Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Биологические свойства аллергоидов из пыльцы злаковых трав

РГ6 од

» \ ДНК

РАМН

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК ям,И. И. МЕЧНИКОВА

СОЛДАТОВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСЕЕВИЧ

УДК:576. 8. 097. 2:616 - 022. 85

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АЛЛЕРГОИДОВ ИЗ ПЫЛЬЦЫ ЗЛАКОВЫХ ТРАВ

14. 00. 36 - иммунология и аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

Москва - 1994

Работа выполнена £ Ставропольском ГП "Аллерген" и на ка ■ федре патологической физиологии Ставропольского государственно; медицинского института

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Б.Н.Райкис

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

| Н.И.Воронкин |

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

В.Б.ГервазиеЕа

доктор медицинских наук, профессор член-корреспондент Российской Академии естественных наук

И.С.Гучин

Ведуцее учреждение: Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. (I.Л.Тарасовича

Защита диссертации состоится ) 1994 г.

е часов на заседании специализированного совета Л 07А.22.0] Научно-исследовательского института вакцин и сыЕороток им. И.И.Мечникова РАМН ( 103064, г.Москва, пер. Мечникова, 5а ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно -исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАИН.

Автореферат разослан 'У? с " ^сЫХ. />->"4 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что наиболее часто зричиной сенсибилизации при поллинозах является пыльца трав семейства злаковых - тимофеевки, овсяницы, ежи, райграсса, ржи, полевицы, мятлика, пырея и лисохвоста ( Пыцкий В.И. с соавт., 1991, Адо А.Д., I97B, Зисельсон А.Д., 1989, Потемкина A.M., 1990, Новиков Д.К., 1991, йзгер Д., 1991 ). В течение 80 лег эффективным методом лечения данной патологии остается специфическая гипосенсибилизирующая иыцутютерапия.

Эффективность такой терапии определяется, в основном, подбором оптимального спектра и адекватной дозы аллергена, введенного при лечении С Горячкина Л.А., с соавт., 1985, Бойко А.Н., Щербак Л.С., 1982, РаЯкис Б.Н., Воронкин Н.И., 1987, Цуценко 3., 1990,lowensielnet- , l9Q4,Voorhorst , Uooft , 1980,&ous^uei ei al., 1987 ). Применение с этой целью экстрактов из смеси пыльцы наиболее распространенных аллергенно-значимых аидоа трав злаковых, выцускаэмых а условиях производства, предпочтительнее, чей смесей моно-аллергоидов из пыльцы таких трав, которые готовятся в условиях аллергологического кабинета, так как исключается риск бактериального загрязнения й является более удобным для медицинского персонала.

КрЬме того, используемые до настоящего времени коммерческие аллергены, представляющие собой водно-солевые экстракты пыльцы, имеют суфстаенныэ недостатки I аллергенность и слабую

ищуногекность ), что значительно увеличивает продолжительность

\

лечения I до 4 - 5 месяцев ) и препятствует введению высоких, максимально переносимых доз аллергена. Это обстоятельство стицу-лироаало исследователей на поиск путей создания новых более эффективных форы лечебных аллергенов - химически модифицирован-

на глвтаральдегидом и формальдегидом ( Наг^Ь еЫ1 , 1970, 1982, Райкис Б.Н., Ворошсин Н.И., 1937 ). Наиболее удачными 1 них явились исследования по модификации экстрактов пыльцы фо] мальдегадом, которые завершились созданием препаратов нового поколения - аллвргоидов, обладающих низкой аллергенностью и высокой имцуногенностьо ( МаЫ1 е1 , 1981 ).

В нашей стране соответствующей нормативно-технической £ кдоеотации на производство аллергенов не было. В связи с эш были проведены исследования, которые позволили путем соответ ствувдей модификации одноэгапного метода фориалинизации полу чить, экспериментально обосновать и клинически изучить аллер гоид из пыльцы амброзии ( Райкис Б.Н., 1974-1991 ).

Это и послужило предпосылкой к разработке аллвргоидов и пыльцы злаковых трав с целью расширения номенклатуры таких пр паратов.

Цель исследования - научно обосновать применение отечес венной одноэтапной технологии формалинизации для изготовления аллвргоидов из пыльцы злаковых трав.

