Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Создание диагностической панели препаратов для выявления аллергии к синантропным членистоногим

"5 ^

О

На правах рукописи

РАДИКОВА Ольга Вячеславовна

СОЗДАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ПАНЕЛИ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АЛЛЕРГИИ К СИНАНТРОПНЫМ ЧЛЕНИСТОНОГИМ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003470440

003470440

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Валентина Михайловна Бержец

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Татьяна Германовна Федоскова

Кандидат медицинских наук Светлана Николаевна Жирова

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича

Защита состоится 28 мая 2009 года на заседании диссертационного совета Д 001.035.01. при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан « » а 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

В последние годы в связи со значительным ростом уровня аллергических заболеваний среди населения большое внимание уделяется изучению спектра внутрижилищных аллергенов.

Известно, что одной из основных причин круглогодичных респираторных аллергозов (бронхиальная астма, аллергические бронхиты, аллергические риниты, аллергические кератоконъюнкгивиты и др.) являются аллергены внутрижшшщной среды обитания человека. В состав основного из них — аллергена домашней пыли - входят продукты жизнедеятельности различных организмов - спутников биоценоза человека: синантропные клещи, частицы насекомых, шерсть домашних животных, плесневые грибы и др., которые встречаются в жилище человека во всех регионах мира. Синантропные виды насекомых широко распространены в окружающей среде человека, являясь не только показателем санитарного неблагополучия жилья и переносчиками возбудителей инфекций, но и продуцентами аллергенов.

Причиной возникновения аллергических реакций наиболее часто являются синантропные виды тараканов, муравьи, мухи, моль. Группа насекомых, обитающих в жилище человека, входит в класс Insecto и относится к типу членистоногих (Arthropoda). К типу членистоногих относят и класс паукообразных. Среди всех групп беспозвоночных животных тип членистоногих отличается наибольшей распространенностью, разнообразием форм, мест обитания, огромным числом видов. Контакт с насекомыми может привести к развитию токсических, псевдоаллергических и аллергических реакций (Хаитов P.M., 2002, Юхтина Н.В., Ляпунов A.B., Рылеева И.В.,

2003).

Научными исследованиями показано, что 60-80% больных, страдающих бронхиальной астмой имеют сенсибилизацию к тараканам, в 10-29 % случаев регистрируются положительные кожные скарификационные пробы на экстракт аллергена из мух. Аллергические реакции на укусы кровососущих насекомых возникают у 17-20% лиц. Высокие показатели сенсибилизации к аллергенам членистоногих приводятся для США и Японии, несколько ниже цифры для стран Ближнего Востока, Израиля (Гущин И.С., Читаева В.Г. 2003).

С точки зрения способности вызывать аллергические реакции у людей наибольшую опасность представляют следующие виды членистоногих, обитающие на территории Европейской части России: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Nauphoeta cinerea), муха комнатная (Musca domestica), моль платяная (Tinea pelionella), клоп постельный (Cimex lectularis), муравей рыжий домовый (Monomorium pharaonis), паук домовый (Tegenaria derhami), комар обыкновенный (Culex pipiens), кожеед (Attagenus Smirnovi Zhari).

Аллергические реакции, вызываемые насекомыми или продуктами их жизнедеятельности, называют инсектной аллергией (лат. Insectum-насекомое). Инсектная аллергия в структуре аллергопатологии составляет 0,5 - 3,5 % (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И., 1995).

Инсектный материал может попадать в организм человека следующими путями: при соприкосновении с насекомыми, раздавливании, контакте с кожей, через рот с пищей, при вдыхании частиц тела насекомых или продуктов их жизнедеятельности, укусах, ужапениях насекомыми (Шульгин A.B., 1989, Гущин И.С., Читаева В.Г., 2003).

Сенсибилизация организма происходит вследствие контакта слизистых верхних дыхательных путей и кожи человека с частицами тела насекомых и продуктами их жизнедеятельности. Основные активные фракции инсектных

аллергенов обладают способностью легко проникать через слизистую и кожу. Патогенетические механизмы возникновения повышенной чувствительности к аллергенам насекомых могут проявляться в виде различных аллергических реакций, но наиболее распространены IgE-опосредованные реакции (Thomas Л.Е., Platts-Mills Т.А.Е., 2001).

Возникнув один раз, инсектная аллергия, как правило, с возрастом не исчезает, а больные нуждаются в специфической терапии препаратами инсектных аллергенов.

В настоящее время зарубежными компаниями созданы диагностические и лечебные препараты аллергенов рыжего, черного, американского тараканов, моли, оконных муравьев, существуют тест-системы для определения специфических lgE-антитсл к аллергенам жуков-кожеедов, личинок хирономид. Проведение аллергообследования в нашей стране ограничено из-за отсутствия отечественных диагностических аллергенов емнантролных членистоногих.

Последние данные о значимости инсектных аллергенов как причины развития аллергических заболеваний определили цели и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Приготовить диагностические аллергены из синантропных членистоногих и исследовать их физико-химические и иммунобиологические свойства.

Задачи исследования

1. Разработать технологию приготовления препаратов аллергенов из 11 членистоногих:

• не жалящих и не кусающих: -таракан рыжий (Blatteila germanica) -таракан черный (Blatta orientaHs)

-таракан американский (Periplaneta americana) -таракан пепельный (мраморный) (Nauphoeta cinerea) -моль платяная (Tinea pelionella) -паук домовый (Tegenaria derhamí) -кожеед {Attagenus Smirnovi Zhan);

• кусающих:

-муха комнатная (Musca domestica)

-муравей рыжий домовый (Monomorium pharaonis);

• кровососущих:

-клоп постельный (Cimeх ¡ectularis) -комар обыкновенный (Culex pipiens).

2. Изучить физико-химические свойства полученных препаратов инсектных аллергенов.

3. Оценить аллергенные и иммуногенные свойства приготовленных инсектных препаратов.

4. Оценить частоту сенсибилизации больных с аллергическими заболеваниями к инсектным аллергенам.

Научная новизна

Впервые в нашей стране разработан способ получения отечественных диагностических препаратов аллергенов из одиннадцати следующих членистоногих: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Nauphoeta cinerea), муха комнатная (Musca domestica), моль платяная (Tinea pelionella), клоп постельный (Cimeх lectularis), муравей

рыжий домовый (Мопотопит ркагаотз), наук домовый (Tcgenaria с1ег1гат1), кожеед (Лtlagenus 5гтгпоу'1 7Аап), комар обыкновенный (Сикх р'цпст), что отражено в заявке на изобретение «Способ получения диагностического аллергена» (№ 2007139159/15).

- Проведена оценка физико-химических свойств новых препаратов аллергенов. Инсектные аллергены гетерогенны по белковому составу, включают высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты. Выявлено, что все приготовленные препараты аллергенов из синантропных членистоногих имеют общий белковый компонент с молекулярной массой 20-30 кДа, что может свидетельствовать в пользу теории паналлергии.

