.Н., Иллго-тович H.A., Деншиков T.üj // Ыесдународный симпозиум по аллергологии и иммунологии. ~ Дагомыс, 1992. - С.286.