Для достижения указанной цели намечено было изготовить моно-аллергоиды из пыльцы тимофеевки, овсяницы, ехи сборной; ыихст-адлергоиды из смеси пыльцы трех V тимофеевки, овсяницы, ежи сборной ) и пяти видов ( тимофеевки, овсяницы, ежи сборно: ржи и райграсса ) растений, к которым наиболее часто встречав' ся сенсибилизация, и изучить их по :

- физико-химическим свойствам;

- антигенности;

- перекрестной антигенной реактивности;

3.

- степени снижения аллергенности в кожных пробах на большое;

- эффективности применения для специфической нмцунотерашш.

Научная новизна.

1. В процессе одноэтадной форыадиниэации аллергенов из пыльцы трав семевстяа злаковых ( тимофеевка, овсяница, ежа сборная ) фориируптся аллергоцди, имевдие сходные физико-химические, антигенные и аллергенные свойства. Это относится как к моно-ал-лергоидам, так и к аллэргоидам, приготовленным из смеси пыльцы трех и пяти видов трав.

2. Экспериментально показана более высокая имцуногеккая активность моно- и ииксг-аллергоцдов аз пыльцы злаховых трав в сравнении с гоиологичныш нативными аллергенами, что обусловлено особенностями физико-химического свойства пыльцы этих видов растений.

3. В аллергоидах из пыльцы злаковых трав ( тимофеевка, овсяница и ежа сборная ) сохранены антигены, перекрестно реагирующие между собой в исходных аллергенах, что связано с их устойчивостью к воздействии формалина.

4. Снижение аллергенной активности в прик-тесте аллергои-дов из пыльцы злаковых трав обнаруживается в большей степени при сопоставлении размеров волдырей на аллерген и аллергоид с учетом реакции-бдаьных на стандартный раствор гистаиина ( метод

), чем при сравнении только размеров волдырей на аллерген и аллергоид, что является результатом индивидуальной чувстви -тельности бальных к гистамину.

5. Механизм имцунотералевтического эффекта от применения аллергоидов в значительной мере объясняется приобретенными свойствами указанных препаратов - их низкой аллергенностыо и высокой имцуностицулируххцей активностью, что позволяет вводить достаточно высокие дозы препарата без дополнительной сенсибилизации организма.

Практическая ценность работы.

1. Впервые на основе отечественной технологии получены аллергоцды из пыльцы тимофеевки, овсяницы, ежи и микст-шиергои дц из смеси пыльцы тимофеевки, овсяницы, ежи и из пыльцы тимофеевки, овсяницы, ежи, ржи и райграсса.

2. Дискриминантный анализ ( в частности ЛДФ ) является более чувствительным методом сравнительного изучения свойств алле гоидов, чем анализ средних единичных показателей или степени их взаимосвязипо коэффициентам корреляции.

3. Лрик-тест является более стандартным, менее травматичным для оценки аллергенности и специфичности аллергоидов «позволяет проведение исследований одновременно большим количеством аллергенов, чем скарификационный тест.

4. Впервые для оценки аллергенной активности формалинизи-рованных аллергенов использован метод ¿1 islrin index ) -определение реакции коаи на аллерген, с учетом такой реакции

на гистамин, что позволяет повысить чувствительность и стацаарт носгь прик-теота.

о. Аллергоидотерапия является более эффективным методом специфической иммунотерапии, чем аллергенотерапия.

В соответствии с подученными результатами экспериментально-э, лабораторного и клинического исследования на защиту выдвинется следурдше положения:

1. Использование однозтапной отечественной технологии фор-шмизации аллергена позволяет подучить моно- и микст-аллерго-щ из различных видов злаковых трав, обладающих сниженной ал -зрганностью и высокой имцуногенностьо.

2. Объективным методом определения остаточной аллергенно-гн в аллергондах является сравнительная оценка активности коа-зй реакции на аллергоид и аллерген с учетом такой активности

1 стандартное количество гистамина I метод ).

3. Применение аллвргоидов из пыльцы злаковых трав для зецифической гипосенсибилизации поллиноза вызывает терапевтически эффект при сокращении курса лечения, количества инъекций и <сла осложнений, в сравнении с коммерческими аллергенами.

Апробация работы. Диссертация апробирована 23.11.93 года а заседании межкафедральной конференции лаборатории аллергенов I "Аллерген" к кафедры патологической физиологии Ставрополь -юго государственного медицинского института. По теме диссер -ацни оцубликовано 7 работ, список которых приводится в конце зтореферата.