- Все полученные экстракты аллергенов членистоногих обладают специфической активностью.

- Одиннадцать приготовленных аллергенов из синантропных членистоногих позволяют создать панель диагностических препаратов для выявления инсектной аллергии.

Практическая значимость

- Применение отдельных аллергенов и целой панели препаратов аллергенов из одиннадцати членистоногих позволит повысить качество диагностики и лечения аллергических заболеваний, расширит возможности иммуноферментного анализа в диагностике инсектной аллергии.

- Предложены санитарно-гигиенические мероприятия по борьбе с синантропными членистоногими, вызывающими аллергические реакции у людей, что отражено в методических рекомендациях для врачей «Диагностика и профилактика аллергических заболеваний, обусловленных сенсибилизацией к синантропным членистоногим».

Основные положения, выносимые на защиту

- Отработана технология получения отечественных препаратов инсектных аллергенов, обеспечивающая сохранение физико-химических свойств, стабильности и безопасности препаратов в течение двух лет.

- Приготовленные препараты инсектных аллергенов обладают высокой специфической активностью, которая установлена в реакциях in vitro (реакция непрямой дегрануляции тучных клеток, ИФА, реакция торможения ИФА, иммунодот) и in vivo (тест анафилаксии).

- Повышенные уровни IgE-AT к различным аллергенам членистоногих у больных бронхиальной астмой с бытовой сенсибилизацией свидетельствуют о диагностической значимости разработанных препаратов аллергенов из одиннадцати членистоногих.

Апробация материалов диссертации и публикации

Основные положения диссертации обсуждены на XI Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, IV Европейском конгрессе по астме (Тенерифе, Испания, 2006), VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии, V Европейском конгрессе по астме (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008).

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 95 листах машинописного текста, иллюстрированы 8 таблицами и 6 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Список цитируемой литературы включает 152 источника, в т.ч. 37 источников отечественной литературы.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Сырьем для получения диагностических препаратов служила смесь замороженных членистоногих каждого вида отдельно, предоставленная инсектарием НИИ дезинфекции и стерилизации.

Для получения препаратов из синантропных членистоногих адаптировали метод A. Coca (Coca A. et al., 1922).

Были приготовлены препараты аллергенов из одиннадцати следующих членистоногих: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Nauphoeta cinerea), муха комнатная {Musca domestica), моль платяная (Tinea pelionella), клоп постельный (Cimex lectularis), муравей рыжий домовый (Monomorium pharaonis), паук домовый ([Tegenaria derhami), кожеед (Attagenus Smirnovi Zhari), комар обыкновенный (Culexpipiens).

О безвредности и токсичности препаратов аллергенов судили по отсутствию признаков заболеваний, снижения массы тела, гибели подопытных животных после введения инсектных аллергенов (Фрадкин В .А., 1990).

В полученных препаратах инсектных аллергенов определяли количественное содержание белка в единицах белкового азота (PNU) методом Несслера и методом Бредфорда (Фрадкин В.А., 1990).

Анализ белкового состава полученных препаратов инсектных аллергенов проводили методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле по Laemmli (Laemmli, 1970; Остерман, 1981).

Сенсибилизирующие свойства полученных аллергенов изучали в опытах анафилаксии на морских свинках (Фрадкин В.А., 1990). Анафилактический шок вызывали двукратным введением препаратов. Первую сенсибилизацию проводили с неполным адъювантом Фрейнда. Разрешающую дозу вводили на 21 день после последней инъекции. Результаты регистрировали путем вычисления анафилактического индекса по формуле Вейгла.

Методы непрямой дегрануляции тучных клеток (НДТК) (Фрадкин В.А., 1990) и твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) (Геразиева В.Б. и др., 1986) использовали для подтверждения аллергенной активности препаратов. Антигенность полученных экстрактов изучали с помощью иммунодота с определением lg G-AT (Михайлов А.Т., Симирский В.Н., 1991) и в реакции торможения ИФА (Жирова С.Н., 1998).

В тесте НДТК использовали сыворотки больных бронхиальной астмой с известной сенсибилизацией к клещам домашней пыли и водно-солевые экстракты инсектных аллергенов. Контролем служили: спонтанная дегрануляция тучных клеток и секреторный ответ тучных клеток, обработанных полученными инсектными аллергенами. Результат считали отрицательным, если процент дегранулированных клеток был менее 7.

Методом твердофазного ИФА в сыворотках крови больных определяли специфические IgE-AT к спектру полученных аллергенов членистоногих. В опыте использовали 80 сывороток больных атопической бронхиальной астмой с бытовой сенсибилизацией. Уровень IgE-AT оценивали в условных

единицах и распределяли но классам от 0 до 4. Специфичность определения 1пЕ-ЛТ была обусловлена использованием коммерческих конъюгатов моноклональных анти-^Е-АТ с пероксидазой корня хрена («Полигност», Санкт-Петербург).

Антигенные свойства приготовленных аллергенов оценивали методом иммунодота (Михайлов А.Т., Симирский В.Н., 1991). Водно-солевые экстракты инсектных аллергенов наносили на нитроцеллюлозные мембраны в концентрации 1мкг/мкл. В качестве негативных контролей наносили на мембраны экстракт из пыльцевых аллергенов, бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мкг/мкл и 1мкл фосфатно-солевого буфера Эванса-Кока. В качестве положительных контролей использовали специфические 1§0-АТ человека. Обработку результатов проводили денситометрическим методом с помощью программы 1та§е<3иап1.

Исследование специфической активности разработанных препаратов аллергенов членистоногих проводили в реакции торможения ИФА. Высокотитражные сыворотки больных бронхиальной астмой (3-4 класс 1§Е-АТ в реакции ИФА ко всем из вышеперечисленных препаратов) истощали заранее приготовленными 2-х кратными разведениями полученных препаратов инсектных аллергенов в равных объемах. Смеси сывороток и аллергенов инкубировали 1 час при температуре 37°С, а затем вносили в лунки планшетов, сорбированных теми же препаратами инсектных аллергенов. Реакцию проводили по общепринятой схеме ИФА.

Специфическую активность препаратов аллергенов учитывали по проценту снижения оптической плотности в сравнении с положительным контролем.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Исходя из задач исследования, на первом этапе были приготовлены водно-солевые экстракты инсектных аллергенов по методу А.Соса в нашей модификации.

В отличие от общепринятой методики в качестве исходного мы использовали предварительно измельченное сырьё из замороженных синантропных членистоногих и экстрагирование проводили в два этапа, используя двойное измельчение и обезжиривание.

Приготовленные водно-солевые экстракты аллергенов из одиннадцати различных членистоногих представляли собой прозрачную жидкость, от светло-желтого до коричневого (в зависимости от вида насекомого) цвета, без осадка, с рН 7,2.

Безвредность и токсичность полученных препаратов проверяли на белых мышах и морских свинках. Животным вводили экстракты инсектных аллергенов в объеме 0,5 мл. Введение препаратов не вызывало признаков интоксикации, снижения массы тела, гибели животных, что свидетельствует о безвредности и не токсичности полученных препаратов аллергенов.

Приготовленные препараты аллергенов испытывали на стабильность. Экстракты хранили при температуре +4°С. Определение физико-химических свойств и содержания белка проводили через 1 год, 1,5 года , 2 года. За это время препараты инсектных аллергенов не меняли своих физических свойств, оставались стерильными и безвредными.

Таким образом, полученные препараты инсектных аллергенов были стабильны, безвредны и нетоксичны.

Высокое содержание белка обнаружилось в препаратах аллергенов моли, кожееда, пепельного таракана, муравья (табл_№1).

Таблица № 1

Содержание белка в приготовленных препаратах инсектных аллергенов

Препарат инсектных Содержание белка (PNU)

аллергенов

Пепельный таракан 10000± 816

Рыжий таракан 56001370

Черный таракан 5800+900

Американский таракан 35001330

Муха домашняя 6000+1300

Моль 25000+800

Клоп постельный 58001900

Муравей рыжий 76001590

Паук домовый 7000+165

Кожеед 1080011000

Комар обыкновенный 71001325

Анализ белкового состава полученных препаратов инсектных аллергенов проводили методом вертикального электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле. Результаты электрофореза показали, что исследуемые препараты представляют собой смесь высокомолекулярных и низкомолекулярных белков. В таблице № 2 показаны значения молекулярной массы белковых фракций, выделенных при электрофорезе приготовленных препаратов инсектных аллергенов. Как видно из результатов, при электрофоретичсском разделении аллергенов различных насекомых большая часть выделенных фракций находилась в диапазоне Мм 45 - 60 кДа и 20 - 30 кДа (рис.1). Подобные данные о выделенных фракциях аллергенных экстрактов насекомых встречаются и в работах других авторов (Kang B.C., 1991, Иванов В. Д., 1998, Chapman M.D., 2000, Daroca Р, 2000, Focke М., 2003). Эти фракции - общие для различных инсектных аллергенов могут быть названы «паналлергенами».

Таблица № 2

Сравнительная таблица молекулярной массы белковых фракций приготовленных препаратов инсектных аллергенов с данными литературы

Препараты инсектных аллергенов Молекулярные массы белковых фракций инсектных аллергенов (кДа)

собственные данные данные литературы

Рыжий таракан 18-60 18,20,23,25,36, 90

Черный таракан 20-35; 65 20, 27, 36, 52,65

Американский 20,45 28, 32,45,72, 78

таракан

Пепельный таракан 20-40; 65 Не известно

Муха комнатная 31 17,27,31,34,36

Моль платяная 20-40 24,31,34

Муравей рыжий 18,21,31,45-60 13-24

Клоп постельный 40-60 18-20

Паук домовый 26,35,38, 45,110 19,26,35,38, 110

Комар 20-95 30, 37,68

обыкновенный

Кожеед 20 10,55

Рис.1. Электрофореграммы экспериментальных препаратов инсектных аллергенов:

А. 1 - белковые маркеры («Pharmacia»,Швеция): 94,6 кДа - cellulase, 66,2 кДа -BSA, 45 кДа -ovalbumin, 31 кДа - carbonic anhidrase, 21,5 кДа - tripsin inhibitor, 14,4 кДа - lisozim; 2 -аллерген из рыжего таракана, 3 - аллерген из черного таракана, 4 - аллерген из американского таракана, 5 - аллерген из пепельного таракана, 6 - аллерген из мухи; Б. 1 - белковые маркеры («Pharmacia»,Швеция), 7 - аллерген из моли, 8 - аллерген из кожееда, 9 - аллерген из паука, 10 - аллерген из клопа, 11 - аллерген из муравья, 12 -аллерген из комара

Специфическую активность полученных экстрактов изучали в тесте анафилаксии, методом НДТК, в реакции иммунодота и с помощью твердофазного ИФА.

В опытах анафилаксии у большинства сенсибилизированных морских свинок на внутривенные введения экстрактов инсектных аллергенов отмечали положительные реакции. Показания анафилактического индекса, вычисленного по формуле Вейгла, выявили, что более выраженными сенсибилизирующими свойствами обладают аллергены рыжего таракана, моли, муравья и клопа (индекс 1,3-1,5), а слабовыраженной активностью -препараты аллергенов паука и комара (индекс 0,8). Препараты аллергенов черного, американского, пепельного тараканов, мухи и кожееда имели индекс Вейгла 1-1,1, что также подтверждает их сенсибилизирующие свойства (табл. № 3).

Таблица № 3

Выраженность анафилактического шока у морских свинок в ответ на

сенсибилизацию разными видами инсектных аллергенов

Препараты инсектных аллергенов Кол - во животных Количество животных с проявлениями анафилактического шока Индекс Вейгла

- + + + + + + + + + +

Рыжий таракан 6 - 3 3 - - 1,5

Черный таракан 6 - 6 - - - 1,0

Американский таракан 6 - 6 - - - 1,0

Пепельный таракан 6 1 4 - 1 - 1,1

Моль 6 - 5 - 1 - 1,3

Комнатная муха 6 1 3 2 - - 1,1

Клоп постельный 6 - 4 2 - - 1,3

Муравей рыжий 6 1 3 1 1 - 1,3

Кожеед 6 - 6 - - - 1,0

Паук домовый 6 1 5 - - - 0,8

Комар 6 1 5 - - - 0,8

Контрольная группа 10 10 - - - - 0

Методом НДТК была подтверждена специфическая активность приготовленных препаратов инсектных аллергенов. Процент дегрануляции тучных клеток при активации их различными аллергенами составил от 18 до 48, что было достоверно выше (р < 0,05) уровня спонтанной дегрануляции, которая равнялась 5-7% (табл. № 4). Наибольшую дегрануляцию тучных клеток вызывали препараты аллергенов рыжего и черного тараканов, комнатной мухи и муравья, что свидетельствует об их высокой специфической активности. Более низкий процент дегранулированных тучных клеток отмечался при использовании препаратов аллергенов паука, пепельного таракана, кожееда (рис.2).

Метод НДТК, где пассивно сенсибилизированные тучные клетки животных в присутствии причинно-значимого аллергена частично или полностью дегранулируют, свидетельствует об аллергенной активности исследуемых препаратов.

Таблица № 4

Оценка активности препаратов аллергенов насекомых в тесте НДТК

Инсектный аллерген Спонтанная дегрануляция тучных клеток (%) Процент дегранулированных тучных клеток (%)

Пепельный таракан 5,5±1,5 29+3,8

Рыжий таракан 5,0±0,6 45+5,4

Черный таракан 6,0±1,4 48±5,4

Американский таракан 5,0±0,6 37±5,8

Моль 5,5±1,5 32+4,5

Комнатная муха 7,0±1,0 44+4,7

Клоп постельный 5,0+0,6 30±5,2

Паук домовый 5,0±0,6 28±4,8

Муравей рыжий 6,0+1,4 45+5,4

Комар обыкновенный 5,5±1,5 39+5,3

Кожеед 5,0±0,6 18±3,0

препараты инсекп

■ черный таракан шмуха и муравей

■ пепельный таракан □ рыжий таракан американский таракан в моль клоп а паук

комар □ кожеед

Рис. 2. Оценка специфической активности препаратов аллергенов членистоногих в тесте НДТК.