V

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из аедеп&я, обзора, литературы, 3 глав собственных исследований, зклвчения, выводов и списка литературы. Работа изложена на £5 страницах машинописи, иллюстрирована 41 рисунком и 14 таб-кцамн. Библиографический указатель содержит 89 отечественных 61 зарубежный источник литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы к методы исследования.

Объектом исследования служили аллергоиды из пыльцы тимо фееЕки, овсяницы, ежи С моно-аллергоиды ), аллергоиды из сме! пыльцы тимофеевки, овсяницы, ежи, а также из смеси пыльцы ти мофеевки, оесяницы, ежи, ржи и райграсса С микст-аллергоиды ,

Аллергоиды готовили по технологии, разработанной для ам-брозийного вллергоида С Лабораторный регламент получения алл гена амброзийного формалинизированного - аллергоида, I 4а-81. Всего изготовлено 54 серии аллерговдов: 18 - экспериментален! серий из пыльцы тимофеевки, 12 - из пыльцы овсяницы, 10 - из пыльцы ежи, 5 - из смеси равных количеств пыльцы тимофеевки, овсяницы, ежи и 9 - из смеси пыльцы тимофеевки, овсяницы, еж1 ржи и райграсса.

Физико-химические показатели в процессе изготовления аллергоидов ( рН, 1Н2-группы, аминный азот, азот белка ) опре ■ деляли согласно Приказа МЗ СССР * 31 от 13.01.83 г. "Об униф! кации методов контроля медицинских и иммунобиологических препаратов".

Фракционный состав исходных и формалинизированних аллергенов изучали гель-фильтрацией на сефадексе 6-75, на уста -новке фирмы ЫШ С Швеция ) и методом электрофореза в агароз ■ ном геле ( Остерман Л.А., 1983 ).

Антигенные свойства препаратов исследовали в реакции преципитации по Оухтерлони и реакции непрямой гемагглптинации ( РПГА ) ( Кэбот Е., Мейер N., 1968 Антисыворотки к аллер: идам и исходным аллергенам получали от кроликов, иммунизиров!

>тносительно высокими дозами по схеме, предложенной Е.Ю.Хав -:иннм и З.Е.Маркозым (.1981) и по схеме, разработанной в аллерго-югическом отделе ГЛ "Аллерген", предусматривающей введение 1тн0сительн0 небольших доз аллергена (, Райкис Б.Н., 1988 ).

Сравнительную характеристику специфичности и аллергенной 1КТИВНООТИ апларгоидов и гомологичных коммерческих аллергенов [роводили методом прик-теста согласно Методических рекомецца -[ий - "Проведение диагностики аллергии тестом укола - прик-тес-ом" ( Фрадкин В.А. с соавт., 1985 ). Результаты прик-теста ыражали через полусумцу размеров диаметров волдыря Да—)

; методом . Кодный иддекс при этом рассчитывается как отно->ение произведения максимального и перпендикулярного к нецу диметров волдыря, полученного в ответ на введение аллергена, к акоцу же произведению диаметров волдыря в ответ на введение

истамина I д?--^ * Да и Аа - максимальный и перпен-

ику-лярный к нецу диаметры волдыря, полученные при кожном тес-ировашш аллергеном или аллергоидом; Дг и дг - максимальный и ерпендикулярный к нецу диаметры волдыря, полученные при тес -ировашш 0,01% гистшина. .

Результаты иммунотерапии оценивали по четырехбальной си-теме I. Адо А.Д., 1978 ), в период цветения и по показателям, аракге'ризувдим : длительность курсов лечения, количество инь -кций, величину начальной, конечной и суммарной доз, частоту ллергичесюнс-асложнений. При этом учитывалась динамика аллэр-енспецифических антител, определяемых методом имцунофермент-ог'о анализа.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась специально по разработанной программе I совместно с Ере -щенко А.) для компьютера, которая включала в себя классические статистические методы, корреляционный и многомерный анализы I сравнение векторов средних Т-критерием Хотелликга и ликейно-ддскриминантная функция ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Физико-химические, антигенные и аллергенные свойства алларгоидов из пыльцы тимофеевки, овсяницы и ежи.

Учитывая широкое распространение на территории нашей стра ны поллинозов, вызываемых пыльцой злаковых трав, и наличие разработанной нормативно-технической документации на изготовление и контроль аллергоида из пыльцы амброзии I Райкис Б.Н. с соавт.

1974-1992 ), задачей данного исследования являлось обоснование возможности использования данной технологии для изготовления аллергоидов из пыльцы злаковых трав.