Методом иммунодота показана способность полученных инсектных аллергенов связывать ^С-АТ, что свидетельствует о наличии антигенной активности у препаратов. В опыте использованы сыворотки десяти больных бронхиальной астмой с известной бытовой сенсибилизацией. Контролем служили сыворотки больных, страдающих поллинозом. После сканирования мембран результаты иммунодота оценивали по интенсивности окрашивания нитроцеллюлозной мембраны. Обработку результатов проводили денситомстрическим методом с помощью программы 1п^еС)иагй.

Результаты эксперимента показали, что наибольшей антигенностью обладали препараты аллергенов рыжего, черного, американского тараканов, мухи и муравья, где показатели интенсивности окрашивания, выраженные в абсолютных значениях, превысили контроль в 2,5 раза и выше. Низкую

реактивность в отношении ^О-ЛТ отмечали у препаратов аллергенов, полученных из кожееда, клопа, паука (рис.3).

1 - суммарные 1$0-антитела человека (50 мкг/мл);

2 - аллерген из рыжего таракана (1 мкг/мкл);

3 - аллерген из черного таракана (1 мкг/мкл);

4 - аллерген из американского таракана (1 мкг/мкл);

5 - аллерген из пепельного таракана (1 мкг/мкл);

6 - аллерген из комнатной мухи (1 мкг/мкл);

7 - аллерген из платяной моли (1 мкг/мкл);

8 - аллерген из постельного клопа (1 мкг/мкл);

9 - аллерген из кожееда (1 мкг/мкл);

10 - аллерген из комара (1 мкг/мкл);

11 - аллерген из паука (1 мкг/мкл);

12 - аллерген из муравья (1 мкг/мкл);

13 - аллерген из золотарника канадского (1 мкг/мкл);

14 - фосфатно-солевой буфер Эванса - Кока

Рис. 3. Схема микроточечного иммунодота

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) проводили с целью выявления диагностической значимости разработанных инсектных аллергенов и определения частоты встречаемости аллергии к насекомым в общей картине сенсибилизации к домашней пыли.

Результаты ИФА, представленные в таблице № 5, показали, что в сыворотках 43 пациентов (53%) выявлены специфические ^Е-АТ к аллергену рыжего таракана, у 37 пациентов (46%) выявлены ^Е-АТ к аллергенам черного и пепельного тараканов, у 38 (47%) - к аллергену американского таракана, 31 пациент (38%) сенсибилизированы к аллергену муравья, 29 (36%) - к аллергену клопа, 27 (33 %) - к аллергену мухи, 16 (20%) - к аллергенам моли и паука, 14 (17%) - к аллергену комара, 11 (13 %) - к аллергену кожееда. Достоверной разницы между уровнем

сенсибилизации к различным инсектным аллергенам из групп не кусающих, кусающих и кровососущих обнаружено не было (р > 0,1).

Количество аллергенспецифических ^Е-АТ соответствовало 1, 2, 3 и 4 классам реакции ИФА. Более высокие уровни 1§Е-ЛТ (3-4 класс) определялись в опытах с аллергенами рыжего таракана, черного таракана, американского таракана, пепельного таракана, комнатной мухи, постельного клопа, комара. Возможно, это связано с различной распространенностью внутрижилищных насекомых (большей среди тараканов, мух, меньшей -кожееды, пауки). Повышению концентрации аллергенов насекомых и большей продолжительности их воздействия способствуют такие факторы, как длительное пребывание в помещении и уменьшение естественной вентиляции жилищ. По данным разных авторов аллергия к тараканам диагносцировалась у 36,8 % - 63,5 % детей с бронхиальной астмой.

Таблица № 5

Показатели уровней специфических 1§Е-антител к различным препаратам инсектных аллергенов в реакции ИФА

Препараты инсектных аллергенов Общее число исследуемых сывороток Число сывороток с ^Е-АТ к инсектным аллергенам в классах реакции ИФА

всего 1класс 2класс 3 класс 4 класс

Рыжий таракан 80 43 21 12 6 4

Пепельный таракан 80 37 22 9 5 1

Черный таракан 80 37 20 9 6 2

Американский таракан 80 38 24 7 6 1

Муравей рыжий 80 31 18 9 2 1

Клоп постельный 80 29 19 5 3 2

Муха комнатная 80 27 18 6 2 1

Моль платяная 80 16 10 4 2 0

Паук домовый 80 16 7 7 2 0

Комар обыкновенный 80 14 4 5 2 3

Кожеед 80 11 10 1 0 0

Исследование специфической активности разработанных препаратов инсектных аллергенов проводили в тесте торможения ИФА с сыворотками, которые показали высокие классы в реакции ИФА. В качестве контроля использовали аллерген коровьего молока.

Снижение оптической плотности было получено только в опыте с препаратом из американского таракана. Чем выше была доза препарата аллергена, тем ниже оптическая плотность. В реакциях торможения ИФА с другими препаратами инсектных аллергенов таких убедительных данных получено не было. Очевидно, это связано с наличием перекрестно-реагирующих антигенов у данной группы препаратов.

Принимая во внимание, что большинство аллергенных белков насекомых схожи по структуре, что приводит к перекрестным аллергическим реакциям, во второй части эксперимента сыворотки больных мы истощали одним аллергеном, а лунки планшетов сорбировали другим аллергеном. В результате полученной разницы в значениях оптической плотности можно полагать о существовании перекреста между разными инсектными аллергенами (что косвенно доказывает их специфическую активность).

При истощении сывороток аллергенами молока эффекта «обратной раститровки» не наблюдалось и оптическая плотность образцов сыворотки практически не изменялась (0,4-0,6).

OD 409

Л - аллерген из американских тараканов (Periplaneta americana); В - аллерген из молока; С - фоновое значение

0.7 • А

А

... В

— с

0.6

0.5

о

0,4

В

0.3

02

0,1

С

о

Oí 1,0 1.S 2,0 2,5 3,0 3,5

Концентрация аллергена, мкг/мл

Рис.4 Снижение оптической плотности сывороток в реакции ингибиции ИФА с инсектными аллергенами

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что препараты, полученные из синантропных членистоногих, отвечают требованиям, предъявляемым к диагностическим видам аллергенов. Они стабильны, безопасны, обладают специфической активностью. Используя препараты аллергенов из различных членистоногих в тестах in vitro, был продемонстрирован их вклад в общую структуру пылевой сенсибилизации больных атопической бронхиальной астмой. По результатам проведенного ИФА все обследованные больные имели полисенсибилизацию разной степени выраженности к инсектным аллергенам. Это свидетельствует об этиологической значимости полученных инсектных аллергенов, необходимости создания панели диагностических препаратов для выявления инсектной аллергии и возможного проведения специфической иммунотерапии.

ВЫВОДЫ

1. Впервые создана диагностическая панель отечественных препаратов инсектных аллергенов из одиннадцати наименований: таракан рыжий (Blattella germanica), таракан черный (Blatta orientalis), таракан американский (Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Nauphoeta cinerea), муха комнатная (Musca domestica), моль платяная (Tinea pelionella), клоп постельный (Cimex lectularis), муравей рыжий домовый (Monomoñum pharaonis), паук домовый (Tegenaria derhami), кожеед (Attagenus Smirnovi Zhan), комар обыкновенный (Culexpipiens).

1. Экспериментальные препараты инсектных аллергенов безвредны, нетоксичны и сохраняют свои физико-химические свойства в течение двух лет.

3. Новые препараты аллергенов из синантропных членистоногих гетерогенны по белковому составу и обладают высокой специфической активностью в реакциях in vitro и in vivo.

4. Диагностическая значимость панели инсектных аллергенов показана для больных бронхиальной астмой с бытовой сенсибилизацией: процент сенсибилизации составил 13% - 53%. Выявлено, что наибольшее количество пациентов сенсибилизированы к аллергенам рыжего и американского тараканов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бержец В.М., Радикова О.В., Хлгатян C.B., Кропотова И.С., Петрова Н.С., Бержец А.И. Создание панели инсектньгх аллергенов и оценка их иммунобиологических свойств // Аллергология и иммунология. - 2005.- Т.6.

- №3.-С.352.

2. Бержец В.М., Кропотова И.С., Хлгатян C.B., Радикова О.В. Совершенствование методов диагностики аллергии к синантропным членистоногим /У Научные труды VI Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке». - 2005. - С.80.

3. Бержец В.М., Кропотова И.С., Радикова О.В. Изучение специфической активности полученных водно-солевых экстрактов инсектных аллергенов//Аллергология и иммунология. - 2006.- Т. 7. — №1.

- С.ЗЗ.

4. Бержец В.М., Радикова О.В., Кропотова И.С., Бержец А.И. Роль аллергенов из насекомых жилища в развитии аллергических заболеваний // Иммунопатология, аллергология и инфектология. - 2006.- №2.- С.49-55.

5. Бержец В.М., Радикова О.В., Хлгатян C.B., Кропотова И.С., Бержец А.И. Оценка специфической активности препаратов аллергенов из синантропных насекомых // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии (ЖМЭИ). - 2006. - № 7. - С.74-78.

6. Бержец В.М., Радикова О.В., Кропотова И.С., Бержец А.И. Роль инсектных аллергенов в развитии аллергических заболеваний // Аллергология и иммунология. - 2006. - 1.1. ~ № 3. - С.278.

7. Бержец В.М., Коренева Е.А., Радикова О.В., Хлгатян C.B., Кропотова И.С., Петрова Н.С., Бержец А.И. Препараты для диагностики и лечения аллергии к синантропным членистоногим // Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней. - 2006. - С.22-23.

8. Бержец В.М., Радикова О.В., Кропотова И.С., Бержец А.И. Приготовление и исследование специфических свойств препаратов инсектных аллергенов // Научные труды VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке». - 2006. -С.71-72.

9. Бержец В.М., Пронькина О.В., Хлгатян C.B., Радикова О.В. Частота выявления сенсибилизации к пыльце растений у детей, проживающих в Тульской области // Иммунопатология, аллергология и инфектология. - 2006.

- Х°4-С.41-44.

10. Кропотова И.С., Бержец В.М., Радикова О.В., Бержец А.И. Аллергия к синантропным членистоногим // Аллергология и иммунология. -2006. - Т. 7. - № 2. - С.224-229.

11. Бержсц В.М., Коренева Е.А., Радикова О.В., Хлгатян C.B., Кропотова И.С., Петрова Н.С., Бержец А.И., Емельянова O.IO. Инсектные диагностические и лечебные аллергены // Российский аллергологический журнал. - 2007. - № 3. - приложение 1. - С.159.

12. Бержец В.М., Коренева Е.А., Радикова О.В., Хлгатян C.B., Кропотова И.С., Петрова Н.С., Бержец А.И., Басилая A.B. Новые диагностические и лечебные аллергены // Аллергология и иммунология. -2007,- Т. 8.- № 1.-С.25.

13. Бержец В.М., Радикова О.В., Хлгатян C.B., Кропотова И.С., Шевченко М.А. Изучение диагностических препаратов инсектных аллергенов // Сборник тезисов II национального конгресса «Современное состояние и перспективы иммунологической диагностики и коррекции вирусных и бактериальных инфекций». - 2007.- С.189-195.

14. Бержец В.М., Радикова О.В., Кропотова И.С., Хлгатян C.B., Шевченко М.А. Оценка специфической активности полученных водно-солевых экстрактов инсектных аллергенов // Российский аллергологический журнал. - 2008.- № 1.- приложение 1.- С.44-45.

15. Бержец В.М., Радикова О.В., Кропотова И.С., Хлгатян C.B. Создание панели диагностических инсектных аллергенов // Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - 2008.- С.22.

16. Радикова О.В., Кропотова И.С., Хлгатян C.B., Петрова Н.С., Бержец

B.М. Исследование иммунобиологических свойств полученных водно-солевых экстрактов инсектных аллергенов // Педиатрическая фармакология. - 2008.-Т.5,- №5.- С.48-51.

17 .Бержец В.М, Радикова О.В., Кропотова И.С., Хлгатян C.B.. Диагностика и профилактика аллергических заболеваний, обусловленных сенсибилизацией к синантропным членистоногим // Научные труды IX Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» - 2008. -

C.141-142.

Подписано в печать:

24.04.2009

Заказ № 1937 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

По данным многочисленных исследований распространенность аллергических заболеваний во всем мире постоянно увеличивается. В экологически неблагоприятных регионах заболеваемость аллергией может достигать 50-60% (Ильина Н.И., 1996; Гущин И.С., 2006). В связи с этим и отечественные и зарубежные исследователи полагают, что такие заболевания, как бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит приобретают эпидемический характер (Ring J., 1991; Хаитов P.M. с соавт., 1995; Barret К., 2000; Thomas n., 2001; Мачарадзе д.Ш. с соавт., 2005).

Многие аллергические заболевания начинают формироваться в детском возрасте. Недооценка симптомов аллергических заболеваний и поздняя диагностика в раннем возрасте приводит к прогрессированию болезни, утяжелению его течения, ухудшению прогноза и ранней инвалидизации детей. В ряде случаев формирование аллергических заболеваний происходит в условиях внутрижилищной среды. Учитывая, что дети большую часть времени проводят в условиях внутренней среды жилых и общественных зданий, появилась необходимость изучения факторов, оказывающих негативное влияние на их здоровье.