В свази с этих были изготовлены аллергоиды из пыльцы ти • мофеевки, овсяницы и ежи. Анализ результатов отражающих изме -некие физико-химических свойств пыльцевых экстрактов, в процессе получения этих аддергоидоз выявил сходную динаанку изменена указанных показателей. Так, ори диализе аллергенов ( перед фор малинизацией ) отмечалось снижение рН с 8.5 - 7.1 до 7.1 - 6.4 а аминного азота - с 199 - 211 ыг/% до 16.6 - 15,2 мгД. После форкадинизации рН снижалось с 7.48 - 7.56 до 7.45 - 7.38, а

зободные аминогруппы ( Ш2 ) - с 73.8 - 59.5 мг/£ до 0 ыг/%.

При этой по данный гель-флльтрации наблюдалось укрупнонно элекул аллергоидоэ из пыльцы тимофеевки,, овсяницы и ежи, кото-зо характеризовалось сдвигоа элоациоккого профиля у аллергои -53 в область более,высоких молекулярных масс, в сравнении с ативкьши аллергенами.

Увеличение ьсолекулы белка аллергоэдов при формалинизащш ¿лицевых экстрактов происходило за счет связывания ( или бло-!ровашш ) полоэмгельно заряженных груш белка формальдеги -3-1. Об этом свидетельствовали: сникеккэ рН, резкое уменьшение зободных ЗГН-э-групп з процессе формата низации и изменение тектрофорэтической подвижности ахлергоидоа в агарозном геле, ¡■о выражалось значительно более активным продвижением фракци-5 аллергоидов к аноду, в сразнэшш с исходнь&га аллергенами.

Взаимодействие формальдегида с положительно зоряаенншга эуппаии белка эксграктов пыльцы злаковых траз сопровоцдалось тонированием части детерминант, отвечающих за антигенные зойства. Это выракалось уменьшением числа линий преципитации, Ьорыировашшх ыегду аллергоидами и гомологичными антиаллерген-аи сыворотками (, выявлялась только I линия ), относительно ¡ела линий, подученных иевду указанными сыворотками и исход -ии здлрргенаш! С 2-3 линии ).

Однако, такие изменения аллергенных свойств в аллергои -»х кз сни4али-йкцукостицулирукщей их активности индуцировать штез специфических преципитируицих антител, комплементарных исходили аллергенам, что определялось в реакции преципитации > Оухторлони, когда аллергоиды и исходные аллергены форыирова-I по одной, сливающейся между собой линии преципитации с ан -

тиаллергоидныш сиворогкаыи. Помимо этого, в аллергоидах, как показала реакция преципитации по Оухтерлони, сохранялись анти генныз детерминанты исходных аллергенов, перекрестно реагирующих мевду собой. Так, в реакции преципитации с антисыворотка ми к аллергоидам из пыльцы тимофеевки, овсяницы и ежи пере -крестно реагировали как исходные гомологичные аллергены, так аллергоиды.

Аллергоиды из пыльцы злаковых трав обладали способность стицулировать формирование не только прециштирувщих, но и гемагглотинирукщих антител. При этом имцунизация кроликов высокими дозами аллергенов и аллергоидов вызывала формирование примерно одинакового уровня антител к тоцу и другоцу препара ту I титр соответственно достигал для тимофеевки « 3,24 ж Ц » 3,08, ежи - в 2,54 и » 2,54 и овсяницы » » 3,46 и 1.| « 3,46 ). При имцунизации относительно низкими дозами активность стицулировать антиаллергенные антитела былг несколько ниже при использовании аллергенов, чем аллергоидов (. соответственно для ежи « 2,64 и » 2,84 и озсянищ

=» 2,7а и ж ).

Вместе с тем, если формалинизация существенно на снижа ла способность аллергоидов иодуцировать синтез антител, то п кал способность взаимодействия аллергоидов с аллергическими антителами заметно нарушалась. Так, при кожном тестировании прик-тестом у больных, сенсибилизированных к пыльце злаковых трав и оценки ее ио полусумме диаметров волдырей < без учета реакции на гистамин ), кожные реакции на аллергоиды в 2,2 - I раза менее активны, чаи на аллерген.