Этиологическая роль внутрижилищных аллергенов в возникновении аллергических болезней очень велика [4,5,10,120,121,126]. Наибольшую роль в этом играет домашняя пыль, которая является многофакторной по составу. Источниками аллергенов в составе домашней пыли могут быть и частицы членистоногих и продукты их жизнедеятельности. Контакт людей с синантропными членистоногими возможен на предприятиях сельскохозяйственного профиля, в жилищах, детских дошкольных и школьных учреждениях, лечебно-профилактических учреждениях, офисах, предприятиях общественного питания, транспорте. Синантропные виды членистоногих широко распространены в окружающей среде человека, являясь не только показателем санитарного неблагополучия жилья и 3 переносчиками возбудителей инфекций, но и продуцентами аллергенов [32,147,149,150]. Причиной возникновения аллергических реакций наиболее часто являются синантропные виды тараканов, муравьи, мухи, моль. Членистоногие могут вызывать разнообразные по тяжести и клиническим проявлениям патологические реакции — от легкого раздражения кожи до анафилактического шока с летальным исходом. Повышенная чувствительность к внутрижилищным аллергенам приводит к развитию бронхиальной астмы, тогда как сенсибилизация к сезонным аэроаллергенам связана с развитием аллергического ринита.

Проявления аллергии к синантропным членистоногим могут носить полисимптоматический характер, иметь длительный латентный период и круглогодичное течение в отличие от сезонной аллергии к членистоногим, которые обитают в открытой природе [7]. Полисимптоматический характер инсектной аллергии привносит значительные трудности в диагностику данной группы заболеваний. Подтвердить диагноз инсектной аллергии помогают специфические методы обследования, при которых используются водно-солевые экстракты аллергенов членистоногих. Возникнув один раз, инсектная аллергия, как правило, с возрастом не исчезает, а больные нуждаются в специфической терапии препаратами инсектных аллергенов [13,29,46].

В настоящее время зарубежными компаниями созданы диагностические и лечебные препараты аллергенов рыжего, черного, американского тараканов, моли, оконных муравьев, существуют тест-системы для определения специфических IgE-AT к аллергенам жуков-кожеедов, личинок хирономид. Проведение аллергообследования в нашей стране ограничено из-за отсутствия диагностических аллергенов синанатропных членистоногих. В отечественной аллергологической практике разрешен к применению только препарат аллергена комара вида Aedes aegypti.

Последние данные о значимости аллергенов синантропных членистоногих в развитии аллергических заболеваний и отсутствие отечественных лечебно-диагностических препаратов инсектных аллергенов определили цели и задачи настоящего исследования.

Цель работы: приготовить диагностические аллергены из синантропных членистоногих и исследовать их физико-химические и иммунобиологические свойства.

В соответствии с поставленной целью необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать технологию приготовления препаратов аллергенов из 11 членистоногих:

• не жалящих и не кусающих: -таракан рыжий {Blattella germanica) -таракан черный (Blatta orientalis)

-таракан американский (Periplaneta americana) -таракан пепельный (мраморный) {Nauphoeta cinerea) -моль платяная (Tinea pelionella) -паук домовый (Tegenaria derhami) -кожеед {Attagenus Smirnovi Zhan);

• кусающих:

-муха комнатная {Musca domestica)

-муравей рыжий домовый {Monomorium pharaonis);

• кровососущих:

-клоп постельный {Cimex lectularis) -комар обыкновенный {Culex pipiens).

2. Изучить физико-химические свойства полученных препаратов инсектных аллергенов.

3. Оценить аллергенные и иммуногенные свойства приготовленных инсектных препаратов.

4. Оценить частоту сенсибилизации больных с аллергическими заболеваниями к инсектным аллергенам.

Научная новизна:

- Впервые в нашей стране разработан способ получения отечественных диагностических препаратов аллергенов из одиннадцати следующих членистоногих: таракан рыжий {Blattella germanica), таракан черный {Blatta orientalis), таракан американский {Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) (Nauphoeta cinerea), муха комнатная {Musca domestica), моль платяная {Tinea pelionella), клоп постельный {Cimex lectularis), муравей рыжий домовый {Monomorium pharaonis), паук домовый {Tegenaria derhami), кожеед {Attagenus Smirnovi Zhan), комар обыкновенный {Culex pipiens), что отражено в заявке на изобретение «Способ получения диагностического аллергена» (№ 2007139159/15).

- Проведена оценка физико-химических свойств новых препаратов аллергенов. Инсектные аллергены гетерогенны по белковому составу, включают высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты. Выявлено, что все приготовленные препараты аллергенов из синантропных членистоногих имеют общий белковый компонент с молекулярной массой 20-30 кДа, что может свидетельствовать в пользу теории паналлергии.

- Все полученные экстракты аллергенов членистоногих обладают специфической активностью.

- Одиннадцать приготовленных аллергенов из синантропных членистоногих позволяют создать панель диагностических препаратов для выявления инсектной аллергии.

Практическая значимость:

- Применение отдельных аллергенов и целой панели препаратов аллергенов из одиннадцати членистоногих позволит повысить качество диагностики и лечения аллергических заболеваний, расширит возможности иммуноферментного анализа в диагностике инсектной аллергии.

- Предложены санитарно-гигиенические мероприятия по борьбе с синантропными членистоногими, вызывающими аллергические реакции у людей, что отражено в методических рекомендациях для врачей «Диагностика и профилактика аллергических заболеваний, обусловленных сенсибилизацией к синантропным членистоногим».

Основные положения, выносимые на защиту:

- Отработана технология получения отечественных препаратов инсектных аллергенов, обеспечивающая сохранение физико-химических свойств, стабильности и безопасности препаратов в течение двух лет.

- Приготовленные препараты инсектных аллергенов обладают высокой специфической активностью, которая установлена в реакциях in vitro (НДТК, ИФА, реакция торможения ИФА, иммунодот) и in vivo (тест анафилаксии).

- Повышенные уровни IgE-AT к различным аллергенам членистоногих у больных бронхиальной астмой с бытовой сенсибилизацией свидетельствуют о диагностической значимости разработанных препаратов аллергенов из одиннадцати членистоногих.

выводы.

1. Впервые создана диагностическая панель отечественных препаратов инсектных аллергенов из одиннадцати наименований: таракан рыжий {Blattella germanica), таракан черный {Blatta orientalis), таракан американский {Periplaneta americana), таракан пепельный (мраморный) {Nauphoeta cinerea), муха комнатная {Musca domestica), моль платяная {Tinea pelionella), клоп постельный {Cimex lectularis), муравей рыжий домовый {Monomorium pharaonis), паук домовый {Tegenaria derhami), кожеед {Attagenus Smirnovi Zhan), комар обыкновенный {Culex pipiens).

2. Экспериментальные препараты инсектных аллергенов безвредны, нетоксичны и сохраняют свои физико-химические свойства в течение двух лет.

3. Новые препараты аллергенов из синантропных членистоногих гетерогенны по белковому составу и обладают высокой специфической активностью в реакциях in vitro и in vivo.

4. Диагностическая значимость панели инсектных аллергенов показана для больных бронхиальной астмой с бытовой сенсибилизацией: процент сенсибилизации составил 13% - 53%. Выявлено, что наибольшее количество пациентов сенсибилизированы к аллергенам рыжего и американского тараканов.

5.3аключение

Инсектная аллергия остаётся ещё малоизученной областью медицины, а быстрый рост заболеваемости атопией, утяжеление течения аллергических заболеваний и, как следствие, инвалидизация населения диктуют необходимость выявлять новые источники аллергенов.

Актуальность проблемы инсектной аллергии носит как медицинский, так и социальный характер, и связана с широкой распространенностью синантропных членистоногих, вызывающих аллергические реакции, а также с отсутствием новых диагностических препаратов инсектных аллергенов.

Учитывая вышесказанное, целью настоящего исследования является приготовление диагностических аллергенов из синантропных членистоногих и исследование их физико-химических и иммунобиологических свойств.

II. МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ

2.1. Технология получения препаратов аллергенов из синантропных членистоногих

Препараты аллергенов из синантропных членистоногих приготавливают методом A. Coca [32]. Это общепринятый метод получения неинфекционных аллергенов водно-солевой экстракцией активных компонентов сырья.

Согласно применяемой технологии процесс получения препаратов инсектных аллергенов включает следующие этапы:

• Подготовка сырья к экстракции (обезжиривание)

• Экстрагирование буферным раствором следующего состава: реактив 1 - 0,5л (NaCl-50rp., KH2P04-3,33rp., Na2HP04-14,30rp.) и реактив 2 - 0,5л (фенол 4%) плюс дистилированная вода - 4л.

• Центрифугирование

• Стерилизующая фильтрация

• Диализ

• Получение готовой формы

Готовые формы доводят до требуемой концентрации и разливают в стерильные флаконы.

2.2. Определение безвредности и токсичности препаратов инсектных аллергенов

Данное исследование осуществляется на двух видах животных: белых мышах и морских свинках, не использованных ранее в опытах. Исследуемый препарат вводят мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл и морским свинкам подкожно по 1 мл. Наблюдают за животными в течение 7 дней [32].

О безвредности и токсичности препаратов аллергенов судят по отсутствию признаков заболеваний, снижения массы тела, гибели животных.

2.3.Определение содержания белка в препаратах инсектных аллергенов

Количественное содержание белка водно-солевых экстрактов аллергенов определяют методами Несслера и Бредфорда [32].

Метод Несслера основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония, образующимися после минерализации белковых продуктов. В центрифужную пробирку вносят пипеткой 5 мл препарата и добавляют 80%-й раствор трихлоруксусной кислоты. Пробу оставляют на 20 часов при температуре 4-8°С. Осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения 2000 об/мин в течение 30 минут, промывают 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, вновь центрифугируют в тех же условиях и удаляют надо садочную жидкость. К осадку прибавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Затем пробу минерализуют на песочной бане не менее 10 часов до обесцвечивания содержимого пробирки. Для колориметрирования в пробирку добавляют 100 мл реактива Несслера. Реактив Несслера включает: ртуть двуйодистая — Юг, калия йодид — 5г, натрия гидроксид -20г, вода —100мл. Оптическую плотность раствора определяют на спектрофотометре при длине волны 400 нм. В качестве контрольной пробы используют 0,1 мл концентрированной серной кислоты. Чувствительность метода 0,01 мг/мл препарата.

Метод Бредфорда основан на изменении окраски Кумасси С-250 при связывании его с белком. К 4,5 мл раствора исследуемого образца добавляют 1,5 мл красителя Кумасси С-250 . Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 620нм. Для контроля используют пробу не содержащую белок. Концентрацию белка в препаратах аллергенов определяют по калибровочному графику. В качестве стандарта используют бычий сывороточный альбумин («Serva» Германия). Чувствительность метода 0,01 мг/мл препарата.

2.4.Электрофорез в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия (PAGE-SDS)

Изучение фракционного состава водно-солевых экстрактов аллергенов проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Laemmli (Laemmli, 1970; Остерман, 1981) [24]. Используют вертикальную электрофорезную камеру. Для проведения электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия готовят концентрирующий и разделяющий гели в следующих объемах:

Концентрирующий гель АА/бисАА 0,32 мл

TrisCl/SDS рН 6,8 0,6 мл Вода 1,5 мл

ПСА 10% 0,025 мл персульфат аммония) TEMED 0,005 мл тетраэтилендиамид)

Разделяющий гель (10%) АА/бисАА 1,7 мл

TrisCl/SDS рН 8,8 1,25 мл Вода 2,08 мл

ПСА 10% 0,025 мл

TEMED 0,005 мл

Перед добавлением персульфата аммония проводят дегазацию раствора, т.к. молекулярный кислород может подавить процесс полимеризации и исказить условия проведения реакции. После добавления персульфата аммония разделяющий гель заливают между пластинками камеры, затем наносят концентрирующий гель. В раствор концентрирующего геля вставляют гребенку, которая создает лунки для нанесения образцов. Полимеризация проходит в течение 45 минут. По окончании полимеризации гель помещают в электрофорезную камеру, в которую добавляют электродный буфер: Глицин 72г Трис 15,125г SDS 5г Вода до 500мл

Гребенку удаляют и в полученные лунки наносят исследуемые образцы по 30 мкл в каждую. Предварительно их смешивают с буфером для образцов 1:1 и кипятят полученные образцы на водяной бане 5 минут. В первую лунку вносят 5 мкл маркера. В состав маркера для электрофореза входит:

Cellulase с Mm 94,6 кДа, BSA - Mm 66,2 кДа, ovalbumin -45 кДа, carbonic anhydrase -31 кДа, trypsin inhibitor—21,5 кДа, lysozime -14,4 кДа.

По окончании электрофореза гель помещают в чистую плоскую посуду и заливают на 10 минут фиксирующим буфером, в состав которого входят 25%-й изопропанол и 10%-ая ледяная уксусная кислота. Затем гель окрашивают с помощью Кумасси ярко голубого R250 («Serva» Германия) в течение 4 часов при медленном помешивании на шейкере, отмывают в 10% уксусной кислоте.

2.5. Модель активной системной анафилаксии

Для иммунизации морских свинок используют нарастающие дозы водно-солевого экстракта аллергена с неполным адъювантом Фрейнда. В состав неполного адъюванта Фрейнда входят арлацел и вазелин в соотношении 2:3. Для получения анафилактической реакции морских свинок дважды сенсибилизируют. Первую инъекцию проводят 50% экстрактами аллергенов в неполном адъюванте Фрейнда подкожно в подушечки передних и задних лапок по 0,1мл в каждую точку.