При оценке результатов тестирования по методу 51 цу-гем учета одновременно с активностью реакции кожи на аллерген ( аллергоид ) реакции кожи на гистамин, была обнаружена более высокая степень снижения аллергенной активности аллергоида I в 6.1 - 4.7 раза ), что свидетельствует и о более высокой чувствительности данного метода. Надо полагать, что резуль -гаты, полученные данным методом, и более достоверны,-чем при оценке кожной реакции на аллерген без учета такой реакции на гистамин, поскольку такой метод учитывает индивидуальную чувствительность больного на гистамин.

Таким образом, результаты лабораторного, эксг.еримен -гального и клинического исследования показали, что использо -зание одних и тех же технологических приемов формалинизации позволяет получить аллергоиды из пыльцы тимофеевки, овсяницы л ежи, обладающие сходными свойствами: высокой иммуностимулирующей активностью и сниженной аллергенносгью. Обобщенная характеристика свойств аллергоидов из пыльцы тимофеевки, овся -яицы и ежи предстазлена в таблица I.

Физико-химические, антигенные и аллергенные свойства микст-аллергоидов из пыльцы злаковых трав.

Учитывая высокую степень полисенсибилизации больных при толлинозах, вызванных пыльцой злаковых трав, и эффективность 1рименения для их терапии смесл аллергенов из пыльцы трав, которые наиболее часто являются прияиной такой сенсибилизации ( Беклемишев Н.Д. с соавт., 1985, йегерЛ., 1991, эЫ'тег еА с*\- , 1984 ), а также положительные результаты изготовления аллергоидов из пыльцы злаковых трав методом одно -

Таблица I.

Результаты Изучения физико-химических, антигенных и аллергенных свойств аялергоидов из пыльцы тимофеевки, овсяницы и ежи.

Показатели Аллергоиды из пыльцы

тимофеевки : овсяницы ежи

Снижение рН при диализе!., __ ........ с 0.5 до 6.6 ?с 8.5 до 7.1 с 7.9 до 6

Сшиение аминного азота в процессе диализа с 210 до 16.6 с 211 до 15.2 с 198 до 15

Сюшисхе. рН при фор-иалинизации с 7.5 до 7.41 с 7.5 до 7.38 с 7.5 до 7

Снижение Ш2-групп при форцалинизаЦин с Ь9.Ь до 0 с 60.2 до 0 с 73.8 до (

Молекулярная масса в гель-фкльтрации относи тально аллергена повышена повышена по пшена

Электрофорегическая подвижность относитель но аллергенов повышена повышена повышена

Способность взаинодей-ств.с антиаллергенными гомологичн.сыворотками снижена снижена снижена

Способность иццуциров. синтез специф.преципи-тируюцих антител,комплемент. исх. аллергенам сохранена сохранена сохранен*

Повышение титра гемаг--глотинирующих антител в РИГА при имцунизации аллергоидами относит, имцунизации аллергенам! 1 К на 15>£ на 1$6

Аллергенная активность: выраженная в размерах : ^ волдарей относительно : в 2.2 раза аллергенов : снижена в 2.2 раза снижена в 2.3 раз<

Аллергедшосгь,выражен-: ,.нижйня ная в £1 относитель-: но аллергена : в о.о раз снижена в 6.1 раза снижена в 4.7 раз«

этапной форыалшшзации, следующей задачей нашего исследования было получение и изучение свойств аллергоидов из смеси пыльцы трех видов ( тимофеевки, овсяницы и ежи ) и пяти видов (тимофеевки, овсяницы, ежи, ряи и райграсса ) трав.

Аллергонды из смеси пыльцы ( миксг-аллергоиды ) готовили по технологии, разработанной для моно-аллергоидов из злаковых трав, предварительно перед экстракцией смешивая в равных количествах данные виды пыльцы.

Результаты изучения динамики показателей физико-химических свойств, определяемых в процессе получения микст-аллергои-дов, свидетельствовали, что их изменения имеют такую see закономерность, как и при получении ыоно-аллергомдов из пыльцы зла -ковых трав. Так, при диализе аллергенов i перед формалинизаци-ей ) отмечалось снижение рН с 8.9 до 7.2 и аминного азота - с 229 - 239 чг/% до 15.7 - 15.4 иг/%. Взаимодействие белка пыльцы с фэрыальдегидом характеризовалось снижением рН с 7.4 - 7.41 до 7.29 - 7.31 и свободных ¡Г^-групп с 101 - 91 ыг/^ до 0 мгД. Такое взаимодействие формалина с пыльцевыми аллергенами вызы -вало увеличение молекулярной массы аллергоида, что выразилось сдвигом элюациошшх профилей аллергоидов в сторону более вы -соких молекулярных масс а сравнении с исходными мияет-аллер -генами, выявляемое при гель-фильтрации.