Вторую - исследуемыми препаратами аллергенов с концентрацией белкового азота 10 ООО PNU подкожно по 1,0мл. Разрешающую дозу аллергена вводят на 21 день после последней инъекции внутривенно.

Анафилактический индекс вычисляют по формуле Вейгла [32]: кол-во животных х +) +(кол-во жив-х х ++) +(кол-во жив-х х+++) +(кол-во ЖИВ-Х Х++++) общее количество животных

2.6. Иммунодот

Иммунодот - это метод выявления антител к антигенам основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые нанесены специфические белки. Для обнаружения связанных антител проводится инкубация с использованием ферментного конъюгата, который способен вызывать развитие цветной реакции.

Белки наносят на нитроцеллюлозные мембраны в концентрации 1мкг/мкл на точку в объеме 1 мкл, затем отмывают мембраны 2 раза в TBST и инкубируют 1 час в 5%-ом обезжиренном молоке, приготовленном на TBS.

TBS:

TB ST :

Tris 12,1 Ir NaCl 87,66г

Tris 12,1 Ir NaCl 87,66г Tween-20 5мл

В качестве негативного контроля наносят на мембраны BSA (бычий сывороточный альбумин) в концентрации 1 мкг/мкл и 1мкл раствора Эванса-Кока.

В качестве положительных контролей наносят по 1мкл специфических IgG человека и кроличьи IgG против иммуноглобулинов человека, разведенные до концентрации 50 мкг/мл в смеси глицерин/TBS 1/1.

После инкубации в молоке мембраны помещают в образцы сыворотки и проводят инкубацию в течение ночи на качалке при 4°С. Затем мембраны отмывают 3 раза по 10 минут в TBST и инкубируют 1 час при комнатной температуре с конъюгатом (alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human Fey secondary antibodies, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA), разведенным 1/ЗОООвЗ% молоке, приготовленном TBS.

После отмывки от конъюгата (3 раза по 10 минут в TBST) мембраны переносят в буфер для проявки 100 mM Tris HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgC12 с добавленными субстратами щелочной фосфатазы NBT (тетразолиум нитро голубой) и BCIP (5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат). Мембраны проявляют до появления насыщенной окраски, после чего промывают 1 раз водой и высушивают.

Оценка результатов проводится денситометрическим методом с помощью программы ImageQuant.

Белых крыс наркотизируют хлороформом, декапитируют, обескровливают. Забрюшинно вводят 0,9 % изотонический раствор

2.7.Метод непрямой дегрануляции тучных клеток хлорида натрия и собирают перитонеальную жидкость в пробирку, предварительно обработанную гепарином.

О количестве тучных клеток судят по окрашиванию их красителем нейтральным красным. Клетки считают под микроскопом в камере Горяева по правилу подсчета клеток крови. К клеточной взвеси добавляют образцы сыворотки крови больного и исследуемого препарата.

В качестве контроля определяют спонтанную дегрануляцию тучных клеток и дегрануляцию тучных клеток, обработанных исследуемыми препаратами.

2.8. Имму но ферментный анализ

Методом твердофазного ИФА определяют специфические 1§Е-антитела в сыворотках крови. Для этого используют полистероловый планшет, сенсибилизированный моноклональными антителами (МкАт) к ^Е («Полимер» Россия). Исследуемые препараты каждый отдельно растворяют в карбонат-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,6±0,2), вносят в лунки полистероловых разборных планшетов фирмы «Полимер» (Россия) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 12 часов.

После этого в лунки планшетов вносят исследуемые образцы сывороток и инкубируют 1 час при температуре 37°С. Затем планшеты трижды отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,4±0,2) и вносят в лунки конъюгат моноклональных анти-^Е-АТ, меченных пероксидазой хрена («Полигност» Санкт-Петербург). После часовой инкубации при 37°С планшеты отмывают фосфатно-солевым буферным раствором и добавляют в лунки субстрат, состоящий из 33% раствора перекиси водорода - Юмкл, цитратного буфера - 1,2мл (рН 4,7±0,2), ортофенилендиамина (ОФД) -Юмкг, дистилированной воды - 20мл. Планшеты с субстратной смесью оставляют при комнатной температуре в темном месте 30 минут. Реакцию останавливают, добавляя 50% серную кислоту по 50мкл в каждую лунку в качестве стоп-реагента. Планшеты помещают в спектрофотометр фирмы «АпЙюб» с длиной волны 492 нм. Интенсивность окрашивания пропорциональна уровню 1§Е в исследуемых образцах. Полуколичественное содержание специфических 1§Е-АТ оценивают в соответствии с оптической плотностью стандартов (стандарт «Полигност» Санкт-Петербург) в классах реакции ИФА [9].

2.9. Метод торможения ИФА

Для определения специфической активности препаратов аллергенов используют метод торможения ИФА. Для этого сначала сыворотки больного истощают заранее приготовленными разведениями аллергенов. В результате специфические антитела, содержащиеся в сыворотке, вступают в реакцию с аллергеном и не выявляются в реакции ИФА. Затем смесь сыворотки и аллергена помещают в сенсибилизированные планшеты и далее реакцию проводят по стандартной методике ИФА. Специфическую активность препаратов аллергенов учитывают по проценту снижения оптической плотности в сравнении с положительным контролем.

2.10. Характеристика обследуемых больных

В работе использовали сыворотки крови взрослых и детей 8-17 лет, страдающих атопической бронхиальной астмой легкой и средней степени тяжести с известной бытовой сенсибилизацией (к домашней пыли и клещам домашней пыли) и состоящих на диспансерном учете у врача-аллерголога городской детской поликлиники г. Реутова и 9-го клинико-диагностического центра Министерства Обороны РФ.

У обследуемых больных брали кровь из локтевой вены в объеме 5,0 мл и центрифугировали 20 минут при температуре +4°С. Сыворотки разливали в криопробирки фирмы «NUNC» (Дания) по 500 мкл и замораживали. Хранили при температуре -20°С до момента использования.

2.11. Методы статистической обработки результатов

Для определения достоверности различий использовали I - критерий Стьюдента. Для применения данного критерия необходимо, чтобы исходные данные имели нормальное распределение. В случае с незначительно отличающимся размером выборки применяется упрощенная формула: где М\Мг ~ средние арифметические, оьа2 - стандартные отклонения, Nx.Ni - размеры выборок.

Количество степеней свободы рассчитывается как

Обработку результатов проводили с помощью статистического пакета программы Excel.

Определяли вероятность возможной ошибки в оценке результатов исследований или показатель достоверности различий — р (уровень значимости). Различия расценивались как достоверные, начиная со значения р<0,05, т.е. в тех случаях, когда вероятность различия больше 95%. При значениях р<0,01 вероятность различия больше 99%, а при р<0,001 - больше 99,9%. I

М, - м2 df = N-l + N, - 2