Указанные изменения, в свою очередь, обуславливали снижение способности микст-аллергоидов взаимодействовать с пре -ципитирувдими антителами, полученными в ответ на иммунизации моно-аллергенами, которые входили в состав ыикст-аллергоидов. Так, в реакции преципитации по Оухтерлони микст-аллергоиды из пыльцы 3 и 5 видов злаковых трав формировали одцу линию или

вообще не формировали линии преципитации с ашшсыворотками к исходным ионо-аллергенаы. В то время как исходные микст-аллергены постоянно формировали с указанными антисыворотками по дв( линии преципитации.

Однако, результаты изучения иммуностимулирующей активности миксг-аллергоидов показали, что они сохраняют высокую способность стимулировать синтез специфических гемагглютинирутощи: антител. В данном случае в качестве контроля были использован смеси коммерческих моно-аллергенов, которые применяются в кли нической практике, а иммунизация проводилась по щадящей схеме - невысокими дозами препаратов ( результаты изучения иммуно -стимулируюцей активности ыикст-аллергоидов представлены на ри сунке I ).

Из этого рисунка видно, что уровень содержания гемагглю тинирующих антител при иммунизации аллергоидами всех взятых для изучения злаковых трав был несколько выше, чем при исполь зовании аллергенов. Поскольку для каждой пары препаратов ( од кого вида растений ) статистические различия были недостоверн ( р > 0.06 ), мы применили многомерный метод ( ЛДЪ ) сравне ния оценки стимулируюцей активности аллергенов и аллергоидов. Он позволяет дать такую оценку по изменению совокупности приз

ков (, уровни содержания у каждого кролика различных антител )

р

Так, фактическое значение Т критерия в ЛДа> ( 3.75 ) было выи критического значения Т^ критерия ( 0.56 ), что свидетельству ег о достоверности ( р < 0.05 ) полученных нами различий и, следовательно, о более высокой иммуногенности аллергоидов по сравнению с аллергенами. Вместе с тем, изучение аллергенной активности микст-аллергоидов показало их низкую способность

I -

I -

1

1

15.

3-

э -

I

I

Тимофеевка Овсяниц д

Рожь

РАйгРЛОб

Рис.1. Результаты сравнительного изучения иммуности-- мулирующей активности микст-аллергоидов (СИ) ) и смеси гомологичных коммерческих моно-аллер-генов ( ) в РИГА.

вызывать аллергические реакции дэц. введении сенсибилизирован -ному больно!^". "Кожные реакции на микст-аллергоид из пыльцы пяти видов трав у 15$ больных были отрицательными, на один крест - у 35,?, на два креста - у 20% и на три - у 30^ больных. В то время как на смесь коммерческих аллергенов из таких же пяти видов пыльцы отрицательных реакций и реакций на один крест не было обнаружено. У всех больных реакции оценивались на два, три и четыре креста. При этом аллергенность в микст-аллергоидах снижалась..' в 2.7 раза (. по методу 31 в 6.1 раз ) по сравне-

2

J.6.

нию с аналогичной смесью коммерческих аллергенов.

Таким образом, результаты изучения микст-аллергоидов из пыльцы трех и пяти видов растений показали принципиальную возможность использования отечественной технологии формалинизации для получения таких аллергоидов, обладающих низкой аллерген -ной и более высокой иммуностимулирующей активностью, в срав -нении с ^модифицированными водно-солевыми экстрактами.

Лечебные свойства аллергоидов из пыльцы злаковых трав.

Представленные в предцлущих разделах автореферата данные послужили основанием для утверждения программы испытания аллергоидов из пыльцы тимоффевки, ежи сборной и овсяницы, а также микст-аллергоида из пыльцы указанных трав на добровольцах ( Решение КМИВП от 20.Oi.87, 2I.i2.88 и решение ученого Совета ГИСК им. Л.А.Тарасевича от ¿4.09.90 ). Результаты таких испытаний, проведенных на базе различных клиник г.Москвы были опубликованы в печати I Горячкина Л.А. с соавт., 1990, 1991; ¿радкин В.А. с соавт., 1990, j.993 ).

Так, при изучении аллергенных свойств аллергоидов, изготовленных из пыльцы злаковых трав Л.А.Горячкиной с соавт. С х990, 199^ ), было установлено снижение интенсивности кожных проб в 2 раза в сравнении с аналогичными аллергенами, а порога чувствительности слизистой носа - в i0-I00 раз. Это позволило начать лечение с 0.2 P//U и тем самым достичь высоких суммарных доз. При этом конечная доза в среднем составила -3000 PNU , а курсовая - 40000 . Курс иммунотерапии аллерго-идами из пыльцы тимофеевки, овсяницы и ежи по данным В.А.йрадки-

на с соавт. ( 1990 ) составил 20 инъекций. Положительный эф -фект был ими получен в 85-94'^ случаев.

Этими исследованиями было также показано, что разрабо -танные нами аллергоиды способствуют более интенсивной выра -ботке "блокирующих" антител, в сравнении с водно-солевыми экстрактами. Оказывают они и стицулиругацее влияние на уровень содержания общего Е, вслед за чем отмечено было его снижение в крови ( 1'орячкина Л.А. с соавт., ¿99а ). Уровень же аллерген-специфических й-антител, по данным одних авторов под влиянием аллергоидотерапии не менялся ( Горячкина Л.А. с соавт., 199± ), или даже имел тенденцию к снижению I йрадкин В.А., 1990 ), что по их мнению указывает на отсутствие дополнительной сенсибилизации за счет вводимого препарата. Содержание же иммуноглобулинов других классов I А, & ) менялось мало, а уровень ДИК оставался неизменным ( ¿радкин В.А. с соавт., 1990 ).

Аналогичные результаты получены при изучении клинической эффективности в наших исследованиях, проведенных на базе Ставропольского городского аллергологического кабинета. В данном случае специфическую иммунотерапию проводили смесью готовых аллергоидов из пыльцы тимофеевки, овсяницы и ежи 15 больным поллинозом, вызванным пыльцой злаковых трав, в качестве контроля под наблюдением находились а2 больных с аналогичной патологией, леченных смесью коммерческих аллергенов из пыльцы ти -мофеевки, овсяницы и ежи, выпускаемых ГП "Аллерген". Специфи -ческую иммунотерапию проводили согласно схеме, представленной в программе по испытанию аллергоидов из пыльцы злаковых трав, утвержденной КМИВД. Результаты такого лечения представлены на рисунке 2.

Рис.2. Дозы аллергоидов (I |) и аллергенов (RsN). введенные при иммунотерапии.

Учитывая более низкую аллергенную активность аллергоидов курс иммунотерапии аллергоидами бил начат в 100 раз более высокими дозами - 0.04 PNU , чем аллергенами - 0.0005 PNU ( р < 0.06 ). Выше была и конечная доза ( 837 PNU ), чем при лечении аллергенами I 547 PNU ) i р > 0.05 ). При этом общая за зе.сь курс I 2459 PNU ), поддерживающая ( 3692 РШ) и общая за иесь период иммунотерапии, включая поддерживающую, I 6x61 PNU ) дозы при лечении аллергоидами были также выше, чем у дольних, леченных аллергенами I соответственно: 2192 ( р>0.05 'ЛИ v р < О.Оо ) и 3.64 (. р > О.ОЬ) PNU).

Относительно более высокие дозы аллергоидов удалось ввести с достоверно меньшим количеством инъекций - 19, вместо 32 при лечении аллергенами ( р < 0.05 ), а длительность лечения сократить с 125 до 82 дней I р < 0.05 ).

В процессе иммунотерапии аллергоидами были отмечены только местные реакции, которые встречались в 2,Г/а случаев, в то время как в группе лечившихся аллергенами зарегистрированы как местные I 1,8/5 ), гак и общие С 1,0% ) реакции на введение препаратов, всего их было 2.8,3 случаев.

Клинический эффект иммунотерапии выражался в снижении или исчезновении симптомов заболевания в сезон цветения злаковых трав, сокращении сроков нетрудоспособности и уменьшении потребности в антигистаминных препаратах. Эффективность иммунотерапии аллергоидами была несколько выше ^ 3.2 балла ), чем аллергенами ( 2.6 балла ).

Кроме того, при изучении аллергенспецифических ан-

тител методом Кай нами было выявлено, что аллергоиды не способствуют повышению уровня содержания таких антител в крови во время иммунотерапии, что подтверидают представленные выше ре -зультаты исследования, разработанных нами аллергоидов, в других клиниках и свидетельствует об отсутствии дополнительной сенсибилизации больных при аллергоидотерапии.

Таким образом, результаты клинического испытания аллергоидов из пыльцы злаковых трав в различных клиниках страны показали, что более высокая терапевтическая эффективность достигается ими в более короткие сроки лечения, с меньшим числом инъекций и осложнений в сравнении с коммерческими аллергенами, что

явилось результатом возможности введения аллергоидов в относительно высоких дозах в силу низкой аллергенности аллергоидов.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые методом одноэтапной технологии получены оте -чественные моно- и микст-аллергоиды из пыльцы злаковых трав, обладающие сниженной аллергенностыа, высокими иммуногенными свойствами и терапевтической эффективностью.

2. Формальдегид вызывает общие для аллергоидов из пыльцы семейства злаковых ( тимофеевки, овсяницы, ежи изменения рН, свободных ¡ГН^-групп, электрофоретической подвижности, антигенное™ и аллергенности.

3. Общие для аллергоидов одного и того же семейства злаковых трав антигены устойчивы к денатурирующему влиянию фор -мальдегида, о чем свидетельствует их сохранение в аллергоидах, выявляемое в перекрестных реакциях.

4. Моно-аллергоиды и микст-аллергоиды из пыльцы злаковых трав обладают более высокой, чем аллергены, активностью инду -цировагь синтез гемагглвтиниругощих и преципитирующих специфи -ческих антител.

5. Способность аллергоидов взаимодействовать с кожносен-сибилизирующими антителами значительно ниже, чем аллергенов, что наиболее объективно выявляется при оценке кожной реакции методом 8Г (¡»¿/и /л<^ех ), который позволяет учитывать неспецифические реакции кожи на гистамин.

6. Аллергоиды из пыльцы злаковх трав вызывают высокий терапевтический эффект, который достигается в более короткий

срок, с меньшим количеством инъекций и аллергических осложнений, чем при лечении коммерческими аллергенами и является результатом введения относительно более высоких доз аллергена за счет низкой его аллергенносги.

Внедрение результатов исследований.

Разработана технология изготовления новых лечебных препаратов: аллергоидов из пыльцы тимоффевки, овсяницы, ежи и микст-аллергоидов из указанных выше видов пыльцы. Экспериментально-производственный регламент на аллергоид из пыльцы ежи, утвержден комитетом по аллергенам и иммунодиагностическим препаратам. Аллергоид освоен на производстве (, ЭПР № 210-89 от 28.06.88 г. ) и реализуется для нувд здравоохранения I реше -ние КШБП от 02.11.89 ).

СПИСОК РАЬОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Принципы биотехнологии в разработке аллергенов для печения аллергических заболеваний. (. соавт. В.Н.Райкис, Н.И.Во-ронкин, 0.А.Гамбург и др.)// Актуальные вопросы биотехнологии: Материалы Всесоюзной научной конференции ( январь 1987, Ленинград ) - М., 1937 - С. ¿70-172.

2. Экспериментальное обоснование технологии изготовления отечественных аллергоидов из пыльцы растений <, соавт. В.И.Воронин, В.Н.Райкис, ¿.Л.Махлиновская и др.)// Актуальные проб -теш прикладной иммунологии, биотехнологии и производства ¡актерийных препаратов - Пернь, 1988 - С. 109-161.

Имцунохиыическая и иммунологическая характеристика аллергоидов из пыльцы луговых трав I соаат. Ь.Н.Райкис, 5.Л. Ыахлиновская, З.К.йиллипова) // Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препарато) - Пермь, ^988 - С. .56-157.

4. Влияние специфической иммунотерапии на популяции и субпопуляции лимфоидшх клеток у больных поллинозом / Б.Н.Рай-кис, Г.Г.Еремин I/ Иммунология, Х99х - № 4.

5. Разработка и сравнительная оценка мультиаллергенного и моноаллергенного ОДА для скрининга аллергии к пыльце злаковых трав. С соавт. Г.Г.Головин, Л.Н.Стаценко, А.В.Ермолов.)// Международный симпозиум по аллергологии и имцунологии - Алма-Ата, ¿992 - С.22.

6. Статистический анализ показателей технологииеского процесса получения аллергоидов с применением ЭВМ // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии - Томск, 1991 - С. 84-85.

7. Информативность прик-теста при диагностике поллиноза аллергенами из пыльцы сорных, луговых трав, деревьев и других растений соавт. Б.Н.Райкис, Г.Г.Еремин )// Иммунология -.992 - С. д..